Procédures modérées

La tumeur greffée sous la peau peut s'ulcérer au point d'implantation, effet que le porteur signale et que ses points limites précoces doivent permettre d'anticiper. 160 souris immunodéprimées vont être utilisées, 96 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 64 un niveau léger, toutes tuées pour le prélèvement de la tumeur, du plasma et du foie. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses hépatiques humaines, cinq prélèvements sanguins en une semaine sous anesthésie, des injections intrapéritonéales d'anticorps sur animal éveillé et des mesures de tumeur au pied à coulisse. Le bénéfice annoncé, une thérapie contre le carcinome hépatocellulaire et d'autres cancers surexprimant la protéine SR-B1, reste au conditionnel, quand la greffe et les prélèvements sont, eux, programmés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’intérêt thérapeutique de l’utilisation d’anticorps dirigés contre la protéine SR-B1 (Scavenger receptor class B type 1), pour une meilleure prise en charge des carcinomes hépatocellulaires. Ce cancer est le cancer du foie le plus fréquent car il concerne 90% des cancers hépatiques primitifs. Actuellement, les options de traitement pour le carcinome hépatocellulaire avancé restent insatisfaisantes en raison de taux de réponse limités, soulignant un besoin urgent de développer de nouvelles thérapies. SR-B1 est un récepteur impliqué dans le transport du cholestérol. Son expression est très largement augmentée dans les carcinomes hépatocellulaires, par rapport au tissu sain. De plus, une forte expression de SR-B1 chez les patients est associée à une baisse de la survie à 5 ans, ce qui en fait un candidat intéressant dans la prise en charge des carcinomes hépatocellulaires. Ces données montrent l’intérêt de cibler les cellules cancéreuses avec des anticorps anti-SR-B1 pour développer une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement des carcinomes hépatocellulaires. L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de plusieurs anticorps anti-SR-B1 dans la prise en charge des carcinomes hépatocellulaires. Les résultats de ce projet permettront dans un 1er temps, de caractériser la pharmacocinétique des trois anticorps, et dans un 2ème temps d’évaluer leur effet antitumoral dans un modèle murin de xénogreffe dérivé de lignées cellulaires humaines.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra le développement clinique d'une nouvelle thérapie et ainsi contribuer à améliorer la prise en charge des patients à l’avenir pour le traitement du carcinome hépatocellulaire, mais également d’autres cancers où la protéine SR-B1 est surexprimée. C’est le cas notamment des cancers du sein ou de la prostate, très largement représentés, et où la surexpression de SR-B1 est aussi associée à un mauvais pronostic vital.

