Procédures modérées

Trois lignées de miniporcs Göttingen, dont une humanisée pour certaines immunoglobulines et une déficiente pour le récepteur à l'hormone de croissance, sont caractérisées pour le compte d'un consortium associant laboratoires publics et industriels du médicament. 126 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec administration unique ou répétée de composés à tester sur deux mois au maximum. Ils subissent des prélèvements sanguins, des examens ophtalmologiques, un enregistrement cardiorespiratoire sous gilet et parfois la pose chirurgicale d'un bouton d'accès vasculaire chez le fournisseur. Environ 24 d'entre eux pourront être réutilisés dans d'autres études et un petit nombre adopté, les autres étant tués pour des prélèvements terminaux, le porteur présentant l'ensemble comme un moyen de réduire à terme le recours aux primates non-humains.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un consortium financé par des fonds européens. Ce consortium international implique des partenaires privés (compagnies pharmaceutiques et sous-traitants) et publics (laboratoires universitaires) et a pour but d’étendre, partager au niveau international et mettre en pratique les connaissances des modèles porcins ; le but ultime étant de renforcer l’usage raisonné des miniporcs en réduisant le recours aux primates non-humains pour les études de sécurité non clinique. Les données générées par ce projet contribueront à : -Caractériser le modèle miniporc Göttingen, le miniporc Göttingen humanisé pour certaines immunoglobulines et le microporc Göttingen (déficient pour le récepteur à l’hormone de croissance), -Ddévelopper, valider et mettre en place des modalités non invasives innovantes pour assurer un meilleur suivi clinique des animaux et permettre une meilleure évaluation des systèmes nerveux et cardiovasculaires, -Enrichir notre compréhension du système immunitaire porcin, -Découvrir et/ou valider des biomarqueurs de toxicité et d’efficacité, -Evaluer l’intérêt des modèles porcins dans le développement des biothérapeutiques, -Contribuer à l’élaboration de modèle in vitro en collaboration avec les autres membres du consortium (ex : toxicité hépatique et rénale) chez le miniporc, -Alimenter une base de données largement accessible compilant les données existantes chez le primate non-humain et l’homme en comparaison avec les données chez le miniporc ou le microporc (données existantes ou générées lors du consortium). Ces données seront exploitées par des biostatisticiens pour évaluer l’intérêt translationnel de ces modèles porcins. A noter également que le consortium comprend des comités consultatifs dédiés aux aspects réglementaires, à l’éthique et au bien-être animal pour assurer le respect des 3R.

Bénéfices attendus

À court et moyen termes, ce projet enrichira nos connaissances scientifiques et notre expertise pratique sur trois modèles porcins. Une meilleure connaissance de ces modèles permettra de les utiliser à bon escient dans l’évaluation de la sécurité des médicaments permettant ainsi : -De générer des informations essentielles avant la première administration chez l’Homme, -D'identifier les candidats médicaments les plus prometteurs, -+D'interrompre plus tôt le développement de molécules ayant un profil non satisfaisant en termes de sécurité, d’efficacité et/ou de pharmacocinétique au regard de l’indication thérapeutique. À plus long terme, ces avancées pourraient offrir une alternative pertinente à l'utilisation de primates non-humains dans l'évaluation préclinique des candidats médicaments. Dans une perspective plus large, les connaissances acquises grâce à ce projet seront partagées au sein d’un consortium européen, regroupant partenaires privés et publics. Cette collaboration favorisera l'identification et la validation de nouveaux biomarqueurs comme indicateurs précoces de toxicité. Les biomarqueurs les plus pertinents pourront être proposés comme outils innovants pour adapter les essais cliniques, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives en matière de diagnostic et de médecine personnalisée par exemple.

Procédures

Les animaux seront concernés par l’administration unique ou répétée (quotidienne ou hebdomadaire) d’un composé à tester, possibles par différentes voies (le plus souvent intra-veineuse ou orale), au cours de l’étude sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements de sang ou autres fluides biologiques, associés à une contrainte légère de quelques minutes, seront nécessaires pour évaluer différents paramètres (par exemple hématologie, biochimie, immunologie) ; leur fréquence et leur volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie (entre 15 et 30 minutes) quand ils sont invasifs. Plus rarement, une procédure chirurgicale pourra être pratiquée chez le fournisseur afin de mettre en place un bouton d'accès vasculaire (durée d’intervention sous anesthésie générale-analgésie inférieure à 2 heures). Des mesures comme par exemple, la température corporelle, le poids sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. En outre, des examens peuvent être réalisés pour évaluer les grandes fonctions physiologiques : - examen ophtalmologique sur animal vigile ou légèrement sédaté (durée maximale : 10 min, 3 fois dans l’étude) - examen cardiorespiratoire et neurocomportementale, sur animal vigile équipé d’un gilet, (enregistrement continu sur 36h, répété 8 fois maximum dans l’étude).

Impact sur les animaux

Les effets attendus chez les animaux seront limités à une contrainte modérée. Ils correspondent aux effets adverses potentiels des produits administrés pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une modification du comportement de l’animal, une baisse de la consommation alimentaire, des signes digestifs type diarrhée, une perte de poids et/ou une modification de la température corporelle, et/ou une sensibilité accrue aux infections. Par ailleurs, les prélèvements et examens nécessaires au cours des études pourraient entraîner des nuisances de courte durée.

Devenir

Ces études nécessitent souvent des prélèvements terminaux (analyse anatomo-pathologique ou quantification de l’exposition tissulaire du composé à tester). C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas ces analyses que certains animaux pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre est d’environ 24 animaux. Seul un petit nombre d’animaux non génétiquement modifiés sera possiblement adoptés.

