Procédures modérées
Développement d’un modèle rongeur diurne pour l’étude du rôle de l’ABCA4 dans le développement de la maladie de Stargardt (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
208 rats des sables, un rongeur diurne dont la rétine ressemble à celle de l'humain, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour analyse de la rétine. L'injection se fait sous la rétine d'animaux âgés de dix à vingt jours, encore avec leur mère, pour inactiver dans un œil le gène responsable de la maladie de Stargardt, l'autre œil servant de témoin. Chaque animal subit ensuite trois électrorétinogrammes, trois tomographies et trois examens du fond de l'œil, tous sous anesthésie, ainsi qu'un transport entre deux établissements. Le porteur qualifie ces examens de non invasifs et affirme que l'injection sous-rétinienne chez le nouveau-né n'engendre "en général, aucune lésion", tout en indiquant qu'une inflammation de l'œil n'est pas à exclure et que les animaux montrant une douleur manifeste sont tués immédiatement.
Objectifs
La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte l’œil, et constitue la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche souvent des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, nommément la macula qui est riche en cônes. Les mécanismes pathogènes ont été largement analysés dans une souche de souris modifiée qui n‘exprime pas le gène responsable. Néanmoins, ces souris ne présentent pas les déficits observés chez les patients. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne appelé Rat des Sables (Psammomys obesus) présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa rétine riche en cônes ressemble fortement à celle de l’homme. L’objectif du projet qui est un projet multisite qui se déroule dans deux établissements utilisateurs est de développer un nouveau modèle animal dans lequel le gène responsable sera invalidé spécifiquement dans la rétine. Les conséquences de la mutation induite seront étudiées par des méthodes non-invasives permettant de suivre la dégénérescence lente de la rétine grâce à l’évaluation longitudinale de la fonction de la rétine et à l'obtention d'images de l’œil. Des analyses cellulaires et moléculaires viendront compléter l’étude. Ainsi, ce modèle permettra d’éclaircir les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie de Stargardt. Si le modèle récapitule les caractéristiques principales de la maladie il sera utilisé dans une deuxième phase pour tester une thérapie génique, potentiellement capable de contrecarrer la dégénérescence et maintenir la fonction des photorécepteurs.
Bénéfices attendus
L’utilisation du modèle rongeur Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme chez l’homme, va permettre d’étudier les mécanismes de la maladie de Stargardt et de tester une potentielle thérapie génique. Il est évident que si des effets bénéfiques suite à l’administration de la thérapie géniques ont constatés, cela ouvre des perspectives importantes pour les patients atteints de la maladie de Stargardt, qui est actuellement sans traitement.
Procédures
Les procédures décrites dans ce projet comprennent une injection sous-rétinienne (EU1/2) réalisée sur animal anesthésié ainsi que des analyses structurales et fonctionnelles de la vision réalisées avec des méthodes non invasives, également sur animal anesthésié. Il s'agit de l'électrorétinogramme (EU1/2), de la tomographie par cohérence optique (EU2/2) et du fond d'oeil (EU2/2). Ces 3 analyses seront réalisées chacune à 3 reprises.
Impact sur les animaux
L’injection sous-rétinienne chez les nouveaux nés de Psammomys obesus, n’engendre, en général, aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. L’ERG et l’imagerie sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière mais une inflammation de l’oeil n’est pas à exclure suite à l’ERG, même si son occurrence est minimisée à travers l’utilisation de gel ophtalmique. Le transport entre les deux EU pourra induire un stress aigu transitoire chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour analyses ultérieures moléculaires et cellulaires de la rétine.
Remplacement
A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles (ce qui nous concerne ici). Toutefois, la technique de modification du gène responsable de la maladie de Stargardt a été validée par analyse génomique et par nos observations expérimentales précédentes.
Réduction
Pour la majorité des expériences chaque animal est son propre contrôle. A savoir un œil est injecté avec une construction contrôle et l’autre avec une construction qui permet d'obtenir l’inactivation du gène impliqué dans la maladie de Stargardt. Le nombre d'animaux a été évalué au maximum en prenant en compte le risque potentiellement engendré par l’injection, ainsi que la variabilité interindividuelle pour aboutir à des résultats significatifs lors de la comparaison entre l’œil contrôle et l’œil traité. Il s'agit également d'une étude où le même animal est suivi à plusieurs temps après injection (étude longitudinale) ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux utilisés. Dans cet avenant le nombre total d’animaux de la procédure 1 a été réduit car les données obtenues ont permis de déterminer que la dégénérescence débute précocement et que les temps de mise à mort tardifs initialement prévus ne sont pas nécessaires.
Raffinement
Les animaux au stade de développement P10-20 sont hébergés avec leur mère et leur fratrie, afin de respecter les interactions sociales et dans un environnement enrichi (matériel de nidification et bâton à ronger), afin de stimuler leur activité motrice. Après le sevrage les animaux sont hébergés en groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe, afin de respecter les interactions sociales et dans un environnement enrichi (bâton à ronger, tunnel), afin de stimuler leur activité motrice. Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum, qui est adaptée selon l’état physiologique des animaux (mère allaitante, animaux sevrés, adultes). Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux au stade de développement P10-20 sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale, à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’œil. Après l’intervention, l’application d’un gel ophtalmique permet d’éviter un desséchement de la cornée. Lors de l’ERG, de l'OCT et du fond d'œil, les animaux sont placés sous anesthésie, complétée d’une analgésie locale pour l’ERG. L’application de gel ophtalmique permet ici aussi d’éviter tout desséchement de l’oeil. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être : deux fois par jour le jour d’une intervention (injection, FO + OCT, ERG), puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté. En cas d’infection ou de douleur manifeste, les animaux seront mis à mort immédiatement selon une méthode adaptée à l’âge de l’animal. Les deux sites expérimentaux sont distants de moins de 10 km. Les animaux sont transportés entre sites expérimentaux, en présence de la personne habituée à les manipuler, dans des boites de transport pour animaux de laboratoire contenant litière et enrichissements type bâton et frisure, nourriture et eau gélifiée. Lors du précédent projet, les animaux n'ont montré aucun signe de stress à leur arrivée dans chacun des sites.
Choix des espèces
Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne Psammomys obesus. Par comparaison avec la souris, la rétine de Psammomys obesus est de plus grande taille et est enrichie en cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) de type cônes (40% versus souris 3%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’injection sous rétinienne et l’étude des cônes, qui sont impliqués dans la maladie de Stargardt. Nous utiliserons des animaux aux stades postnataux P10-20 (jours après la mise bas), car ce stade correspond à la période où la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans), et la protéine ciblée n’est encore que peu exprimée dans les photorécepteurs.
Etude des mécanismes de rejet inné après transplantation d’organe et tissue
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Prélèvement du cœur ou du rein sur les souris donneuses, puis greffe sur les receveuses au cours d'une opération de vingt à quatre-vingt-dix minutes selon l'organe, suivie de quatre injections de morphine et d'un suivi qui peut atteindre cent soixante-huit jours. 4 240 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les lignées d'élevage au phénotype dommageable subissent trois prélèvements sanguins par an au sinus rétro-orbitaire pendant cinq ans, et les receveuses de greffe d'îlots pancréatiques reçoivent d'abord une injection provoquant un diabète, puis deux contrôles de glycémie par semaine. Chaque chirurgie entraîne une gêne au réveil et une douleur malgré les analgésiques, et toutes les souris sont tuées en fin de procédure pour que soient prélevés leur sang, leurs organes lymphoïdes et les greffons.
Objectifs
La transplantation est souvent le traitement le plus efficace, voire le seul, pour les patients en insuffisance terminale d'organe. Ce processus permet de remplacer l’organe malade par celui d’un donneur génétiquement différent. Cependant, son efficacité à long terme est limitée par le rejet, principal facteur de perte de greffon. Ce rejet survient car le système immunitaire du receveur reconnaît le greffon comme un tissu étranger. Actuellement, le rejet est attribué à la reconnaissance du greffon par la réponse immunitaire adaptative. Nos recherches récentes explorent le rôle d’un autre bras du système immunitaire, l’immunité innée, révélant un potentiel thérapeutique inédit pour éviter et traiter le rejet du greffon. L’identification et la compréhension des mécanismes du rejet inné permettraient de mieux évaluer et suivre les patients, tout en ouvrant la voie à de nouveaux traitements innovants. Les objectifs du projet sont : i) analyser les réponses de l’immunité innée du receveur contre le greffon; ii) tester des molécules susceptibles de freiner les lésions de rejet et d’augmenter la durée de vie des greffons ; iii) étudier comment l’interaction entre les cellules innées et les lymphocytes. Cette approche optimiserait la sélection des donneurs et prolongerait la survie des greffons, tout en améliorant la qualité de vie des receveurs. Des études récentes montrent que le type de rejet varie selon les cellules immunitaires impliquées et le type de greffe. Nous utiliserons diffèrents modèles de greffes pour explorer la contribution des cellules de l’immunité innée dans le rejet de greffe chronique et aiguë. Le projet est structuré en 8 procédures, chaque modèle de greffe (moelle osseuse, greffe cardiaque, rénale, îlots) étant étudié avec deux objectifs : 1) caractériser les mécanismes impliqués dans le rejet de greffe médié par les monocytes et tester des molécules visant à réduire le risque de rejet ; 2) analyser les mécanismes impliqués dans le rejet de greffe médié par les cellules innés NK avec les lymphocytes. D’une durée de 5 ans, le projet pourrait impliquer jusqu’à 4240 souris, avec des expériences réalisées en séquence et arrêtées en cas d’hypothèse invalidée.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'améliorer la compréhension du rôle du système immunitaire inné dans le rejet de greffe, ainsi que de ses interactions avec le système adaptatif. Cette meilleure connaissance pourra nous guider dans l'identification de traitements potentiels pour atténuer le rejet. L’effet thérapeutique de molécules candidates sera étudié, ce qui permettra de sélectionner et valider des candidats capables de moduler ces interactions, avec des études plus approfondies sur les mécanismes moléculaires in vitro.
