Procédures modérées

Des dépilations, des croûtes et des ulcérations au point d'irradiation pendant cinq à six jours : 3 592 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyses post-mortem. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, une irradiation ciblée, puis des traitements d'immunothérapie et des prélèvements sanguins jusqu'à trois mois après. L'objectif est de tester si de nouvelles techniques d'irradiation combinées à l'immunothérapie contrôlent mieux les tumeurs agressives et les métastases, les essais cliniques restant annoncés pour la fin du projet. Le choix de la souris tient à l'abondance de la littérature en radiothérapie et à des modèles tumoraux décrits comme pertinents pour la transposition clinique.

Objectifs

Certaines tumeurs solides, comme les cancers du sein triple négatif et les mélanomes, sont particulièrement difficiles à traiter en raison de leur agressivité, de leur capacité à métastaser et/ou de leurs taux de récurrence locale très élevée. Le cancer du sein triple négatif évolue plus agressivement que les autres formes de cancer du sein, a un taux élevé de récidive à distance et est souvent diagnostiqué après que la tumeur se soit étendue au-delà du sein. Le mélanome, un cancer de la peau, peut se propager à d’autres parties du corps. Le carcinome épidermoïde de la cavité buccale, un type de cancer de la tête et du cou, représente le 6e cancer les plus répandus dans le monde, avec un pronostic souvent défavorable en raison de la récurrence locale et des risques de complications, notamment à proximité des glandes salivaires. La radiothérapie est l’un des traitements les plus efficace et couramment utilisés contre le cancer, mais la méthode conventionnelle présente des limitations pour certaines tumeurs agressives et métastatiques, car elle peut endommager les tissus sains environnants et est moins efficace pour contrôler les métastases (la radiothérapie conventionnelle est un traitement plutôt local). Ce projet propose de combiner des techniques de radiothérapie innovantes avec l’immunothérapie, un traitement prometteur qui renforce la capacité du système immunitaire à attaquer les cellules cancéreuses. Ces nouvelles techniques de radiothérapie permettent une distribution plus ciblée des doses, réduisant ainsi la toxicité pour les tissus sains, favorisant une activation plus forte du système immunitaire et un effet systémique. Ces approches ont montré des résultats prometteurs en termes de contrôle de la croissance tumorale, même à des doses élevées, et d'efficacité contre les métastases. L’objectif principal de ce projet est de démontrer que la combinaison de la radiothérapie innovante et de l’immunothérapie constitue une approche thérapeutique plus efficace pour traiter des tumeurs solides, notamment les plus agressives et/ou métastatiques. Nous évaluerons cette stratégie sur plusieurs types de tumeurs afin d’étudier son potentiel à améliorer le traitement de cancers difficiles à soigner avec les méthodes actuelles.

Bénéfices attendus

Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus sains. Dans ce projet nous cherchons à améliorer le résultat des traitements en combinant des techniques d’irradiation innovantes avec de l’immunothérapie. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques complètes qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier à des patients qui actuellement reçoivent un traitement seulement palliatif ou pour lesquels les conséquences sur les tissus sains sont très impactantes pour leur qualité de vie et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très métastatiques. . le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.

Procédures

Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux sous anesthésies générale gazeuse et locale (environ 20 minutes) sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux sous anesthésies générale gazeuse et locale (environ 20 minutes) sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. A un temps prédéterminé, les souris seront irradiées au niveau de la tumeur sous anesthésie générale gazeuse (environ 20 minutes) puis recevront des traitements selon 2 schémas différents soit 2, 5 et 8 jours post irradiation soit 24h avant l’irradiation puis 48h et 120h post irradiation (durée de chaque administration inf à 10 sec). Des prélèvements de sang seront réalisés à différents temps : 24 h avant, , 7 jours post-irradiation et 3 mois post-irradiation pour les animaux suivis à long terme. A chaque prélèvement, les animaux seront anesthésiés avec un mélange d’air et d’isoflurane à 4% puis seront maintenus sous anesthésie gazeuse toute la durée du prélèvement (environ 10 minutes).