Remplacement

Ce projet s'inscrit dans une démarche globale des 3Rs visant à remplacer et/ou réduire et raffiner l'utilisation d'animaux de laboratoire, en s'appuyant sur les données qui seront générées par le consortium européen et le partage d'informations. Cette approche intègre plusieurs éléments clés : une revue bibliographique approfondie, l'utilisation de biologie moléculaire, le développement de modèles in vitro basés sur le modèle miniporc ainsi que l'analyse de données cliniques recueillies chez les patients. Pour mener à bien ces activités, une équipe pluridisciplinaire d'experts intervient pour optimiser l'utilisation des prélèvements sanguins et tissulaires générés pendant les études et pour développer des alternatives innovantes aux modèles animaux traditionnels. Le recours à l’animal de laboratoire reste cependant nécessaire car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant la complexité des interactions (notamment via le système immunitaire) d’un organisme entier et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci. De plus, il est nécessaire de pouvoir identifier ou valider des biomarqueurs présents dans les fluides biologiques et/ou certains tissus (accessibles sur animal entier) et de transférer les connaissances scientifiques acquises au cours de ces études aux études cliniques.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques, lignes directrices internationales et internes) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. Lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. De plus, le but ultime du consortium européen dans lequel ce projet s’inscrit est d’apporter une alternative pertinente à l’utilisation de primates non-humains en diminuant le recours à l’utilisation de ces animaux pour l’évaluation préclinique des candidats médicaments.

Raffinement

La contrainte des prélèvements et administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et d’entrainement avec distribution systématique de récompenses alimentaires (par exemple, pour certains prélèvements sanguins, mis en hamac après training avec renforcement positif, ou habituation à la position assise pour un entrainement à l’administration par voie orale ou aux prélèvement sanguins). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et de mettre en place des mesures spécifiques (changement de dose, arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support ou analgésie) par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire en application des points limites stricts et spécifiques de la procédure. De plus, des examens non invasifs complémentaires (capteurs intégrés à des gilets, vidéo-surveillance) permettront un meilleur suivi clinique des animaux tout au long des études. En outre, des prélèvements de sang ou de tissus seront effectués pour développer des nouveaux marqueurs sanguins et mettre en place une banque de tissus en collaboration avec les partenaires du consortium européen.

Choix des espèces

Les porcs sont utilisés pour la recherche biomédicale et dans des études visant à évaluer l’efficacité, la pharmacocinétique, le métabolisme et la toxicité des médicaments. D’un point de vue anatomique et/ou physiologique, les systèmes cardiovasculaires, urinaires, tégumentaires et digestifs des porcs ont, en particulier, été considérés comme utiles dans la modélisation chez l’Homme. La taille et le poids important des porcs domestiques (charcutiers) ont été considérés inadaptés à la Recherche. En conséquence, des souches plus petites ont été développées grâce à un processus de sélection (miniporcs), et sont utilisées comme animal de laboratoire car elles sont plus faciles à manipuler et nécessitent également moins de substances actives/formulation. Pour renforcer davantage la pertinence des modèles porcins à des fins scientifiques, plusieurs souches ont été récemment développées : le miniporc humanisé pour IgG1 et IgG4 permettant de limiter les réactions immunogéniques non transposables à l’Homme et le microporc transgénique déficient pour le gène du récepteur à l’hormone de croissance permettant une réduction supplémentaire de la taille des miniporcs. Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes afin d’évaluer de manière satisfaisante les profils PK, PD, et toxicologiques de molécules pharmaceutiques.

Neuf séances d'imagerie sous anesthésie générale, la tête maintenue dans un cadre par les oreilles, précédées chacune d'une mise à jeun la veille, et trois ponctions de liquide céphalorachidien. 15 macaques à longue queue vont subir cela dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après qu'un syndrome parkinsonien leur a été provoqué par une vingtaine d'injections hebdomadaires d'un neurotoxique. Le RNT qualifie l'imagerie de "non-invasive et indolore" et limite la durée sous anesthésie à deux heures, quand la description des procédures annonce trois heures au maximum. Tous les macaques seront tués à la fin de l'étude pour comparer les mesures non invasives à des dosages dans les tissus, le porteur présentant le don de leurs tissus comme une façon de "valoriser l'animal".

Objectifs

La créatine (Cr) est une molécule qui, dans le cerveau, permet aux cellules de se constituer une réserve d'énergie. Elle circule dans le sang et rentre dans le cerveau via le transporteur de la créatine (CRTR). Le déficit de ce transporteur est responsable d’une maladie neurologique rare : en entrainant une absence de Cr et donc un déficit énergétique au niveau cérébral, il conduit à des retards mentaux sévères, un syndrome autistique et des crises d’épilepsie chez les enfants. A ce jour, aucun traitement n’est disponible. La supplémentation en Cr a été évaluée mais le traitement ne peut pas entrer dans le cerveau . On a développé une Cr modifiée (appelée « molécule test »)) pour le traitement des maladies neurologiques avec un déficit énergétique. Evaluée sur un modèle murin de la maladie liée au déficit de CRTR,, « molécule test » sous forme de microémulsion a permis l’amélioration des fonctions cognitives ainsi qu’une restauration des niveaux de Cr dans le cerveau. Afin d’envisagerun essai clinique de phase 1, il est important de mettre en place au préalable des outils non invasifs de suivi et de poursuivre ces expériences dans des modèles d’étude précliniques plus pertinents. De plus, dans la perspective de généraliser ce traitement à d’autres maladies neurologiques qui présentent des déficits énergétiques, des essais sur des modèles murins de la maladie de Parkinson montrent un effet thérapeutique significatif après un mois d’administration intra-nasale. En effet, la Cr est non seulement une importante source d'énergie pour les cellules, mais possède également des propriétés anti-oxydantes directes. Elle empêche la mort cellulaire en aidant au maintien de l'intégrité des mitochondries, les organites de respiration des cellules. Les déficits de fonctionnement des mitochondries et la génération d’espèces oxydatives sont des causes connues de mort cellulaire dans la maladie de Parkinson. En nous appuyant sur ces premiers résultats, et sur des données déjà acquises chez le modèle primate sain, l’objectif de notre étude est d’évaluer sur un modèle primate de la maladie de Parkinson l’efficacité thérapeutique de la « molécule test »contre cette maladie et de valider les biomarqueurs pertinents qui permettraient de suivre l’efficacité de ce traitement avec des outils non invasifs tels que l’imagerie cérébrale .

