Procédures modérées
Suivi de l’activité cérébrale pendant le comportement social et cognitif chez la souris
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Pour former des doctorants et de jeunes chercheurs aux techniques d'enregistrement de l'activité neuronale, 36 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie cérébrale d'une heure trente, avec injection de vecteurs viraux et pose d'un implant dans le cortex préfrontal, avant d'être soumise à quatre passages de dix minutes dans des tâches de mémoire. Le porteur nomme ces tâches, dont un apprentissage fondé sur l'évitement d'un morceau de scotch adhésif, susceptible selon lui de provoquer stress et anxiété. Chaque étudiant travaille sur un seul animal, et les points limites annoncés pour chaque procédure ne sont pas détaillés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de former des étudiants en thèse et de jeunes chercheurs post-doctorant français mais également d’universités étrangères partenaires. Cette formation se déroulera dans le cadre d’une école thématique visant à former les jeunes chercheurs sélectionnés aux techniques de suivi de l’activité neuronale au cours d’une tache comportementale chez la souris. Étudier l'activité neuronale chez l’animal libre de ses mouvements et effectuant une tache comportementale est essentiel pour comprendre comment les différents types de mémoire fonctionnent. En observant comment l'activité évolue pendant le comportement, nous pouvons identifier les mécanismes qui permettent au cerveau de retenir, de traiter et d'utiliser des informations, notamment dans des situations sociales ou lorsqu'il faut prendre des décisions. Cette approche est fondamentale dans la recherche en neurosciences afin de mieux comprendre certains troubles cognitifs et psychiatriques, comme la schizophrénie, l'autisme ou les troubles de l'attention, où la mémoire de travail et la mémoire sociale sont souvent touchées.
Bénéfices attendus
Cette école offrira aux étudiants un cadre unique pour approfondir leurs compétences en neurosciences, avec un focus sur l'étude de l’activité neuronale en comportement. En combinant des sessions pratiques et théoriques, ils apprendront les bonnes pratiques en expérimentation animale et seront formés aux tests comportementaux les plus adaptés à leurs recherches. De plus, les étudiants recevront une formation approfondie sur les méthodes d'enregistrement de l'activité neuronale par photométrie par fibre, ainsi que sur les techniques d'analyse des données. Grâce à ces apprentissages, ils seront capables de mettre en pratique leurs nouvelles connaissances dans leurs propres laboratoires, contribuant ainsi à renforcer la rigueur et la qualité de leurs futures recherches. Une fois de retour, ils pourront également appliquer et disséminer la règle des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) pour une approche plus éthique et responsable en expérimentation animale, un aspect clé abordé lors de l’école.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant l’injection de vecteur viraux et la pose d’un implant pour suivre l’activité neuronale du cortex préfrontal. Cette chirurgie sera effectuée sur animal anesthésié et analgésié et durera environ 1h30. Par la suite, les animaux seront exposés à l’une des trois tâches comportementales suivantes : (i) mise en place d'une mémoire rapide ou en un essai, (ii) mémoire sociale et (iii) mémoire de travail. Chaque test durera 10 minutes et sera répétée 2 fois par jour sur 2 jour soit un total de 4 passages. A l’issue des tâches comportementales, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie en vue de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
Les chirurgies au niveau du cerveau (injections de virus) peuvent entraîner une infection localisée et/ou un affaiblissement des animaux pendant les heures suivant celles-ci. Un risque d’inflammation peut aussi être considéré suite aux sutures. Un risque d’hypothermie est possible sous anesthésie tout comme un arrêt cardiorespiratoire. La mise en place de la mémoire en un essai, basé sur l'évitement d'un morceau de scotch adhésif peut entraîner un stress et possiblement une anxiété chez les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux de cette procédure sera euthanasié à la fin des expérimentations afin de prélever les tissus pour analyses.
Remplacement
Aucun modèle mathématique ou in vitro n'existe actuellement pour décrire les dynamiques des réseaux de neurones impliqués dans la mémoire. Ainsi, l'utilisation d'animaux éveillés s'avère indispensable pour comprendre les mécanismes mis en place, au fur et à mesure de l’apprentissage. Pour ce faire, l'emploi d'un modèle animal mammifère est essentiel afin d'obtenir des résultats pouvant être extrapolés à la compréhension du processus d’apprentissage humain. La souris représente un choix privilégié en raison de la similitude entre le fonctionnement de son cerveau et les tests comportementaux employés, par rapport à ceux observés chez l'Homme. Enfin, les structures étudiées ne sont pas présentes chez les invertébrés.
Réduction
Le projet impliquera au total 36 souris sur 2 ans. Nous limitons au maximum le nombre d'animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque étudiant travaillera avec un seul animal, mais l'ensemble des données de tous les participants sera mis en commun à la fin de l'école. Ainsi 4 à 5 animaux par expérience seront utilisés. Ce regroupement permettra d'analyser en profondeur l'activité du cortex préfrontal à travers les trois procédures expérimentales étudiées, tout en optimisant les ressources animales. Nos recherches bibliographiques n'ont pas mis en évidence de différences significatives entre les mâles et les femelles. Nous utiliserons un nombre équilibré de mâles et de femelles pour toutes les expériences.
Raffinement
Des éléments d'enrichissement supplémentaires, tels que la présence d’un nid et des petites bûches en bois, sont introduits dans la cage d’hébergement des souris. Les conditions chirurgicales (anesthésie, analgésie, asepsie) et les soins post-opératoires appliqués garantissent une prise en charge appropriée pour diminuer toute souffrance de l’animal après chirurgie. L’ensemble des tâches comportementales est associé à de la récompense (alimentaire ou sociale) ou à de l’évitement (scotch) mais pas d’apprentissage par punition. Les stratégies de raffinement mises en place lors de ce projet comprennent l’enrichissement environnemental proposé aux animaux dans leur cage d’élevage, le soin apporté aux animaux tout au long de ces procédures, du choix des procédures afin de garantir une anesthésie et une analgésie optimale quant celles-ci font parties de procédures et d’une surveillance régulière garantie par un personnel formé. La mise en place de points limites pour chaque procédure proposée nous permet de garantir le bien être animal dans l’entièreté de ce projet.
Choix des espèces
Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs pour l’étude de phénomènes complexes tels que la mémoire. L’étude d’un système intégré nécessite d’avoir recours à des animaux « entiers ». Cette nécessité est d’autant plus incontournable lorsqu’il s’agit de l’étude des comportements et capacités cognitives telles que la mémoire. Pour l’ensemble de ces raisons, seule l'utilisation d'animaux nous permet de répondre à ces questions. La souris est le modèle privilégié pour pouvoir étudier les corrélats neuronaux des comportements. Les outils nous permettant ce suivi étant disponible pour ce modèle. Les animaux en comportement seront utilisés au premier stade adulte (à partir de 50 jours), ce qui permet d'avoir des taux d'apprentissage élevés, tout en étudiant l'activité des réseaux neuronaux dont le développement post-natal est fini. Les animaux sont injectés avec les vecteurs viraux à 7 ou 8 semaines et commencerons à être utilisés 3 semaines plus tard.
Evaluation de l’innocuité, de la tolérance locale et de l’efficacité de produit dans un modèle d’infection oculaire bactérienne chez le lapin.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Les deux yeux de chaque lapin sont infectés par une bactérie après scarification de la conjonctive sous anesthésie, puis reçoivent jusqu'à soixante-dix administrations de collyre en deux semaines, avec des prélèvements par coton-tige et un examen oculaire chaque jour. 210 lapins subissent ces procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, avec conjonctivite attendue, œdème des paupières et inflammation de l'iris, et sont hébergés seuls dès l'infection. Le projet teste cinq à dix candidats médicaments pour un donneur d'ordre, en vue d'une mise sur le marché. 195 lapins sont tués, leur infection rendant selon le porteur toute réutilisation impossible, tandis que dix lapins de réserve non infectés seront réutilisés pour la formation du personnel et cinq proposés à l'adoption.
Objectifs
Les infections oculaires (conjonctivites, kératites et uvéites) sont un motif fréquent de consultation en ophtalmologie. Elles peuvent entrainer une gêne et des douleurs significatives mais également des complications sévères, jusqu’à la perte de la vision, si elles ne sont pas traitées correctement. Il est donc primordial de traiter rapidement et efficacement ces infections afin d’éviter des complications pouvant conduire à des interventions médicales ou chirurgicales. La multiplication des résistances aux antibiotiques nécessite constamment le développement de nouveaux médicaments offrant des traitements plus efficaces et mieux tolérés. L’objectif du projet est d’évaluer l’innocuité, la tolérance locale et l’efficacité de différents candidats médicaments (tel que des collyres) dans un modèle d’infection bactérienne oculaire chez le lapin. Entre 5 et 10 traitements à des posologies différentes pourront être testés au cours de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera aux développements et éventuellement à la mise sur le marché de nouveaux produits ophtalmiques offrant des traitements plus efficaces et mieux tolérés contre les infections bactériennes oculaires.
