Procédures modérées

3 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune manipulée moins d'une minute tous les deux à trois jours pendant trois à trente jours de traitement. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et comprennent une injection de cellules tumorales sous la peau, entre les côtes ou dans une veine, un suivi de la croissance tumorale au pied à coulisse ou par bioluminescence sous vingt minutes d'anesthésie, des injections intrapéritonéales trois fois par semaine et des gavages de solutions médicamenteuses ou bactériennes. Le porteur indique que la croissance tumorale et les traitements peuvent faire perdre du poids aux souris, et que les sites d'injection peuvent s'infecter. L'objet du projet est de relier la composition du microbiote intestinal à la réponse aux immunothérapies, et le porteur conclut à la "nécessité d'utiliser un organisme entier" dans lequel les cellules immunitaires circulent.

Objectifs

La dysbiose du microbiote intestinal a été reconnue comme une des caractéristiques du cancer impliquée dans le dialogue cancer-immunité au niveau clinique. Pour cette raison, nous souhaitons identifier les produits microbiens (tels que les métabolites) présents dans l’intestin afin d’étudier leur impact sur le cancer. L’objectif de ce projet est d’évaluer si la dysbiose du microbiote intestinal induit des changements métaboliques et immunitaires, à la fois dans l'intestin et au niveau systémique, qui peuvent être pertinents pour améliorer la prise en charge du cancer. Il s’agit d’un nouveau concept qui mérite une recherche approfondie.

Bénéfices attendus

Le cancer du poumon est le deuxième cancer le plus fréquent chez l’homme, le troisième chez la femme, ce qui en fait un problème majeur de santé public. Ainsi il est important d’étudier les mécanismes de réponse aux traitements dans ce type de cancer. Dans cette étude, nous espérons que la dysbiose intestinale identifiée pourra être utilisée en tant que biomarqueur prédictif de la réponse au traitement dans le cancer L’ensemble de ce projet de recherche a pour finalité essentielle d’améliorer la prise en charge des patients et les effets des immunothérapies.

Procédures

Tous les animaux seront manipulés brièvement (moins d’une 1 minute) tous les 2 à 3 jours pour mesurer les tumeurs ou les co-traitements. Deux tiers des souris recevront des traitements dans l’eau de boisson qui seront changés tous les 2 à 3 jours. La durée des traitements variera entre 3 à 30 jours. Certaines souris seront soumises à une expérience de croissance tumorale : 1 injection en sous-cutanée ou en intercostale sous anesthésie (3 à 5 minutes pour chaque souris) ou 1 injection en intraveineuse sur animal vigile (environ 3 minutes par souris). Une heure avant et huit heures après l’injection des cellules en intercostale, les souris recevront un analgésique. La croissance tumorale sera suivie par mesure manuelle (pied à coulisse) ou par bioluminescence. Cette dernière méthode nécessitera d’endormir pendant 20 minutes la souris qui sera placée sur un tapis chauffant. D’autres souris seront soumises à une administration de molécules thérapeutiques par voie intra-péritonéale sur animal vigile. Un tiers des souris recevront 3 injections par semaine et le reste des souris recevront 4 injections au total pendant l’expérience. Certaines souris seront soumises à l’administration d’une solution médicamenteuse ou bactérienne, par gavage sur animal vigile (3 administrations par semaine). Du sang sera prélevé une fois sur l’animal vigile (3 à 5 minutes) pour certaines expériences afin d’évaluer les changements métaboliques face aux traitements.

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent engendrer un stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. L’anesthésie peut induire un stress thermique. Les gavages répétés peuvent entrainer une certaine contrainte. Un prélèvement sanguin sur animal vigile effectué pourrait engendrer une légère douleur et la formation d’un hématome. Par ailleurs, la croissance tumorale et l’administration de traitements peuvent entrainer une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux.

Devenir

Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. Chaque procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus, sang et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude peut exclusivement être conduite in vivo, car il n’y a pas de modèles alternatifs permettant d’étudier l’efficacité des traitements anticancéreux et de confirmer leur action via l’activation du système immunitaire. Il est donc essentiel d’utiliser un modèle reproduisant au mieux l’environnement tumoral et le fonctionnement du système immunitaire. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules et les molécules du système immunitaire peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, des groupes de 10, 20 ou 40 souris (selon les procédures) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés, soit au total 3360 souris. Nous appliquerons des tests statistiques appropriées à notre modèle d’étude pour comparer les effets étudiés entre les groupes. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Les échantillons seront partagés avec des collaborateurs.

Raffinement

Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress. Pour minimiser leur stress, plusieurs souris seront logées dans la même cage, offrant un environnement social au calme et un espace vital suffisant. Les conditions d’hébergement respecteront les normes conventionnelles, comprenant un régime alimentaire normal disponible en permanence et un accès libre à l’eau. Un milieu enrichi adapté est prévu: dans les cages il y aura des nids et des tunnels en carton. Le comportement général des animaux sera surveillé régulièrement et leur poids sera mesuré avant le début des traitements, ainsi qu’une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. L’anesthésie sera effectuée lors des injections des cellules tumorales. Une heure avant et huit heures après l’injection des cellules en intercostale, les souris recevront un analgésique. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte des points limites préétablis.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. Tout d’abord, la souris est un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à celui de l’homme, ce qui en fait un modèle pertinent. De plus, sa génétique est bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. L’utilisation de la souris présente plusieurs avantages: nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Nous utiliserons des animaux témoins et transgéniques avec un phénotype normal. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire actif.

Tester des candidats médicaments antiépileptiques pour le compte d'industriels du médicament : 1 200 rats issus de deux lignées sélectionnées pour être épileptiques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un tiers subit une neurochirurgie d'environ une heure sous anesthésie générale, puis vit seul en cage, l'isolement social suivant l'implantation des électrodes d'enregistrement. Les injections peuvent être quotidiennes pendant quatre mois au maximum, et le porteur signale des effets indésirables non attendus possibles, perte de tonus musculaire, somnolence ou excitation selon les molécules. 1 000 rats seront tués pour prélever cerveau et tissus, 200 pourront être réutilisés pour de la formation ou un autre plan d'étude, l'effectif total reflétant selon le porteur "l'activité envisagée de la société" sur cinq ans.

Objectifs

L’épilepsie représente l’une des atteintes neurologiques les plus prédominantes, avec environ 0.8 à 1 % de la population mondiale souffrant d’un syndrome épileptique. Il existe différents types d’épilepsies pouvant être catégorisées suivant l’origine de la maladie mais également suivant l’origine cérébrale des décharges épileptiques. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à une forme généralisée d’épilepsie ; l’épilepsie-absence. Cette forme d’épilepsie se caractérise par l’apparition de décharges épileptiques généralisées non convulsives associées à une brève interruption de conscience et un arrêt de toute activité. Au niveau électroencéphalographique, des activités épileptiques sont observées. Ces crises sont appelées décharges pointes-ondes. Le développement clinique de nouvelles drogues antiépileptiques requiert tout d’abord le test sur des épilepsies pharmaco-résistantes en polythérapie puis en monothérapie. Ces nouvelles molécules doivent ensuite montrer une efficacité sur des épilepsies généralisées de type absence en polythérapie puis en monothérapie. L’épilepsie-absence a pu être modélisée chez le rat par croisement successif. Il existe 2 lignées obtenues de cette façon. Des études pharmacologiques sur ces modèles ont montré une sensibilité aux mêmes antiépileptiques que les patients, mais aussi une même sensibilité aux molécules induisant une aggravation chez les patients. Ces modèles, au cours des années, sont devenus des références pour évaluer les effets curatifs et éventuellement aggravants de nouvelles molécules en développement. Les traitements actuels contre l’épilepsie ne sont pas satisfaisants, il est donc nécessaire de valider de nouveaux candidats médicament. Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouveaux médicaments afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles. Ce projet permettra une meilleure sélection et validation de nouveaux médicaments contre l’épilepsie absence et d’optimiser les chances de succès lors des phases cliniques.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels contre l’épilepsie ne sont pas satisfaisants, il est donc nécessaire de valider de nouveaux candidats médicament. Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouveaux médicaments afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles.