Impact sur les animaux

L’implantation tumorale va conduire au développement de tumeurs ou de métastases qui pourront avoir pour conséquence une gêne à la mobilité ou des difficultés respiratoires. Suite à l’irradiation des signes de dermatites peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids transitoire et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours. Les traitements d’immunothérapie n'ont montré aucun signe de toxicité chez les souris traitées dans la littérature. , ni dans nos précédentes expériences

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de ce nouveau traitement vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées et des métastases. Les mécanismes inflammatoires, d’infiltration immunitaire et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Ces mécanismes sont les clés pour une combinaison efficace avec l’immunothérapie. Dans une première étude in vivo, nous avons démontré que les nouvelles techniques de radiothérapie que nous évaluons induit un recrutement efficace des cellules immunitaires et cela justifie l’évaluation de la combinaison avec des immunothérapies. De plus, l’évaluation des combinaisons radio-immunothérapies requièrent l’expérimentation in vivo où l’interaction entre la réaction à la radiation et le système immunitaire peuvent être activées. Il est donc impossible de faire nos études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser a été calculé à l'aide d'outils statistiques. Ce nombre est ajusté au plus bas mais permet tout de même de pouvoir conclure.

Raffinement

Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des souris sera mise en place avant toute expérimentation : les souris seront manipulées quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons quotidiennement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être (détail des points limites appliqués dans la description de chaque procédure). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale adaptée aux interventions chirurgicales mises en place, avec une prise en charge antalgique. Suite à la croissance tumorale et à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours) pour y remédier, des soins support seront mis en place et des aliments appétants sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème, apaisante cicatrisante antalgique sera administrée sur la peau pour permettre la cicatrisation (au minimum 1 semaine, application quotidienne). En cas d’atteinte d’un point limite, conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement utilisées en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Les modèles tumoraux que nous allons utiliser sont bien caractérisés dans la littérature et pertinents pour la translation clinique (ex. métastatiques ou très agressives) Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 8 à 10 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

Sélectionnés pour deux mutations spontanées qui les rendent obèses et diabétiques, 600 rats reçoivent une à deux administrations quotidiennes du composé à tester, puis cinq prises de sang après six heures de jeûne, avant traitement puis à deux, quatre, six et huit semaines. À six semaines viennent les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, de 210 minutes, la surcharge en insuline pouvant les mettre en difficulté pour revenir à une glycémie normale. Des cathéters sont ensuite implantés dans la jugulaire et la carotide sous anesthésie, avec cinq jours d'isolement, avant un "clamp" terminal de 210 minutes à jeun sous perfusion continue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués pour récupérer tissus et sang, le porteur ne rapportant l'effectif de 600 qu'au besoin de dix animaux exploitables par groupe en fin de clamp.

Objectifs

Le diabète a touché 8,5% de personnes de plus de 18 ans dans le monde. 90% des personnes diabétiques sont atteintes de diabète de type 2, forme de diabète associé à l’obésité. Le nombre de personnes diabétiques ne cesse d’augmenter. Le diabète a des conséquences dramatiques sur le fonctionnement de certains organes comme le foie, le système nerveux, les reins ou le cœur et certaines de ces conséquences sont mortelles. Le diabète de type 2 se caractérise par deux phases, la phase de résistance à l’insuline où les niveaux plasmatiques d’insuline sont très élevés pour essayer de contrer l’hyperglycémie puis au fur et à mesure les cellules béta pancréatiques sécrétant l’insuline se fatiguent, ne sont plus capables de répondre et meurent. On parle alors de phase de dépendance à l’insuline. Plus le diabète de type 2 est traité précocement, moins les conséquences sont dramatiques. Ainsi, il est important de développer des thérapies qui ciblent la phase de résistance à l’insuline. Pour se faire, des animaux rendus obèses et diabétiques par l’apparition de deux mutations spontanées ont été séléctionnées puis reproduits entre eux pour créer une lignée. La résistance à l’insuline peut être évaluée de différentes manières : en réalisant des tests de tolérance à l’insuline et au glucose mais la technique dite "clamp" car elle permet la mesure de la sensibilité à l’insuline au niveau des différents organes et de façon bien précise, en utilisant des radiotraceurs. Ainsi, au cours de ce projet, des rats obèses seront traités ou non par des molécules et leur résistance à l’insuline sera évaluée par des tests de tolérance puis un "clamp".

Bénéfices attendus

Par cette étude, de nouveaux traitements ciblant la résistance à l’insuline et donc les phases précoces du diabète peuvent être trouvés. Également, comme le diabète évolue très vite vers une stade d’insulinopénie, c'est à dire que le corps ne sécrète plus d'insuline, des traitements ciblant les phases plus avancées du diabète peuvent être trouvées.