Bénéfices attendus

Il existe un besoin de traitement efficace contre les dysfonctionnements mitochondriaux bien établis dans la maladie de Parkinson. Aujourd’hui, aucun traitement n’est disponible, en particulier à cause de la difficulté de pénétrer dans le cerveau en passant la barrière hématoencéphalique. La « molécule test », capable de rentrer dans le cerveau, pourrait relever ce défi. ralentissant ou arrêtant les dysfonctionnements mitochondriaux des neurones afin d’éviter leur mort et ainsi d'entraver la progression de la maladie de Parkinson. Notre approche originale de l’administration de la « molécule test » grâce à un spray intra-nasale vise ainsi à améliorer les symptômes moteurs et la cognition des patients atteints de la maladie avec une approche peu invasive. Au-delà de fournir un nouveau traitement, le développement et la validation des techniques d’imagerie non invasive proposées aura des applications directes en clinique. Ceci permettra de mesurer directement in vivo le taux de la créatine présente, un biomarqueur essentiel dans le suivi des patients qui subiront ce type de traitement.

Procédures

Tous les primates subiront 9 examens d’imagerie non invasive sous anesthésie générale de 3h max. Trois prélèvements de sang et liquide céphalorachidien (LCR) seront faits sur tous les animaux sous anesthésie générale (30min). La maladie de Parkinson sera induite chez tous les animaux par injection intramusculaire chronique hebdomadaire d’une molécule chimique, utilisée depuis 40 ans en milieu scientifique. Le nombre d’injections est animal dépendante et variable mais inférieur à 20 et la durée du geste est de 2 minutes. L’évolution de la maladie chez les animaux sera évaluée à l’aide d’une échelle clinique (observation simple) basée sur la motricité pour ajuster le régime d’injections et atteindre des symptômes parkinsoniens modérés. Les primates seront également filmés une fois par semaine pendant 3 mois au maximum et les vidéos de 30 minutes seront analysés pour quantifier la distance totale parcourue et la vitesse de déplacement.. Une fois le modèle stable, le traitement avec la « molécule test » ou son solvant comme contrôle lui sera administré par spray intranasale une fois par jour, 5 jours par semaine pendant 3 mois.

Impact sur les animaux

La procédure d’imagerie est non-invasive et indolore. Cependant, le caractère répétitif de l’anesthésie et la mise à jeun la veille de chaque séance d’imagerie sont pris en compte à l’égard des point limites. La durée des examens sous anesthésie est limitée à 2h pour minimiser tout inconfort et le risque d’hypothermie est contrôlé par le soutien thermique (couverture chauffante et plaids). L’irritation locale au niveau des oreilles, pour maintenir la tête dans un cadre, est possible. Le temps d’acclimatation et le respect de temps de pause entre séances d’imagerie devraient minimiser les nuisances pour les animaux. La pesée hebdomadaire permettra de dépister toute altération causée par les mises à jeun répétées et de compenser avec un supplément de nourriture avant d’arriver aux points limites si besoin. L’induction du modèle parkinsonien demande des injections intramusculaires qui, selon l’expérience de notre laboratoire, ne sont pas irritantes localement. Une alternance droite-gauche sera quand même mise en place pour réduire l’inconfort. L’induction du syndrome parkinsonien peut donner lieu à un manque d’appétit et de soif transitoire et une prise en charge pour le soutien alimentaire des animaux au quotidien (plusieurs fois par jour) sera faite . L’administration intranasale du produit est rapide et indolore mais demande une contention qui pourrait être stressante pour les animaux. Une accoutumance à la contention et à l’interaction avec les intervenant formés à réaliser ce geste sera effectuée au préalable. Le produit et la voie intranasale ont déjà été testés chez le primate sain et n’ont pas donné lieu à des irritations des muqueuses nasales, mais la dilution du produit et sa fréquence d’administration seront adaptés si besoin. Si nécessaire, les administrations intra-nasales se feront sur l’animal sédaté très légèrement en vue de la proximité de la bouche et du risque pour le manipulateur. L’hébergement individuel lors des mises à jeun ou des intoxications pourrait être une source de stress pour les animaux qui sera réduit au maximum, avec des mises en groupe temporaires et hors repas.

Devenir

A la fin de l’étude, les modèles animaux seront euthanasiés pour valider la sensibilité et la robustesse des mesures non-invasive du métabolisme neuronal versus une mesure invasive dans les tissus, impossibles à pratiquer chez le patient. A l'issue de cette dernière, un don de tissus sera effectué dans une optique de réduction du nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques afin de valoriser l'animal.

Remplacement

Le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour atteindre les objectifs fixés dans ce projet. En effet, aucun milieu de culture ou système synthétique ne permet aujourd’hui d’évaluer l’’utilisation de la voie nasale pour cibler directement le cerveau (voie « nose-to-brain ») via les nerfs olfactifs et trijumeaux. Seul un modèle animal permet de tenir compte des interactions structurelles et fonctionnelles de ces nerfs et cellules, et ainsi de valider une voie d’administration du traitement originale et peu contraignante pour les patients ainsi qu’un biomarqueur d’imagerie in vivo. Les animaux étudiés dans le cadre de ce projet proviendront d’élevages reconnus.

Réduction

Un total de 15 primates est prévu dans ce projet pour tester l’efficacité de la « molécule test » contre les dysfonctionnements métaboliques connus dans un modèle primate de la maladie de Parkinson. Les groupes expérimentaux permettront de comparer 4 animaux modérément parkinsoniens traités avec cette molécule thérapeutique, ou avec son solvant (n=4) et un groupe contrôle (n=4). Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par retour d’expérience de plusieurs projets portant sur ce même modèle animal qui ont démontré une efficacité thérapeutique robuste et donné lieu à des essais cliniques en utilisant les mêmes outils d’imagerie et étude comportementale. Le suivi longitudinal/répété chez le même individu par des méthodes d’évaluation non-invasives, comme le comportement et l’imagerie, permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives dans le temps entre les groupes.