Procédures

1/3 des animaux de ce projet va subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des enregistrements une à deux fois par semaine. Lors de ces enregistrements des traitements pharmacologiques en courte durée seront administrés (injections aigues durant quelques minutes), Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées une fois par jour, sur une durée maximum de 4 mois. Des prélèvements sanguins (d'une durée de quelques minutes) pourront être faits au cours de la procédure expérimentale en fonction du plan expérimental établi.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir une neurochirurgie d’environ une heure comprenant la période d’anesthésie. Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation due au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social. Les prélèvements sanguins pourront produire une douleur modérée (piqure d’aiguille). Les animaux présentent un phénotype d’épilepsie d’absence : les animaux présentent des absences momentanées de courtes durées.

Devenir

Dans la procédure 1 : les animaux pourront être réutilisés au besoin pour de la formation, si leur bien-être le permet et s’ils n’ont pas reçu toutes les administrations prévues dans les procédures. Dans la procédure 2 : les animaux seront mis à mort dans le but de faire des prélèvements et des analyses du cerveau et des tissus. Si les animaux ne sont pas mis à mort, ils pourront être réutilisés (pour de la formation ou pour un autre plan d'étude) si : - le nombre d'injection maximum n'a pas été atteint - le bien être de l'animal le permet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle implique des mécanismes pathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou fait par ordinateur). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Nous pouvons estimer notre utilisation à 4 lots par an sur 5 ans (soit 400 animaux). Un maximum de 20 rats par lot est prévu, selon le protocole expérimental établi. Ce nombre permet d’obtenir une bonne fiabilité des résultats et une puissance statistique suffisante pour conclure sur l’efficacité du composé testé. Pour la procédure 2, nous planifions l’utilisation de 2 lots par lot d’animaux passant en procédure 1 (2x4x20x5 rats) sur 5 ans pour les dosages pharmacocinétiques. Un lot représente un dosage sur un plan d’étude croisée : utilisation de 4 animaux par condition (en moyenne 5 conditions par plan d'étude). Les animaux pouvant être testés sur 2 plans d’étude croisé, ce nombre de lots reflète l’activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années, soit 800 animaux. Ce nombre d’animaux est un nombre maximal, l’utilisation dépendra de la demande. Ce nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées.

Raffinement

Le projet implique la mise en place d’un système d’enregistrement de l'activité des neurones chez le rongeur avec une chirurgie. Cependant, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Une analgésie est réalisée avant et après la chirurgie de manière à réduire la douleur pouvant survenir lors de l’acte chirurgical. A leur arrivée, les animaux passent 1 semaine en acclimatation dans l’animalerie avant toute expérience. Les animaux sont rassemblés 1 fois par semaine dans une « cours de récréation » pour assurer le maintien du contact social. Les animaux d’une même étude (maximum 12 animaux par session) sont rassemblés dans une enceinte fermée sur les cotés avec litière et divers enrichissements, leur permettant une liberté de mouvement plus grande et une interaction entre congénères. Cette session dure 30 minutes. Des points limite ont été définis et une prise en charge de la douleur avec utilisation d’analgésique sera effectué en cas de besoin.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer dans la compréhension des épilepsies. Les lignées des rats épileptiques ont été développées en sélectionnant des lignées de rats naturellement épileptiques, qui présentent le même type d’anomalies comportementales et neuronales que l’humain. Les activités neurologiques, visibles à l’enregistrement de neurones ont des tracés similaires à ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie-absence : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les modifications comportementales sont similaires à celles d’un humain pendant une crise absence : brève rupture de contact se traduisant par une activité motrice figée et une fixité du regard. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues. Des animaux adultes sont utilisés (âge minimum de 2 mois). Pour que les implantations des électrodes et leur fixation sur la boite crânienne se fassent sans douleur, il faut que la structure osseuse soit mature, c’est-à-dire que l’animal ait fini sa croissance osseuse. De plus, les crises d’épilepsie apparaissent et sont stables à adulte dans les 2 souches.

816 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit l'implantation d'un cathéter intraveineux et une chirurgie crânienne d'une heure pour y fixer un dispositif d'enregistrement des neurones et une électrode de stimulation, puis dix sessions quotidiennes d'auto-administration de drogue de six heures et un test de recherche de drogue de six heures. Les rats sont ensuite soumis à une stimulation magnétique transcrânienne de dix minutes, adaptée d'une technique déjà employée chez des personnes dépendantes, et vivent seuls en cage sur les périodes d'isolement prévues. Le porteur conclut qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permettrait cette étude et que l'utilisation de l'animal y est "indispensable".

Objectifs

L’addiction aux drogues est une maladie chronique qui affecte gravement la santé, la société et l'économie. Une des principales difficultés de cette maladie est le risque élevé de rechute, même après une longue période d’abstinence. Ce risque est probablement dû à des changements durables dans certaines régions du cerveau causés par la consommation de drogues. Mieux comprendre ces changements est essentiel pour développer de nouveaux traitements qui aideront les personnes à rester abstinentes. Dans ce projet, nous étudions chez le rat comment certaines parties du cerveau sont modifiées par la prise de drogue et comment cela influence le comportement. Nous utilisons des fibres optiques pour observer en direct l’activité des neurones dans ces régions du cerveau pendant que l’animal est éveillé et réalise certaines tâches. Ensuite, nous allons stimuler une autre région du cerveau qui est déjà une cible thérapeutique chez les humains pour traiter l'addiction. Nous testerons si cette stimulation peut inverser les changements provoqués par la drogue. Cette technique, appelée stimulation magnétique transcrânienne, est déjà utilisée chez les humains pour traiter certaines addictions. En adaptant ce type de stimulation aux rats, nous espérons mieux comprendre comment elle influence les circuits cérébraux de l'addiction et, à terme, améliorer les traitements pour les personnes dépendantes.

Bénéfices attendus

La mesure de l'activité des neurones avec une fibre optique est une technique importante pour comprendre comment certaines parties du cerveau fonctionnent quand un animal cherche à prendre de la drogue ou à y replonger après une pause. En regardant directement ce qui se passe dans le cerveau pendant que l'animal agit, on peut découvrir quelles parties du cerveau sont responsables de ces comportements, et comment elles changent en fonction de ce qui se passe. Cela nous aide à trouver des moyens d’empêcher les rechutes chez les personnes qui essaient d’arrêter la drogue. Par exemple, en voyant comment l'activité du cerveau change, on pourra tester si des traitements, comme la stimulation d’une zone spéciale du cerveau peuvent aider à calmer les envies de drogue. Les résultats de cette étude nous aideront à mieux comprendre comment fonctionne le cerveau quand il devient dépendant, et pourront nous montrer de nouvelles façons d'aider les personnes à ne pas retomber dans l’addiction.