Procédures
Elévages des souris du phénotype dommageable : prélèvement sanguin au sinus retro-orbital trois fois par an, maximum 5 secondes par prélèvement – durée 5 ans Souris receveuses des cellules moelle osseuse : Greffe des cellules moelle osseuse sous anesthésie (injection dans le ventre 5 sec) + analgésie morphinique (4 injections dans le ventre 20 sec) – au niveau du rein - Incision au niveau du flanc latéral. (opération 20 minutes) Souris donneuses de greffon cardiaque : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 15 minutes Souris receveuses de greffon cardiaque : greffe cardiaque sous anesthésie (injection dans le ventre 5 sec) + analgésie morphinique (4 injections 20 sec) – opération au niveau du cou (opération 60 minutes) Expérience de maximum 56 jours Souris donneuses de greffon rénale : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 20 minutes Souris receveuses de greffon rénale : greffe rénale sous anesthésie (injection dans le ventre 5 sec) + analgésie morphinique (4 injections soucutanée 20 sec) – opération au niveau du ventre (opération 90 minutes) + + analgésie morphinique (4 injections dans le ventre 20 sec) – opération au niveau du ventre (total opération 20 minutes) Expérience de maximum 168 jours Souris receveuses de greffon d’îlots pancréatiques : Injection dans le ventre pour une induction chimique de diabète (maximum 5 secondes). Greffe des cellules de pancréas sous anesthésie (injection dans le ventre de 5 secondes) + analgésie morphinique (4 injections dans le ventre de 20 secondes) – réalisée au niveau du rein via une incision sur le flanc latéral. (opération 20 minutes). Suivi de la glycémie par glucomètre (prélèvement sanguin de la queue deux fois par semaine, maximum 5 secondes par prélèvement). Expérience de maximum 56 jours
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales et les prélèvements de sang sont susceptibles d’entrainer un stress (contention) et une légère douleur. La greffe de cellules de moelle osseuse, cœur, rein et îlots pancréatiques sont des procédures bien documentées, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. Chacun des 4 types de chirurgie entrainera une gêne lors du réveil et douleur (malgré les analgésiques) et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort en fin de procédure avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Les mécanismes de rejet d’organe ne peuvent pas être reproduits in vitro.
Réduction
Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour garantir des résultats pertinents, fixé à 8 animaux par groupe. Afin d’atteindre cet effectif malgré les taux de réussite variables des greffes rénales, des greffes d’îlots et de l’induction du diabète (80-90% et 70% respectivement), chaque groupe comprendra entre 10 et 14 individus au départ. Cette marge permet de s’assurer qu’au moins 8 animaux pourront être analysés par groupe. Au total, 4240 souris (Mus musculus) seront nécessaires pour ce projet. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique afin d’assurer la robustesse des analyses. Les expériences seront réalisées de manière séquentielle, chaque étape étant conduite uniquement après l’obtention et l’analyse complète des résultats de la procédure précédente. Si les résultats obtenus ne permettent pas de valider l’hypothèse testée, les étapes suivantes ne seront pas engagées. Cette approche garantit que la poursuite des expériences repose sur des résultats concluants, limitant ainsi la réalisation d’expériences non nécessaires.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera évalué et pris en compte tout au long du protocole grâce à un suivi rigoureux, incluant l’observation de leur poids, de leur comportement et de leur état général. Des points limites spécifiques à chaque chirurgie seront définis pour assurer une prise en charge adaptée. Des traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés afin de garantir le confort des animaux lors des interventions chirurgicales et des prélèvements sanguins. Un suivi rapproché sera effectué après chaque chirurgie, avec une surveillance accrue en fonction des signes cliniques observés. Pour limiter le stress, les animaux seront maintenus en groupes sociaux. Les interventions chirurgicales seront réalisées par un professionnel formé à la chirurgie sur rongeurs, avec du matériel stérile et sous conditions optimales. Après la chirurgie, les animaux seront placés en armoire chauffante pour favoriser leur réveil.
Choix des espèces
La souris, grâce à sa similarité génétique et physiologique avec l’homme, est un modèle idéal pour étudier la réponse immunitaire allogénique. Notre projet utilise diverses lignées de souris génétiquement modifiées et de fonds génétiques variés pour simuler différents types de rejets, qu’ils soient allogéniques ou innés : 1. Souris receveuses et donneuses sans système adaptatif (immunité innée seule) pour étudier les monocytes : BRG (receveuses et donneuses contrôles), NSG (donneuses uniquement, SIRPA mismatch). 2. Souris receveuses sans système adaptatif pour l’étude des NK : Rag. 3. Souris donneuses de greffons pour l’études des NK: C57BL/6 (contrôle), B2MKO (absence de MHC-I, « missing-self »). 4. Pour les greffons exprimant l’antigène OVA : B6-OVA, B2MKO-OVA. 5. Pour les donneuses de cellules T spécifiques d’OVA : Rag OTII. Ces souches permettent une analyse précise des mécanismes de rejet de greffe. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées (age de la maturité sexuelle) Age maximum 12 mois en fin de procédure.
Etude exploratoire du rôle des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Les souris qui atteignent les critères d'arrêt de la grille de score sont tuées immédiatement. 505 souris vont être utilisées dans ce projet, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un cocktail d'antibiotiques pendant quatorze jours, subissent une irradiation du bas du corps sous anesthésie, avalent sept jours durant un produit chimique dans leur eau de boisson qui provoque lésions intestinales, diarrhée, perte de poids et saignements anaux, ou sont infectées par gavage avec une bactérie intestinale. Le porteur indique que les doses ont été calibrées pour rester tolérables chez les souris témoins, admet que des signes cliniques plus importants ou plus précoces peuvent apparaître chez les souris mutantes privées des cellules étudiées, et range les retombées thérapeutiques au rang de perspectives.
Objectifs
Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules clefs du système immunitaire. Lors d’infections virales elles produisent en grandes quantités les interférons, des molécules essentielles pour bloquer la propagation du virus chez l’hôte infecté. Les pDC interviennent aussi dans d’autres fonctions physiologiques. Lorsque la peau est lésée, les pDC se localisent dans la lésion et promeuvent la réparation du tissu grâce à leur production d’interférons. Les pDC sont très nombreuses dans l’intestin. Chez l’individu sain les pDC de l’intestin seraient impliquées dans la tolérance aux aliments. La flore intestinale est essentielle pour le bon fonctionnement du système immunitaire, mais son impact sur les pDC de l’intestin a été peu étudié. Notre premier objectif est de déterminer si et comment les pDC intestinales sont affectées si on traite temporairement les souris avec une combinaison d’antibiotiques qui élimine la flore intestinale. Le rôle des pDC au cours des maladies inflammatoires de l’intestin est très controversé. Dans certains modèles de ces maladies elles seraient délétères en promouvant l’inflammation, alors que dans d’autres elles seraient bénéfiques en promouvant la réparation des tissus enflammés ou en limitant les infections intestinales. Notre hypothèse est que cette controverse ne dépend pas uniquement du modèle de maladie étudié, mais aussi de la spécificité du modèle murin utilisé pour étudier les pDC. Nous avons généré et validé un nouveau modèle murin permettant la perte sélective des pDC depuis la naissance sans affecter aucun autre type de cellule. Grâce à ces souris notre deuxième objectif est d’étudier le rôle des pDC intestinales dans trois modèles distincts de maladies inflammatoires de l’intestin. Dans ces modèles l’inflammation intestinale est obtenue suite à l’exposition de l’intestin 1) aux rayons X ou 2) à un produit chimique ou 3) à l’infection par un pathogène intestinal, le Citrobacter rodentium. Ces trois modèles induisent des lésions intestinales par des mécanismes différents. Il est donc possible que selon le modèle étudié la perte des pDC ait un impact différent et, par conséquent, soit associé à des fonctions bénéfiques ou délétères. Connaitre le rôle des pDC dans ces différents modèles de pathologie intestinale va ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients souffrant de maladies inflammatoires de l’intestin, pour lesquelles peu de traitements sont efficaces à ce jour.