Raffinement

Afin de minimiser le stress et l’angoisse les animaux l arriveront au moins un mois avant le début de l’étude. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation d’examens d’imagerie comporte des analgésiques pour minimiser les sensations désagréables lors de l’intubation et l’emplacement dans le cadre d’imagerie. En lien avec ces procédures d’imagerie, certains point limites ont été définis en lien avec une potentielle réaction à l’anesthésie de certains individus très rarement observée dans notre laboratoire. Les paramètres physiologiques (rythme cardiaque, pression artérielle, fréquence respiratoire) sont utilisés pour adapter la profondeur d’anesthésie et comme témoins de la gestion de l’analgésie. Le maintien de la température corporelle est assuré par une couverture chauffante avec rétrocontrôle (sonde rectale). Les primates non-humains seront hébergés en groupes sociaux dans des cages équipées spécifiques de l’espèce. La durée de l’hébergement individuel sera limitée aux mises à jeun pour les séances d’imagerie et l’induction du syndrome parkinsonien, tout en gardant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres primates hébergés dans la même pièce. Des enrichissements adaptés seront mis en place : structurels (balançoire, miroir); alimentaires (fruits, graines dans le fourrage); manipulables (jouets); auditifs (musique). En effet, en préparation à toute manipulation pour le nursing lors de l’induction du parkinsonisme et des administration intra-nasales, un contact quotidien positif sera établi à travers la distribution de friandises à la main et entrainement à boire à la seringue. Les injections intramusculaires pour l’induction du modèle de Parkinson sont réalisées à l’aide de seringues de type « insuline » avec une aiguille très fine pour réduire l’inconfort locale liée à des injections répétées et en alternant les sites d’injection (droite-gauche). Le nombre totale d’injections pour générer un modèle modéré de la maladie de Parkinson ne devrait pas dépasser 30 piqûres sur 7-10 jours consécutifs, puis une injection hebdomadaire. Une échelle d’observation des symptômes sera utilisée au quotidien pendant la période d’induction du modèle pour ajuster le rythme des injections. Les administrations intra-nasales sont rapides et indolores mais une accoutumance à ce mode d’administration du produit sera également mise en place après acclimatation et avant l’initiation de l’étude.

Choix des espèces

Les primates non humains possèdent une architecture cérébrale semblable à celle de l’humain, avec notamment un cortex plissé présentant de nombreux sillons cérébraux et circonvolutions. De plus, leur métabolisme est plus proche du métabolisme humain que ne l’est le métabolisme du rongeur. La maladie de Parkinson et les déficits métaboliques qui entrainent une mort neuronale se produisent chez le patient adulte et les animaux recrutés pour l’étude seront également au stade adulte. Sans compter que la maturation du cerveau peut avoir un impact sur la quantité totale de créatine ainsi que la génération du modèle parkinsonien chez le macaque juvénile est difficile en vue de sa plasticité. Adulte (développement du cerveau achevé) entre 4 et 9 ans. La maturation du cerveau peut avoir un impact sur la quantité totale de créatine et la génération du modèle parkinsonien chez le macaque juvénile est difficile en vue de la plasticité extrême du système nerveux central.

Cinq injections en cinq jours pour faire pousser une tumeur de la prostate, puis une castration chirurgicale de trente minutes, puis des injections bloquant ou stimulant les cellules tueuses naturelles jusqu'à trois fois par semaine, et enfin un inhibiteur de l'hypoxie cinq jours par semaine. 8 660 souris vont être utilisées de cette façon, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur chiffre à une heure et deux minutes le temps total d'intervention par animal et qualifie les douleurs postopératoires de mineures. Il annonce vingt animaux par groupe expérimental, sans expliquer comment ce calcul aboutit à 8 660 souris.

Objectifs

Afin de mieux comprendre la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate (CaP), ce projet vise à étudier les effets de la castration chirurgicale dans plusieurs modèles murins de cancers prostatiques. En effet, le traitement du cancer de la prostate chez l'homme repose sur la chirurgie et l'utilisation de traitement anti androgénique appelé castration chimique. Malheureusement, après un temps limité de sensibilité aux traitements, 20% des patients développent des résistances à ces traitements et les cancers "résistants à la castration" sont de très mauvais pronostic. Il est donc primordial de mieux comprendre la résistance à la castration. Les études récentes menées au laboratoire mettent en évidence une implication forte du facteur de transcription Hif1a induit par l'hypoxie dans le développement de la résistance à la castration. Ainsi nous voulons étudier le mécanisme moléculaire sous-jacent pour mieux comprendre par quel biais l'inactivation de Hif1a rend ces tumeurs sensibles à la castration. Nos données préliminaires montrent un infiltrat de cellules natural killer majeur dans les souris sensibles à la castration comparé à celles qui présentent des tumeurs résistantes à la castration. L'objectif est donc de conduire une étude dans laquelle les cellules natural killer sont bloqués ou stimulés afin de voir la réponse sur la croissance des tumeurs après castration. Comme nos premières études déjà publiées montrent également un effet de l’inhibition d’Hif1a sur la résistance à la castration nous aimerions tester l’effet synergique de l’inhibition de Hif1a et de l’activation des cellules NK dans des cancers résistants à la castration. L’objectif est également d’étudier le rôle des cellules natural killer dans l’initiation des métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si la stimulation des cellules Natural killer peut empêcher l'apparition de métastases et si la combinaison entre la stimulation des cellules Natural killer et l'inhibtion de Hif1a peut permettre une meilleure sensibilisation à la castration et par quels mécanismes. Si cela s'avère être le cas, cette étude pourra ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate résistant à la castration.

Procédures

Les souris subiront 5 injections sur 5 jours pour induire l'apparition des tumeurs (5 minutes par souris), puis une intervention chirurgicale (castration ou contrôle) à différents stades de la tumeur (30 min par souris) et les injections de traitement stimulant ou bloquant les cellules natural killer 1 à 3 fois par semaine pendant 0 à 4 semaines (jusqu'à 12 minutes) et une administration d'un inhibiteur de l'hypoxie 5 fois par semaine pendant 0 à 3 semaines ( jusqu'à 15 minutes). Les animaux subiront donc 1 heure et 02 minutes d'intervention.