Procédures

En fonction des groupes, toutes les interventions ne se feront pas sur tous les animaux. Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter intraveineux (durée : 15minutes par animal) pour permettre l’auto-administration de drogue. - chirurgie crâniale pour implantation du dispositif d’enregistrement de l’activité des neurones : 1 fois (1 heure par animal). - implantation d’électrode de stimulation des neurones : 1 fois (acte réalisé en même temps que la chirurgie crâniale citée ci-dessus ; 30 minutes par animal) Sur animaux vigiles : - en amont de chaque chirurgie, 1 injection sous cutanée d'antalgiques - après la chirurgie, 2 injections sous cutanée d’antalgiques - au maximum 14 pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (1 fois par semaine , sur toute la durée du projet) - 1 injection intraveineuse (par le cathéter), les 5 premiers jours après la chirurgie d’implantation de cathéter et tous les jours d’auto-administration (15 injections) - 10 sessions d’auto-administration (1 session / jour, 6h/session) - test de recherche de drogue (1 session / rat de 6 heures) - stimulation cérébrale (1 session / rat de 10 minutes) - enregistrement de l’activité cérébrale

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour ce projet sont : -Chirurgies : inconfort transitoire au réveil, et douleur post-opératoire minorée par des antalgiques -Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience -Période d’abstinence : peut causer un léger stress -Isolement : stress modéré -Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’enregistrement -Dispositif de stimulation cérébrale : gène légère pendant la durée de la stimulation -L’acte de pesée, les injections sous-cutanées (5 injections) et les tests comportementaux sur animal vigile peuvent induire un léger stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mis à mort par une méthode reglementaire afin de réaliser des prélèvements et analyse des cerveaux.

Remplacement

Ce type de recherche vise à développer une technique permettant d'enregistrer l'activité des neurones directement chez un animal éveillé pendant qu'il effectue des tests comportementaux. Pour étudier ce processus, il est essentiel d'observer des réseaux de neurones qui fonctionnent normalement, ce qui n'est possible que chez un animal vivant. Après vérification, il n'existe actuellement pas de méthode alternative, comme des tests en laboratoire sur des cellules (in vitro) ou des simulations informatiques (in silico), qui permettrait de réaliser cette étude sans utiliser d'animaux vivants. C'est pourquoi l'utilisation de l'animal est indispensable pour ce type de recherche.

Réduction

L'estimation du nombre d'animaux de ce projet est basée sur la variabilité naturelle et permet d'obtenir des résultats fiables sur le plan statistique. Dans la première expérience, des groupes de 12 rats seront nécessaires, afin de déterminer les meilleures conditions d’expérimentation tout en utilisant le moins d’animaux possibles. Pour les autres expériences, 24 rats par groupe seront nécessaires, selon des calculs statistiques pour obtenir des résultats fiables. L'approche se fait étape par étape, avec certaines étapes réalisées uniquement si les résultats de l'étape précédente sont concluants. Le nombre d'animaux indiqué représente un maximum. Ainsi, notre projet nécessitera un maximum de 816 rats répartis en différents groupes et tests .

Raffinement

Le bien-être des animaux est une priorité tout au long de l’expérience. Nous veillons régulièrement à leur état de santé en surveillant leur alimentation, apparence et comportement. Une grille de score précise et un plan d’intervention permettent d’identifier rapidement les signes de souffrance et d’agir avant que l’animal ne souffre trop. Si un animal atteint un seuil critique, il est pris en charge sans délai. Les animaux sont pesés chaque semaine, et dès leur arrivée à l’animalerie, ils sont hébergés dans des cages ventilées, à température et humidité contrôlées. Pour répondre à leurs besoins naturels, ils ont des objets à ronger et un accès libre à l’eau et à la nourriture. Avant toute procédure, les animaux bénéficient d’une période d’adaptation de 7 jours. Lors des chirurgies, les rats reçoivent une anesthésie générale et locale, avec des analgésiques pour gérer la douleur, et leur température est maintenue grâce à un tapis chauffant. Après l'opération, un traitement antidouleur est poursuivi pendant 48 heures, couvrant ainsi les 72 premières heures post-opératoires.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus souvent utilisé pour étudier l’addiction, car ses réactions aux drogues ressemblent beaucoup à celles des humains. Comme les humains, les rats peuvent s’auto-administrer spontanément toutes les drogues que l’on abuse, ce qui n’est pas toujours le cas avec d’autres espèces animales. Ces caractéristiques en font un modèle idéal pour comprendre l’addiction. Dans cette étude, nous utiliserons des rats de la lignée "Sprague-Dawley". Ces rats ont une diversité génétique importante, ce qui est utile pour refléter la variabilité que l’on observe chez les humains. Nous choisirons des rats « jeunes adultes », âgés de 7 à 8 semaines, un âge souvent utilisé dans nos recherches pour éviter les variations dues à l’adolescence, qui pourraient influencer les résultats.

Pour entretenir un élevage de tiques au laboratoire, 20 lapines adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à raison d'une lapine par repas sanguin, trois à quatre fois par an pendant cinq ans. Chacune est tondue sur un quart de la surface du dos, porte deux capsules collées à la peau et un gilet vétérinaire, puis reste douze jours seule en cage pendant que les tiques la piquent par intermittence. Le porteur décrit un stress thermique le temps que les poils repoussent, une gêne de trois jours due aux capsules, un prurit de cinq à sept jours et un stress d'isolement sur toute la durée. 15 lapines seront proposées à l'adoption et 5 tuées pour prélèvement d'organes, le porteur indiquant qu'un gorgeur artificiel existe mais n'obtient que 25 % de repas réussis, ce qui rend selon lui le recours au lapin "encore nécessaire".

Objectifs

L’objectif de ce projet est l’utilisation de lapins pour entretenir et maintenir un élevage de tiques en laboratoire. Les tiques serviront par la suite à réaliser diverses expériences nécessitant l’utilisation de cet acarien hématophage (qui se nourrit exclusivement de sang). Nous utiliserons les tiques pour réaliser des infections expérimentales avec divers agents pathogènes afin d’analyser leur transmission et comprendre la relation entre l’hôte vecteur et le pathogène, pour développer de nouveaux protocoles d’identification de tiques par biologie moléculaire ou encore pour tester des molécules acaricides ou répulsives. Nous collecterons également du sang sur 5 lapins pour étudier le système immunitaire de ces animaux après un cycle de gorgement des tiques.

Bénéfices attendus

Les lapins qui serviront dans la procédure de ce projet, permettront d’entretenir un élevage de tiques dans le laboratoire. Les tiques sont de très importants vecteurs de micro-organismes pathogènes à la fois pour les animaux et pour l’être humain. Pour lutter contre les tiques il est indispensable de connaitre leur biologie et leur physiologie, ce qui ne peut se faire que grâce à un élevage maintenu en laboratoire. Outre l’acquisition de connaissances, cet élevage permettra aussi de tester de nouvelles molécules acaricides dites « naturelles » pour en évaluer l’efficacité. Enfin, nous utiliserons ces tiques pour mettre en place de nouveaux protocoles d’identification moléculaire des différentes espèces. Du sang sera collecté sur des lapins ayant eu une procédure de gorgement pour étudier l’immunité « anti-tique » développée chez ces lapins.