Procédures
Les animaux subiront une intervention afin de réaliser l’infection des 2 yeux sous anesthésie et analgésie. La procédure d’infection durera en moyenne 30 minutes (anesthésie comprise). Les animaux vigiles recevront dans les 2 yeux les produits tests, références ou contrôles. Ces produits seront administrés entre 1 et 5 fois par jour. L’administration des traitements commencera le lendemain de l’infection et se poursuivra jusqu’à 7 ou 14 jours post-infection (en fonction de la durée de l’étude). Les animaux recevront donc au maximum 70 administrations oculaires. Ces administrations dureront environ 5 minutes. Des examens spécifiques oculaires des 2 yeux seront réalisés quotidiennement de l’infection jusqu’à la fin de l’étude (soit 8 ou 15 examens en fonction de la durée de l’étude post-infection). Ces examens dureront environ 10 minutes. Des prélèvements oculaires à l’aide d’un coton-tige seront réalisés sous anesthésie locale au niveau des 2 yeux avant l’infection (baseline), environ 12h après l’infection puis à 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11 et 14 jours après l’infection (soit 8 ou 11 prélèvements en fonction de la durée de l’étude post-infection : 7 ou 14 jours). Ces prélèvements dureront environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle d’infection oculaire, une conjonctivite est attendue chez les animaux ce qui entrainera l’apparition de différents signes cliniques tels qu’une hyperémie palpébrale et bulbaire (accumulation de sang au niveau des paupières ou du bulbe oculaire), exsudation, chémosis (gonflement de la conjonctive), œdème des paupières, blépharite (inflammation de la paupière), iritis (inflammation de l’iris). La sévérité et la durée de ces signes pourront varier entre les animaux traités et non traités. Les animaux seront manipulés régulièrement (jusqu’à 5 fois / jour) pour différents actes susceptibles d’induire un stress : examen oculaire, examen clinique, pesée, administration des traitements, réalisation des prélèvements oculaires.
Devenir
Les animaux inclus dans les études seront euthanasiés à la fin du protocole car ils seront entrés dans une procédure infectieuse rendant leur réutilisation impossible. De plus, des prélèvements des yeux pourront être réalisés pour analyse histologique. Dans la mesure du possible, les animaux réserves qui n’auront finalement pas été inclus dans les études pourront être réutilisés pour de la formation continue du personnel ou adoptés selon la procédure d’adoption de l’EU.
Remplacement
Afin de répondre aux objectifs de ce projet ainsi qu'à des exigences réglementaires, le recours à l'expérimentation animale est nécessaire car il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode alternative in vitro ou in silico permettant de modéliser la réponse d’un organisme entier vivant à une infection bactérienne locale (modélisation d’une situation clinique). En effet, cette réponse dépend d’un très grand nombre de facteurs impliquant notamment l’ensemble du système immunitaire. Une sélection in vitro des candidats les plus prometteurs pourra être réalisée en amont des études précliniques par le donneur d'ordre.
Réduction
Dans un premier temps, des études sur un nombre restreint d’animaux (3 animaux par conditions expérimentales) pourront être réalisées afin de valider l’établissement d’un modèle de conjonctivite et/ou d'ajuster différents paramètres tels que la concentration et la fréquence d’administration des traitements. Une fois les conditions optimales définies et afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur l’innocuité, la tolérance locale et l’efficacité des produits testés, des études avec des groupes d’au moins 6 animaux seront réalisées. Un groupe contrôle traité avec le placebo/véhicule sera systématiquement inclus dans les études.
Raffinement
Une période d’acclimatation de minimum 8 jours sera respectée pour les lapins. Les animaux seront hébergés avec les enrichissements appropriés (plateforme et cachette, bâtonnet de bois à ronger, balles (jeux) et galet de foin, autant que possible en groupe sociaux en parcs ou en cages durant la période d’acclimatation puis en individuel après l’infection afin d’éviter tout risque de bagarre pouvant engendrer des blessures au niveau des yeux ne permettant plus de répondre à l’objectif de l’étude (innocuité et tolérance locale). Les animaux seront observés quotidiennement, à l’aide d’une grille de scoring permettant d’observer à la fois leur état général et leur mobilité, afin de déceler précocement tout signe clinique anormal et mettre en place des mesures de prise en charge aussi rapidement que possible (mesures de soutien de type désinfection de plaies, hydratation, isolement etc. ou bien mise à mort en cas d'état de santé considérablement dégradé et irréversible). Des pesées seront réalisées quotidiennement. De plus, un vétérinaire ophtalmologue spécialisé réalisera quotidiennement un suivi clinique oculaire. Lors de l’anesthésie, une attention particulière sera portée pour éviter l'hypothermie : mise en place de tapis chauffant et/ou réveil des animaux sous lampe chauffante. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux de l’animal pendant l’anesthésie pour éviter le dessèchement cornéen. Un protocole analgésique sera mis en place avant et aprés la scarification de la conjonctive et un anesthésique local sera appliqué avant la scarification de la conjonctive et avant chaque prélèvement oculaire permettant la quantification de la charge bactérienne. Les lapins seront habitués à entrer dans la boite à contention. Pour cela, il seront placés plusieurs fois dans la boite en amont de l’étude sans réalisation de geste technique. Une récompense alimentaire (boulette croquante au fruit) leur sera alors donnée à ce moment-là.
Choix des espèces
Le lapin est l’espèce privilégiée dans les modèles d’infection oculaire. Sa taille permet une observation confortable des signes cliniques oculaires. De plus, cette espèce est très bien caractérisée et présente des similarités anatomiques avec l’homme permettant une transposition des résultats. Les lapins seront utilisés entre 10 et 12 semaines afin d’avoir des animaux d’environ 2-3 kg au moment de l’infection. Les animaux seront donc réceptionnés à partir de 8/9 semaines (pour prendre en compte la période d’acclimatation de minimum 8 jours). Il n’y a pas de contraintes spécifiques liés à l’âge pour ce type d’étude, cependant des animaux de 2-3 kg permettent une manipulation facile et le système immunitaire du lapin aura atteint une maturité fonctionnelle complète à partir de 8 semaines.
Mise au point d’un modèle permettant l’étude du vieillissement cellulaire.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une instillation de virus modifié dans le nez, puis huit injections en un mois d'un composé qui déclenche la mort des cellules vieillissantes de leurs poumons. Le projet sert d'abord à vérifier qu'une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiées fonctionne, avant de l'employer dans de futurs travaux. Le porteur indique avoir testé ce modèle en culture cellulaire, et affirme que la validation dans un "organisme complexe, proche de l'Homme" reste nécessaire.
Objectifs
En vieillissant, les cellules de nos tissus accumulent de multiples défauts conduisant à un déclin progressif de la fonction tissulaire. Le vieillissement augmente donc les risques de nombreuses maladies, dont le cancer. En 2013, la sénescence cellulaire a été décrite comme l'une des principales caractéristiques du vieillissement. Ce processus est provoqué par un stress ou des dommages intracellulaires et/ou extracellulaires excessifs, et entraîne un arrêt de la division cellulaire à long terme. La sénescence cellulaire a été décrite comme un mécanisme suppresseur de tumeur limitant la capacité des cellules endommagées à proliférer. Cependant, la sénescence cellulaire peut également avoir divers effets favorisant le développement tumoral, en fonction du contexte cellulaire et de la composition de son phénotype sécrétoire pro-inflammatoire. Enfin, l’élimination de cellules sénescentes chez des souris a permis de retarder l’apparition de caractéristiques liés à l’âge et le dysfonctionnement tissulaire, ainsi que d’augmenter la longévité. Pour pouvoir étudier le rôle de la sénescence cellulaire dans divers contextes pathologiques, nous allons mettre au point un nouveau modèle murin afin de (1) pouvoir tracer et quantifier la sénescence des cellules à quatre âges différents et de (2) permettre l’élimination spécifique de ces cellules sénescentes. Nous serons alors à même de mieux comprendre leur implication dans divers contextes pathologiques.
Bénéfices attendus
La mise en place et la validation de ce nouveau modèle murin nous permettra d’étudier par la suite le rôle des cellules sénescentes dans divers contextes pathologiques. Ainsi, cela permettra potentiellement le développement de diverses stratégies thérapeutiques où la sénescence cellulaire joue un rôle prépondérant.
Procédures
Au cours de ce protocole, les animaux seront soumis à l'instillation intranasale de virus ainsi qu'à de multiples injections. Les cellules sénescentes n'étant pas forcément très nombreuses, nous souhaitons tester notre nouveau modèle murin par activation des systèmes de traçage et d'élimination de toutes cellules sénescentes au niveau pulmonaire. Pour se faire, nous aurons recours à l'instillation intranasale de virus modifié permettant l'activation de ces systèmes dans n'importe quel type de cellules présentes au niveau des poumons. Les animaux seront anesthésiés au préalable et recevront une seule instillation. Puis, nous injecterons un composé synthétique venant induire spécifiquement la mort des cellules sénescentes. Les animaux recevront deux injections du composé synthétique par semaine pendant un mois, soit un total de huit injections.
Impact sur les animaux
Au cours de ce protocole, les animaux pourront ressentir une douleur légère et du stress lors des multiples injections.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin d'être analysés et de déterminer si notre nouveau modèle murin est fonctionnel et peut être utilisé pour de futurs projets de recherche scientifique pour lesquels nous souhaitons étudier le rôle de la sénescence dans divers contextes pathologiques.
Remplacement
Notre nouveau modèle murin étant un modèle génétiquement modifié, nous avons testé sa validité dans un premier temps par culture et traitement de cellules dérivées de divers organes de ces souris. Néanmoins, il est nécessaire de valider nos résultats dans un organisme complexe, proche de l’Homme, où de nombreux facteurs externes difficiles à reproduire en culture cellulaire entrent en jeu.