Impact sur les animaux

Les effets secondaires post chirurgicaux sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas. En cas de mauvaise ligature des artères, une hémorragie peut avoir lieu. Cette complication est très rare et facilement visible du fait du gonflement important de la zone et d'effets secondaires généraux sur l'animal. Le blocage des cellules natural killer a été déjà éffectué dans de nombreuses études chez la souris et sont administrés en routine par un laboratoire collaborateur sans observation d'effets secondaires. L'activation des cellules natural killer peut engendrer une perte de poids transitoire des souris traitées dans les 48h suivant l'administration, les souris reprennent habituellement leur poids de départ dans la semaine qui suit l'injection. La croissance des tumeurs de prostate est lente et donc les variations de poids liée à leur croissance ou régression sur 2 semaines est négligeable. L'inhibition de l'hypoxie peut entrainer une perte de poids général de l'animal qui sera suivi au cours du temps.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les organes et de les analyser.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.Par ailleurs, nous utilisons des organoïdes dérivés des tumeurs pour étudier un certain nombre de paramètres, cependant l'étude du microenvironnement nécessite de se placer en condition in vivo stricte.

Réduction

Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Afin d’obtenir des résultats significatifs avec une bonne puissance, nous aurons besoin de 20 animaux par groupe. Le nombre d’animaux sera de 8660 souris maximum.

Raffinement

On procèdera à l'anesthésie générale des souris par inhalation d'isoflurane, et après l'induction, une analgésie par buprénorphine en injection intrapéritonéale sera faite. En post-opératoire, une analgésie systématique par injection de métacam sera faite. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, de la buprénorphine sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage.Par ailleurs, les animaux castrés (ouverture abdominale avec retrait des tesitcules) et les animaux opérés mais non castrés (ouverture abdominale sans retrait des tesitcules) seront séparés: une cage opérée mais non castrée versus une cage castré par exemple pour éviter tout risque de domination. En cas de signe de douleur (dos voute, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation, l'animal sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Après les injection-intrapéritonéales, les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter une éventuelle infection sur les sites d'injection, et en cas d'observation de rougeur, de voussure ou de signe de douleur, les animaux seront retirés de l'étude et un avis vétérinaire sera pris. Par ailleurs, pour prévenir une éventuelle perte de poids liée aux traitements, le poids sera pris 1 fois par semaine pendant la durée de l'étude et si une diminution est observée, de la nourriture enrichie sera administrée aux souris, si une perte de poids une perte de plus de 20% était détectée, les animaux seraient mis à mort et retirés des études.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le CaP humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes. A l'âge de 8 semaines, nous administrons un produit pour induire le développement de tumeurs. Puis à différents temps, nous débutons les expériences (castration, neutralisation des cellules Natural Killer, stimulation de ces cellules et l'inhibition de l'hypoxie) avec les différents groupes expérimentaux et nous euthanasierons les animaux à un temps court et un temps long après les traitements.

Gavées quinze jours ou nourries trois mois avec des compléments, certaines recevant en plus une injection de LPS pour déclencher une inflammation aiguë, 1 280 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Le projet cherche à démontrer qu'une supplémentation nutritionnelle limite le déclin cognitif et les troubles de l'humeur liés à l'âge. Le porteur annonce des tests comportementaux de cinq à dix minutes étalés sur trois semaines, sans préciser lesquels, et ramène les effets attendus du gavage quotidien à une irritation de l'œsophage.

Objectifs

Le projet vise à étudier l’impact de nutriments/ combinaison de nutriments sur les capacités cognitives chez des souris adultes et âgées ainsi que les mécanismes d’action mis en jeu dans ces processus (neuroinflammation par exemple).

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de démontrer qu’une supplémentation nutritionnelle en nutriments permet 1) de limiter et de prévenir le déclin cognitif lié à l’âge et donc de favoriser le vieillissement en santé, véritable enjeu de santé publique dans une population toujours plus vieillissante ; 2) de limiter les symptômes les troubles de l’humeur (anxiété, diminution de l’interaction sociale, dépression) associés au vieillissement. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre de recherche portant sur la nutrition préventive et personnalisée. Les résultats attendus sont donc une amélioration des troubles de l’humeur et de la cognition au cours du vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions afin d’évaluer l’impact de la supplémentation nutritionnelle sur la santé cognitive et mentale. Les supplémentations nutritionnelles seront données soit dans leurs croquettes pendant 3 mois, soit par gavage gastrique pendant 15 jours. Enfin, certains animaux recevront une seule injection de LPS en ip afin d’induire une inflammation aigue qui sera évaluée 2h après. Les tests comportementaux d'une durée de 5 à 10 min sont étalés sur environ 3 semaines et chaque test est séparé du suivant d'au moins 2 jours pour le bien-être des animaux.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas d’effets indésirables attendus induits par la supplémentation nutritionnelle car l’alimentarité du produit a été démontré. Cependant le gavage quotidien peut avoir des effets indésirables légers comme une irritation de l’œsophage. Les tests comportementaux induisent un stress de courte durée (le temps du test) chez l’animal. L’injection de LPS peut induire un malaise aigu pendant quelques heures après l’injection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les cerveaux et réaliser des analyses biochimiques ou immunohistologiques.

Remplacement

L’étude des comportements de type cognitifs et troubles de l’humeur ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au mieux en se basant sur des expériences préalablement menées au laboratoire qui ont montré́ par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. La significativité́ de différence statistique entre plusieurs groupes sera déterminée par analyse de variance ou t-test ou tests non paramétriques en fonction des comparaisons souhaitées. D’après les études déjà menées au laboratoire sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 16 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique/sédatif avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. L’hébergement se fera en cage collective et l’environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. Les animaux seront soumis à plusieurs tests comportementaux toujours espacés d’au moins 2 jours afin de limiter le stress. Des points limites ont été quantifiés pour limiter toute douleur chez les animaux.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. C’est un animal sur lequel les traitements nutritionnels et les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Les souris seront utilisées soit adultes pour valider les déficits comportementaux des animaux âgés (groupe contrôle), soit âgées pour évaluer l’impact de la supplémentation sur la prévention des troubles cognitifs et de l’humeur liés à l’âge.