Bénéfices attendus
Le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin vise principalement à bloquer les molécules promouvant l’inflammation. Ces molécules sont surtout produites par les cellules du système immunitaire. Cependant, ces mêmes traitements affectent aussi l’efficacité des réponses du système immunitaire face à des pathogènes, rendant les patients plus susceptibles aux infections microbiennes. De plus, certaines cohortes de patients souffrant de MICI sont résistantes à ces traitements, soulignant ainsi la nécessité de trouver d’autres stratégies thérapeutiques plus adaptées. Nos études peuvent ouvrir de nouvelles perspectives de traitements pour promouvoir la guérison et/ou atténuer les symptomes associés au MICI en stimulant ou en inhibant les fonctions des pDC.
Procédures
Traitement antibiotique dans l’eau de boisson modifiant la flore intestinale pendant 14 jours. Irradiation pendant 10 minutes de la partie inférieure du corps sur animaux sous anesthesie générale. L'injection de l'anesthésie est effectuée une fois par voie intrapéritonéale et dure 20 secondes. Une partie des animaux (30) recevront vigiles une seule fois par injection intrapéritonéale un composé, ceci 4 heures avant la mise à mort 4 jours après irradiation. L'injection intrapéritonéale dure 20 secondes. Administration d’un composé dans l’eau de boisson sur animaux vigiles pendant 7 jours. Administration d’une souche bacterienne par gavage unique sur animaux vigiles. Le gavage dure 20 secondes. Gavage unique sur animaux vigiles avec un composé permettant d’étudier la permeabilité intestinale. Le gavage dure 20 secondes. Prélevement de sang sur souris sous anesthesie générale 2 heures après gavage. Le prélèvement de sang est effectué une seule fois et dure 30 secondes.
Impact sur les animaux
Le traitement d’une durée maximale de 2 semaines par cocktail d’antibiotique est généralement bien toléré. Le traitement antibiotique peut impacter la motilité intestinale et provoquer constipation ou diarrhée. Les trois modèles de maladies inflammatoires de l’intestin présentés dans ce projet ont déjà été mis au point dans une équipe de notre institut, ce qui nous permettra de bien maitriser le suivi des souris traitées et limiter le nombre de souris requis pour les mises au point des protocoles. L’exposition aux radiations ionisantes sera restreinte à la partie inférieure du corps avec un dosage qui n'induit pas de perte de poids, de colite ou de diarrhée dans les souris contrôle C57BL/6. Cependant, il est possible que des signes cliniques puissent apparaître dans les souris mutantes. Le traitement avec le DSS induit des lésions et une inflammation de l’intestin, accompagnée d'une perte de poids et de diarrhée pendant une durée de 7 jours. Cela peut induire aussi des saignements et des lésions au niveau anal. La dose de DSS utilisée sera calibrée pour induire une colite modérée chez les souris C57BL/6. Cependant, il est possible que des signes cliniques plus importants ou plus précoces puissent apparaître dans les souris mutantes. En ce qui concerne l’infection par Citrobacter Rodentium, les souris C57BL/6 sont naturellement résistantes à l'infection, donc elles tolèrent l'infection et récuperent en 2-3 semaines sans signes cliniques évidents. La souche de C. rodentium et la dose d’inoculum ont été choisies sur la base de la literature comme étant bien tolerées chez les souris C57BL/6. Cependant, des signes cliniques peuvent apparaître dans les souris mutantes.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement organe et/ou analyse.
Remplacement
Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire et de la réparation tissulaire au cours d’une inflammation produite in vivo. La complexité des nombreuses interactions cellulaires impliquées dans le processus inflammatoire et dans la réparation tissulaire associées aux MICI justifie l’utilisation de modèles d’études in vivo. De plus, la flore intestinale a été montrée comme capable de réguler les fonctions de nombreux organes de l’hôte et leur intercommunication. L’intégration d’un système vivant et complet est donc indispensable pour reproduire l’ensemble de ces processus dans leur complexité.
Réduction
Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits au minimum. Nous utiliserons des souris de fond génétique pur, C57BL/6, ce qui nous permet de limiter la taille des groupes expérimentaux à 5 souris par souche et par condition, en raison d’une variabilité inter-individuelle moindre par rapport aux animaux de fond génétique mixte. Ces nombres ont déjà été validés dans d’une autre équipe de notre institut, qui maitrise les procédures incluses dans ce projet, comme suffisantes pour effectuer des analyses statistiques fiables dans les procédures utilisées.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques et exemptes d’organismes pathogènes spécifiques. La température, l’hygrométrie et la photopériode sont contrôlées et régulées. Chaque animal bénéficiera d’au moins 100 cm2 de surface. Pour limiter le stress des animaux, ils seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Le poids, l’apparence (en particulier du pelage), l’activité, la mobilité des animaux, la consistance des selles avec éventuel saignement et éventuellement la température corporelle seront suivis quotidiennement au début de chaque traitement. Dans le cas d’affaiblissement des souris de la nourriture sous forme de gélée sera mise à l’intérieur de la cage afin d’en faciliter l’accès et la surveillance sera renforcée à deux fois par jour. Les points limites et des grilles de score ont été définis dans chaque procédure. Sur la base de ces points limites un système de scoring de la douleur sera scrupuleusement appliqué pour évaluer les signes de souffrance relatifs à l’expérimentation en cours, et mettre en place le plus précocément les mesures pour les réduire les nuisances et la souffrance des animaux. Les animaux atteignant les critères d’arrêt seront immédiatement euthanasiés.
Choix des espèces
La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Des souris âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées car elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires. Un écart type de maximum 2 semaines au sein d’un même groupe expérimental est défini afin de limiter les variabilités qui pourraient exister entre des souris d’un écart d’âge plus important.
Identification des composés sémiochimiques (odeurs) et des voies neuronales impliqués dans les régulations sociales de la fonction de reproduction chez la brebis – Partie 02
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Maîtriser la saisonnalité de la reproduction des brebis, dont dépendent la disponibilité et le prix du lait et de la viande, est la finalité affichée de ce projet. 120 ovins y sont utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour les 60 mâles et modéré pour les 60 femelles. Les mâles subissent six prélèvements sanguins, les femelles huit, plus deux anesthésies générales, deux intubations, une endoscopie de vingt minutes et des séances d'imagerie d'une heure, avec transport entre deux unités expérimentales. Les mâles retournent ensuite dans leur troupeau d'origine, les brebis sont tuées pour des analyses de biologie moléculaire, le porteur présentant cette recherche sur les odeurs comme une voie "plus responsable et plus éthique" que les traitements hormonaux.
Objectifs
Chez les petits ruminants, la saisonnalité de la reproduction conduit à des variations annuelle de la disponibilité et du prix des produits (lait et viande) sur le marché. La maîtrise de la saisonnalité de la reproduction chez ces animaux est donc un enjeu majeur pour les éleveurs. Depuis les années 1970, les traitements hormonaux sont utilisés pour désaisonner la reproduction et ils restent le seul moyen efficace pour contrôler la reproduction à ce jour. L’utilisation d’hormones dans les élevages est cependant un sujet de préoccupation majeur et un enjeu de santé publique. Dans ce projet nous proposons d’approfondir la compréhension d’un processus biologique naturel qui pourrait apporter une solution aux traitements actuels : l’effet mâle (EM). En effet, chez les ovins, un mâle rendu sexuellement actif via un traitement photopériodique va, via l’émission de molécules odorantes être capable de désaisonner les femelles qui interagissent avec lui. Dans ce projet nous proposons d’identifier les molécules à l’origine de l’EM mais également de mieux comprendre comment le cerveau des femelles intègrent ces signaux pour développer de nouvellesapproches agroécologiques, bassée surl'olfaction qui pourraient être plus responsables et plus éthiques. Ce projet sera réalisé dans deux unités expérimentales différentes.
Bénéfices attendus
Le présent projet vise à étudier les mécanismes biologiques de l'effet Male avec pour but ultime de remplacer les traitements pharmacologiques hormonaux dans les exploitations. Une meilleure compréhension des mécanismes de contrôle de la reproduction chez les ovins est néanmoins indispensable pour tenir cet objectif de remplacement.
Procédures
Six prélèvements sanguins seront réalisés sur les mâles inclus dans cette étude dans EU1. Huit prélèvements sanguins, deux anesthésies générale 2 intubations, une endoscopie et séances d'imagerie seront réalisées sur les femelles inclues dans cette étude dans l'UE2. Les prélèvements sanguins durent quelques secondes et seront suivis d'une récompense. Les anesthésies générales et les intubations durent moins de 1h30. L'endoscopie dure 20 minutes environ et les séances d'imagerie durent environ 1heure.