Procédures

Pour l’étude de pharmacocinétique, les animaux recevront une injection unique d’anticorps sur animaux vigiles. Cette injection est réalisée en moins d’une minute. Les animaux subiront 5 prélèvements de sang en une semaine. Chaque prélèvement est réalisé sur animaux anesthésiés et prend environ une minute à être réalisé. Pour étudier l’effet des anticorps, les animaux seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Les animaux recevront un traitement par injection d’un anticorps ou véhicule par injection intrapéritonéale. Cette injection est réalisée sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisée. Simultanément à l’injection de l’anticorps, les tumeurs seront mesurées à l’aide d’un pied à coulisse, et cette mesure prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisée en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux entraîne un stress physique modérée de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection des anticorps en intrapéritonéal entraîne une douleur légère de courte durée. Dans certains cas la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules, entraînant une douleur modérée de courte durée.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus (tumeurs, plasma et foie) qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Plusieurs stratégies de remplacement ont été mises en place afin de réduire au minimum le recours à l'expérimentation animale. Nous utilisons également en parallèle des modèles in vitro afin de confirmer notre hypothèse avant de passer sur le modèle animal. Néanmoins, dans les essais de pharmacocinétiques pour toutes substances thérapeutiques, les tests sur animaux entiers ne sont pas substituables par des tests simplifiés in vitro. Cela en raison du besoin de mesurer les variations de concentration de la substance thérapeutique dans le plasma d’un organisme ayant des organes et des systèmes pleinement fonctionnels. Également, les modèles cellulaires ne permettent pas de reconstituer l’effet de l’angiogenèse (formation de nouveaux vaisseaux qui peuvent influencer la réponse thérapeutique en entrainant l’activation de certaines voies de signalisation) ou toute la complexité biologique (interaction des éléments du microenvironnement tumoral avec le système biologique de la souris ou modélisation de l’hétérogénéité cellulaire et génétique d’une tumeur) d’un être vivant sur l’efficacité d’un traitement. La validation de ces dernières nécessite le recours à l'expérimentation animale en raison de sa grande complexité. De plus, les modèles cellulaires ne peuvent récapituler que partiellement la pathogenèse complexe du carcinome hépatocellulaire.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, pour améliorer au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, et des tunnels kraft pour leur permettre de se cacher. Ils auront accès sans restriction à la nourriture et à l'eau pendant toute la durée de l'expérience. Les animaux seront maintenus en groupe sociaux dans des cages ventilées en zone exempt d'organismes pathogènes spécifiques, ce qui permet que les animaux immunodéprimés ne développent pas d'infection. Les animaux seront manipulés à l’aide de tubes de manipulation afin d’éviter toute préhension stressante par la queue de l’animal. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Une méthode anesthésique sera appliquée lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement, et une observation scorée est réalisée 2 fois par semaine. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatations de 14 jours, les souris seront laissées 1 semaine sans manipulation puis habituées à la contention au cours de la 2ème semaine afin de diminuer le stress lié aux injections. Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie afin de minimiser le stress que pourrait induire la contention.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères proches de l’homme. Les phénomènes biologiques mis en jeu chez ces 2 espèces sont très comparables lors d’un traitement anti-cancéreux. Ces modèles ont contribué dans le passé à établir le potentiel curatif de combinaisons thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les anticorps que nous nous proposons d’étudier sont spécifiques de la protéine humaine que nous souhaitons cibler, le modèle de xénogreffe dérivé de lignées cellulaires nous permet d’utiliser des lignées cellulaires humaines qui expriment fortement cette protéine. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum, afin de mimer la pathologie qui touche principalement les adultes. De plus, il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.

Cinq chocs électriques de 0,6 milliampère en dix minutes : c'est le protocole de stress aigu appliqué à une partie des souris de ce projet sur les mécanismes cérébraux du trouble de stress post-traumatique. 1 100 souris au total vont être utilisées, 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 300 un niveau léger, chacune subissant une chirurgie d'injection dans le cerveau et, pour certaines, une biopsie de queue vers le sixième jour après la naissance. Le porteur annonce vouloir modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale sur simulateur informatique pour diminuer à l'avenir le nombre d'animaux utilisés, sans que cette perspective n'entame les 1 100 souris engagées ici. Toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé et analysé ex vivo.