Nourries vingt semaines à un régime gras jusqu'à l'obésité et au diabète, puis gavées chaque jour pendant vingt-huit jours et isolées en cage individuelle sur toute cette période, 220 souris subissent aussi quatorze incisions de la veine de la queue pour mesurer leur glycémie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que le régime peut altérer les capacités motrices au point de rendre l'animal incapable d'accéder à la nourriture et à la boisson, créer un état dépressif et de l'anxiété, et que l'hébergement individuel sera "source d'angoisse prolongée". Toutes sont tuées à la fin de la procédure pour les analyses post-mortem.

Objectifs

La prévalence mondiale de l’obésité est en constante progression. L'obésité est un facteur de risque majeur pour le développement du diabète de type 2 et de perturbations cardiométaboliques dont la MAFLD (Metabolic dysfunction-Associated Fatty Liver Disease). Cette pathologie est principalement caractérisée par une profonde perturbation du métabolisme du foie et par un développement de fibrose. Actuellement, aucune approche médicamenteuse efficace n’est commercialisée à l’heure actuelle. L’objectif de notre projet est d’étudier les potentielles interactions entre 2 cibles thérapeutique sur l’évolution de fibrose dans un modèle de souris souffrant de MAFLD.

Bénéfices attendus

La prise en charge et le traitement du diabète de type II et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses bien que multiples voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un récepteur et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi leur efficacité. Ce projet permettra de nous renseigner sur le réel potentiel thérapeutique d’une double approche pharmacologique dont les deux stratégies ont déjà chacune démontré des effets hépato-protecteurs. Ceci pourrait avoir un réel impact pour les patients.

Procédures

Pendant les 20 premières semaines de la procédure, les souris seront manipulées hebdomadairement pour monitorer leur masse corporelle. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 10 minutes par souris cette période. Pendant les 28 jours de traitements pharmacologique, la masse corporelle sera évaluée quotidiennement. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 14 minutes par souris cette période. De plus, l’administration quotidienne des traitements pharmacologiques par gavage oro-pharyngé nécessitera l’immobilisation de chaque animal pendant 10 secondes supplémentaires, soit 19 minutes au total par animal sur cette période et 29 minutes sur l’ensemble du projet. Pour chaque test nécessitant une mesure de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local afin de prélever du sang total et ainsi réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle).

Impact sur les animaux

En plus d’une altération des paramètres métaboliques, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Enfin, l’hébergement en cages individuelles pendant les 28 derniers jours de la procédure sera source d’angoisse prolongée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

L’obésité, le diabète de type 2 et le développement de MAFLD sont le fruit de dérégulations multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin et une perturbation de l’homéostasie lipidique ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier ces aspects, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de réaliser des effets doses, ni de multiplier les temps de traitements, pour un large spectre de molécule, dont celles utilisées dans ce projet. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe (10 animaux par cages) pendant les 20 premières semaines avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. Pendant les traitements pharmacologiques, les souris seront amenées à être hébergées de manière individuelle afin de pouvoir monitorer la prise alimentaire quotidienne pouvant être influencée par les différends traitements. Pour chaque cas, un enrichissement plus important sera apporté dans chaque cage. De plus, le contact visuel et olfactif entre animaux sera maintenu via l’utilisation de cages transparentes sans couvercle filtrant.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le début du projet fera appel à des souris de 12 semaines. Considérant les 20 semaines de régime WD, les animaux seront âgés de 32 semaines lors du commencement de l’approche pharmacologique et de 36 semaines lors de la fin de l’expérimentation.

Une fausse route pendant le gavage ou un saignement qui ne s'arrête pas après une prise de sang entraînent la mise à mort immédiate de l'animal. 130 souris vont être utilisées dans ces conditions, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus. Elles sont gavées, saignées toutes les trois semaines, privées d'eau et de nourriture quatre heures avant chaque gavage, isolées une heure pour la collecte des fèces et placées en cage à métabolisme. L'objet réel du projet est de comparer des émulsifiants alimentaires, protéines de pois et arabinoxylanes, à un polysorbate déjà utilisé par l'industrie, le porteur qualifiant ces gestes de "nécessaires pour répondre aux questions scientifiques d'intérêt".

Objectifs

La carence en vitamines liposolubles, une forme courante de malnutrition, pose des défis importants à la santé humaine et au développement dans le monde entier. Malgré leur rôle crucial dans le métabolisme et l'immunité, les carences en vitamines liposolubles constituent un problème de santé mondial qui touche tous les groupes d'âge. Les émulsions huile dans eau sont souvent utilisées pour encapsuler et délivrer ces vitamines. La plupart des études disponibles reposent sur des études in vitro et mettent en jeu des émulsifiants tels que le polysorbate 80, la carboxyméthylcellulose ou l'hydroxypropylcellulose. Bien qu'il s'agisse d'émulsifiants largement utilisés par l'industrie alimentaire, leur utilisation dans les produits de consommation courante fait l'objet d'une certaine controverse car certaines données suggèrent que ces émulsifiants ont un impact négatif sur le microbiote intestinal, en augmentant sa capacité à pénétrer la couche de mucus normalement stérile, et qu'ils peuvent être à l'origine d'une inflammation intestinale et d’états pathologiques associés. Parallèlement à cette controverse, l'intérêt pour une transition vers des aliments et des ingrédients plus durables est apparue ces dernières années, tant dans la communauté des chercheurs que dans l'industrie alimentaire. Les régimes alimentaires durables sont des régimes alimentaires ayant de faibles conséquences sur l’environnement, qui contribuent à la sécurité alimentaire et nutritionnelle ainsi qu’à une vie saine pour les générations présentes et futures. Ce projet de recherche vise donc à évaluer l'effet inflammatoire/anti-inflammatoire d’émulsions stabilisées par des émulsifiants « durables » (protéines de pois, arabinoxylanes), sans et avec vitamines liposolubles, chez la souris et de comparer leurs effets à ceux induits par une émulsion stabilisée par des polysorbates. Le projet cherche également a évaluer les conséquences de l’usage de ces nouveaux émulsifiants sur la métabolisation des vitamines.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de clarifier plusieurs questions scientifiques, à savoir : • Connaître l'effet inflammatoire/anti-inflammatoire et l’effet sur la perméabilité intestinale de nouveaux émulsifiants « durables » et voir si les vitamines peuvent réguler cet effet inflammatoire. • Evaluer la nature de la métabolisation des vitamines E et D et l’effet des émulsionnants sur cette métabolisation.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins au début puis 1 fois toutes les 3 semaines pendant la procédure. La durée de chaque prélèvement sanguin est calculée autour de 5 minutes. Le gavage sera réalisé avec les animaux en état de vigile. La procédure de gavage est estimée à 2 minutes hors la préparation de la seringue.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont : 1) Stress lié à la manipulation pendant les prélèvements, pesées hebdomadaires et des changements de litière 2) Stress pendant les prélèvements sanguins 3) Stress pendant le gavage. 4) Stress lie à la privation d’eau et de nourriture pendant 4h avant les gavages, et la séparation des individus pendant le temps nécessaire pour collecter les matières fécales (approximativement 1 h) 5) Stress lie aux cages à métabolisme Malheureusement il s’agit de gestes nécessaires pour répondre aux questions scientifiques d'intérêt