Procédures

Tonte de 5 minutes pratiquée avec une tondeuse électrique vétérinaire. Pose de deux capsules et d’un gilet (quelques minutes) sur la peau des lapins. Dépôt des tiques sur la peau du lapin, piqures par les tiques (12 jours de contact, piqure par intermittence). Prise de sang (quelques minutes).

Impact sur les animaux

Lors de la procédure expérimentale le lapin pourrait ressentir un stress physique de 5 minutes environ pendant la tonte qui doit être pratiquée avec une tondeuse électrique vétérinaire. Le lapin rasé au niveau du dos (25% de sa surface) pourrait ressentir un stress thermique le temps que les poils repoussent soit environ une douzaine de jours. Les deux capsules, où sont placées les tiques pendant la procédure, collées avec une colle latex non toxique, pourront gêner le lapin pendant environ 3 jours, le temps que l’animal s’habitue. Pour limiter l’accès du lapin aux capsules, il porte pendant la durée de la procédure un gilet vétérinaire qui peut occasionner un stress physique pendant 24 à 48h. Lors du dépôt des tiques sur la peau du lapin, un stress physique de quelques minutes pourra être ressentie. Un prurit pourrait apparaitre lors du repas sanguin des tiques soit environ 5 à 7 jours maximum. Les lapins seront hébergés individuellement le temps de la procédure de repas sanguin qui dure 12 jours, cela pourrait induire un stress d’isolement pendant la durée de cette période. Un stress physique d’environ 5 minutes sera ressenti pendant la prise de sang ainsi qu’une douleur de piqure de sévérité légère de courte durée (3 secondes).

Devenir

15 des 20 lapins seront proposés à l’adoption. 5 lapins seront mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer des organes.

Remplacement

Les tiques sont des animaux hématophages stricts : le repas sanguin sur un animal vertébré est donc obligatoire pour leur métamorphose et donc les maintenir en élevage. Un système de repas sanguin artificiel sera utilisé dès que possible afin de ne pas utiliser de lapin. A l’heure actuelle, ce n’est pas un système totalement optimal (on obtient une efficacité de repas sanguin de 25% en moyenne pour les tiques déposées sur le gorgeur artificiel) ce qui ne permet pas d’obtenir suffisamment de tiques pour maintenir une colonie ou lors d’un besoin ponctuel de nombreux individus. Le recours à un lapin est donc encore nécessaire. En revanche le repas sanguin sur ce système artificiel sera utilisé pour les larves (disponible en très grand nombre) et pour les infections expérimentales.

Réduction

Les tiques sont des acariens hématophages pour qui le repas sanguin est obligatoire pour leur métamorphose et donc pour entretenir un élevage Ces repas sanguins sont réalisés au laboratoire tous les 3 - 4 mois sur des lapins. Nous réaliserons donc entre trois et quatre procédures de repas sanguin par an pendant toute la durée de ce projet. Chaque procédure sera réalisée avec 1 lapin. Nous utiliserons donc au maximum pendant les 5 années du projet 20 lapins. Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur notre expérience de la conception d’études de ce type. Un système de repas sanguin artificiel permet de réduire le nombre de lapin dans ce projet. Pour ce dispositif les tiques sont placées dans un flacon de culture cellulaire percé sur sa face supérieure pour y adapter un gorgeur en verre. Ce gorgeur est fermé à sa base avec une peau de lapin pour que les tiques puissent se fixer et il est rempli de sang de mouton défibriné maintenu à 37°C qui sera changé deux fois par jour, pour que les tiques puissent se nourrir. Nous l’utiliserons pour le nourrissage des larves de tiques et lors des expériences d’infection expérimentales des tiques.

Raffinement

Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. L’absence d’effets indésirables sera contrôlée au cours de l’expérience et des points limites spécifiques sont mis en place, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure. La présence d’un prurit important, une déshydratation, un comportement anormal des lapins seront surveillés comme des indicateurs d’effets indésirables. Si l’un de ces indicateurs est atteint, le lapin sortira de la procédure et le protocole de repas sanguin sera arrêté. La consultation du vétérinaire référent permettra de mettre en place un traitement correctif pour cet animal. Les lapins seront maintenus dans des portoirs conventionnels (le milieu est enrichi avec des jouets et des balles autoclavables, hébergement en cage collective pour éviter les stress d'isolement) permettant ainsi l’interaction entre les individus. Lorsque les lapins arrivent de chez le fournisseur, ils resteront 7 jours minimum dans la pièce d’hébergement avant d’entrer dans la phase d’habituation à la procédure. Le lapin en expérimentation sera séparé du groupe, afin d’éviter que les individus non appareillés viennent défaire le gilet et abîmer les capsules du lapin en expérimentation. Même individualisé, les lapins auront un contact auditif et olfactif avec les autres lapins. Les lapins seront habitués à la manipulation une semaine en amont du repas sanguin pour l’habituer à l’opérateur et à la procédure. Nous ferons fonctionner la tondeuse quelques minutes à proximité du lapin la semaine avant le repas sanguin pour l’habituer au bruit. Nous enfilerons le gilet au lapin 3 ou 4 fois la semaine précédant l’expérimentation. Le lapin le gardera quelques minutes à chaque fois. Nous placerons les animaux qui subiront une prise de sang dans un sac de contention plusieurs fois et pendant 5 minutes la semaine précédant l’expérimentation. Pendant le repas sanguin, nous surveillerons l’apparition d’une réaction allergique ou un des effets indésirables cité au début de ce paragraphe. Une crème anti-démangeaison pourra être appliquée sur recommandation du vétérinaire référent si on constate la présence d’un prurit ou d’une allergie à la piqure des tiques. On limitera le nombre de tiques par lapin au strict minimum pour éviter toute spoliation sanguine des lapins.

Choix des espèces

Nous utiliserons des lapins car les tiques présentent des spécificités d'hôtes relativement strictes et ne peuvent se gorger que sur certains animaux vertébrés. Afin de maintenir un élevage de tiques au laboratoire, il est nécessaire d’obtenir un grand nombre de tiques gorgées pour chaque stade et le lapin permet de nourrir simultanément plusieurs tiques sans lui nuire. L’utilisation de lapins permet d’éviter l’apparition d’anémie compte tenu de la sa taille lors de la procédure expérimentale. Les lapins que nous utiliserons seront des femelles adultes d’environ 6 mois. Ce stade permet de gorger un nombre suffisant de tiques pour maintenir la pérennité de l’élevage de tiques. D’autre part, ce stade relativement jeune, permettra un replacement des animaux après l’expérimentation.

Test de suspension, marche sur poutre, réflexe sensitif, test de force, couloir de marche, sensibilité à la chaleur : six épreuves motrices et sensorielles étalées sur trois jours, et pour d'autres souris un électromyogramme du nerf sciatique de trente minutes sous anesthésie profonde. 190 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs nerfs périphériques. Elles développent une neuropathie auto-immune qui peut provoquer des sensations douloureuses et une paralysie. Le porteur retient des femelles tuées à 20 semaines, avant que les atteintes nerveuses soient détectables, d'autres à 35 semaines quand ces atteintes sont assez avancées pour être caractérisées, et 36 mâles pour le maintien des colonies.