Objectifs

Les troubles du stress post-traumatique (TSPT) sont des troubles psychiatriques qui surviennent après un événement traumatisant. Ils se traduisent par une souffrance morale et des complications physiques qui altèrent profondément la vie personnelle, sociale et professionnelle." (INSERM). Ces troubles surviennent suivant des épisodes de peur intense, où le souvenir de cet évènement est ensuite revécu par la personne. Ainsi, les TSPT ont pour cause le souvenir anormalement fort de l'événement traumatisant. Leur encodage nait de l'interaction de plusieurs régions cérébrales, parmi lesquelles l'amygdale centrale joue un rôle prépondérant. De plus, cette structure est à la base des réponses autonomes, comportementales et émotionnelles de la peur, faisant de ce noyau une structure de choix pour l’étude des TSPT. Nous nous intéressons tout particulièrement à un type de cellulaire : les astrocytes. Ces cellules ont pour rôle principale d’assurer le bon fonctionnement des neurones à proximité, fonction dont dépend leur morphologie. Aujourd’hui, il est établi que l’ocytocine (OT) via son récepteur (OTR) présent sur les astrocytes de l’amygdale centrale permet la modulation de la réponse émotionnelle lors d’une anxiété, d’une peur ou d’un stress aigu. Ce projet vise à comprendre comment l’OTR, via les astrocytes, module l’activité neuronale. Pour cela, nous couplerons pharmacologie et pharmacogénétique à des enregistrements d’activité des neurones et d’imagerie de fluorescence des astrocytes. Cette étude apportera de nouvelles connaissances quant aux mécanismes d’action des TSPT, via une meilleure compréhension des interactions neurone-astrocyte.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes cérébraux mis en place notamment l’impact de la gliotransmission sur le réseau neuronale au cours d’un stress aigu ce qui permettrait d'ouvrir des voies thérapeutiques permettant de réduire les symptômes de personnes traumatisées ou excessivement anxieuses.

Procédures

La totalité des souris subiront une procédure chirurgicale d'injection cerebrale et une chirurgie terminale pour perfusion avec prélèvement sur animal anesthésié. Certains animaux subiront une biopsie de queue sur animal vigile autour de 6 jours post natal pour réaliser leur génotypage. Enfin, des souris subiront en plus un protocole de stress pendant 10min.

Impact sur les animaux

Pour les expériences sans protocole de stress, la nuisance se limite à l'insertion d'une aiguille pour injecter les anesthésiques. Les injections virales peuvent entrainer des démangeaisons et une légère douleur au site d'incision ainsi qu’une perte de poids sont attendues après l'opération. Le protocole de stress aigu est un protocole qui provoque un stress, une angoisse ainsi qu'une douleur courte et transitoire ne pouvant être evités etant l'essence même de notre étude.

Devenir

Les animaux seront systématiquement mis à mort afin de réaliser une biopsie du cerveau et analyse ex vivo.

Remplacement

Notre étude porte sur l’analyse de l’activité complexe de réseaux neuronaux qui ne peuvent être pour le moment reproduits in vitro ou in silico. Il n’est donc pas possible, à ce jour, de remplacer l’usage d’animaux vivants. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef. Ce projet est donc une étude de physiologie intégrée, reposant sur un dialogue entre le cerveau et le corps.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au strict nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. L'effectif a été évalué en se basant sur les travaux réalisés précédemment dans l'équipe. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef. Lors de notre étude, nous allons modéliser les réseaux neuronaux avec les astrocytes au niveau de notre structure nous permettant à l'avenir de diminuer le nombre d'animaux utilisés

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupes sociaux dans des cages enrichies. Les souris seront observées quotidiennement (aspect du pelage, mobilité, absence de prostration). Une attention particulière sera portée aux signes de stress, qui sera limité au maximum par une manipulation des animaux au moyen d’un tunnel. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées. Nous utiliserons aussi des tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle des animaux tout au long de la chirurgie. Un gel hydratatnt sera aussi placé sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Après la chirurgie, de la nourriture hydratée et des croquettes seront déposés dans la cage afin de faciliter l'hydratation et la prise de nourriture. Des points limites précoces et spécifiques aux procédures ont été établis ce qui permettra d'interrompre les procédures à tout moment et donc soustraire l'animal à la souffrance. Pour le protocole de stress, des tests préalables ont déjà été réalisés dans nos études précédentes sur : 1) le nombre de choc (5) et 2) la l'intensité de ces derniers (0,6mA) qui correspondent à la bibliographie du domaine.