Impact sur les animaux
Les différentes injections nécessaires pour l'anesthésie générale nécessite une contention légère qui peut induire un stress minime. Les différentes étapes de transport peuvent également engendrer un stress minime pour les animaux. La procédure d'endoscopie peut générée une douleur légère durant quelques heures. La procédure de prélévement sanguin nécessite une contention qui peut induire un stress léger.
Devenir
Les mâles seront réintroduits dans le troupeau d'origine de l'unité expérimentale. Les femelles seront euthanasiées pour les besoins d'étude en biologie moléculaires afin d'affiner notre compréhension du mécanisme.
Remplacement
L'effet mâle est une pratique utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevages. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeu nécessitent, de fait, l'utilisation d'animaux vivants et ne peux être substitué par une approche alternative. Le modèle choisi est le modèle de référence pour étudier effet. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension de ce processus physiologique.
Réduction
Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés et la moitié seront réintroduit au sein du troupeau de l'EU2. S'agissant d'exposition des femelles exposées aux mâles actifs avec une finalité d'analyse en biologie moléculaire, les animaux seront euthanasiés. Pour les besoins de l'analyse statistique, en se basant sur la variabilité intrinsèque des méthodes de quantifications utilisées dans ce projet, 15 animaux par groupe seront nécessaires à l'étude.
Raffinement
Nous raffinerons chaque procédure dans le but de réduire au maximum l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les animaux. Les animaux seront hébergés en groupes lors des procédures afin de réduire le stress au maximum. Aussi, la priorité sera mise sur l'habituation des animaux au maniements et aux différents déplacements nécessaires à l'étude (déplacement pour rejoindre les enclos, déplacement entre les unités expérimentales pour les besoins de l'imagerie). Les habituations seront menées par une mise en contact quotidienne des animaux avec le matériel de transport (petite remorque spécifique pour le transport d'animaux utilisée par le personnel animalier), les animaux seront déplacés à minima par deux, pour éviter la sensation d'isolement pour réduire le stress au maximum et d'obtenir des résultats de qualité. Le comportement (notamment l'isolement du groupe, grincement des dents), l'état clinique des brebis et la prise alimentaire des animaux seront surveillés tout au long de l'expérimentation. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de la prise en charge adéquate avec l'appui d'un avis vétérinaire.
Choix des espèces
L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux vivants et ne peux être substitué par une approche alternative. Le modèle choisi ici, est celui pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique. L'étude nécessite des animaux ayant une fonction de reproduction mature, donc des animaux ayant passé le stade de la puberté.Ainsi les animaux utilisés seront adultes.
Modélisation de la transition psychotique chez le Rat: Recherche des altérations cognitives induite par un stress chronique pendant l’adolescence
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Vingt et un jours de stress chronique pendant l'adolescence, puis une restriction alimentaire à 20 grammes par jour pouvant durer trois mois, attendent 960 rats utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement du cerveau. Quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse s'y ajoutent, espacés d'au moins trois semaines. Le porteur réduit les nuisances attendues à un ralentissement de la prise de poids et à un stress de courte durée lié aux tests, et écrit vouloir "éviter toute souffrance" alors que le protocole consiste précisément à stresser les animaux pendant trois semaines. Il annonce plusieurs tests comportementaux durant de cinq minutes à une heure, sans préciser lesquels.
Objectifs
Les troubles psychotiques sont fréquents. Ils apparaissent généralement à l’adolescence, une période de grands changements, tant sur le plan physiologique, psychologique, que social. Ces troubles ont des conséquences majeures sur la vie personnelle, sociale, et professionnelle des patients et de leur entourage en font un véritable enjeu médical et socioéconomique. Malheureusement les origines de la maladie restent mal connues car plurifactorielle. Son développement résulterait d’une interaction entre gènes et environnement, suggérant qu’il existe une vulnérabilité génétique précipitée par des facteurs environnementaux comme le stress. Des adolescents ou jeunes adultes présentant des symptômes atténués ou très transitoires de psychose ont été identifiés comme des individus à ultra-haut risque de psychose. Deux tiers des sujets à ultra-haut risque ne développeront pas de trouble psychotique. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la sensibilité ou la résilience au stress notamment pendant la période cruciale qu’est l’adolescence pourrait permettre de faire émerger de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce projet, chez le Rat, vise à étudier les conséquences comportementales et plus particulièrement sur la cognition pouvant s’apparenter aux les troubles psychotiques suite à stress chronique à l’adolescence afin d'identifier les mécanismes biologiques et moléculaires impliqués dans cette dernière et la résilience au stress.
Bénéfices attendus
A terme, l’identification des mécanismes biologiques sous-tendant la vulnérabilité au stress pourrait ouvrir la voie au développement de stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les stades précoces des troubles psychotiques.
Procédures
Les animaux pendant l'adolescence subiront sur une période de 21 jours un stress chronique. Ils seront également évalués à 2 périodes de temps dans plusieurs tests comportementaux espacés de 24h au minimum et durant entre 5 minutes et 1h. Chez ses mêmes animaux 4 prélèvements sanguins seront effectués avec au minimum 3 semaines entre chaque prélèvement. Les prélèvements seront réalisés sur une période de 5 minutes sous anesthésie gazeuse générale. Pour une partie des tests cognitifs effectué l’animal sera place en restriction alimentaire (20g de nourriture/jour/rat). Cette restriction se fera sur toute la durée des tests et pourra donc atteindre 3 mois.
Impact sur les animaux
Le stress réalisé pendant l'adolescence va induire un ralentissement de la prise de poids. Les tests comportementaux utilisés peuvent engendrer un stress chez l'animal mais sont de courte durée. Les prélèvements sanguins peuvent entrainer un stress et une douleur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de pouvoir collecter leur cerveau pour des analyses moléculaires.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est une nécessité pour cette étude qui propose une approche comportementale qui n’est possible qu’à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes et une analyse de puissance statistique. De plus, certaines expériences présenteront un aspect longitudinal afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser.
Raffinement
Les rats sont hébergés en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Les soins sont toujours effectués par les mêmes expérimentateurs et animaliers afin de réduire le stress des animaux. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront observés régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur sera soulagé avec des analgésiques. Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie générale avec prise en charge de la douleur pour limiter le stress et la douleur associés à ce geste.
Choix des espèces
Nous avons choisi le rongeur et plus particulièrement le Rat car il présente l’avantage, d’être proche physiologiquement de l’Homme, conférant ainsi aux résultats des recherches une meilleure performance translationnelle. D'ailleurs, le Rat, contrairement aux souris, est plus réceptif aux interactions sociales et présente dans le temps des performances cognitives plus stables. De plus, des résultats préliminaires issus de notre laboratoire ont pu montrer que certains stress pendant l'adolescence pouvaient avoir des répercutions à long terme qui pouvaient varier d'un individu à l'autre, comme chez l'Homme. Les animaux issus de femelles gestantes commandées seront utilisés à partir de 28 jours de vie (adolescence).
Evaluation de molécules sur des modèles murins de cancers de la peau humains pour une meilleure prise en charge thérapeutique de patients en échec de traitement.
- Recherche appliquée
- Cancers
Tuées au plus tard six semaines après la greffe pour que la tumeur soit récupérée et analysée, 3 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de mélanome humain prélevé sur biopsie leur est implanté sous la peau du cou au cours d'une chirurgie de trente à quarante minutes. Une partie d'entre elles reçoit ensuite, huit semaines durant, une injection abdominale quotidienne ou un gavage quotidien cinq jours sur sept, avec irritation possible du tube digestif. La croissance de la tumeur peut provoquer ulcération, changement de respiration, agressivité et mobilité réduite, et la souris est alors tuée dès que le seuil de la grille de score est atteint, seuil que le porteur présente comme une mesure de bien-être.
Objectifs
Le mélanome est un cancer de la peau ayant un mauvais pronostic et une incidence croissante, ce qui en fait un problème majeur de santé publique. De nouvelles thérapies ont permis d’améliorer la prise en charge du mélanome lorsque celui-ci s’est propagé dans d’autres organes, cependant l’inefficacité des molécules thérapeutiques courantes et la toxicité sont des phénomènes très fréquents qui limitent grandement leur bénéfice clinique. Ainsi, l’identification de nouvelles molécules thérapeutiques efficaces reste un enjeu considérable. Notre projet permettra tout d’abord d’avoir à disposition du matériel biologique en quantité suffisante pour réaliser des tests de molécules thérapeutiques sur des prélèvements de tissus dérivés de biopsie de peau de patients atteints de mélanome. Il permettra également de tester de nouvelles combinaisons de thérapie anti-cancer de la peau dans ce modèle de souris.
Bénéfices attendus
L’inefficacité des molécules thérapeutiques courantes est un phénomène très fréquent chez les patients traités par des thérapies ciblées, notamment dans les cancers de la peau et plus spécifiquement dans le mélanome. La découverte de nouvelles pistes thérapeutiques pour ces patients sont des enjeux considérables de nos jours. A terme, ce projet va nous permettre de guider la décision thérapeutique chez les patients atteints de mélanome en échec de traitement.