Réduction
Ce protocole contient deux procédures qui ont pour but de mettre au point notre modèle d’étude. Nous utiliserons tous les contrôles nécessaires tout en prenant le nombre minimum de souris par groupe, incluant à la fois des mâles et des femelles. Les animaux d’une même portée ne comportant pas la modification génétique seront utilisés comme contrôles pour les procédures expérimentales. Puisque nous cherchons à valider le modèle murin, nous nous basons sur des données de la littérature quant à la mise au point de l'instillation intranasale de virus ainsi que des injections du composé synthétique induisant la mort cellulaire. De plus, les procédures de validation se feront en deux temps: si nous ne visualisons pas les cellules sénescentes pulmonaires après instillation de virus, nous ne procèderons pas à l'élimination des cellules.
Raffinement
Dès leur arrivée dans l’animalerie, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours avant toutes manipulations. Une période d’habituation aux expérimentateurs et à la manipulation sera par la suite mise en place. Les souris seront pesées et observées au moins une fois par semaine dès la mise en place du protocole expérimental. Cette pesée entre dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Les animaux seront observés lors du change par le personnel animalier. Une liste de scoring sera mise en place afin de déterminer l’éventuel degré de souffrance/l’atteinte d’un point limite. Les animaux seront hébergés en groupe dans chaque cage. Ces dernières comporteront des enrichissements comme du coton de nidation, des batônnets de bois et des maisons.
Choix des espèces
Une fois mis en place, notre laboratoire prévoit d'utiliser ce modèle murin pour des recherches comportant des analyses d’expression de gènes. Ainsi, la souris apparaît comme un modèle pertinent pour effectuer des études vivo du fait de sa forte homologie avec le génome humain. Les divers contextes pathologiques que nous étudierons par la suite n’étant pas toujours évident à mettre en place de façon représentative in vitro, le modèle murin apparaît alors approprié en termes de complexité et de pertinence par rapports aux questions scientifiques de notre équipe. Par ailleurs, nous travaillerons avec des animaux adultes, de différents âges, puisque la sénescence des cellules est plus fréquente au cours du vieillissement physiologique.
Défaut mandibulaire chez le rat : un modèle pour évaluer des biomatériaux destinés à la régénération osseuse
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
75 rats subissent le percement d'un défaut osseux dans la mandibule, chacun pouvant recevoir deux implantations de biomatériau au cours d'une intervention de vingt minutes. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et le porteur envisage des infections et des réouvertures de plaie comme complications possibles. Les rats sont tués par groupes, à chaque échéance expérimentale, pour analyse radiologique et histologique de l'os. Le bénéfice annoncé, des membranes de régénération osseuse utilisables en clinique, suppose encore une validation ultérieure sur des animaux plus grands que le porteur présente comme une étape à venir.
Objectifs
Les pertes de substances osseuses représentent un défi en chirurgie orale et orthopédique. En clinique, l'utilisation de greffe autologue est très répandue mais présente certains inconvénients (chirurgie additionnelle, morbidité du site donneur...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier ces limitations. Pour évaluer les propriétés ostéogéniques des biomatériaux étudiés, nous souhaiterions avoir recours à un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité. Ce modèle est facile à mettre en œuvre et reproductible. Le modèle de défaut osseux mandibulaire est réalisé chez le rat adulte afin de d’évaluer les propriétés ostéogéniques des biomatériaux implantés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (membranes pour la régénération osseuse guidée) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse dans la perspective d’une utilisation en clinique.
Procédures
Les animaux auront une chirurgie osseuse au niveau de l’os mandibulaire. L’intervention a lieu une seule fois et dure 20 mn maximum par animal.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut entraîner des douleurs mais ne nécessitera pas de fixations interne de l’os. De rares complications post- opératoires sont à envisager : infection ou réouverture de la plaie. Pour toute complication, un nettoyage du site opératoire par l’application d’un antiseptique (Bétadine) sera réalisé. La rupture d’un point de suture entraînera éventuellement la reprise de ce dernier en fonction de la cicatrisation de la plaie. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et avec application d’un analgésique (Buprénorphine,0,05 mg/kg injecté par voie intrapéritonéale). L’estimation de la souffrance est réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie.
Devenir
Après les implantations, les animaux de chaque lot correspondant à un temps expérimental donné seront mis à mort à l’issu de ce temps expérimental, de même que les animaux atteignant les points limites. Des analyses radiologiques et histologiques seront ensuite réalisées sur les echantillons issus de ces animaux.
Remplacement
Les produits destinés à être implantés chez l'humain doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent être d'abord testés dans un modèle de rat, puis, si les résultats obtenus sont satisfaisants, ils doivent être testés dans un modèle chez le gros animal.
Réduction
Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré une absence de cytotoxicité in vitro, ainsi qu’une biocompatibilité in vivo, et une seule lignée de rats sera utilisée. Le nombre d'animaux a été déterminée par une approche statistique. De plus, afin de réduire le nombre de rat, 2 implantations pourront être réalisées par animal.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux bénéficieront d'une procédure analgésiante afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite anesthésiés dans une chambre à induction puis maintenue anesthésiés au masque avec de l'isoflurane. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, le rat sera réintégré à sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur une semaine. Toutes les modifications de comportement et d’aspect seront consignées dans un fichier informatique par les personnes impliquées directement dans ce projet. Une grille de score basée sur des critères significatifs sera mise en place et des points limites adaptés seront utilisés. Un arbre décisionnel sera suivi pour déterminer la conduite à tenir, incluant la mise à mort en fonction de critères d'arrêt de souffrance définis. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères avec présence de litière en copeaux de peupliers et de jouets, ainsi que des bâtons à ronger qui sont régulièrement mis dans les cages.
Choix des espèces
Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau mandibulaire. De plus, il a été choisi à la suite de travaux réalisés dans notre laboratoire et par d'autres équipes portant sur l'analyse des propriétés histologiques et biologiques de biomatériaux destinés à la régénération osseuse. En cas de résultats satisfaisant et supérieurs à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, une validation chez le gros animal sera nécessaire. Rats Sprague Dawley adultes de 10 semaines, d’un poids d’environ 350 - 400 grammes. La croissance du squelette doit être arrivée à son terme. Il faut des animaux de poids suffisant pour supporter la procédure.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une partie des 960 souris est rendue colitique par un stimulus inflammatoire, les autres restant indemnes pour la comparaison, toutes reçues à l'âge de trois semaines et en pleine croissance. Elles absorbent un métabolite de fongicide présent dans l'eau potable, seul ou en cocktail avec d'autres polluants, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit des gavages sous anesthésie locale et deux tests d'anxiété au maximum, qui consistent à placer chaque souris seule sur une structure à découvert ou surélevée, et parle d'inconfort plutôt que de douleur. Toutes sont tuées pour des prélèvements terminaux destinés à mesurer la motricité et la perméabilité intestinales.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : 1) Evaluer l’impact d’une exposition à un polluant (métabolite de fongicide) d’origine hydrique (seul ou en cocktail avec d’autres polluants) sur les fonctions digestives et comportementales dans un modèle murin 2) Savoir si la présence de ce polluant dans l’eau potable peut être un facteur de risque pour le développement de maladies chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre : 1) de savoir si une exposition in vivo à un polluant d'origine hydrique peut être un facteur de risque pour le développement de maladies chroniques inflammatoires digestives (colite). 2) de définir des doses et durée d’exposition de polluants potentiellement à risque pour la santé. 3) d’évaluer le risque potentiel d’un effet « cocktail » de l’association de plusieurs polluants connus de l’eau potable sur la santé.
Procédures
Dans ce projet, aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée. Si les manipulations des animaux sont peu douloureuses, elles peuvent présenter un certain inconfort. Les tests comportementaux d'anxiété (2 maximum) nécessitent de placer les animaux individuellement dans un environnement modérément anxiogène (structures à découvert avec ou non plancher surélevé). Toutefois ces tests sont de très courte durée (< 10 minutes) et après chaque test, les animaux sont rapidement replacés dans leurs cages avec leurs congénères. Pour les études d'explorations digestives, une étape de gavage (1 ou 2 fois selon la procédure) nécessitant la contention de l'animal est appliquée. Cette procédure réalisée par un expert et sous anesthésie locale, ne dure pas plus de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, stress et douleur peuvent être générés par les différentes expérimentations comme le gavage et les prélèvements sanguins pour l’exploration fonctionnelles digestive in vivo ou encore les changements d’environnement dans les tests comportementaux. Ces effets seront limités autant que possible grâce à l’expertise des gestes techniques de l’expérimentateur.
Devenir
Mise à mort de toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour des expériences ex vivo de motricités et de perméabilités intestinales ainsi que pour des études transcriptomiques, protéomiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Dans ce projet, les effets recherchés de l’exposition aux polluants portent sur plusieurs organes (cerveau, intestin, microbiote) dont les interactions complexes ne peuvent être modélisés in vitro ce qui justifie l’utilisation d’un modèle animal.
Réduction
Sur la base d’expérimentations animales similaires et grâce à l’utilisation d’outil biostatistiques, le nombre minimum d’animaux à utiliser par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80% dans cette étude a été déterminé.
Raffinement
Le bien-être animal (temps d’acclimatation, hébergement, enrichissement, activité, comportement, alimentation, hydratation) sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Pour l’ensemble des procédures, des points limites sont mis en place et décrits dans chacune d’elle.