Choix des espèces

Le modèle expérimental chez la souris est un standard pour ce type d'expérience et comporte une série de symptômes superposables avec la pathologie humaine. La grande majorité des expériences réalisées à ce jour concernant l'action de l'ocytocine au sein de l'amygdale ont été effectuées chez la souris. Ainsi, il nous pourrons aisément comparer et interpréter les résultats et pour la qualité des mesures effectuées, il est préférable de travailler chez cette espèce. De plus, nos différentes procédures ont besoin de modèles génétiquement modifiés qui n’existe que chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, ce qui correspond à environ 5 semaines. En effet, nous nous intéressons ici à un mecanisme qui n'est pas développemental et pour cette raison nous souhaitons utiliser des animaux matures. Sachant que l'encéphale se développe encore jusqu'à la cinquième semaine, nous avons donc choisi d'utiliser des animaux à partir de 5 semaines.

Une ou deux chirurgies d'une heure chacune, espacées de deux semaines, pour injecter des traceurs dans le cerveau et la moelle épinière : 540 souris vont être utilisées, toutes tuées, lors d'une chirurgie terminale ou plus tôt lorsque leur génotype ne convient pas. 440 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger, une biopsie d'oreille sur animal éveillé servant au génotypage des lignées transgéniques. Le projet cherche à savoir si des neurones de la formation réticulée compensent la perte des neurones moteurs dans la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur justifie la souris par la disponibilité de plusieurs lignées mutantes et par le fait que la multiplication des modèles est, écrit-il, désormais requise pour convaincre la communauté scientifique.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la plus fréquente des maladies neurodégénératives du neurone moteur adulte. Elle induit une paralysie progressive des patients et conduit irrévocablement au décès 2 à 5 ans après l’apparition des premiers signes. Elle demeure encore incurable. Environ 10% des patients présentent des mutations dans des gènes qui ont été identifiés et ont permis le développement de souris transgéniques qui reproduisent les symptômes de la maladie. La SLA découle de la mort de neurones impliqués dans le contrôle des muscles et présents dans deux régions : 1) la partie supérieure du cerveau (cortex cérébral) et 2) la moelle épinière. Ces neurones qui dégénèrent au cours de la SLA sont en interaction avec une troisième population neuronale impliquée dans le contrôle des muscles et situées entre ces deux populations, dans une région appelée formation réticulée. Malgré ces interactions, on ne connaît ni le devenir au cours de la maladie, ni la contribution à la maladie des neurones de la formation réticulée. Partant de résultats scientifiques obtenus dans d’autres contextes pathologiques, nous émettons l’hypothèse que les neurones de la formation réticulée pourraient compenser les pertes des neurones directement ciblés par la SLA, et représenter une population neuronale d’intérêt thérapeutique. Pour tester cette hypothèse, nous proposons 1) de marquer et quantifier les neurones de la formation réticulée, et 2) de marquer et quantifier les neurones du cortex cérébral (en amont), qui se connectent directement aux neurones de la formation réticulé

Bénéfices attendus

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Histologiquement et cliniquement elle se définit comme la dégénérescence des neurones moteurs du cortex cérébral et de la moelle épinière. Cependant, ceux-ci sont en interaction avec d’autres neurones moteurs, notamment dans la formation réticulée, dont la contribution à la maladie n’a pas encore été évaluée, et qui pourraient compenser, sur le plan fonctionnel, les pertes des autres neurones, et représenter de fait une nouvelle population neuronale d’intérêt thérapeutique. Dans ce contexte, nous nous proposons d’évaluer le devenir des neurones moteurs de la formation réticulée dans des modèles de sclérose latérale amyotrophique, afin de développer de potentielles nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à trois types d’intervention : - Une biopsie de l’oreille sur animal vigile pour permettre le génotypage des animaux transgéniques. - Une chirurgie unique, ou deux chirurgies successives, sur animaux anesthésiés, espacées de deux semaines, d’une durée de 1 heure maximum chacune pour injecter au sein du cerveau ou de la moelle épinière les traceurs permettant d’identifier les neurones d’intérêts et leurs connexions. - Une chirurgie terminale, sur animaux anesthésiés, pour prélever les organes d’intérêt : cerveau et moelle épinière.