Objectifs

Les nerfs périphériques sont les cibles de complications auto-immunes majeures : les neuropathies périphériques. Aucune piste thérapeutique n'est pour l'instant envisagée pour tenter de soigner cette pathologie nerveuse très invalidante pour les malades. L'identification des gènes qui interviennent dans le développement de cette maladie est un premier pas pour la découverte d'un traitement qui permettrait de protéger voire réparer les nerfs atteints.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension de l'implication des facteurs qui régulent l'activité des lymphocytes dans la survenue de la neuropathie périphérique ouvre la voie à de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de la complication la plus commune et la plus invalidante qui touche les nerfs périphériques.

Procédures

Les animaux adultes seront soumis à une série de test pour étudier leur démarche, leur équilibre et leur coordination motrice : 1) test de suspension : 20s par animal, 2) marche sur poutre : 3 x 1 min avec 10 min d'attente entre chaque passage, 3) reflexe sensitif : moins de 10 s par animal, 4) test de force : 2 x 20s par animal avec 10 minutes d'attente entre les deux mesures, 5) couloir de marche : 3 x 30s par animal avec 30 minutes d'attente entre chaque passage, 6) sensibilité à la chaleur : 30s maximum par animal. Les animaux ne subiront ces tests qu'une seule fois et étalés sur 3 jours pour limiter leur fatigue. D'autres animaux seront profondément endormis pour analyser le fonctionnement de leurs nerfs sicatiques par électromyogramme. Il faut compter 30 min par animal pour ce test.

Impact sur les animaux

La survenue de la neuropathie occasionne des atteintes neurologiques qui peuvent être délétères pour le confort de l'animal (sensations douloureuses, paralysie...).

Devenir

tous les animaux utilisés pour cette étude seront sacrifiés et leurs nerfs périphériques seront prélevés pour mener à bien les études tissulaires et cellulaires nécessaires à une meilleure compréhension des atteintes nerveuses constatées

Remplacement

Les complications neurologiques font intervenir de multiples acteurs cellulaires et systémiques qui ne peuvent être modélisés in vitro. Le fonctionnement des nerfs et les conséquences fonctionnelles de leurs altérations nécessitent l’analyse de composantes sensori-motrices propres aux animaux vivants.

Réduction

Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre la puissance statistique suffisante pour l'analyse des altérations comportementales induites par la perturbation du système sensori-moteur. Nous soumettrons les données au test satistique le plus adapté pour que nos analyses soient pertinentes avec un minimum d'animaux utilisés.

Raffinement

Un suivi spécifique de la douleur due à la survenue de la neuropathie sera mis en place tout au long du projet pour limiter au maximum la souffrance des animaux. Une grille spécifique d'évaluation de la douleur a par ailleurs été mise en place pour prendre en charge l'éventuelle souffrance des animaux chez qui l'intégrité des nerfs périphériques peut être compromise. Les animaux seront quotidiennement surveillés et des dispositions seront prises pour palier les possibles altérations de la locomotion qui compromettraient la capacité des animaux à se nourrir et s'hydrater (mise à disposition de gel d'hydratation et de croquettes au fond de la cage, pesée régulière...).

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères au systême métabolique et physiologique suffisamment proche de l’Homme pour servir à une meilleure compréhension de la neuropathie périphérique et à l’évaluation de l’importance d'un réceptur spécifique des celluels immunitaires et leur ligand sur l'apparition et le développement de la pathologie. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de ces gènes sont très bien adaptées chez la souris. L’analyse comportementale ainsi que les techniques biochimiques et histologiques envisagées pour étudier l'étendue de la neuropathie nous permettront d’apporter des réponses claires quant à l’implication des lymphocytes et de l'auto-immunité sur la neuropathie périphérique. - 3 lots de souris femelles (30 individus/lot) sont sacrifiés à l'âge de 20 semaines, lorsque le diabète spontané est censé se déclarer mais que les atteintes neurologiques ne sont pas détectables. - 3 lots de souris femelles (30 individus/lot) sont sacrifiés à l'âge de 35 semaines, lorsque les atteintes nerveuses déclarées sont suffisemment avancées pour que l'on puisse les caractériser le mieux possible. - Seuls 36 mâles seront utilisés pour assurer le maintien des colonies d'animaux.

Ovariectomisées puis pourvues d'un implant sous-cutané d'œstradiol, 256 souris femelles reçoivent pendant douze semaines une alimentation riche en graisses et en fructose associée à un mélange de phtalates. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées pour prélever leurs micro-vaisseaux cérébraux. La treizième semaine, elles reçoivent une injection de progestérone, parfois une injection intrapéritonéale de colorant, puis sont mises à mort dix minutes ou trois heures après. Le porteur qualifie les effets du régime de "très limités voire inexistants", tout en listant la douleur post-chirurgicale, les irritations et infections de sutures et une prise de poids qui nuirait à la mobilité.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier l’effet d’une co-exposition à un régime alimentaire riche en graisses et en fructose, mimant une alimentation déséquilibrée à l’origine de désordres métaboliques (régime obésogène et diabétogène), associée à l’exposition chronique à des doses environnementales de phtalates, composés chimiques utilisés comme plastifiants et reconnus comme perturbateurs endocriniens susceptibles de modifier le fonctionnement du système hormonal, sur les micro-vaisseaux cérébraux chez la souris femelle adulte : intégrité de la paroi des capillaires cérébraux, inflammation du tissu cérébral et dégénérescence neuronale. Ce travail permettra d’évaluer les effets sur les micro-vaisseaux cérébraux des inter-relations possibles entre alimentation obésogène-diabétogène, et contamination chimique environnementale par les perturbateurs endocriniens de type phtalates, qui pourraient être une des causes d’une altération de la santé reproductive chez la femelle.

Bénéfices attendus

Le projet se place dans le contexte de la transition alimentaire, des changements des comportements de consommation et de l'exposition environnementale aux perturbateurs endocriniens. Le projet analyse les altérations générées sur la fonction cérébrovasculaire et les positionne dans une perspective intégrative, permettant de progresser sur la notion de vulnérabilité des populations sensibles. A terme, les résultats obtenus sur ce modèle expérimental mimant un mode de vie occidental pourront participer à l'évaluation du risque pour la santé humaine vis-à-vis de l'exposition environnementale aux phtalates. Ce projet servira de support aux recommandations pour la nutrition humaine, en termes de sécurité alimentaire, de toxicité des emballages, mais aussi pour les changements de comportement des consommateurs.