Choix des espèces
Le modèle C57 bl/6J est utilisé dans de nombreux projets au sein laboratoire. Notre unité possède ainsi une expertise reconnue pour l’étude des fonctions digestives et l’étude du comportement chez cette souche de souris et nous permet de ne pas utiliser trop d’animaux. Les animaux arriveront à l’âge de 3 semaines et seront en pleine croissance. L’utilisation de jeunes animaux permettra de mettre en évidence d’éventuels défauts de croissance / développement dus aux polluants.
Etude de l’efficacité d’un candidat-médicament anticancer seul ou en combinaison, sur différents modèles de cancers.
- Recherche appliquée
- Cancers
Une partie des 912 souris est immunodéficiente, pour que des tumeurs d'origine humaine y soient greffées sans rejet, ce qui les expose aux infections. Toutes reçoivent une injection ou une implantation chirurgicale de cellules tumorales, puis une injection hebdomadaire du composé testé dans la veine de la queue ou dans l'abdomen, leurs tumeurs étant mesurées trois fois par semaine, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur mentionne une douleur après la chirurgie et une gêne à la locomotion possible si le volume tumoral atteint le point limite. Toutes sont tuées à la fin de l'étude du fait de l'injection de cellules tumorales, l'objet étant d'établir le mécanisme d'action d'un dérivé bactérien anticancer avant d'envisager des essais chez l'humain.
Objectifs
Depuis quelques décennies, l'immunothérapie s'impose comme une approche thérapeutique innovante contre le cancer, visant à stimuler ou réactiver le système immunitaire. Récemment, la prise en charge de cancers tels que le mélanome ou le cancer du poumon a fait des avancées notables grâce à une catégorie de ces immunothérapies, qui vont empêcher l’épuisement des cellules immunitaires qui détruisent les cellules infectées ou anormales. Depuis le XIXe siècle, on sait que les composants de certaines bactéries déclenchent une réponse immunitaire contre le cancer, mais leurs effets secondaires limitent leur usage clinique. Aujourd’hui, un dérivé moins toxique et plus efficace a été mis au point. Il a montré son efficacité à bloquer la croissance tumorale chez la souris, aussi bien en seul sur un modèle de cancer osseux qu'en association avec des immunothérapies sur d’autres cancers, sans provoquer d’effets secondaires graves. Dans l’optique du lancement futur des essais cliniques chez l’humain, il est important de comprendre et connaitre les mécanismes d’actions de la formule finale de ce composé. Après avoir défini la posologie la plus adaptée, son efficacité sera évaluée dans différents modèles représentant des cancers communément retrouvées chez l’humain, injecté seul et en combinaison avec des traitements déjà utilisés en clinique. Puis, le type de cellules immunitaires activé par le composé et impliqué dans l’efficacité à empêcher la croissance tumorale sera mis en évidence.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui encore, beaucoup de cancers ne présentent aucun traitement efficace, ou une résistance au traitement se développe chez certains patients. Ce projet va permettre d’évaluer la portée d’action du composé sur différents modèles de cancers mimant ceux pouvant être retrouvés chez l’humain. Également, cela permettra de voir si, associé au composé, les thérapies disponibles mais inefficaces peuvent retrouver leur efficacité après stimulation de l’immunité. Dans un second temps, cette étude montrera les cellules immunitaires impliquées dans l’efficacité au composé. Cela permettra, pour cette étude ou à plus large portée pour la lutte contre le cancer, de se concentrer précisément sur les mécanismes à cibler.
Procédures
- 1 injection de cellules tumorales sous anesthésie - durée < 1 minute. Ou 1 chirurgie (sous anesthésie) pour implantation de la tumeur (selon le type de tumeur) – durée 5 min - 1 contention + 1 injection/semaine du composé testé dans la veine de la queue (animal vigile) et/ou 1 injection/semaine en intra-péritonéale (sous anesthésie) - durée < 5 minutes. - Mesures de volumes tumoraux et pesée 3x/semaine - durée < 1 minute - Petite incision de la veine de la queue (sous anesthésie) pour prélèvement de sang – durée < 1 min
Impact sur les animaux
Pour toutes les souris - Stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux et pesées (durée de quelques minutes, 3 fois/semaine) - Douleur lors d’injection : Lors de l’implantation des cellules tumorales (durée de quelques minutes, une fois), et lors de l’injection du/des traitement(s) (durée de quelques minutes, maximum 4 fois) - Douleur post-chirurgicale après implantation de tumeurs et suture. - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral atteint le point limite. Il n’y a pas de métastases attendues avec les modèles tumoraux utilisés. Pour les souris à phénotype dommageable (immunodéficience) : risque d’infection
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude, dû à l'injection de cellules tumorales
Remplacement
Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité de ce composé et sa formulation ont été préalablement validées in vitro au laboratoire. Des tests plus poussés doivent être réalisés sur modèle animal pour évaluer l’effet de ce composé sur un organisme entier et plus complexe. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du microenvironnement, et également du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion du composé dans le système sanguin et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire activée par le composé, sa migration, son recrutement et son effet sur la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.
Réduction
Selon les précédentes expériences dans les mêmes conditions de traitement et de contrôles avec des souris, le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a pu être déterminé grâce à un logiciel statistique.
Raffinement
Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement critères physiques, ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels sera annotée sur une fiche de suivi, et comparée à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Elles seront sous anesthésie générale avant injections et pendant la chirurgie. Un coussin chauffant est utilisé lorsque l’animal est endormi pour palier à la baisse de température corporelle lors de l’anesthésie. Les copeaux de litières seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs et éviter les nécroses. Les souris ont différents types d’enrichissement régulièrement renouvelé : maisons, tunnels, nids de cotons et paillage. Pour les souris présentant un phénotype dommageable (immunodéficience), celles-ci seront manipulée stérilement, et hébergées sous portoirs ventilés. Les gants seront changés avant manipulation.
Choix des espèces
Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs, et permettent de constituer des groupes avec un nombre de souris suffisant, compatibles avec des résultats statistiquement significatifs. L’utilisation de souris immunodéficientes va permettre d’étudier l’effet du composé sur des tumeurs d’origine humaine, sans risque de rejet par le système immunitaire murin. Les souris seront utilisées entre 6 et 12 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte. Cette tranche d’âge permet aux souris d’avoir un système immunitaire mature tout en ayant une prise tumorale optimale.
Etude des propriétés immunitaires des antigènes dérivés du génome non-codant.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 516 souris vont être utilisées, chacune portant une tumeur induite par un carcinogène, greffée sous la peau ou appliquée sur une peau abrasée, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Un quatrième groupe est irradié pour détruire son système immunitaire avant de recevoir une greffe de moelle osseuse, avec des diarrhées, de la prostration et une altération de l'état général possibles pendant trois semaines. Toutes sont tuées pour analyses post-mortem. Le porteur revendique de suivre vingt peptides chez la même souris pour réduire les effectifs, affirme qu'il reste "nécessaire" de valider ses observations dans un "organisme entier", et annonce comme retombée d'accélérer le développement de vaccins anti-tumoraux.
Objectifs
L’essor récent des approches d’immunothérapie a révolutionné la prise en charge de cancers préalablement incurables. Cependant, ces approches ne sont pas efficaces pour les patients et ne s’appliquent pas à tous les cancers. Pour élargir leur champ d’application, il est essentiel d’identifier des stratégies visant à combiner les médicaments d’immunothérapie déjà utilisés avec d’autres molécules ou approches qui augmenteront l’efficacité des traitements. Une piste privilégiée est le développement de vaccins anti-tumoraux. L’objectif de tels vaccins seraient d’induire le développement de cellules immunitaires capables de reconnaître les cellules tumorales. Une étape essentielle est d’identifier les molécules exprimées par les cellules cancéreuses (antigènes) et pas par les cellules saines. Cela est possible car pendant la tumorigénèse, les cellules cancéreuses divergent petit à petit des cellules normales par l’accumulation d’anomalies génétiques ou épigénétiques. On sait depuis longtemps que le système immunitaire peut détecter les anomalies génétiques associées aux cancers. Ces dernières années, de nombreuses équipes ont montré qu’il peut détecter la plupart des anomalies épigénétiques acquises pendant la tumorigénèse. Cependant, il est nécessaire de tester si les cibles dérivant de ces anomalies épigénétiques sont adéquates pour une vaccination anti-tumorale, en déterminant notamment la stabilité de leur expression au cours du temps, leur capacité à induire une réponse immunitaire robuste, etc… L’objectif de ce projet est de fournir une description approfondie des réponses immunitaires contre les anomalies épigénétiques associées aux cancers, pour accélérer le développement de vaccins anti-tumoraux.