Impact sur les animaux

1. Un stress induit par la séparation souriceaux/ mère, une contention douce, et une douleur légère à l’oreille lors de la biopsie requise pour le génotypage des animaux. L’ensemble de la procédure dure moins d’une minute. 2. Une partie des animaux pourraient présenter de légères atteintes motrices et une perte de poids inférieure à 10%. 3. Des chirurgies qui peuvent entraîner des douleurs modérées dues à une inflammation transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes d’intérêt (cerveau et moelle épinière), ou en raison d’un génotype non conforme.

Remplacement

Ce projet consiste à déterminer, dans un contexte neurodégénératif, le devenir et le rôle de neurones impliqués dans le contrôle moteurs, et en interaction avec deux populations neuronales situées en amont et en aval et ciblées par la SLA, au sein du système nerveux central de mammifère. Une telle complexité des réseaux neuronaux ne peut pas, à l’heure actuelle, être reproduite in vitro. En effet, les organoïdes ne permettent actuellement que de modéliser deux des trois régions du cerveau qui sont investiguées ici. En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal ne saurait être remplacé par un modèle cellulaire ou in sillico.

Réduction

D’après les travaux préliminaires de notre consortium de recherche (composé d’experts de la moelle épinière, de la formation réticulée et du cortex cérébral), un nombre minimum de 8 animaux (4 femelles et 4 mâles) pourrait suffire pour mettre en évidence une modification statistiquement significative des populations neuronales d’intérêt ou de leur connectivité. Ici, nous proposons des groupes de 10 animaux afin de pouvoir exclure éventuellement un (ou plusieurs) animal(aux) si la qualité de certaines chirurgies s’avérait insuffisante. Nous proposons donc de commencer les expériences avec 8 animaux par groupe, et de n’inclure davantage d’animaux que si nécessaire. Le nombre d'animaux a été évalué pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici d’utiliser les femelles et les mâles issus de mêmes portées.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, frisure, tunnels), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Les animaux seront utilisés avant l’apparition de symptômes moteurs sévères. Nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoires. Enfin, des points limites spécifiques au phénotype des animaux, ou aux chirurgies ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Parmi les modèles de SLA, les souris sont les plus appropriées à notre étude car 1) elles présentent le niveau de complexité du cerveau et de la moelle épinière adéquat, 2) il existe plusieurs lignées de souris qui, dans leur ensemble, couvrent plusieurs mutations retrouvées chez les patients contrairement aux modèles de primates (très rares) ou de rats (peu fréquents), et la multiplication des modèles est désormais requise pour convaincre la communauté scientifique, et 3) elles permettent davantage de manipulations génétiques, par croisement, qui permettent en outre de répondre également à des questions mécanistiques. Les animaux seront utilisés à partir de 45 jours et jusqu'à 90 jours ou 120 jours maximum selon les lignées, et dans tous les cas avant l’apparition de symptômes moteurs sévères.

Une partie des souris utilisées appartient à une lignée transgénique retenue pour son nombre plus élevé de cellules mémoires dites MAIT, censé rendre l'effet recherché plus facile à observer. 1 946 souris vont être utilisées, 1 574 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 372 un niveau modéré. Elles reçoivent une injection de cellules sous anesthésie, puis une administration de produits sous une anesthésie pouvant atteindre quarante minutes, puis six injections espacées de vingt minutes le jour de leur mise à mort. Le porteur affirme que les activations du système immunitaire ainsi provoquées ne sont pas douloureuses et que le passage par un organisme vivant intégré est "indispensable" pour tester les mécanismes de régulation. Toutes sont tuées pour le prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.