Procédures
La mise en place de ces différents modèles consiste dans un premier temps à implanter un bout de tumeur de peau humaine sous la peau au niveau du cou de la souris. Cette chirurgie se fait sous anesthésie générale et dure environ 30 à 40 minutes. Les souris sont ensuite surveillées sur une cage maintenue à 37°C jusqu’à leur réveil (15 minutes). Une injection sous la peau du flanc d’un anti-douleur sera réalisée afin de limiter la douleur de la souris pendant 72h post-opératoire. Les souris seront euthanasiées au bout de 6 semaines maximum afin de récupérer la tumeur. Pour l’autre partie du projet, nous testerons in vivo (sur un animal vivant entier) la meilleure réponse à une combinaison observée ex vivo (sur des fragments de tumeurs). Pour cela des souris ayant subi les mêmes interventions que décrites précédemment recevront une injection quotidienne (5 jours par semaine) dans l’abdomen ou un gavage une fois par jour (à l’aide d’une sonde de gavage) d’un ou plusieurs inhibiteurs de protéines impliquées dans le développement du mélanome (durée : 30s, sur souris éveillées) pendant 8 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Suite à la croissance des tumeurs et/ou au développement de métastases, une perte de poids peut être observée. Un développement trop important de la tumeur peut également induire une ulcération, un changement de la respiration ou encore une agressivité. Une réouverture de la zone d’implantation de la tumeur ainsi qu’une infection, inflammation ou irritation peuvent être observées. Les souris peuvent présenter une mobilité réduite si la tumeur atteint une taille trop importante. Enfin, la thérapie médicamenteuse peut se révéler légèrement toxique, ce qui se manifestera par une perte de poids principalement ou un gonflement de l’abdomen. Certains traitements étant administrés par gavage (1 fois par jour, 5 jours/7), une irritation du tube digestif est possible.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales afin de collecter la tumeur qui sera analysée et conservée afin de caractériser au niveau cellulaire l’effet de la thérapie
Remplacement
Nous réalisons au maximum des expériences en utilisant des fragments de tumeurs in vitro (sans utilisation d’animaux) qui permettent de déterminer les meilleures combinaisons thérapeutiques. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles animaux vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de nos résultats in vitro sans utiliser un modèle animal entier vivant.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. De plus, les cellules cancéreuses dont le nombre a été augmenté dans la première partie du projet sont utilisées pour trouver in vitro (sans utilisation d'animaux) les traitements les plus efficaces, permettant ainsi de réduire le nombre de groupes de souris utilisées dans la seconde étape du projet.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte la taille de la tumeur, l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. La tumeur sera mesurée deux fois par semaine afin d’anticiper une potentielle souffrance. En cas de signe de douleur (expression faciale, posture voutée, perte de poids importante) et de tumeur d’une taille importante (définie dans la grille de score) avec ou sans ulcération, la souris sera immédiatement euthanasiée selon une méthode réglementaire.
Choix des espèces
Les modèles de greffe de tumeurs humaines sur des souris sont bien décrits dans la littérature scientifique et sont pertinents pour l’étude de l’effet de thérapies sur la croissance de ces tumeurs humaines. Le mélanome étant un cancer qui se développe chez l’adulte, ainsi des souris adultes âgées de 5 semaines, âge permettant une prise de greffe efficace seront utilisées dans ce projet.
Rôle des astrocytes dans les interactions sociales en physiologie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une craniotomie, l'injection d'un virus dans le cerveau et deux heures trente de chirurgie pour poser un dispositif d'imagerie attendent une partie des 2 210 souris de ce projet, toutes tuées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. S'y ajoutent des injections abdominales trois à cinq jours de suite, puis des tests d'anxiété et de locomotion, de mémoire sur trois jours, de préférence sociale, de sociabilité face à une femelle puis à un mâle, et de dominance dans un tunnel traversé cinq fois par jour. L'objet déclaré est le rôle des astrocytes et de l'ocytocine dans les interactions sociales, avec pour horizon lointain des traitements de l'autisme. Le porteur indique que le dispositif d'imagerie pèse 2 grammes, soit environ 10 % du poids d'une souris, et que les tests comportementaux pourraient augmenter l'anxiété des animaux dont il mesure précisément la sociabilité.
Objectifs
Les astrocytes sont des cellules du cerveau qui jouent un rôle important en aidant les neurones à communiquer efficacement. Cette communication est essentielle pour les pensées, les émotions et les comportements. Ce projet vise à mieux comprendre comment ces cellules influencent les interactions sociales, en étudiant l’effet de l’ocytocine, une hormone qui favorise les liens sociaux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines molécules et signaux dans le cerveau, en particulier ceux liés à l’ocytocine et au calcium, influencent les interactions sociales. À long terme, cette recherche pourrait conduire à de nouveaux traitements pour des troubles comme l’autisme, en agissant sur ces signaux pour améliorer la sociabilité.
Procédures
Injection dans la cavite abdominale (environ 5 minutes, une fois par jours 3 à 5 jours de suite par souris) Injection intracerebrale (environ 30 minutes, une seule fois par souris) Chirurgie pour utiliser le dispositif (environ 2h30, une fois par souris) Tests comportement anxiété/locomotion (10 min, une fois par souris) Test comportement mémoire (10 min le premier jour, 20 min le deuxième jour, 10 min le troisième jour, une seul fois par souris), Test de préférence sociale (3 x 10 minutes, une fois par souris), Test comportement de sociabilité directe (10 minute le premier jour face à une femelle, 10 minutes le deuxième jour face à un male), Test de dominance (la souris traverse le tunnel 5x pendant 3 jours pendant l'entrainement puis test pendant 10 minutes maximum)
Impact sur les animaux
L’injection dans la cavité abdominale peut induire une douleur et un stress légers à la piqure et une irritation abdominale en lien avec le produit injecté. La craniotomie réalisée pour l'injection de virus et/ou l'implantation peut générer des douleurs. Le dispositif utilisé pour l'imagerie pèse 2g ce qui représente environ 10% du poids de la souris et pourrait causer des nuisances. Les tests comportementaux réalisés pourraient induire une augmentation de l'anxiété.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir prélever leur cerveau pour des études en histologie ou biochimie.
Remplacement
Le but majeur du projet est d'étudier le rôle des interactions neurogliales dans les interactions sociales, qui nécessité une approche in vivo sur modèle animal. Il n'existe pas encore de modèles mathématique ou in silico alternatifs permettant l'étude de comportements. De plus, les interactions sociales sont des processus multidimensionnels qui ne peuvent pas être récapitulée sur des lignée cellulaires humaines ou animales ou tout autre modele in vitro, cellulaire ou subcellulaire.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons le même animal lorsque cela est possible pour analyser les effets au niveau de nos deux régions d'intérêts. Nous estimons qu’une quinzaine de souris est nécessaire lors des expériences de test comportementaux pour obtenir des résultats suffisamment fiables pouvant être testés à l’aide d’un test statistiques. Cependant, compte tenu de possibles aléas liés à l’injection du virus , nous ajoutons 5 souris supplémentaires soit un maximum de 20 groupes par groupe testé. Pour les expériences de séquençage et de caractérisation microscopique et biochimique, une quinzaine de souris est nécessaire pour être testés à l’aide d’un test statistiques.
Raffinement
Les animaux ayant reçus un acte chirurgical seront placés sous surveillance jusqu’au réveil des animaux. Puis, les animaux sont replacés dans leur cage d’origine (avec leur congénères) et seront sous une surveillance renforcée. Les points limites sont définis par des changements dans l'aspect physique/comportement ou si des blessures sont constatées. Les animaux seront euthanasiés si leur bien-être est compromis. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant les 5 jours qui suivent la chirurgie. De plus, nous utiliserons la grille d'évaluation du bien-être animal validée par le comité éthique pour suivre quotidiennement les animaux. En cas de douleurs ou de souffrances observés à la suite des chirurgies, nous injecterons un antalgique en sous-cutanée. Avant le premier test de comportement, nous procéderons à une habituation des souris à l'expérimentateur en réalisant une habituation pendant 3 jours consécutifs. Pour les tests d'imagerie endoscopique, les animaux seront habitué pendant 5 jours consécutifs à porter le miniscope sur leur tête pendant 10 minutes.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus répandue dans les laboratoires de Neurosciences aujourd’hui et toutes les lignées transgéniques utilisées ici se basent sur cette espèce. Elle permettra une meilleure reproductibilité des résultats et une meilleure comparaison avec ceux publiés dans la littérature. De plus, ce modèle permet d’étudier les interactions neurones-astrocytes in vivo dans des aspects comportementaux complexes. Dans le but d’étudier les propriétés neuronales et astrocytaires et leurs interactions, les expériences seront réalisées chez la souris adulte (2-5 mois). Contrairement aux jeunes souris en phase de croissance ou aux souris âgées, les adultes ont une certaine stabilité hormonale et comportementale, ce qui peut réduire la variabilité expérimentale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées chez des souris âgées de 1 à 5 mois et les études de comportements seront réalisées au moins 3 semaines après injections stéréotaxiques.