Procédures

Les animaux sont exposées pendant 12 semaines à un régime alimentaire riche en graisses et en sucre ou contôle, associé ou non à un mélange de phtalates mimant l’exposition environementale à des phtalates, composés chimiques perturbateurs endocriniens largement utilisés comme plastifiants, entre autres, dans les contenants alimentaires. Les études publiées précédemment indiquent que les souris supportent assez bien ces troubles métaboliques lorsqu’elles sont nourries et abreuvées ad libitum, ce qui sera le cas tout au long des expérimentations. Pour cette étude, toutes les souris femelles doivent avoir le même statut homonal. Pour ce faire, après la semaine d'habituation à l'animalerie, les animaux subissent sous analgésie et anesthésie préalables, une ovariectomie (10 min) associée à une supplémentation en oestradiol à l'aide d'un implant sous-cutané (3 min). Une semaine après rétablissement, les souris sont exposées au régime alimentaire pendant 12 semaines. Au début de la 13ème semaine, les souris vigiles reçoivent une supplémentation en progesterone par injection sous-cutanée (2 min), 4 à 5 heures avant leur euthanasie. Enfin, toujours à l’issue de ces 12 semaines et après l'injection de progesterone, une partie des animaux à l’état vigile reçoivent en plus une injection unique par voie intrapéritonéale (durée 1 min) d'une solution de colorant puis sont euthanasiés 10 min ou 3 h après. Tous les animaux sont euthanasiés par différentes méthodes réglementaires selon les analyses à réaliser.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables liés au régime alimentaire sont, à priori, très limités voire inexistants. Ce régime alimentaire décrit dans la littérature n'est pas connu pour causer des troubles digestifs et la surveillance quotidienne des animaux et des cages (litière) permet de prévenir tout inconfort (diurèse augmentée). Les nuisances qui pourraient survenir sont celles liées 1) aux injections intra-péritonéale et sous-cutanée : inconfort passager dû à la manipulation et à la contention et douleur légère passagère au point d’injection ; 2) à l’ovariectomie et à la pose d’implant sous-cutané : douleur post-chirurgicale, problèmes liés aux sutures (irritations, infection); 3) une prise de poids qui nuirait à la mobilité; 4) effets indésirables de l'anesthésie inhérents à toute chirurgie et risques/contraintes opératoires (hypothermie, réveil/arrêt cardiorespiratoire (peu probable).

Devenir

L’euthanasie des animaux est nécessaire pour effectuer les analyses post-mortem à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire dans les régions cérébrales concernées par l’impact d’un régime alimentaire obésogène-diabétogène associé à une exposition à des doses environementales de phtalates.

Remplacement

La modélisation ou les études in vitro (lignées cellulaires, co-cultures, organoïdes, …) ou sur les invertébrés ne permettent pas l’étude de l’impact d’un régime alimentaire obésogène-diabétogène (mimant le régime alimentaire occidental actuel) associé à l’exposition aux perturbateurs endocriniens environementaux, sur les micro-vaisseaux du cerveau et leur environnement. Les modèles in vitro de micro-vaisseaux cérébraux existant actuellement ne permettent pas encore ce type d’étude intégrée demandant de s’intéresser non seuleument aux vaisseaux cérébraux mais également à leur environnement, en lien avec les organes périphériques tels que les ovaires chez la femelles. Les invertébrés ne présentent pas de capillaires cérébraux de structure et de fonction semblables à ceux des mammifères. La modélisation nécessite des données cellulaires pour permettre d’apporter des informations sur le fonctionnement du cerveau et des micro-vaisseaux en particulier. De plus, les résultats obtenus sur ce modèle expérimental mimant un mode de vie occidental doivent pouvoir participer à l'évaluation du risque pour la santé humaine vis-à-vis de l'exposition environnementale aux phtalates. Ils serviront de support aux recommandations pour la nutrition humaine, en termes de sécurité alimentaire, de toxicité des emballages, mais aussi pour les changements de comportement des consommateurs. La souris est le modèle animal le plus approprié pour ce type d’étude physio-physiopathologique.

Réduction

Un total de 256 souris est nécessaire pour ce projet. Le dimensionnement des groupes expérimentaux pour chaque cohorte est déterminé au plus juste pour obtenir des données quantitatives permettant une analyse statistique robuste, recevable pour publication scientifique dans des journaux internationaux à comité de lecture, et en prenant en compte l’hétérogénéité inter-individuelle et les besoins et nécessités des protocoles expérimentaux, selon la règle des 3R. Ce projet est un projet de recherche original et ne bénéficie pas de résultats déjà existants sur lesquels s’appuyer. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été confirmé par un calcul de puissance et des tests statistiques pertinents seront faits pour une interprétation fiable des résultats. Les protocoles utilisés sont adaptés pour limiter le nombre d'animaux.

Raffinement

Les souris proviennent d’un fournisseur extérieur agréé, sont réparties par 5 maximum dans chaque cage pour éviter l’isolement et hébergées dans une pièce dédiée de notre animalerie dans des conditions contrôlées. Dès leur arrivée, les animaux sont manipulés régulièrement afin de réduire le stress lors des expérimentations. Les cages sont en portoirs ventilés et contiennent de la sciure enrichies avec du nid végétal ; elles sont transparentes, placées les unes à côté des autres. Les animaux ont libre accès à la nourriture et à la boisson. Aucune procédure expérimentale ne nécessite l’isolement d’animaux. La surveillance quotidienne des animaux et des cages (litière) par au moins une personne formée et compétente permet de prévenir tout inconfort (diurèse augmentée). Les données relatives à ces contrôles sont enregistrées et validées par la structure bien-être animal (SBEA) locale et des points limites définis pour permettre de repérer rapidement tout animal malade, blessé ou en souffrance (inconfort, stress, angoisse) et de prendre les mesures appropriées en interagissant avec la SBEA locale et le vétérinaire référent. Pour les actes chirurgicaux, les animaux sont anesthésiés et la douleur est prise en charge en pré- et post-opératoire par l’administration d’antalgiques. La surveillance post-opératoire est assurée 2 fois par jour pendant 3 jours lors de l’administration des antalgiques. Les animaux sont euthanasiés par différentes méthodes réglementaires selon les analyses à réaliser.

Choix des espèces

La souris est un des modèles les mieux caractérisés pour les études métaboliques et il existe de nombreux outils biotechniques disponibles pour ce modèle animal (anticorps, lignées transgéniques...). Cela permet également de comparer les résultats obtenus avec ceux de la littérature et avec nos résultats précédents pour affiner nos hypothèses de travail. Le projet vise à étudier les effets d'une exposition à une alimentation déséquilibrée, associée à des perturbateurs endocriniens environementaux sur la fonction cérébrovasculaire chez la souris femelle adulte: l'exposition au régime est donc faite chez l'adulte, il convient d'utiliser des animaux au stade adulte, âgés de 8 semaines au début du traitement. Les animaux sont commandés chez le fournisseur à l’âge 7 semaines pour éviter les effets du transport sur les derniers stades de maturation du système nerveux central. Les animaux sont acclimatés pendant 1 semaine dans notre animalerie (nouvel environnement).

Placées dès le sevrage, à trois semaines, sous régime hyperlipidique ou standard pendant douze semaines, 1 300 souris mâles et femelles enchaînent ensuite quatre tests comportementaux espacés d'au moins 48 heures. Une partie subit une chirurgie stéréotaxique d'une heure, une partie des femelles une ovariectomie, et 52 d'entre elles un jeûne de cinq heures suivi de sept prélèvements sanguins en deux heures. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, le conditionnement de peur pouvant provoquer un stress aigu durant 24 heures et la chirurgie une perte de poids limitée à 13 %. Toutes finissent par une mesure de masse grasse de deux minutes, un dernier prélèvement de sang, puis la mise à mort pour récupérer les cerveaux.