Objectifs

Le système immunitaire a pour rôle de détecter un potentiel danger et d’y répondre par le biais des globules blancs afin d’éliminer cette source de danger. On compte parmi ces globules blancs des cellules appelées « lymphocytes T », dont le sous-type dit « CD4 » est absolument essentiel pour l’organisation et l’action du système immunitaire. Par exemple, les patients qui ont un déficit en lymphocyte T CD4 développent de graves maladies infectieuses. Chaque lymphocyte T généré dans l’organisme est capable de reconnaître une cible qui lui est unique. Quand un lymphocyte T n’a pas encore rencontré sa cible au long de la vie de l’individu, on dit qu’il est « naïf » et lorsqu’il a rencontré sa cible, on dit que cette cellule est « mémoire ». Les cellules mémoires sont capables de répondre plus rapidement en cas de reconnaissance d’un danger et c’est sur ce principe qu’est basée la vaccination.

Bénéfices attendus

Ce projet tente de répondre à une question fondamentale en immunologie : comprendre les différents signaux qui sont intégrés par les cellules T CD4 naïves et qui peuvent influencer leur activité. Ce projet pourrait permettre à court terme d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent l’activation des cellules T CD4 naïves qui, pour rappel, sont des cellules clés de la fonction du système immunitaire. A plus long terme, nos résultats pourraient avoir des applications très intéressantes notamment dans le domaine de la vaccination car nous pourrions développer de nouveaux adjuvants capables d’activer des cellules mémoires et ainsi orienter la réponse T CD4 naïve de la façon la plus optimale par rapport à l’effet recherché.

Procédures

Dans la procédure expérimentale, les souris anesthésiées recevront d’abord une injection de cellules mémoires et/ou naïves (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 5 min). Puis les animaux recevront 6h plus tard une administration de produits non douloureux. Ce geste sera réalisé sur animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 40 min). Le jour de la mise à mort, les animaux recevront six injections, chacune séparée de 20 min, d’un produit non inflammatoire sous anesthésie (durée de chaque anesthésie < 5 min).

Impact sur les animaux

Suite à l'injection d’anesthésique dans l'abdomen une douleur légère immédiate de courte durée liée à la piqûre est attendue. Au réveil de l’anesthésie, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie par les animaux après l’administration des traitements ou l’injection de cellules. Il est important à souligner que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées

Remplacement

Le type d’activité que peut adopter une cellule CD4 naïve a déjà été étudiée in vitro et nous sommes capables aujourd’hui de modifier le comportement d’un lymphocyte T CD4 in vitro. Cependant, le comportement que va adopter un lymphocyte T CD4 in vivo peut être très différent de celui obtenu in vitro. Malheureusement, nous n’avons pas aujourd’hui les technologies nous permettant de reproduire in vitro les différents signaux complexes que peuvent recevoir les cellules naïves au sein de leur environnement proche. En effet, les mécanismes qui peuvent moduler l’activité des cellules naïves CD4 sont très nombreux et font notamment intervenir les cellules présentatrices de l’antigène (c’est-à-dire la source de danger), les cellules naïves et les cellules mémoires. Ainsi, une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris est nécessaire. Cette étape est notamment indispensable pour tester les mécanismes de régulation. Stratégie de remplacement : Des expériences in vitro ont déjà été réalisées au laboratoire et ont démontré que l’environnement immédiat des lymphocytes est déterminant pour leurs fonctions. Il est maintenant nécessaire de valider ces résultats dans un environnement intégré qu’est la souris.

Réduction

Nous utiliserons de façon générale 12 souris par groupe expérimental. Il s’agit d’un nombre suffisant nous permettant de surmonter les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à notre modèle. Ce nombre se base sur des expériences préliminaires déjà réalisées au laboratoire en utilisant ce modèle.