Procédures

Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Cinq prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (avant traitement et 2, 4, 6 et 8 semaines après traitement) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang se fait sur animal vigile et libre de ses mouvements, il est préalablement habitué à ce geste. La prise de sang dure environ 2 minutes par animal, et nécessite que l'animal ait un jeun de 6h. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectués après 6 semaines de traitement, ces tests durent 210 minutes. La surcharge en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant du glucose. L’implantation de cathéters à demeure dans la veine jugulaire et dans l'artère carotide : la chirurgie est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. Les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant les 5 jours post chirurgie. Une manipulation de 210 minutes appelée « clamp » est réalisée après 8 semaines de traitement. Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue.

Impact sur les animaux

1 – L’évolution de la maladie liée au phénotype des rats va induire une obésité et donc une baisse d’activité des animaux, lorsque le diabète va s’installer, les animaux vont uriner plus et avoir besoin de s’hydrater plus, ils peuvent également perdre du poids lors des stades plus avancés. 2 – Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3 – Les mises à jeun (6h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress, notamment pour des animaux diabétiques. 4- Lors de la mesure de la composition corporelle, l'animal est placé dans un tube à contention pendant environ 2 minutes, cela peut engendrer un stress modéré. 5 –La surcharge en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose. 6 – La chirurgie (implantation des cathéters jugulaire et carotide) est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. L’anesthésie et la cicatrisation sont plus difficiles chez un animal diabétique. 7- Les animaux seront hébergés en individuel après la chirurgie pendant 5 jours, cela va induire un stress. 8- Clamp : Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue. Cette manipulation terminale peut être source de stress.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (comptage des radioéléments, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...).

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. D’ailleurs, la société possède aujourd’hui une plateforme in vitro pour y répondre. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les étapes de la procédure seront réalisées sur le même animal. Des étapes de screening sont réalisées afin d’obtenir des groupes homogènes et les animaux ayant les meilleurs critères permettant d’avoir des données fiables et exploitables en fin d’étude et d’éviter de répéter plusieurs fois la dite étude. Nous effectuerons des tests statistiques, le nombre de données par groupe nécessaire pour être statistiquement robuste et donc pouvoir conclure sur l’effet d’un traitement est de 10 en fin de clamp.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rats de les mordiller. Après chaque prélèvement de sang, nous ajouterons des rouleaux de coton en guise de « récompense ». La durée de ces projets étant longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. La chirurgie sera effectuée sous une couverture analgésique adaptée. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points limites définis, l'animal serait euthanasié. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de soluté de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques.

Choix des espèces

L’espèce a été choisie car son phénotype altéré induit le développement d’un diabète et de l’obésité sous régime normal avec une phase d’hyperinsulinémie à 5-7 semaines d’âges et une phase d’insulinopénie à l’âge de 13-15 semaines. Le rat est une espèce adaptée pour l’étude de la résistance à l’insuline par clamp lors de son jeune âge puisque les données obtenues sont assez homogènes. La chirurgie pour la mise en place du cathéter impacte très peu l'obésité et la résistance à l'insuline. Lors des âges plus avancés, ces rats spontanément diabétiques et obèses développent un diabète avec une insulinopénie et une mort des cellules béta ce qui permet d’identifier ce modèle de rat comme étant adapté pour l’étude des stades avancés du diabète. Ainsi, il permet aussi d’évaluer l’effet préventif de certains traitements sur l’évolution du diabète. L’espèce a été choisie car son phénotype altéré induit le développement d’un diabète et de l’obésité sous régime normal avec une phase d’hyperinsulinémie à 5-7 semaines d’âge et une phase d’insulinopénie à 13-15 semaines d'âge.

Vingt-quatre souris subissent chacune six gavages, six anesthésies générales pouvant atteindre deux heures et douze injections intraveineuses, une fois leur tumeur greffée développée. 360 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses de tissus : 40 reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, 320 une greffe chirurgicale dans le coussin graisseux, et 48 d'entre elles enchaînent trois anesthésies et six injections intraveineuses. Le porteur décrit des nuisances courtes et de faible intensité, hormis l'inflammation modérée au point d'injection des cellules tumorales. Il annonce des protocoles d'imagerie diagnostique transférables aux patients, quand le projet consiste à observer par scintigraphie et échographie comment une tumeur greffée contourne un traitement anti-angiogénique.