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés pour évaluer les effets des émulsifiants sur l’inflammation et la métabolisation des vitamines E et D.

Remplacement

Les modèles in vitro (e.g. culture cellulaire) ne reproduisent pas la complexité biologique du tube digestif (mucus, mouvement, échange entre organes, présence d’un microbiote). Le recours au modèle animal demeure la meilleure approche pour étudier l’inflammation et la métabolisation des vitamines puisque (actuellement) seul un modèle animal permet d’avoir une approche intégrée de ces phénomènes complexes multiparamétriques.

Réduction

Ce projet est constitué de 13 conditions au maximum. Ce nombre est choisi en se basant sur les résultats préliminaires physicochimiques qui ont permis d’éliminer les conditions non pertinentes et donc de réduire drastiquement le nombre d’individus. Pour chacune de ces conditions, et compte tenu de la variabilité interindividuelle existant chez la souris et de la difficulté de la mise en place du protocole, des groupes de 10 individus sont nécessaires pour assurer la validité statistique du phénomène observé. Un nombre plus restreint d’animaux ne permettrait pas une finesse suffisante des résultats pour répondre à nos objectifs de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Le début des régimes aura lieu après 7 jours d’adaptation dans l’animalerie. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. L’enrichissement sera actualisé toutes les semaines afin d’apporter de la nouveauté aux souris. L’enrichissement sera fait avec des igloos, des tubes, des cabanes, du papier kraft, de la cellulose, du bois ou du foin. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Tout animal présentant des signes de mal-être sera mis à mort. Une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Les souris seront observées 15 minutes après la procédure pour détecter des signes de douleur ou de détresse. Dans le cas d’une fausse route lors du gavage ou d’un mal-être des souris, les animaux seront mis à mort Pour atténuer les niveaux de stress des souris associés a les cages à métabolisme, les souris seront soumises une période d’habituation des souris : 2 ou 3 jours avant la collecte d’urine, les souris seront placés 8h dans les cages afin qu’elles s’imprègnent de cet environnement. Toutes les procédures invasives (prélèvement sanguins, mis à mort) seront réalisées sous anesthésie générale. Lors des prises de sang, si le saignement venait à ne pas s'arrêter, l'animal serait immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Dans cette étude nous utilisons des souris pour évaluer la biodisponibilité des micronutriments et de l’inflammation, car leur système de digestion et d’absorption est anatomiquement proche de celui de l’homme. L’utilisation de ce modèle permettra la comparaison de résultats avec des études scientifiques déjà disponibles. Bien que nous devions essayer d'utiliser des modèles cellulaires in vitro chaque fois que possible pour réduire le nombre d'animaux au minimum, dans ce projet, les modèles cellulaires disponibles ne peuvent pas fournir de réponses à nos questions, lorsque des processus physiologiques complexes sont impliqués. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement et rester comparable avec les études déjà faites, qui utilisent aussi de jeunes adultes.

Une injection sous la peau tous les deux jours pendant trente-cinq jours, deux passages sur tapis de course, deux gavages au glucose et deux séances d'imagerie sous anesthésie. 256 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leurs organes soient pesés et analysés. Elles sont d'abord rendues obèses par douze semaines de régime hyperlipidique, afin de tester une molécule anti-obésité seule ou associée à une molécule de référence. Le porteur résume les nuisances à des injections "pouvant altérer le bien-être" des animaux, écrit être "malheureusement contraint" d'utiliser des modèles animaux, et précise que l'efficacité de cette molécule a déjà été validée in vitro et in vivo par ses collaborateurs américains.

Objectifs

L'obésité est un problème de santé publique majeur et croissant qui est fréquemment associé à des complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l'hypertension, des concentrations de lipides élevées dans le sang et les maladies hépatiques. Le développement de nouvelles molécules susceptibles de réguler la prise alimentaire, de réduire la masse grasse et de renforcer la masse musculaire est actuellement en plein essor. L’objectif de ce projet est de tester l'effet d’une nouvelle molécule pharmaceutique d’intérêt donnée seule ou en combinaison avec une molécule de référence.

Bénéfices attendus

Notre étude, en améliorant la connaissance sur les effets et le mode d’administration de nouvelles molécules pour lutter contre l'obésité et ses complications nous permettra de préparer la mise en place d’une étude clinique de phase 1 et à terme une meilleure prise en charge des patients obèses. Cette étude permettra de déterminer si au-delà de la perte de masse grasse attendue, on peut aussi espérer voir une augmentation de la masse musculaire.