Bénéfices attendus
Le développement de l’immunothérapie a révolutionné la prise en charge de nombreux cancers. Cependant, ces protocoles ne sont pas efficaces pour tous les patients et ne s’appliquent pas à toutes les pathologies. Améliorer leur efficacité est un enjeu central en cancérologie. Le développement de vaccins anti-tumoraux thérapeutiques est une piste prometteuse pour améliorer le champ d’application de l’immunothérapie. Ces dernières années, de nombreuses équipes ont identifié de nouvelles sources de molécules exprimées par les cellules tumorales qui peuvent être détectées pour le système immunitaire. Cependant, il est nécessaire de mieux décrire les réponses immunitaires contre ces nouvelles molécules si on veut s’appuyer sur cette découverte pour améliorer la prise en charge clinique des patients. Le projet proposé ici apportera une compréhension approfondie des réponses immunitaires contre les cancers et consolidera les approches visant au développement de vaccins anti-tumoraux.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, une molécule carcinogène (induisant la formation des tumeurs) sera injectée à des souris anesthésiées (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie inf à 5 min). Dès que les tumeurs seront palpables (5-7 jours post-injection), elles seront mesurées deux fois par semaine sur animaux vigiles à l’aide d’un point à coulisse pendant toute la durée de la procédure. Dans un deuxième lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l'expérience – durée du geste inf à 10 sec). Dès que les tumeurs seront palpables (5-7 jours post-injection), elles seront mesurées deux fois par semaine sur animaux vigiles à l’aide d’un point à coulisse et les animaux seront traités 2 fois par semaine par injection pendant toute la durée de la procédure. La mesure de la tumeur et l’injection pour le traitement sont réalisées en même temps (une seule contention inf à 2 min). Dans un troisième lot d’animaux, des cellules tumorales seront appliquées aux animaux anesthésiés après abrasion douce de la peau (1 fois au cours de l’expérience – durée de l’anesthésie env 20 min). Dès que les tumeurs seront palpables (5-7 jours post-injection), elles seront mesurées deux fois par semaine sur animaux vigiles à l’aide d’un point à coulisse pendant toute la durée de la procédure. Dans un quatrième lot d’animaux, les animaux seront irradiés pour éliminer les cellules immunitaires. 4h après irradiation, des cellules de moelle osseuse d’intérêt seront injectées par voie intraveineuse sur animaux vigiles (1 fois au cours de l'expérience – durée du geste inf à 10 sec) pour reconstituer le système immunitaire. 6-8 semaines après injection, un prélèvement de sang sera réalisé sur animaux vigiles (1 fois au cours de l'expérience – durée du geste inf à 10 sec) pour évaluer la reconstitution.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée ou soumis à une procédure de carcinogenèse chimique développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Pour les expériences d’injections de carcinogènes, de cellules ou des traitements, il est attendu une douleur directe associée à l’utilisation d’une aiguille. Pour le prélèvement de sang, il est également attendu une douleur légère liée à la piqûre elle-même (gène de courte durée ). Suite aux irradiations, certains animaux peuvent présenter des problèmes de diarrhée, prostration, altération de l’état général pendant les 3 premières semaines suivant l’irradiation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences in vitro ainsi que de nombreuses analyses bioinformatiques qui nous ont permis d’identifier des peptides dérivant de gènes, de mutations ou du génome silencieux exprimés par plusieurs lignées tumorales. Cependant, pour analyser si leur expression peut être affectée lors d’une réponse immunitaire efficace, il nous est essentiel de réaliser certaines expériences en utilisant des modèles de souris. En effet, il n’existe pas à l’heure actuelle de système d’activation in vitro permettant de récapituler la complexité des interactions entre cellules tumorales et système immunitaire lors du développement d’un cancer. Par conséquent, pour décrire les propriétés immunologiques des antigènes dérivés du génome non-codant, il nous est essentiel d’avoir recours à un modèle animal. Le modèle murin est particulièrement adapté du fait de la proximité des systèmes immunitaires entre hommes et souris.
Réduction
Nous avons réalisé des approches expérimentales et bioinformatiques en profondeur pour caractériser au mieux l’expression de différents types d’antigènes par nos cellules tumorales d’intérêt et ajuster les expériences à faire in vivo. Cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet. Néanmoins, il est nécessaire de valider ces observations dans le contexte d'un organisme entier où les interactions complexes entre cellules tumorales et système immunitaire seront reproduites. D’autre part, nous utiliserons systématiquement des approches dites de « multiplexage », qui permettront de suivre dans la même souris le comportement d’au moins 20 peptides différents. Ces approches complexes ont déjà été mises en place au laboratoire, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux utilisés dans ce projet . Les nombres d’animaux dans les différentes procédures ont été déterminés sur la base d’expériences similaires au laboratoire et sur la base des données de la littérature
Raffinement
Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer la souffrance, et des points limites ont été définis. Les animaux seront mis à mort à l’atteinte des points limites. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés 2 à 3 fois par semaines pour leur état général et pour mesurer la taille de la tumeur afin d'appliquer les points limites décrits dans la grille de score. Les gestes invasifs seront réalisés sous anesthésie générale avec recours aux analgésiques.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes. Il y a également de nombreux modèles de tumeurs transplantables disponibles, bien décrits et reproductibles, qui permettront de répondre rapidement aux questions posées dans ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.
Modification de l’expression de gènes dans des cellules souches musculaires à l’aide de vecteurs viraux (adénoviraux AAV) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Injectées avec des vecteurs viraux dans les jours suivant leur naissance ou à quatre semaines, puis soumises à un régime spécifique et à deux gavages, 136 souris subissent la destruction chimique d'un muscle de la patte par injection de chlorure de baryum sous anesthésie. La régénération dure trente jours. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger à modéré, et le porteur indique que la lésion peut être douloureuse pendant cette phase. L'objectif déclaré est de valider une méthode qui permettrait ensuite de cibler n'importe quel gène sans créer une nouvelle lignée de souris, et toutes sont tuées pour prélever leurs cellules souches musculaires.
Objectifs
Le muscle possède une remarquable capacité de régénération, due en grande partie à la fonction des cellules souches musculaires, également connues sous le nom de cellules satellites. En réponse à une lésion musculaire ou à une maladie affectant le tissu musculaire, les cellules satellites s'activent et génèrent de nouvelles cellules musculaires pour réparer les dommages. Pour maintenir leur capacité de régénération, les cellules satellites doivent rester dans leur niche appropriée, qui leur fournit des éléments optimaux tels que des nutriments, des signaux chimiques et un soutien physique. Lorsqu'elles sont retirées de cette niche spécialisée, les cellules satellites perdent leur capacité de régénération. L'un des principaux défis de la recherche biomédicale est d'identifier les facteurs qui composent cette niche spécialisée, car cette connaissance pourrait aider à préserver les propriétés régénératrices des cellules satellites et éventuellement à les exploiter à des fins thérapeutiques. La matrice extracellulaire, un réseau complexe de protéines comme les collagènes, joue un rôle crucial dans la niche des cellules satellites. Nous avons identifié plusieurs facteurs candidats de la matrice extracellulaire et nous souhaitons étudier leurs fonctions à l'aide de modèles de souris génétiquement modifiées. Ce projet devrait nous permettre de développer une nouvelle méthode pour générer rapidement des souris génétiquement modifiées afin d'étudier le rôle de différents facteurs de la niche dans la fonction des cellules satellites.
Bénéfices attendus
Bénéfice à court terme (scientifique) : La matrice extracellulaire est un environnement riche et dense composé de nombreuses protéines différentes spécialisées en fonction du tissu. Ce projet nous permettra de cribler l'importance des différents composants de la matrice extracellulaire exprimés par les cellules souches musculaires pour leur activité lors de lésions musculaires. Bénéfice à long terme (scientifique + réduction du nombre d'animaux) : Ce projet nous permettra de confirmer la stratégie de ciblage de differentes gènes d’intérêt en utilisant une seul model. Par conséquent, dans une perspective à long terme, la validation de cette stratégie nous permettra, ainsi qu'à d'autres chercheurs-euses, d'utiliser ce protocole comme un modèle rapide et robuste pour cibler n'importe quel gène d'intérêt dans les cellules souches musculaires directement in vivo sans avoir besoin de développer de nouvelles model de souris pour chaque gène d'intérêt. Cela réduira considérablement le nombre de souris utilisées par projet.
Procédures
Les souris incluses dans ce projet recevront en une injection des vecteurs viraux, en un seul geste (rapide (moins d'une minute)) soit après la naissance, soit à l'âge de 4 semaines. Une fois adultes, les souris seront soumises à un régime alimentaire spécifique en granules pendant deux semaines suivi par deux gavages (pendant deux jours consictifs, un par jour, en un seul geste, ce qui prend moins d'une minute). Deux semaines après, un seul muscle d'une seule jambe sera blessé par injection intramusculaire (rapide (moins d'une minute)) sous anesthésie générale. Le processus de régénération musculaire dure 30 jours chez la souris.
Impact sur les animaux
Concernant l'injection des vecteurs viraux chez les souriceaux après la naissance ou chez les souris adultes, ils seront realisées rapidement et à l'aide d'une aiguille adaptée et fine afin de minimiser la douleur chez l'animal. La douleur est donc considérée comme faible. Le gavage est effectué par des chercheurs formés et expérimentés en un seul geste, rapidement, à l'aide de sondes adaptées. La douleur est minimale et l'inconfort pour l'animal est très faible. Enfin, concernant l'induction de lésions musculaires par injection de BaCl2 dans le muscle tibialis antérieur (TA), l'injection est réalisée rapidement, sous anesthésie, en un seul geste et à l'aide d'aiguilles fines adaptées pour minimiser la douleur. Cependant, étant donné que l'induction de la lésion elle-même peut être douloureuse pour les souris pendant la régénération musculaire, des analgésiques ainsi que des adaptations de l'environnement et de la nourriture des animaux dans la cage ont été envisagés et décrites dans les sections adaptées.
Devenir
Toutes les animaux inclut dans ce projet seront utilisées pour effectuer des prélèvements musculaire afin d'avoir accès aux cellules souches musculaire.