Objectifs

Si l’obésité est un réel problème de santé publique, générant une diminution de l’espérance de vie en raison des maladies qu’elle entraîne (hypertension, cancers, diabètes …), elle est également associée des déficits de mémoire. Ceci est d’autant plus problématique pendant l’enfance et l’adolescence qui représentent des périodes de maturation de certaines structures du cerveau indispensables pour la mémoire, comme l’hippocampe. Notre équipe a récemment mis en évidence chez la souris que la consommation d'une nourriture hyperlipidique (HL) pendant l'adolescence, en plus d'entrainer l’obésité, perturbe la mémoire et ceci implique un important système neuromodulateur, le système endocannabinoïde (SEC), au sein d’une structure particulière du cerveau (l'hippocampe). Nos études, tout comme la quasi-totalité des études de la littérature, ont utilisé des souris mâles comme modèle de l'obésité. Cependant chez l'humain, l'obésité affecte hommes et femmes de façon équivalente. Ainsi, pour élargir l'étendue de ces découvertes chez l'Homme, l’équipe s’est récemment intéressée aux deux sexes en incluant l'utilisation de souris femelles. Il a pu être démontrer que la nourriture HL consommée à l’adolescence a bien des effets délétères sur la mémoire des souris femelles, semblable à ceux observés ultérieurement chez les mâles. Bien que le SEC soit également impliqué chez la femelle, les types cellulaires et/ou les structures cérébrales mis en jeu semblent différentes de celles des mâles. L'objectif du présent projet est d'identifier les mécanismes neurobiologiques impliqués dans les déficits de mémoire induit par la consommation d'un régime obésogène hyperlipidique à l’adolescence chez les deux sexes, afin de mieux considérer l'effet genre. Pour cela, des souris mâles et femelles seront exposées pendant 12 semaines à un régime hyperlipidique (HL) ou standard (Cont) avant de réaliser des tests comportementaux simples permettant d’évaluer la mémoire. L’ensemble des procédures proposées est en conformité avec les directives européennes 2010/63/UE et françaises, dans le respect des nouveaux standards de soin et de bien-être des animaux (règle des 3Rs).

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des effets d'une nourriture HL sur le cerveau et la mémoire en identifiant certains mécanismes afin d'envisager potentiellement à plus long terme des stratégies thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux subiront, à au moins 48h d’intervalle, quatre tests comportementaux. Chaque étape de ces tests dure entre 6 et 10 minutes. Une partie des animaux (52) subira une fois un jeune de 5h préalablement aux mesures métaboliques (7 prélèvements sanguins sur une durée de 2 h). Une partie des animaux subira une intervention chirurgicale. La chirurgie stéréotaxique, réalisée sous anestésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire, dure 1h avec une phase de réveil de 20 minutes. Une partie de femelles subira également une ovariectomie, réalisée sous anesthésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire. Cette intervention dure 15 minutes avec une phase de réveil de 5 minutes. Tous les animaux subiront en fin d’expérimentation, une seule analyse en imagerie d’une durée de 2 min afin d’évaluer la répartition de leur masse grasse/masse maigre et un seul prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

L’alimentation obésogène donnée pendant 12 à 15 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes, comme ceux utilisés dans notre étude. Les tests de comportement, ainsi que les injections intra-péritonéales peuvent induire un stress qui sera limité par une habituation à la manipulation et à l'injection avant expérimentation. Les prélèvements de sang à la queue durant le test de tolérance au glucose (GTT) pourront engendrer une légère douleur aux animaux. La chirurgie stéréotaxique pourra entraîner dans les 48h suivant l’opération une douleur et un stress se traduisant par une perte de poids qui doit se limiter à 13% du poids initial. La phase d'acquisition du conditionnement de peur pourrait induire une gêne passagère des animaux et entraîner un stress aigu qui pourrait se poursuivre pendant 24h, mais nos précédents tests n’ont pas montré d’effet sur l’état général ou le poids des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en vue de récupérer leurs cerveaux pour des analyses biochimiques ou des contrôles histologiques.

Remplacement

L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et du fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène et il n’est pas possible de le remplacer par des approches cellulaires sur des modèles in vitro ou in silico. Les tests comportementaux utilisés font appels à des comportements spontanées chez les rongeurs. Les chirurgies sont courtes mais nécessaires pour réaliser des manipulations chémogénétiques dans le cerveau et restent peu invasives dans la vie de l'animal. Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire les souffrances inutiles et réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. De plus, le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats concluants et permettre des comparaisons statistiques fiables. Cela représente un total de 1300 (702 femelles et 598 mâles) sur 5 ans. Ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des effets d'une nourriture HL sur le cerveau et la mémoire en identifiant certains mécanismes afin d'envisager potentiellement à plus long terme des stratégies thérapeutiques.

Raffinement

Un soin particulier sera porté au bien-être de l'animal tout au long de sa vie. Les souris recevront de l’eau et de la nourriture à volonté et seront surveillées régulièrement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré- et post-opératoire pour limiter la douleur. Toutes les précautions d'asepsie et de confort seront prises pour limiter l'inconfort des animaux (application d'un gel ophtalmique, opération sur tapis chauffant, ré-hydratation post-chirurgie). Les jours suivant la chirurgie, les animaux sont surveillés attentivement une fois par jour pour s’assurer de leur bon rétablissement. Avec la mise en place de points limites, si un animal présente une anomalie, il sera immédiatement isolé, surveillé et soigné par la prise d’un anti-inflammatoire pendant 3 jours jusqu’à amélioration. Durant les mois suivant la chirurgie, les animaux seront surveillés tous les jours de la semaine et pesés 1 fois par semaine par un personnel qualifié. S’il n’y a aucun signe de mal-être chez l’animal, il passera en phase comportementale qui sera optimisée pour durer le moins de temps possible. L’expérimentateur prendra le plus grand soin en manipulant l’animal et les tests comportementaux seront le moins stressant (lieu calme, acclimaté et inoffensif) et les souris seront remises avec leurs congénères entre chaque phase de test. Les injections pharmacologiques seront réalisées de façon aigüe de sorte à limiter les interventions sur l’animal.

Choix des espèces

Le modèle de rongeur soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. En particulier, les tests comportementaux permettant d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives et émotionnelles sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Les souris seront exposées aux régimes obésogène ou contrôle dès le sevrage (3 semaines d’âge) et pendant 12 semaines afin de couvrir la période de l'adolescence. Les approches immunohistochimiques et biochimiques permettent d’appréhender les mécanismes physiologiques régissant l’effet de différents apports nutritionnels sur les fonctions cérébrales.