Objectifs

Les thérapies anti-cancéreuses dites anti-angiogéniques ont pour but d’arrêter la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans les tumeurs et ainsi empêcher leur croissance. Cependant, une reprise de la croissance des vaisseaux sanguins de la tumeur est observée après quelques mois de traitement dans la majorité des cas. Cette resistance au traitement est également observée dans le modèle de cancer chez la souris que nous développons. Ce projet propose une étude des vaisseaux sanguins et de la consommation de glucose de la tumeur lors du traitement anti-angiogénique. Nous utiliserons pour cela des caméras d’imagerie médicale non invasive, techniques utilisées également chez l'homme en clinique : scintigraphie et échographie. La scintigraphie permet d'acquérir une image révélant la consommation en glucose des tumeurs, paramètre lié à leur croissance et leur agressivité. L'échographie nous permettra d'obtenir une image des vaisseaux sanguins de la tumeur à l'échelle micrométrique. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les cancers adaptent leurs vaisseaux sanguins et leur façon de se nourrir en réponse aux traitements anti-angiogéniques.

Bénéfices attendus

Cette étude aura pour résultats: (1) de mieux comprendre comment les tumeurs adaptent leur vaisseaux sanguins et leur façon de se nourrir en réponse aux traitements anti-angiogéniques, (2) de développer des protocoles d'imagerie diagnostique permettant de classer les cancers au moment de leur détection entre tumeurs pouvant répondre favorablement aux traitements et tumeurs résistantes, méthodes pouvant in fine être transférée chez les patients, (3) de développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant le métabolisme tumoral en complément de la destruction du réseau vasculaire.

Procédures

40 souris recevront une greffe de cellules par injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse. Cette procédure devrait durer moins de 10 minutes. 248 souris auront une contention pour recevoir une dose d’analgésique par injection puis auront une chirurgie pour avoir une greffe dans le coussin graisseux sous anesthésie gazeuse. Cette procédure devrait durer 10 à 15 minutes. 72 animaux auront une contention pour recevoir une dose d’analgésique par injection puis une chirurgie pour avoir une greffe dans le coussin graisseux sous anesthésie gazeuse. Cette procédure devrait durer 10 à 15 minutes. Lorsque leur tumeur se sera développée, 48 de ces souris subiront : Gavage (

Impact sur les animaux

Lors des séances d'imagerie sous anesthésie, les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort lors de la manipulation et de la fatigue suite aux anesthésies (nuisances courtes et de faible intensité). A la suite des injections intraveineuses d'agent de contraste d'imagerie sous anesthésie, les animaux peuvent ressentir une douleur légère et de courte durée au site d’injection. La chimiothérapie anti-angiogénique sera administrée par gavage, ce qui peut générer du stress et de l’inconfort de courte durée (nuisance légère). L’injection de cellules tumorales peut provoquer de l’inflammation au niveau de la zone d’injection pouvant induire une irritation (nuisances modérées courtes).

Devenir

A l'issue de ce projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses ex vivo nécessaires au projet.

Remplacement

Les analyses in vitro ne sont pas suffisantes pour l’étude du lien entre métabolisme et vascularisation tumoraux, ce qui intègre le micro-environnement tumoral. Il est donc très difficile voire impossible de reproduire fidèlement l'ensemble de ces interactions in vitro, dans des modèles de cellules isolées. De plus, les cellules humaines de paragangliomes ne poussent pas en culture in vitro. Il est donc encore nécessaire d’utiliser un modèle de tumeur chez la souris afin de s’approcher au plus des tumeurs humaines. De plus, les méthodes de diagnostique testées dans ce projet sont des méthodes d'imagerie médicale ayant vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué d'après nos précédentes études d'imagerie sur ce modèle, qui ont fait l'objet de publication. Nous nous aidons de plus d'une plateforme internet qui propose un outil de calcul statistique pour l'expérimentation animale. Les groupes ont été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisant statistiquement pour arriver à des conclusions robustes. Les données générées seront ensuite analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

La procédure chirurgicale sera pratiquée après administration en sous-cutané d’un analgésique 30 min avant la chirurgie. Les animaux sont ensuite endormis et maintenus par anesthésie gazeuse sur un tapis chauffant puis surveillés jusqu’à leur réveil. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été établis pour le suivi de l'état des animaux. Par ailleurs, les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi.