Remplacement
Dans ce projet, nous nous intéressons aux cellules souches musculaires et à la structure de leur matrix extra cellulaire in vivo. Bien que plusieurs systèmes de culture cellulaire se soient développés, le comportement de ces cellules change lors de leur mise en culture. Par conséquent, la simulation complète de la matrice extra cellulaire physiologique des cellules souches musculaire n’est pas encore possible in vitro, ce qui nous oblige à passer par des modèles in vivo.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, tous les tests in vitro possibles ont été réalisés. Cependant, pour confirmer notre stratégie de travail nous aurions besoin de 36 souris avant de commencer les expériences principales. Ensuite, pour la phase expérimentale, nous avons décidé de réduire le nombre d'animaux en induisant une lésion musculaire dans un seul muscle d'une seule patte par souris, ce qui nous permettra de comparer le comportement des cellules souches musculaires au repos (muscle controlatéral non lésé = témoin) ou après régénération musculaire. Ainsi, 100 animaux (10 lots de 10 souris, pour avoir par lot, 5 souris controles et 5 souris expérimentales) sont prévus pour la phase expérimentale. Ces groupes représentent le minimum nécessaire pour pouvoir effectuer une analyse statistique et conclure les résultats expérimentaux.
Raffinement
Tout au long du projet, le comportement et le poids des souris seront surveillés par le même manipulateur afin de détecter tout signe de douleur ou d'inconfort chez les souris. Toutefois, l'induction de la blessure musculaire provoque des lésions musculaires et une régénération. De la nourriture et de l’hydrogel seront mis à disposition dans la cage les trois premiers jours au cas où les animaux ne parviendraient pas à atteindre la grille pour se nourrir. Également, des anti-douleurs sont prévus pour réduire la douleur des souris. Un tableau d'évaluation des animaux et des points limites a été préparé, adapté à chaque intervention, et sera consulté tout au long du projet pour évaluer l'état de chaque souris incluse dans chaque procédure
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples : 1. La souris est un mammifère et la structure de son muscle squelettique est très similaire à celle du muscle squelettique humain. 2. La courte durée de gestation et la maturité post natale chez la souris sont compatibles avec la durée de nos expériences. 3. La petite taille des souriceaux nous permet de cibler toutes les cellules avec une petite quantité des vecteurs viraux. 4. Des études similaires sur la délivrance de gènes par des vecteurs viraux chez la souris ont servi de base à la conception de l'expérience. 5. Notre laboratoire possède une expertise dans la manipulation des souris. pour l'injection des vecteurs viraux, les souris seront injectées soit après la naissance, soit à l'âge de 4 semaines. L'objectif est de cibler le plus grand nombre de cellules souches musculaire par l'intermédiaire des vecteurs viraux. Par la suite, les tests de régénération musculaire seront effectués chez des souris adultes, soit à 11-15 semaines d'âge, pour étudier le comportement et la capacité des cellules souches musculaires pendant la régénération des muscles squelettiques.
Etude de la biodistribution de nanoparticules pour la délivrance d’ARN chez un modèle murin d’inflammation intestinale aigüe et chronique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris qui servent à l'apprentissage des gestes sont des animaux écartés d'autres projets en raison de leur sexe, dont le porteur indique qu'ils auraient de toute façon été tués. 256 souris vont être utilisées au total, 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 96 un niveau sévère, toutes tuées à l'issue. Elles sont épilées sur le dos, reçoivent jusqu'à six administrations intrarectales sous anesthésie et un gavage, et une inflammation intestinale leur est provoquée par un agent chimique, avec perte de poids, selles modifiées et sang dans les selles. Le porteur annonce un projet qui "pourrait transformer le traitement des maladies inflammatoires", quand l'objet immédiat se limite à suivre où vont des nanoparticules d'ARN dans le corps et à vérifier leur tolérance à court terme.
Objectifs
Les maladies inflammatoires de l’intestin sont des troubles auto-immuns caractérisés par une inflammation sévère et récurrente de la paroi du tube digestif. Ces maladies, en augmentation dans les sociétés modernes, sont graves et les traitements actuels peinent à offrir une efficacité durable, entraînant souvent des effets secondaires pour les patients. Il est donc important de développer des approches thérapeutiques nouvelles et mieux ciblées. Ce projet de recherche a pour but de mettre au point une approche thérapeutique innovante, utilisant un nanosystème capable d’améliorer la prise en charge de ces pathologies inflammatoires. Ce projet d’expérimentation sur un modèle animal vise précisément à étudier la distribution de nanoparticules à base d’ARN, biodégradables et biocompatibles, dans un modèle de maladie intestinale inflammatoire (comme celles de type Crohn et colite ulcéreuse). Le projet s’inscrit dans une démarche scientifique et médicale visant à répondre aux interrogations suivantes : 1. Suivre la distribution et le ciblage des nanoparticules à ARN : Comprendre comment ces nanoparticules se répartissent dans l’organisme après une administration orale, et voir si elles ciblent efficacement les zones inflammatoires de l’intestin. 2. Évaluer la sécurité et la dégradation des nanoparticules : Analyser la tolérance des nanoparticules chez l’animal en vérifiant l’absence d’effets toxiques à court terme, ainsi que leur biodégradation et élimination. Pour atteindre ces objectifs, plusieurs nanosystèmes à base d’ARN ont été conçus et validés. Leur stabilité a été démontrée en conditions simulées (environnements gastriques et intestinaux), et leur compatibilité avec des cellules murines et épithéliales a été testée avec succès en laboratoire. Le passage à des études sur un modèle animal est donc maintenant nécessaire pour confirmer leur potentiel en tant que traitement des inflammations intestinales, ainsi que leur sécurité et leur efficacité. Ainsi, nous évaluerons la biodistribution de ces nanoparticules à partir du système digestif, une donnée cruciale pour l’évaluation future de leur potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les inflammations chroniques, comme la maladie de Crohn ou la colite ulcéreuse, représentent un défi thérapeutique en raison de leur nature chronique et de l’absence de traitements ciblés. Les nanoparticules à base d’ARN offrent un potentiel thérapeutique innovant, avec des applications pour délivrer des agents anti-inflammatoires directement aux zones affectées, réduisant ainsi les effets secondaires systémiques. Ce projet vise à étudier la biodistribution de nanoparticules biodégradables et biocompatibles dans un modèle murin de maladies inflammatoires aigüe et chronique de l’intestin. Bénéfices à court terme : Le projet fournira des données sur la répartition biologique et la biocompatibilité de ces nanoparticules, en évaluant leur capacité à cibler les tissus intestinaux inflammés et leur tolérance chez les animaux. Bénéfices à long terme : À terme, ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles thérapies pour les maladies inflammatoires intestinales et d'autres maladies inflammatoires chroniques, offrant des traitements plus ciblés et efficaces. Il pourrait également améliorer les connaissances sur les nanotechnologies, avec des applications potentielles en thérapie génique. En conclusion, le projet pourrait transformer le traitement des maladies inflammatoires, offrant à la fois des bénéfices immédiats en recherche fondamentale et des retombées cliniques à long terme pour les humains et les animaux.
Procédures
Dans les différentes procédures : - les animaux seront épilés sur une petite zone du dos - les animaux recevront une ou plusieurs (6 maximum) administrations intra-rectale (5 minutes maximum pour l’ensemble du geste), sous anesthésie et une seule administration par gavage oral (moins d’une minute pour le geste), sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux (contention, pesée et anesthésie) pourra entraîner un état de stress. L’épilation nécessaire à la sensibilisation au produit peut créer une légère irritation. L’injection d’un agent chimique va induire une inflammation au niveau de l’intestin peut se traduire par une perte de poids, une consistance des selles particulière et une présence de sang dans les selles. L’administration par voie orale, lorsqu’il est bien maitrisé, est un geste rapide (moins d’une minute). Toutefois, cela pourrait éventuellement provoquer une légère irritation au niveau de l’œsophage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort lorsque les gestes sont maîtrisés ou afin de réaliser des études ex-vivo post mortem.
Remplacement
Bien que les tests en laboratoire (in vitro) soient utiles pour des études préliminaires, ils ne peuvent pas simuler toute la complexité des interactions biologiques qui existent dans un organisme complet. Ces études en laboratoire nous ont déjà permis de démontrer que nos nanoparticules sont stables dans des conditions physiologiques variées (milieux qui simulent les fluides gastrique et intestinal) et qu'elles sont compatibles avec des cellules immunitaires et intestinales. Cependant, pour évaluer efficacement notre traitement dans le cadre de l’inflammation intestinale, il est indispensable d’avoir recours à des tests sur organisme vivant (in vivo). 1. Distribution et dégradation dans le corps : En utilisant un modèle in vivo, nous pouvons étudier où les nanoparticules se dirigent dans le corps après administration et comment elles se dégradent. Ces éléments sont cruciaux pour la sécurité du traitement, ce qu’une étude en laboratoire ne permet pas d’évaluer complètement. 2. Tolérance et sécurité globales : Pour garantir que le traitement ne déclenche pas de réactions indésirables ou toxiques dans un organisme entier, un modèle vivant est essentiel. 3. Interaction avec le microbiote intestinal : Le microbiote joue un rôle clé dans l’inflammation intestinale. Un modèle in vivo permet d’examiner comment les nanoparticules interagissent avec cette communauté complexe de micro-organismes, un élément qui ne peut être simulé de manière fiable en laboratoire. 4. Réalité des conditions de maladie : Les organismes vivants reproduisent les conditions pathologiques réelles, permettant ainsi de tester la réponse au traitement dans des conditions proches de celles rencontrées par les patients. 5. Effets dynamiques dans l’intestin : L’inflammation intestinale modifie des processus comme la perméabilité de l’intestin et son activité motrice, qui influencent directement l’efficacité des traitements oraux. Un modèle in vivo est donc nécessaire pour vérifier si nos nanoparticules parviennent à atteindre la cible thérapeutique. En somme, l’utilisation d’un modèle vivant permet de recréer un environnement biologique complet et complexe, essentiel pour confirmer l’efficacité, la biocompatibilité, et la sécurité de notre traitement dans des conditions proches de celles de l’humain.