Raffinement

Tous les gestes douloureux ou nécessitant une immobilisation parfaite de l’animal seront réalisés sous anesthésie avec recours aux analgésiques si nécessaire. Lors des anesthésies, la température corporelle des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de tapis chauffant. Par ailleurs, pour éviter l’assèchement des yeux pendant les anesthésies, les yeux des animaux seront recouverts de vaseline officinale. Une solution de Ringer lactate préchauffée à 37°C sera administrée en fin d’anesthésie pour améliorer le réveil de l’animal. Les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’état des animaux sera évalué de manière objective grâce à une grille de score permettant de définir des points-limite. L’atteinte de ces points-limite conduira à la mise en place de soins de support/analgésiques voire à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie pour plusieurs raisons : a) nous avons une bonne connaissance de son génome, ce qui nous permet notamment d'utiliser des souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt. b) la souris est aussi un modèle de choix du fait de la disponibilité de souches congéniques (« génétiquement proches ») et transgéniques (« génétiquement modifiées »). c) enfin, nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris Nous utiliserons des souris de « phénotype sauvage » (non génétiquement modifiées) mais également une lignée transgénique car cette lignée possède un plus grand nombre de cellules mémoires particulières dites « MAIT » ce qui permettrait d’observer plus facilement l’effet biologique attendu (influence des cellules mémoires sur le devenir des cellules naïves). Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 12 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.

820 poissons zèbres juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certains passant deux à trois heures dans un test de mémoire dont une heure entière de stimulations électriques. Ils subissent aussi la coupe d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie brève, des séances d'imagerie, et pour d'autres une exposition à des agents pharmacologiques par bain ou par injection. Le porteur qualifie ces chocs de faible intensité et affirme qu'ils n'induisent pas de douleur, tout en retenant le nombre de stimulations reçues par un même individu comme l'un des deux points limites de la procédure. Les poissons expérimentaux sont tués à l'issue, les reproducteurs porteurs de la mutation liée au syndrome Kabuki étant gardés en vie pour maintenir la lignée.

Objectifs

Le syndrome Kabuki, principalement causé par un exemplaire non fonctionnel d'un gène identifié chez l’homme, est caractérisé par une déficience intellectuelle et des troubles immunologiques pour lesquels il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement. Les mécanismes à l'origine de ce syndrome ne sont pas élucidés. Les 3 principaux objectifs du projet sont : (1) de modéliser les anomalies au niveau du système immunologique et du système nerveux du syndrome Kabuki grâce à une lignée de poissons dont l'un des 2 exemplaires du gène correspondant n’est pas fonctionnel; (2) de caractériser chez ces poissons les problèmes induits par le défaut génétique au niveau des cellules nerveuses et immunitaires, et enfin (3) de tester l’effet thérapeutique de plusieurs agents pharmacologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait d’abord valider l'utilisation du modèle pour étudier les troubles immunologiques et du système nerveux du syndrome Kabuki. Une fois ce modèle validé, il nous aidera à déterminer quels sont les gènes et les types cellulaires plus spécifiquement impliqués dans la survenue des problèmes immunologiques et nerveux associés à ce syndrome. Enfin, les tests avec des agents à visée thérapeutique réalisés à la fin de ce projet pourraient aboutir à de nouvelles pistes pour le développement de traitements pour les patients.

Procédures

L’utilisation d’une lignée de poissons-zèbre déficiente pour un gène particulier portant une mutation nécessite de vérifier la présence de cette mutation. Pour cela, une unique procédure d'identification à partir du prélèvement d’un fragment de tissu de la nageoire caudale est réalisée sous anesthésie générale brève (