Procédures

Les souris recevront tous les 2 jours une injection sous-cutanée sur une période de 35 jours. Des prélèvements de sang ponctuels seront effectuées à j32 et à J53. Les souris subiront deux gavages oraux avec du glucose à jour 32 et 53. Une mesure d'activité physique sur tapis de course sera réalisée à jour 26 et à jour 47. Une mesure de dépense énergétique sera faite à jour 29 et 50. A jour 35 et 56, une acquisition d’images d'une durée de 30 à 40 minutes sera réalisée sur animaux anesthésiés pour déterminer le pourcentage corporel en masse grasse et masse maigre. Un prélèvement sanguin terminal sera réalisé sous anesthésie avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Le protocole comporte des actes (injections sous cutanée) pouvant altérer le bien-être temporaires des animaux et apporter un stress sur une courte durée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récolter et peser différents organes pour définir les conséquences du traitement et permettre des analyses moléculaires des modifications induites.

Remplacement

Il est à noter que l'efficacité de la molécule a déjà été validé par nos collaborateurs américains via une étude pilote réalisée in vitro et in vivo. Le métabolisme énergétique et le développement de l'obésité est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier ce paramètre d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux.

Réduction

Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée et d'un logiciel dédié au calcul d'effectif. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude.

Raffinement

Enfin, les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. Les cages seront enrichies par des frisottis et un dôme en carton. Après une semaine d'adaptation et d'acclimatation, les souris seront nourries pendant 12 semaines avec le régime hyperlipidique. Afin de limiter les souffrances expérimentales, une surveillance attentive et quotidienne des animaux sera réalisée au cours de la procédure. Des signes cliniques définissant les points limites, au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal euthanasié, ont été fixés.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser de manière intégré les mécanismes de régulation de l'homéostasie énergétique. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie (et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines au moment de la mise sous régime hyperlipidique et la fin des études sera prévue 16 à 19 semaines plus tard. A cet âge, les paramètres métaboliques sont stables et ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.

Nourries à un régime riche en graisses pendant toute l'expérimentation pour développer une fibrose du foie, 110 souris reçoivent deux injections par semaine pendant huit semaines, puis un second médicament au même rythme. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leur foie soit prélevé. Dans la rubrique des effets néfastes attendus, le porteur mentionne une diarrhée rare, du stress à la manipulation et une légère douleur aux points d'injection, puis termine en écrivant que les traitements "vont également améliorer l'état de santé des souris". Le bénéfice annoncé pour les patients reste à venir, le médicament de référence ne réduisant la fibrose que chez 21 % d'entre eux d'après le porteur lui-même.

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier l'efficacité d’une combinaison associant un potentiel traitement pour la fibrose du foie dans la Maladie Hépatique Associée au Syndrome Métabolique (MASH) et un anticorps pour une meilleure prise en charge de la MASH. Cette dernière, également connue sous le nom de maladie du foie gras, est la conséquence d’une alimentation trop riche en sucre et en graisse. Ce type d’alimentation va entrainer le stockage et l’accumulation de graisses dans le foie, ce qui va conduire à une inflammation locale au sein de l’organe. Cette inflammation chronique va entraîner avec le temps le développement d’une fibrose dans 20% des cas. Au stade précoce, la MASH est souvent asymptomatique et est généralement diagnostiquée lorsque la fibrose hépatique se développe, pouvant évoluer vers une cirrhose ou un cancer du foie dans les cas les plus graves. Un potentiel médicament a obtenu des résultats positifs dans un essai clinique de phase II pour le traitement de la fibrose dans la MASH. Cependant, il permet de retarder l’échéance en réduisant la fibrose chez seulement 21% des patients. Il y a donc un besoin urgent d’optimiser ce traitement. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie et du processus de fibrose hépatique. Cela suggère qu’une combinaison entre notre anticorps et ce traitement prometteur pourrait améliorer l’efficacité du traitement des fibroses hépatiques. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de la combinaison entre un traitement prometteur et notre anticorps sur la progression de la fibrose hépatique dans la MASH.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à étudier l’efficacité d’une combinaison thérapeutique associant, un traitement prometteur pour le traitement de la fibrose hépatique dans la MASH et un anticorps. Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’efficacité de cette combinaison afin d’envisager l’utilisation de cet anticorps en combinaison avec un potentiel traitement qui sera utilisé pour MASH. Cela permettra une meilleure optimisation thérapeutique chez les patients atteints de MASH et de fibrose hépatique et contribuera à améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.

Procédures

Afin d’induire une fibrose hépatique les animaux suivront un régime riche en graisses tout au long de l’expérimentation. Les animaux recevront un traitement par un anticorps 2 fois par semaine pendant 8 semaines par injection. Cette injection est réalisée sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux recevront également un 2ème médicament par injection 2 fois par semaines pendant 8 semaines. Les traitements sont réalisés sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisé. Un prélèvement de sang sera réalisé avant et pendant le traitement afin d’évaluer l’évolution de la fibrose hépatique. Avant d’effectuer ces prélèvements de sang, les souris recevront un anesthésiant local puis ces dernières auront une anesthésie générale. Cette procédure est réalisée en 1 minute environ. Les animaux subiront également un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Le médicament étudié peut de rare fois entrainer une diarrhée. Un stress lors de la manipulation des souris pour réaliser les traitements risque également d’être observé. Une légère inflammation ainsi qu’une légère douleur de courte durée suite aux injections risque d’être observées. L’injection des traitements vont également améliorer l’état de santé des souris en diminuant la pathologie (fibrose hépatique par exemple).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures. Cela permettra d’étudier en détail l’effet de notre traitement sur la souris et de mieux comprendre le mécanisme d’action qui améliore la pathologie.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à de précédentes études afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques, analgésiques et de confort seront appliquées lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatations de 14 jours, les souris seront laissées 7 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections. Des points limites spécifique au projet ont également été établis faisant référence aux injections : apparition d’une induration au niveau des sites d’injection du traitement.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Ce choix se rapproche de l’âge chez l’humain lors du développement de fibrose hépatique (âge adulte).