Réduction
Dans la première étape de notre projet, nous allons apprendre à maîtriser deux techniques spécifiques d’administration de composés aux animaux. Il est essentiel que ces administrations soient effectuées avec précision pour réduire au maximum le stress des animaux et assurer la fiabilité des résultats futurs. Pour cet apprentissage, nous utiliserons des animaux qui ne seraient pas utilisés dans d'autres projets, par exemple en raison de leur sexe, et qui auraient autrement été euthanasiés. Dans la deuxième étape, le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente.
Raffinement
Pour préparer les souris au projet, nous les acclimaterons pendant une semaine pour réduire leur stress. Pendant tout le protocole, nous veillerons à leur bien-être et prendrons des précautions pour minimiser toute souffrance ou stress. Dans leurs cages, elles auront des objets comme des petites maisons et du paillage pour les distraire, et seront placées en groupes de cinq car elles sont sociables. Les souris seront transportées en toute sécurité dans des boîtes fermées et isolées du bruit. Toutes les souris seront observées pendant chaque pesée (tous les jours) afin de détecter une éventuelle apparition de signes de souffrance. Quand cela sera nécessaire, des experts montreront les techniques spécifiques pour minimiser le stress des souris. Si elles perdent trop de poids, nous ajouterons de la nourriture humide et de l'eau gélifiée pour les aider à s'alimenter. Si le rasage provoque une irritation, une crème apaisante sera appliquée, et la litière pourra être adoucie. Avant l’administration intra-rectale, les souris recevront une anesthésie légère, et nous humidifierons leurs yeux pour les protéger. Les points limites seront évalués quotidiennement à partir de l’induction de la pathologie, selon une grille de score : il varie de 0 à 4 (le détail de cette grille est explicité dans les procédures). De plus les critères comportementaux et apparences seront également pris en compte. Un traitement palliatif sera mis en place dès lors que la situation nécessaire et possible laissant une possibilité de rémission et non mise à mort systématique après 24h. Nous suivrons la distribution des nanoparticules dans leur corps en les surveillant étroitement pendant 48 heures, à des intervalles réguliers, tout en vérifiant leur poids et leur bien-être pour s'assurer qu'elles ne souffrent pas.
Choix des espèces
Le développement de nouvelles thérapies types nanosystèmes nécessite une évaluation chez le petit animal en complément des études in vitro pour déterminer leur devenir et leur efficacité in vivo. L’acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. La souris représente un modèle expérimental privilégié pour mimer la physiopathologie des maladies inflammatoires intestinales. Le modèle d’inflammation intestinale induite par l’agent chimique d’intérêt est déjà bien établi et mime la pathologie humaine que nous ciblons. Les Balb/c sont décrites dans la littérature pour être sensibles à l’induction d’une inflammation intestinale, contrairement à d’autres lignées. Ce modèle nous permettra donc d’acquérir les données nécessaires pour démontrer, dans un futur projet, l’efficacité thérapeutique notre nanosystème. Les animaux utilisés auront environ 6 semaines au début des procédures, conformément aux données de la littérature indiquant que les souris de cet âge sont plus réceptives au développement d'une inflammation intestinale après administration de l’agent chimique. Au-delà de cet âge, l'induction d'une inflammation intestinale devient plus difficile.
Rôle des neutrophiles dans le développement de la parodontite: modèle expérimental chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à huit poses de ligature autour des dents, renouvelées tous les trois jours sous anesthésie générale profonde, plus trois radiographies 3D des mâchoires sous anesthésie gazeuse et une dernière anesthésie avant la mise à mort. 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à 1, 4, 14 ou 28 jours pour prélever leurs tissus. La moitié des ligatures est imbibée de bactéries agressives pour le parodonte, et le porteur signale des douleurs gingivales postopératoires, des abcès possibles et une baisse de la mastication et de la prise de poids. Il estime, "par nos expériences passées", que huit animaux par groupe suffisent à obtenir une différence statistique, alors que les 128 souris se répartissent en huit groupes de seize.
Objectifs
La parodontite est une maladie fortement prévalente qui entraine une destruction des tissus de soutien des dents, et des édentements précoces. Elle est déclenchée par un déséquilibre de la flore bactérienne. La concentration de certains globules blancs, comme les neutrophiles, dans le tissu conjonctif est en corrélation avec la gravité de la parodontite. Cependant, leur fonction et leur distribution spatio-temporelle dans les tissus de la parodontite restent inconnues. Notre projet vise à étudier le rôle des neutrophiles à plusieurs étapes du développement de la maladie, dans un modèle de parodontite expérimentale chez la souris. La parodontite sera induite sous anesthésie générale profonde pendant 1, 5, 14 ou 28 jours, selon un protocole validé dans la littérature. Nous caractériserons radiographiquement l’évolution de la destruction du parodonte chez des souris au cours du temps, puis analyserons les fonctions des neutrophiles. Le projet se déroulera sur un an et nécessitera 128 souris.
Bénéfices attendus
Les neutrophiles sont les globules blancs les plus abondants et les premiers à intervenir lors d’une inflammation gingivale. L’analyse de l’évolution des fonctions de ces cellules au cours de la parodontite est cruciale pour mieux comprendre la pathologie. Grâce à ce projet, nous espérons découvrir de nouvelles cibles de diagnostic et de traitement de la parodontite.
Procédures
Les souris seront soumises au modèle de parodontite : pose d’une ligature (5 minutes) par souris sous anesthésie générale profonde (maximum 8 anésthésies + 1 anésthésie avant la mise à mort, par animal), renouvelés tous les 3 jours pendant 1, 4, 14 ou 28 jours (maximum 8 poses de ligature). Avant et à la fin de la mise en œuvre de ce modèle, une radiographie 3D (maximum 3 radiographies) des machoires sera réalisée pour toutes les souris sous anesthésie légère gazeuse (maximum 3 anésthésies par animal, durée 5 minutes/souris). Nous aurons alors 8 groupes de souris : (4 groupes avec une ligature simple, 4 goupes avec une ligature imbibée de bactéries agressives pour le parodonte). Les animaux seront mis à mort à 1, 4, 14 ou 28 jours pour évaluer l’évolution des fonctions des neutrophiles dans la parodontite avec ou sans bactérie agressive.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour l’animal pourraient être : - exceptionnellement pour les souris recevant la pose de ligature : des douleurs gingivales post-opératoires, voir des abcès gingivaux, diminuant la mastication et la prise de poids des animaux. - pour tous les animaux : une hypothermie au cours de l’anesthésie. - pour tous les animaux : une résistance à l’anesthésie.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux sont mis à mort, permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.
Remplacement
Nous développons une recherche sur modèle expérimental chez le petit animal, car il n’existe pas d’autres méthodes alternatives (in vitro, in silico) pour l’étude de la parodontite dans son ensemble, et la souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de cette maladie. Le modèle étudié permet de reproduire certaines caractéristiques de la pathologie humaine telles que l'inflammation et la perte osseuse.
Réduction
Nous utiliserons une lignée consanguine dont le fond génétique est contrôlé et homogène pour minimiser la variabilité des phénotypes et donc le nombre d’animaux à utiliser. Afin de minimiser le nombre d’animaux, une étude de puissance statistique a été réalisée pour le modèle de parodontite. Par nos expériences passées, il est estimé qu’une réponse sur un nombre de 8 animaux est suffisante pour obtenir une différence statistique.
Raffinement
Afin d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur les éléments suivants sont mis en place : (1) Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, en milieu enrichi pour minimiser leur stress (2) Avant chaque examen radiologique, sans intervention chirurgicale, une anesthésie légère mais dont l’efficacité est validée, sera effectuée (3) Avant chaque pose de ligature les souris seront anesthésiées profondément (4) Après chaque anesthésie, les souris seront placées dans un environnement chauffé et surveillées jusqu’à leur réveil (5) Les animaux seront surveillés le lendemain de chaque intervention ainsi que tous les 2 à 3 jours par le personnel dédié de l'animalerie ou/et les responsables de projet (6) Des points limites ont été établis. (7) La mise à mort anticipée sera effectuée selon les méthodes réglementaires, en cas d’atteinte de points limites. (8) Une analgésie est administrée avant la mise à mort
Choix des espèces
Le modèle de parodontite induite par ligature chez la souris est un modèle d’étude pertinent permettant de reproduire plusieurs caractéristiques de la pathologie humaine (inflammation et resorption osseuse). Ce modèle est validé par la littérature scientifique. 3 mois – âge adulte avec croissance des maxillaires achevée
Altération du métabolisme du stroma médullaire au cours de la progression leucémique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Irradiées à 2 grays pendant environ trois minutes, puis greffées de cellules leucémiques sous anesthésie, 375 souris vont être utilisées, 309 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 66 un niveau sévère. Chacune peut subir jusqu'à trois prélèvements de 50 microlitres de sang sous anesthésie, espacés d'une semaine ou de 48 heures si la proportion de cellules leucémiques dans le sang approche le point limite. Le porteur justifie le classement en gravité sévère par l'effet cumulé des manipulations et de la progression d'une leucémie aiguë myéloïde, dont les symptômes peuvent devenir graves en fin d'étude. Au plus tard 21 jours après la greffe, toutes sont mises à mort pour caractériser leur moelle osseuse, à laquelle le porteur indique ne pas pouvoir accéder autrement.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre ce qui, dans le milieu de la moelle osseuse de souris atteintes d'une forme légère de leucémie, aide les cellules cancéreuses à survivre et à se multiplier. Plus précisément, nous voulons savoir comment l’augmentation du nombre de cellules malades affecte leur environnement immédiat, notamment les cellules qui soutiennent et nourrissent les autres cellules (appelées cellules stromales). Nos premiers résultats montrent que cet environnement change dès les tout premiers stades de la maladie. Nous allons donc étudier si la présence de quelques cellules leucémiques (moins de 5%) dans la moelle osseuse peut déjà modifier la fréquence, les fonctions et le comportement des cellules environnantes, ainsi que leur capacité à soutenir les cellules leucémiques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à repérer les premiers changements dans l’environnement de soutien de la moelle osseuse (appelé stroma) au début du développement de la leucémie. Ces anomalies nous aideront à comprendre comment elles favorisent l’aggravation de la maladie et préparent un terrain favorable aux rechutes. Nous espérons comparer nos résultats obtenus sur les souris avec des données humaines (provenant d’échantillons de patients ou de bases de données publiques). Cela permettra de valider nos découvertes et peut-être d’identifier de nouveaux indicateurs permettant de mieux prédire l’évolution de la leucémie.