Impact sur les animaux

La nageoire régénérant rapidement et spontanément chez cette espèce, le prélèvement d'un fragment de tissu de la nageoire caudale ne crée pas de gêne ou d’incapacité durable chez les animaux maintenus en hébergement. Réalisée par un personnel qualifié, elle n’induit généralement aucune douleur. Au cours des tests comportementaux, la stimulation électrique sera calibrée de façon à ne pas interrompre l'exploration spontanée des animaux selon des protocoles bien documentés qui n’induisent pas de douleur. Une attention particulière sera toutefois portée : 1) aux signes de stress, notamment lors de l’introduction dans la zone de test, et 2) au nombre de stimulations subi par un même individu lors de la phase de conditionnement. Ces deux paramètres constituent les points limites majeurs pour cette procédure. Lors des tests pharmacologiques, qui peuvent générer du stress et/ou de l’inconfort sur les animaux, le comportement de nage et la prise alimentaire des animaux expérimentaux seront donc surveillés avec attention durant et après le traitement selon des grilles de scoring adaptées.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à l’issue des procédures décrites dans cette demande d'autorisation de projet, exceptés les animaux portant un exemplaire non fonctionnel du gène d'intérêt, et identifiés après une procédure de vérification de la présence de cette mutation. Ces derniers seront gardés en vie afin de maintenir la lignée à l'état hétérozygote pour assurer la reproduction lors du projet.

Remplacement

Le comportement des poissons et le fonctionnement des cellules immunitaires ne peuvent être étudiés qu’in vivo au niveau d’un organisme entier, il n’est donc pas possible de remplacer l'utilisation d'animaux vivants pour ce projet de recherche. Le comportement examiné et les cellules immunitaires d'intérêt n’étant matures qu’aux stades juvéniles, il n’est pas possible de mener cette étude à des stades précoces du développement.

Réduction

Nous réaliserons une expérience pilote chez des larves de moins de 5 jours de développement afin de déterminer quel agent thérapeutique de notre panel compense le mieux les effets de la mutation de notre gène d'intérêt chez l’espèce étudiée et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’individus à utiliser a été calculé afin d’obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Enfin nous avons établi des procédures en étapes successives, ce qui permet de stopper l'expérimentation dès que les objectifs scientifiques sont atteints.

Raffinement

Les poissons utilisés sont maintenus avec un seul exemplaire du gène d'intérêt non fonctionnel, ce qui permet d'éviter l'apparition de défauts dommageables pour le bien être des animaux au cours de l'expérimentation. Des grilles d'évaluation seront utilisées pour effectuer un suivi complet du bien-être des animaux selon leur aspect, leur activité, leur prise alimentaire et leur comportementet afin de définir des points limite adaptés en fonction de leur âge. Cette surveillance fine permet, à chaque étape du projet, de prendre des mesures adaptées pour réduire les nuisances sur le bien-être des animaux voire d'interrompre l'expérimentation. Une grande attention sera portée aux conditions d’hébergement et le comportement de nage ainsi que la prise alimentaire des animaux reproducteurs seront l’objet d’une surveillance régulière, trois fois par jour.

Choix des espèces

Le poisson-zèbre a été choisi pour ce projet car les processus biologiques étudiés (mémoire, immunité) ont été bien décrits chez cette espèce. De plus, une lignée de poissons mutante pour le gène d’intérêt a déjà été générée et son étude à des stades précoces a montré l’existence d'atteintes chez ces poissons semblables à celles du syndrome Kabuki. Ces résultats indiquent donc que le poisson-zèbre est un modèle de choix pour permettre à la fois d’étudier les mécanismes de la maladie humaine et de procéder à des tests pour de nouveaux agents thérapeutiques. Les poissons seront utilisés à des stades juvéniles (1 à 2 mois de vie) pour toutes les procédures décrites et sont justifiés scientifiquement par des études préalables qui ont démontré que : 1) le comportement que nous allons tester chez les poissons mutants se développe seulement à partir de 3 semaines de vie, et que 2) concernant l’étude immunologique, les cellules d’intérêt sont impliquées dans la régénération de la nageoire entre 3 et 8 semaines de vie. Une étude pilote utilisant des jeunes larves sera également menée afin de sélectionner de façon rapide et fiable le(s) meilleur(s) candidat(s) parmi les agents pharmacologiques à tester ensuite à des stades plus tardifs.