Effet d’un nouvel anti-inflammatoire sur la circulation sanguine et le pronostic neurologique dans un modèle d’arrêt cardiaque chez le cochon EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
26 cochons adultes de 50 kilos vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant un arrêt cardiaque provoqué puis quinze minutes de réanimation. Une stimulation du ventricule droit déclenche la fibrillation, l'animal reste anesthésié quatre heures, puis il est réveillé et surveillé vingt-quatre heures avant d'être tué pour prélèvement d'organes. Le massage cardiaque mécanique peut provoquer des lésions internes douloureuses au réveil, et la procédure impose une hypoxie globale et un stress métabolique pendant ces vingt-quatre heures. Les retombées annoncées se limitent à mieux comprendre l'instabilité circulatoire et les lésions cérébrales qui suivent un arrêt cardiaque, quand l'atteinte infligée aux cochons, elle, est immédiate.
Objectifs
L'arrêt cardiaque correspond à l'arrêt brutal de la circulation sanguine et de la respiration. En Europe, seulement 11,7 % des personnes victimes d'un arrêt cardiaque en dehors de l'hôpital survivent. Cependant, à peine 7 % d'entre elles retrouvent un bon état neurologique, c'est-à-dire sans séquelles importantes. Au fil des années, les progrès scientifiques et technologiques ont permis d'améliorer les chances de survie. Par exemple, le massage cardiaque effectué rapidement par un témoin et l'utilisation précoce de défibrillateurs semi-automatiques ont considérablement augmenté les chances de survie. De nombreux facteurs influencent le pronostic, (temps écoulé avant le début des massages, problème de ventilation, ...) et ne permettent pas toujours de prédire avec précision l'évolution pour chaque patient. C'est pourquoi une étude comparative est essentielle pour mieux comprendre et améliorer les traitements actuels , en particulier pour étudier un nouvel anti-inflammatoire utile en urgence. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs différent (noté EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Ce projet étudie les effets d'un nouveau médicament sur l'inflammation et les dommages au cerveau causés par un manque temporaire de circulation sanguine. Ces connaissances aideront à mieux comprendre pourquoi la circulation sanguine devient instable et comment des lésions cérébrales peuvent se produire après un arrêt cardiaque.
Procédures
Les animaux auront tout d'abord une injection d'un calmant afin de réduire le stress dû à la manipulation (durée 2 minutes) dans l'EU1 puis une perfusion intraveineuse sera posée afin de permettre une anesthésie générale (2minutes). A partir de ce moment, les animaux seront sous anesthésie profonde et subiront un arrêt cardiaque puis une réanimation qui durera 15 minutes (opérations dans l'EU2). Ils resteront anesthésiés pendant 4h après l'arrêt cardiaque avant d'être réveillés et surveillés pendant 24h (retour dans l'EU1). Après 24h, Ils recevront une nouvelle injection de calmant et une nouvelle anesthésie avant mise à mort pour réaliser les prélèvements terminaux.
Impact sur les animaux
Nuisances : douleur due à l'injection de la prémédication en intra-musculaire (20 secondes) ; Risques inhérents à la procédure : Induction d'une fibrillation ventriculaire par stimulation dans le ventricule droit provoquant un arrêt cardiaque, une hypoxie globale et un stress métabolique chez l’animal (24h). La procédure implique un massage cardiaque mécanique qui peut engendrer des lésions physiques internes, douloureuses au réveil de l'animal (24h).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour prélèvements d'organes en vue de l'étude des tissus.
Remplacement
L'arrêt cardiaque et la réanimation cardio-pulmonaire touchent plusieurs systèmes du corps en même temps : le cœur, le cerveau, les vaisseaux sanguins et le système immunitaire. Ces interactions complexes ne peuvent pas être entièrement reproduites en laboratoire ou avec des modèles informatiques. Les expériences sur des cellules isolées aident à comprendre certains mécanismes mais elles ne reflètent pas le fonctionnement global d’un corps vivant, où circulent le sang, les hormones et les réponses immunitaires. Les simulations informatiques, basées sur des données existantes, ne peuvent pas prédire avec précision les réactions complexes d’un organisme entier à des traitements comme ce nouvel anti-inflammatoire.
Réduction
Le modèle est déjà en place dans notre structure permettant de réduire le nombre d’animaux à étudier, personnel formé à l’étude et à la manipulation du modèle porcin. Le nombre d'animaux a été déterminé grâce à un test de puissance statistique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en petits groupes pour réduire leur stress et leur angoisse. Leur environnement est aménagé avec des jouets (balles, cordes) pour les stimuler et favoriser leur bien-être. Avant le début de l'expérience, ils ont une période d'acclimatation d'au moins sept jours pour s'habituer à leur nouveau cadre de vie et réduire le stress. Avant l'intervention, on leur donne des médicaments pour les détendre et pour soulager la douleur afin de les manipuler sans qu'ils aient peur ou soient soumis à des traitements douloureux. Durant l'expérience, les animaux sont sous anesthésie et analgésie profonde, et leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, respiratoire, pression artérielle) sont surveillés en continu. Si un signe de douleur ou de réveil apparaît, les médicaments sont ajustés immédiatement pour garantir leur confort. Après l'intervention, les animaux sont placés en salle de réveil où ils sont surveillés de manière continue. Leur état et leur paramètres vitaux sont suivis de près pour détecter rapidement toute anomalie ou signe de détresse. Des points limites à chaque étape du protocole ont été établis.
Choix des espèces
Le choix du porc comme modèle animal et le stade préclinique de cette étude sont justifiés par la nécessité de simuler avec précision les conditions humaines d’un arrêt cardiaque et d’une réanimation afin d’évaluer l’impact d’un traitement. Cette démarche est essentielle pour faire progresser la recherche médicale, améliorer les traitements et garantir la sécurité des thérapies avant leur application clinique. Un animal adulte de 50kg a été choisi afin de pouvoir réaliser une réanimation cardio-pulmonaire permettant de reproduire la prise en charge d'un patient adulte à l'hôpital.
Étude sur la caractérisation des miRNA circulants associés à l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Génétiquement hémophiles, 32 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une ponction du genou droit sous anesthésie pour provoquer un saignement articulaire, geste douloureux qui peut entraîner boiterie et gêne locomotrice. L'objectif déclaré est de repérer dans le sang des micro-ARN servant de marqueurs précoces de la dégradation du cartilage et de l'os, deux de ces marqueurs ayant déjà été validés chez des patients hémophiles. Le porteur précise que la souris hémophile, contrairement aux malades humains, ne saigne jamais spontanément et ne saigne que si on la blesse, et justifie la mise à mort par la "nécessité" de prélever tout le sang de l'animal.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques où la forme sévère est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Les saignements articulaires répétés, peuvent conduire à une atteinte articulaire handicapante appelée arthropathie hémophilique. Il s’agit d’une complication grave, de la maladie. La présence anormale du sang dans la cavité articulaire conduit à une inflammation et à terme à la destruction progressive de l’articulation. Actuellement, le diagnostic d’une dégradation du cartilage et de l’os se fait par l’examen clinique, la radiographie, l’échographie et l’IRM. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de détecter à un stade assez précoce de l’arthropathie. Les biomarqueurs représentent des candidats pour le diagnostic précoce. Les micro-ARN circulants sont présents dans de nombreux fluides, notamment le sang. Ils sont stables et résistants aux analyses et représentent déjà de bons candidats comme biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic d’autres pathologies comme la polyarthrite rhumatoïde. Il existe des similitudes physiopathologiques commune entre la polyarthrite rhumatoïde et l’arthropathie hémophilique dont l’inflammation articulaire et la destruction du cartilage et de l’os. En amont, une étude clinique précoce réalisée par notre équipe a identifié et validé deux micro-ARN circulants comme biomarqueurs de l’arthropathie hémophilique chez les patients hémophiles ayant des lésions avancées d’arthropathie. Nous cherchons à identifier des marqueurs globaux de l’atteinte du cartilage et de l’os pour à terme proposer la détection de certains biomarqueurs permettant le diagnostic de l’arthropathie hémophilique à un stade le plus précoce. Nous avons fait l’hypothèse que l’identification de biomarqueurs précoce de l’arthropathie hémophilique permettrait la mise en place d’un nouvel outil de diagnostics simple et rapide, réalisé lors de bilan sanguin. L’objectif de ce projet est d’identifier des biomarqueurs pour un diagnostic précoce de l’arthropathie hémophilique. Afin de détecter le plus tôt possible la mise en place d’une synovite et ainsi bloquer l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B sévères et à terme chez les patients.
Bénéfices attendus
La comparaison entre les différents stades d’atteinte de l’arthropathie nous permet de cibler les microARN d’intérêts pour le diagnostic de l’arthropathie hémophilique à un stade précoce. La conservation inter-espèce de ces biomarqueurs nous permet également de proposer une étude clinique afin d’évaluer l’efficacité des micro-ARN comme outil de diagnostic clinique chez l’Homme.