Procédures
Selon la procédure, les animaux subiront une exposition à des rayonnements X (2Gy, environ 3 minutes), une transplantation de cellules leucémiques sous anesthésie (quelques minutes), et une série de 3 prélèvements maximum de 50µL de sang sous anesthésie (quelques minutes), espacés d’une semaine ou bien au minimum de 48h si le pourcentage de cellules leucémiques dans le sang approche sans l’atteindre le point limite fixé. Au maximum 21 jours après transplantation, les souris seront anesthésiées pour euthanasie et prélèvement d’organes.
Impact sur les animaux
Les animaux développeront une pathologie tumorale humaine potentiellement grave, ce qui justifie la classification en procédure de gravité sévère. Cette classification tient compte des effets cumulés des manipulations et de l'évolution de la maladie, même si les différentes étapes individuelles sont associées à des degrés de gravité moindres. Par exemple, la transplantation des cellules cancéreuses provoquera une brève douleur légère. Les anesthésies nécessaires pour les prélèvements sanguins (au maximum trois) et pour l’irradiation (réalisée une seule fois avant la transplantation) peuvent causer un stress de courte durée. De même, les manipulations répétées, comme les pesées, peuvent être sources d’angoisse. Cependant, c’est l’impact global de la progression de la maladie tumorale, avec des symptômes potentiellement graves en fin d’étude, qui justifie le classement en gravité sévère pour ces procédures. Cela inclut les éventuels effets sur le bien-être des animaux, qui seront surveillés en continu pour intervenir rapidement en cas d’inconfort ou de souffrance.
Devenir
Les 375 souris impliquées dans ce projet feront l’objet d’une caractérisation de la moelle osseuse qui nécessitera leur mise à mort. Il est en effet impossible d’accéder de manière non invasive à cet organe.
Remplacement
La leucémie aiguë myéloïde étant dans la catégorie des cancers « liquides », il n’est pas possible à ce jour d’établir de modèle 3D in vitro permettant de reproduire la complexité du tissu de la moelle osseuse, notamment sur des suivis dans le temps. De plus, la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement ne peut pas être modélisée facilement in vitro. D’autre part, les cellules leucémiques utilisées sont des cellules dont la dépendance au stroma et au microenvironnement de la moelle osseuse est primordiale pour leur survie. La souris est donc le modèle expérimental le plus adapté pour modéliser la pathologie humaine. Cependant les résultats de ces analyses in vivo prévues dans ce projet nous permettront de pouvoir ensuite modéliser in vitro ces interactions à l’aide de cellules leucémiques humaines et des lignées de cellules stromales humaines. Ainsi nous pourront remplacer les études in vivo par des analyses in vitro ce qui est une prévision relevante dans le cadre des 3R.
Réduction
Ce projet de 4 ans a été soigneusement planifié pour limiter au maximum l’utilisation d’animaux tout en obtenant des résultats fiables. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé avec précision en s’appuyant sur nos connaissances des modèles étudiés. Nous avons identifié des moments-clés (appelés « points de cinétique ») correspondant à des stades précoces ou modérés de la maladie, qui ne causent généralement pas de douleurs aux animaux. Pour réduire encore le nombre d’animaux, nous nous concentrons sur seulement deux moments-clés lors des principales étapes de l’étude, et nous avons utilisé un outil statistique spécialisé pour calculer combien d’animaux sont nécessaires par groupe. Ce calcul prend en compte un impact attendu d’au moins 20% entre les groupes sains et malades, avec un très haut niveau de précision (90% de puissance et un risque d’erreur de 5%). Enfin, à chaque fin d’expérience, nous collecterons tous les organes et échantillons nécessaires (comme la moelle osseuse, la rate, les ganglions et le sang) afin de réaliser un maximum d’analyses sur ces mêmes échantillons et éviter de multiplier les expérimentations. Aller jusqu’au stade avancé de la maladie dans une première étape est crucial pour obtenir suffisamment de cellules leucémiques à utiliser dans les expériences suivantes.
Raffinement
Notre connaissance des modèles nous permet de réduire le nombre de prélèvements sanguins pour le suivi de la pathologie. En effet à 14 jour post injection, la fréquence de cellules leucémiques dans la moelle osseuse est de l’ordre de 3 à 5% sous la forme d’ilots, alors qu’à J21 nous avons un envahissement d’environ 40-60% avec une couverture presque homogène des cellules leucémiques. Enfin, l’envahissement médullaire faible ou modéré n’est généralement pas associé à des douleurs chez les animaux. Dans un souci de raffinement, le suivi du développement leucémique, lorsque nécessaire, se fera par des mesures de suivi dans le temps utilisant un procédé peu ou pas invasif, à savoir les techniques de cytométrie en flux sur prélèvement sanguin réalisé sous anesthésie gazeuse. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum (à volonté), cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés et/ou de coton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par les limitations des études in vitro. En effet la complexité des interactions entre les différentes cellules composant le microenvironnement de la moelle osseuse est difficile à modéliser in vitro. En effet, les modèles 3D in vitro (sphéroïdes, organoïdes) ne sont pas encore suffisamment complexes à l’heure actuelle et ne permettent pas de reproduire la complexité du tissu de la moelle osseuse. Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’utilisation de lignées de cellules leucémiques qui restent dépendante d’un support stromal pour survivre et proliférer est un avantage comparé à l'utilisation de lignées cellulaires ayant perdu cette dépendance. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de cellules leucémiques murines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 8 à 12 semaines au moment de la greffe.
Etude des maladies rénales chez la souris et mise au point d’un modèle ex vivo utilisant des reins de souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une biopsie de la queue, trois injections rétro-orbitaires quotidiennes et des séjours de six heures en cage métabolique deux fois par semaine : 2 000 souris vont être utilisées, 1 940 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 60 un niveau modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes, les reins au premier chef. Le projet consiste à mettre au point un système d'explants rénaux ex vivo et à le comparer à une maladie rénale provoquée chez l'animal par injection d'une substance. Le porteur présente ce système comme destiné à "remplacer l'utilisation de modèles animaux" et affirme qu'une seule souris permettra de tester de nombreuses molécules, tout en déclarant 2 000 souris pour y parvenir.
Objectifs
Les maladies rénales chroniques sont un enjeu majeur de santé publique. Nous développons un système d'explants rénaux ex vivo permettant l'étude de le physiopathologie rénale de façon dynamique. Ce modèle ex vivo sera comparé à un modèle in vivo de maladie rénale obtenu par injection d'une substance. dans ce modèle, la fonction rénale sera analysée grâce aux urines des animaux prélevés dans des cages à métabolisme.
Bénéfices attendus
A terme ce projet permettra le développement d'un modèle ex vivo de maladies rénales rares et sévères et la création d'une plateforme de criblage pour des candidats-médicaments. L'utilisation de modèle ex vivo permettra de réduire l'utilisation des animaux à des fins de recherches car une seule souris permettra de tester de nombreuses molécules.
Procédures
Biopsie à la queue (1 fois 10 secondes). Une injection rétro-orbitaire quotidienne pendant 3 jours (1 min/ jour). Prélèvements urinaires en cage métabolique sur animal vigile (6 heures d'isolement 2 fois par semaine).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension, douleur légère de courte durée au point d’injection et stress lié aux cages métaboliques.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
L'objectif du projet est de développer un système ex vivo permettant de remplacer l'utilisation de modèles animaux par un modèle ex vivo.
Réduction
Les accouplments sont optimisés pour réduire le nombre d'animaux générés à leur minimum. Le nombre d'animaux a été optimisé pour pouvoir avoir la puissance statistique nécessaire à l'analyse des résultats.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Une grille de score de souffrance et des points limites stricts et spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance, grâce à l'utilisation d'une analgésie. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les injections sont réalisées sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
La physiologie des fonctions rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. De la naissance à l'age adulte car nous avons un élevage. Les animaux adultes sont utilisés pour isoler les glomérules et pour le modèle pathologique.