Seuls les macaques crabiers ont montré une réactivité croisée avec l'anticorps testé lors des essais in vitro, ce qui écarte souris, rats, lapins et chiens. Quatre d'entre eux, jeunes adultes, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection intraveineuse lente de quinze minutes sur chaise de contention, puis huit prélèvements sanguins et huit mesures du temps de saignement par micro-incision de la peau, étalés sur un mois, avec des contentions de trois à vingt-cinq minutes. Aucune mise à mort n'est prévue et tous sont gardés en vie à la fin du projet sur avis vétérinaire, en vue d'une réutilisation.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier les effets et le devenir d’un anticorps bispécifique (ciblant deux protéines sur les plaquettes) à deux doses différentes chez le singe cynomolgus dans le cadre du développement d’un traitement contre les maladies thrombo-inflammatoires chez l’Homme. Ce projet permettra d’établir le profil pharmacocinétique du candidat médicament et ses relations dose-effet mais également de déterminer la dose qui sera utilisée dans de futurs projets précliniques et cliniques. Les données qui seront extraites de ce projet vont également permettre d’évaluer la capacité de l’anticorps à inhiber l’activation plaquettaire tout en préservant une coagulation normale et donc d’obtenir des informations sur sa sécurité. Ce projet ouvrira la voie à des tests cliniques (sur patients humains), offrant l’espoir d’une nouvelle option de traitement pour les maladies causées par une coagulation et une inflammation anormales. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de ce candidat-médicament. Des prélèvements de sang ainsi que des mesures du temps de saignement seront réalisés à différents délais avant et après administration de la molécule test. Différents paramètres physiologiques seront également suivis (ex : température corporelle, poids, état général). L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de déterminer la dose toxique. C’est pourquoi, les deux doses utilisées dans ce projet sont, a priori, efficaces pharmacologiquement mais non toxiques (d’après des études préliminaires in vitro réalisées sur la même molécule et in vivo sur un anticorps similaire utilisant la même voie d’action et la même cible). Enfin, aucune mise à mort n’est prévue pour raison scientifique dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

La thrombose artérielle est un trouble courant chez l’Homme qui est généralement causé par l'érosion ou la rupture d'une plaque d'athérosclérose (dépôt lipidique dans les vaisseaux sanguins) pouvant provoquer des lésions ischémiques. Lorsque qu’une plaque se rompt et provoque une occlusion dans les artères coronaires ou cérébrales, elle peut entraîner respectivement un infarctus du myocarde ou un accident vasculaire cérébral (accidents vasculaires représentants les principales causes de décès dans le monde). Plusieurs médicaments sont maintenant disponibles pour traiter la thrombose artérielle. Cependant, ces médicaments ciblent des mécanismes communs à la thrombose et à l'hémostase. Leur utilisation entraîne donc un risque accru de complications hémorragiques non contrôlées en parallèle de leur efficacité antithrombotique. Dans ce contexte, il existe une réelle nécessité de développer de nouveaux traitements sûrs et efficaces sans effets secondaires systémiques tels que l'hémorragie. D’après différentes études réalisées in vitro, le candidat médicament (anticorps) testé dans le cadre de ce projet semble avoir le potentiel de fournir une activité immunomodulatrice ciblée avec un profil de sécurité très encourageant pour traiter de manière efficace ce type de maladies thrombo-inflammatoires. En effet, des données publiée sur un anticorps similaire ont montrées que le mode d’action utilisé était efficace et sûr chez les primates et chez l’Homme. En outre, cet anticorps similaire a démontré un excellent profil de sécurité, à la fois chez des volontaires humains sains et chez des patients souffrant d’un accident vasculaire cérébral ischémique aigu, renforçant ainsi le potentiel thérapeutique de ce type d’anticorps. Des tests préliminaires in vitro réalisés sur du sang humain et de singes ont déjà montré des résultats prometteurs pour l’anticorps testé, confirmant son efficacité sans nuire aux cellules sanguines. Les bénéfices attendus du projet sont donc, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un nouvel anticorps bispécifique utilisé comme thérapie ciblée, efficace et sûre contre les maladies thrombo-inflammatoires. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront notamment de sélectionner la dose à privilégier pour de futures études précliniques et cliniques.

Procédures

DDeux groupes de deux animaux seront inclus dans ce projet : Groupe 1 anticorps à 1mg/kg et groupe 2 anticorps à 5mg/kg. Les animaux sont acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) depuis plusieurs mois et ils bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) de plus de trois semaines avant le début du projet. À l’issue de cette période, les animaux feront l’objet d’un examen vétérinaire qui permettra de déterminer l’état de santé général des animaux avant l’administration de l’anticorps. Deux prélèvements de sang ainsi que deux mesures du temps de saignement (temps nécessaire à l’arrêt spontané d’un saignement après réalisation d’une micro-incision de la peau) seront réalisés avant l’administration du candidat médicament. Les animaux recevront la molécule test par injection intra-veineuse lente de 15 minutes (temps de contention sur chaise d’environ 25 minutes). Ensuite, 6 prélèvements de sang et 6 mesures du temps de saignement seront réalisés à différent délais post-administration (prélèvements étalés sur une durée d’un mois) afin d'étudier le profil pharmacocinétique, l’effet de la molécule dans le temps et sa capacité à moduler l'activation plaquettaire tout en préservant la coagulation. Les mesures du temps de saignement impliquent une contention sur chaise à contention durant environ 15minutes. Les prises de sang nécessitent une contention de 3 à 15 minutes (contention manuelle ou sur chaise à contention au besoin). Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions).

Impact sur les animaux

Les administrations intra-veineuses peuvent provoquer un stress léger, une douleur légère lors de l’injection, des ecchymoses ou des hématomes. Les prélèvements sanguins et les mesures du temps de saignement pourront provoquer un stress léger, une douleur légère, un saignement local mineur et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées ainsi que les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront gardés en vie (selon avis du vétérinaire de l’établissement utilisateur).

Remplacement

Les études de pharmacocinétique, de pharmacodynamie et de sécurité précliniques in vivo sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. Ce projet permettra de déterminer, entre autres, la concentration plasmatique dans le temps de l'anticorps, sa relation dose-effet mais également de déterminer la dose qui sera utilisée dans de futurs projets précliniques et cliniques. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex: in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 2 groupes de 2 animaux ont été constitués, soit 4 animaux au total. Ce nombre permettra d’obtenir des résultats fiables, interprétables et transposables. Les deux groupes permettront d’étudier les effets de l’anticorps testé à deux concentrations différentes. Le nombre de groupe ne peut donc pas être réduit d’avantage. Le nombre d’animaux par groupe a été limité à 2. Ce nombre permettra de détecter une tendance dans le groupe. Cette étude n’étant pas règlementaire, elle ne nécessite pas de réaliser des tests statistiques sur de grandes cohortes d’animaux.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux seront hébergés en groupes sociaux. Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra: 1) Des enrichissements structuraux ; 2) De la litière pour leur permettre de fourrager ; 3) Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine ; 4) Des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; 5) De la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux sont acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) depuis plusieurs mois et ils bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) de plus de trois semaines avant le début du projet. Ce programme d’habituation est associé à du renforcement positif (ex : distribution de récompenses) ce qui permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, température rectale...). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

L’anticorps étudié dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. Cet anticorps a pour cible deux protéines spécifiques modulant l’activité plaquettaire. Or, au cours d’études préliminaires in vitro, seuls les singes cynomolgus ont démontré une réactivité croisée avec l’anticorps testé. L’absence de réactivité croisée chez la souris, les rats, les lapins et les chiens exclue donc l’utilisation de ces espèces dans ce cadre de ce projet. La proximité phylogénétique et physiologique entre les macaques et l'Homme, notamment concernant l’organisation de leur système immunitaire explique ces résultats. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter le système cardiovasculaire, il est donc préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.