Procédures
Les souris subissent une ponction du genou droit sous antalgie et anesthésie générale (2-3 minutes) pour simuler l’arthropathie hémophilique et l’évaluation de l’atteinte ostéochondrale. Le dernier jour, les souris sont mises à mort sous antalgie et anesthésie générale par prélèvement sanguin (5 minutes).
Impact sur les animaux
Le phénotype des animaux comporte une vulnérabilité du point de vue de la coagulation, avec risque de saignement prolongé en cas de blessure mais pas de saignement spontané comme dans la forme humaine de la maladie Les ponctions du genou engendrent une douleur. L’arthropathie induite par la ponction peut occasionner une gène locomotrice, une démarche anormale ou boiterie ainsi qu’une légère douleur lors des déplacements et redressements de l’animal sur ses pattes arrières.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement tout le sang, non compatible avec le maintien en vie de l'animal.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Dans cette étude, chaque souris constitue son propre contrôle pour les mesures biologiques et histologiques, réduisant le nombre de souris et participant à la robustesse de l’étude d’un point de vue statistique.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal dont l'application des points limites stricts et spécifiques du projet. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges. En cas d’apparition de problème locomoteur (boiterie ou difficulté à la station debout), de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage sont mis à disposition dans la cage. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Effet d’un composé en développement sur les fonctions musculaires chez un modèle de myopathie de Duchenne chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Pour évaluer un composé développé par un client industriel contre les atteintes musculaires de la myopathie de Duchenne, 57 souris mâles porteuses d'une mutation spontanée vont être utilisées. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et tous les animaux sont tués pour le prélèvement des muscles des pattes, du cœur et du diaphragme. Chaque souris passe vingt-neuf pesées, quatre mesures de composition corporelle, deux mesures de force musculaire sous anesthésie, un rotarod, un grip test, un hanging test, deux tests d'endurance, une mesure de pression artérielle, cinq prises de sang et quarante-huit heures de mesure de l'activité spontanée. Le porteur reconnaît que la souris mdx ne présente ni espérance de vie réduite ni activité spontanée diminuée, contrairement aux patients, et qualifie l'étape in vivo d'incontournable pour le dossier réglementaire ouvrant les premiers essais chez l'humain.
Objectifs
La myopathie de Duchenne est une maladie d'origine génétique induisant une dégénérescence progressive de l’ensemble des muscles de l’organisme. Elle est liée à une anomalie positionnée sur le chromosome X, responsable dans la perte de fonctionnalité des fibres musculaires. Chez les patients atteints de cette maladie, qui sont à plus de 99% des hommes, les fibres qui constituent les muscles squelettiques et cardiaque se détériorent à chaque contraction et finissent par se détruire. Des cellules souches musculaires tentent de régénérer le tissu lésé, mais ce processus est vite débordé et la dégénérescence finit par l’emporter. Les patients atteints de la maladie de Duchenne présentent ainsi une espérance de vie très réduite, de l'ordre de 25 ans, du fait notamment de complications cardiaques et respiratoires. La recherche est ainsi très active concernant cette maladie et plusieurs pistes visant à mise au point d’un traitement curatif sont actuellement à l’étude. Néanmoins, à aujourd'hui, il n'existe aucun traitement curatif sur le marché. Le présent projet vise à étudier les effets d'un composé X en développement sur les symptômes musculaires liés à la myopathie de Duchenne. Le modèle employé est un modèle de souris qui possède une mutation génétique spontanée et qui présente des symptômes proches de la maladie de Duchenne chez l'humain, bien qu'ils soient beaucoup moins prononcés. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament (Composé X) sur les capacités musculaires du modèle de maladie de Duchenne.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé visant à traiter les conséquences musculaires de la maladie de Duchenne chez l'humain. Alors que plusieurs molécules ont été testées ces vingt dernières années, il n'existe toujours aucun médicament permettant d'améliorer ou de traiter la maladie de Duchenne. Il s'agit donc une pathologie présentant un besoin médical très important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de la maladie de Duchenne.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (29 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Analyse non invasive de composition corporelle (4 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 3) Mesures in vivo de la force musculaire sous anesthésie avec réveil (2 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 20 minutes); 4) Mesures de la locomotion par Rotarod (1 mesure; Durée de la mesure : 10 minutes); 5) Mesure de la force de préhension des pattes avant par grip test (1 mesure, durée de la mesure 5 minutes); 5) Mesure de la force de préhension des 4 membres par hanging test (1 mesure; Durée de la mesure: 3 minutes); 6) Tests d'endurance (2 tests, Durée de la mesure : 45 min); 7) Mesures de pression arterielle (1 mesure; Durée de la mesure: 15 minutes); 8) Prélèvements sanguins (5 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de l'activité spontanée totale et de dépenses énergétiques (1 session de mesures de 48h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les tests de mesure de composition corporelle et de pression artèrielle pourront être source de stress du fait de la manipulation et d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les tests d'activité locomotrice pourront également être source de stress. Les mesures de force musculaire in vivo nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Enfin, les prélèvements sanguin pouront être source de douleur légères. Enfin, bien que considéré comme un modèle de maladie de Duchenne d'intérêt, la souris mdx présente un phénotype bien plus léger que l'humain. Ainsi, bien que présentant une moindre force musculaire que les souris sauvages malgré une hypertrophie musculaire, les souris mdx ne présentent pas de réduction de leur espérance de vie, ni de différence dans l'activité spontanée, à la différence de l'humain. En effet, les défauts musculaires des souris mdx n'apparaissent que lors de tests impliquant un effort assez soutenu. Le phénotype de ces souris mdx n'est ainsi pas dommageable.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les muscles des pattes, le coeur et le diaphragme pour des analyses fonctionnelles (mesures de force musculaire ex-vivo), histologiques et pour comptage des mitochondries.
Remplacement
Le programme global dans lequel s'insère le présent projet implique un industriel pharmaceutique qui développe un composé d'intérêt dans le domaine de la Myopathie de Duchenne et deux Sociétés de Recherche sous contrat, l'une in vitro et l'autre in vivo. L'objectif du projet est de permettre de mener le développement du composé X au stade clinique. La première phase d'étude sera réalisée in vitro par le partenaire suédois. Le présent projet in vivo ne sera mené qu'uniquement en cas de résultats convainquants sur les modèles in vitro. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de tester, dans un second temps, le composé sur organisme entier afin de vérifier que les effets observés sur système in vitro se traduisent effectivement en un bénéfice dans le cadre de la pathologie. Par ailleurs, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre de 15 animaux par groupes utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés en tenant compte de l'hétérogénéité du modèle de souris utilisé. Le groupe contrôle du modèle, constitué de souris sauvages, a été réduit à 12 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu que la maladie de Duchenne touche à 99,5% des garçons, l'étude sera limitée au seul genre mâle.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés via la nourriture. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2/3 souris par cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs (50μL de sang par prélèvement) et une crème à base de lidocaïne sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
La modèle de souris que nous avons sélectionné pour le présent projet est un modèle classiquement utilisé pour étudier la Myopathie de Duchenne et pour tester des candidats médicaments au stade préclinique visant à traiter cette pathologie. Le modèle récapitule de nombreux symptômes de la pathologie, tout en n'exhibant qu'une forme légère de la maladie comparativement à l'humain (espérance de vie non réduite et locomotion non affectée par la mutation). Les souris seront reçues à 5 semaines d'âge. Cet âge a été déterminé en fonction de la cinétique des défaut musculaires observés chez le modèle de souris employé. En effet, à partir de 12 semaines, ces souris commencent à présenter un développement musculaire exagéré par hyperactivation des cellules souches du muscle. Bien que la force musculaire des souris pathologiques reste inférieure à celle des souris sauvages à tout âge, et compte tenu de la durée du traitement, nous souhaitons que les souris ne présentent pas une hypertrophie musculaire trop marquée en fin d'étude.
Validation de molécules anti diabétique par voie orale chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Gavage quotidien pendant jusqu'à 84 jours, jusqu'à 84 mesures de glycémie par piqûre du bout de la queue, jusqu'à 84 injections d'insuline et jusqu'à 14 prélèvements sanguins : 690 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le diabète leur est provoqué par une injection pharmacologique, et tous sont tués en fin d'étude après un prélèvement de sang total sous anesthésie. Le porteur liste parmi les effets attendus l'infection et la nécrose de l'extrémité de la queue, liées à la répétition quotidienne des mesures de glycémie et des prises de sang. Les molécules antidiabétiques orales évaluées ne sont désignées que comme des molécules d'intérêt, sans indication de leur nature ni du nombre de composés testés.
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique grave qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (hormone hypoglycémiante), ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit. De nombreux traitement des patients diabétiques consistent en des injections par voie sous-cutanée, douloureuses et inconfortables (Insuline etc…). Ces traitements sont la plupart du temps combiné à des traitements oraux tel que la metformine afin d’avoir des résultats plus ou moins efficace selon les patients. Enfin ces traitements actuels sont souvent associés à des effets secondaires indésirable. L’objectif du projet est de développer et valider de nouvelles molécules orales pour le traitement du diabète. Le projet se déroulera pour chaque molécule d’intérêt en 2 phases : - Validation de la biodisponibilité de nos molécules d’intérêt sur un modèle de rat sain - Si nous validons la biodisponibilité de nos molécules d’intérêt, une étude de bio efficacité serra réalisé sur un modèle de rat diabétique.
Bénéfices attendus
Les médicaments oraux sont souvent perçus comme plus pratiques et moins contraignants à prendre que les injections. Cela améliore ainsi la compliance des patients ce qui est un point fondamentale pour une prise en charge efficace et optimale du patient vivant avec un diabète. De plus, les médicaments oraux sont plus faciles à stocker, à transporter et à administrer dans de nombreux contextes, y compris dans des environnements ruraux ou éloignés où l'accès à des soins médicaux spécialisés peut être limité. Enfin, l’un des bénéfices important que le projet apportera sera la découverte de nouvelles molécules efficaces présentant peu ou pas d’effet secondaire chez le patient atteint de diabète.
Procédures
Le diabète sera induit par injection pharmacologique réalisée sur animal vigile (1 injection/animal, durée une minute). Des molécules seront administrés aux rats (sains ou diabétiques) par voie orale (gavage 1 fois par jour sur maximum 84 jours, acte de 30 secondes par rat).Tout au long de l’étude, la glycémie sera mesurée sur animal vigile à l’aide d’un glucomètre à l'aide d'une micro goutte de sang obtenue par piqûre de l'extrémité de la queue (durée de quelques secondes) afin d’évaluer l’efficacité de nos molécules (84 fois/animal maximum). De plus, les animaux diabétiques recevront au maximum 84 injections d’insulines si la glycémie reste élevée après traitement (durée quelques secondes). Enfin, afin d’évaluer l’efficacité de notre traitement, au maximum 14 prélèvements sanguins seront réalisées par animal sur l’ensemble de l’étude (1 minute par prélèvement). En fin de procédure, le sang totale des rats sera prélevé sous anesthésie, analgésie profonde.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sont : • Peur de courte durée en lien avec le gavage quotidien et les prises de sang au cours du suivi. • Douleur légère de courte durée de l’incision de la pointe de la queue pour le prélèvement sanguin. • Détérioration (infection ; nécrose) de l’extrémité de la queue en lien avec les mesures glycémiques quotidienne et les prises de sang • Saignement post incision de la queue • Douleur légère de courte durée en lien avec l’injection d'une molécule induisant le diabète • Perte de poids en lien avec l’induction du diabète • Hyperglycémie en lien avec le développement du diabète au cours de l’étude • Répétition des interventions durant toute la durée de l’étude (mesure de glycémie, gavage, prise de sang).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.
Remplacement
Nous souhaitons évaluer l’efficacité de nos traitement oraux dans le cadre du diabète. Or, Il est largement démontré aujourd’hui que la régulation glycémique et la physiopathologie du diabète font intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, pour valider l’efficacité de notre traitement anti diabétique, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à les cellule insuline isolée, mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent (pancréas, foie muscle….). Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Le nombre d’animaux total nécessaire pour obtenir des résultats statistiques a été déterminé en utilisant un logiciel adapté. De plus, que ce soit avant les tests sur l’animal (étude in vitro de toxicité…) et après l’étude de bio disponibilité (PE1), le nombre de groupes (et donc le nombre total d’animaux) sera réévalué afin de ne tester que les concentrations présentant un intérêt thérapeutique. Par conséquent au maximum cette étude nécessitera 690 rats. Enfin, la réalisation de ces procédures par du personnel formé et habitué à ces manipulations, et la standardisation du protocole, garantiront une bonne reproductibilité et une réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Afin de réduire au maximum le stress, les rats seront maintenus en groupe sociaux tout en respectant la règlementation en vigueur concernant le nombre de rat par cage. Le raffinement intervient également au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Afin de limiter au maximum le stress lors du suivi, une habituation à la manipulation et au gavage est réalisée 2x/semaine pendant la période de quarantaine. Le bien-être des animaux sera pris en compte durant l’ensemble de l’étude avec un suivi journalier de ceux-ci avec une surveillance accrue après administration oral de nos molécules. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés voir la mise à mort en cas d’atteinte de points limites. Les animaux diabétiques recevront une insulinothérapie en fonction de leur glycémie. Les posologies appliquées seront celles couramment utilisée au laboratoire et validée par notre vétérinaire référent. Le cas échant, la cétonémie sera mesurée afin d’ajuster les doses d’insuline à injecter. Enfin, les prélèvements terminaux sont réalisés sous anesthésie et analgésie profonde.
Choix des espèces
Le rat est la principale espèce utilisée dans les études sur le diabète car les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme. De plus, notre laboratoire possède une grande expertise sur la sensibilité à la molécule induisant le diabète chez le rat, du pourcentage de réussite d’induction du diabète et son suivi. Enfin, le volume de sang pouvant être récolté nous permet de réaliser l’ensemble de nos dosages biologiques/biochimiques. Les rats pour cette étude seront âgés de 8 semaines, coïncidant avec un poids d'environ 200g. C’est à ce poids que le protocole d’induction du diabète présente le meilleur taux de succès avec un risque de mortalité faible.
Etude du rôle d’une nouvelle protéine importante pour le maintien de l’homéostasie rénale chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Jusqu'à huit séjours de six heures en cage métabolique individuelle pour recueillir les urines, une injection rétro-orbitaire par jour pendant trois jours et une injection intrapéritonéale par jour pendant dix jours : 1 000 souris vont être utilisées dans ce projet sur les maladies rénales chroniques. 672 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 328 un niveau léger, toutes étant tuées pour le prélèvement des reins. Le porteur reconnaît que les signes de mal-être liés à l'insuffisance rénale provoquée par les traitements sont difficiles à détecter autrement que par une altération du comportement et la présence de sang dans les urines. L'effectif de 1 000 souris est présenté comme le produit d'un plan expérimental donnant la puissance statistique voulue, sans qu'aucun chiffre intermédiaire ne vienne l'étayer.
Objectifs
Les maladies rénales chroniques représentent un véritable enjeu de santé publique. Tout particulièrement, les glomérules ont une importance capitale car ils représentent le siège de la filtration du plasma sanguin. Les options thérapeutiques restent limitées, et aucune stratégie thérapeutique n’a été approuvée pour les principales causes de ces maladies. L’objectif principal de ce projet est donc d’identifier le rôle d'une protéine que nous avons récemment identifié dans le développement et progression de certaines formes sévères de maladie rénales chroniques.
Bénéfices attendus
A terme, ces travaux permettront une meilleure compréhension du rôle de cette nouvelle protéine dans le contexte des maladies rénales. Il est essentiel de mieux comprendre le rôle physiopathologique de molécules d’intérêt pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées pour les maladies rénales sévères.
Procédures
Un prélèvement d'un morceau de queue
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension, douleur de courte durée lors de la biopsie de queue pour le génotypage (< 2mm), douleur de courte durée au point d’injection et stress lié aux cages métaboliques. Les signes de mal-être résultant de l'insuffisance rénale provoquée par les traitements sont difficiles à détecter autrement que par l'altération du comportement et l'hématurie.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les reins.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour identifier les mécanismes physiopathologiques des maladies rénales incluant les cultures cellulaires (in vitro). Cependant, les expériences in vitro ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu dans le développement de l’insuffisance rénale chronique. La culture cellulaire ne peut pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours des maladies rénales glomérulaires comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire. Il n'existe pas de modèle de remplacement in vitro ou in silico à l'heure actuelle pour ces raisons. Nous travaillons néanmoins au développement de nouveaux modèles d'organe sur puce qui permettront à l'avenir de remplacer partiellement le recours aux animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Nous optimisons l'utilisation des organes pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les accouplements sont optimisés pour permettre d'obtenir les animaux d'intérêt avec le meilleur rendement possible. Les lignées sont cryoconservées lorsque le recours aux animaux n'est plus nécesssaire afin d'éviter les élevages inutiles.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal- être. Une grille de score de souffrance et des points limites spécifiques au projet ont été́ établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3. Des litières doubles sont utilisées dans les cages contenant des animaux diabétiques pour limiter le nombre de changes. Des biberons de 300mL sont mis dans les cages d'animaux diabétiques pour s'assurer qu'ils ne manquent pas d'eau. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifères en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes pour l'étude des lésions rénales car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les animaux sont utilisés de la naissance à l’âge adulte car nous avons un élevage mais seuls les adultes agés de plus de 8 semaines (arrivés à leur maturité sexuelle et donc fin de leur développement) sont utilisés pour les modèles expérimentaux de maladies rénales.