Choix des espèces

Le choix des souris permet d’avoir accès à des animaux constituant un modèle préclinique particulièrement adapté à la réalisation de greffes de cellules et/ou tumeurs humaines ou de souris. Nos lignées cellulaires sont issues de souris ayant un fonds génétique mixte, rendant préférable l’utilisation d’une souris receveuse afin de minimiser le risque de rejet. Enfin, nous disposons au laboratoire de systèmes d’imagerie du petit animal particulièrement adaptés à la souris. Les animaux seront âgés de 7 à 8 semaines (jeunes adultes ayant atteint la maturité ; cet âge correspond à l’âge médian de développement de la maladie chez l’homme). C'est cet âge qui est le plus souvent rapporté dans la littérature pour ce type d'étude, ce qui nous permettra de confronter nos résultats avec ceux d'autres équipes.

Aucun des six macaques à longue queue de ce projet ne sera tué à l'issue, le porteur prévoyant de les transférer vers d'autres études sans retirer chirurgicalement le matériel implanté. Ils vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance modéré, avec des injections intramusculaires d'aripiprazole par périodes de deux semaines sur quatre mois, quinze scans d'imagerie cérébrale sous anesthésie répartis sur plus d'un an, l'implantation par vis en titane d'un plot de tête et d'une chambre d'enregistrement ouvrant sur une craniotomie de 10 mm sur 10, puis trente injections intracérébrales hebdomadaires sur huit mois. Le porteur reconnaît un risque d'infection lié à la chambre et des lésions cérébrales à prévoir avec la répétition des pénétrations d'électrode, tout en jugeant une lésion débilitante "extrêmement rare". Le maintien en vie s'explique par la valeur acquise par ces animaux, entraînés à réaliser des tâches cognitives sur écran tactile et donc réutilisables pour des approches invasives.

Objectifs

L’aripiprazole est un antipsychotique de troisième génération indiqué dans le traitement de différentes maladies neuropsychiatriques présentant un déséquilibre dopamine-sérotonine, telles que le syndrome de Gilles-de-la-Tourette, la schizophrénie et les troubles bipolaires. Bien que son utilisation s’accroisse, les mécanismes d’action de l’aripiprazole restent peu compris. Les objectifs du présent projet sont d’identifier où et comment ce traitement agit dans les différentes régions cérébrales pour moduler de multiples fonctions cognitives et motrices.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la balance dopamine-sérotonine dans le contrôle comportemental. Ainsi, notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant le mode d’action de l’aripiprazole, désormais traitement de première intention pour de nombreux patients atteints de troubles psychiatriques. Une meilleure compréhension des mécanismes d’action de l’aripiprazole et des effets cognitifs induits par ce traitement ouvrira certainement une meilleure prise en charge thérapeutique de ces patients, avec une approche de plus en plus individualisée. En combinant différentes modalités d’imagerie cérébrale, nous allons avoir l’opportunité de caractériser comment la balance dopamine-sérotonine module l’activité neuronale de repos à l’échelle du cerveau entier. Cette balance étant défectueuse dans de nombreuses pathologies (ex : dépression, anxiété, schizophrénie, Tourette, addictions), nos résultats seront donc d’intérêt pour de nombreuses applications. En complément, l’apport de l’electrophysiologie va nous permettre d’étudier des aspects plus fonctionnels de l’action de l’aripiprazole et de la balance dopamine-sérotonine au niveau des neurones du striatum. Nos résultats devraient ainsi démontrer l’importance de cette structure sous-corticale dans le contrôle de certains biais décisionnels, et définir quels types de troubles émergent lorsque la balance dopamine-sérotonine devient dysfonctionnel dans cette région du cerveau.

Procédures

(i) Traitement pharmacologique systémique par aripiprazole en semi-chronique (plusieurs périodes de 2 semaines, injections en IM). Ces tests s’étendront sur 4 mois, afin de tester comportementalement plusieurs doses de traitement. (ii) Examens d’imagerie cérébrale sous anesthésie générale. L’action de l’aripiprazole sur les systèmes dopaminergiques et sérotoninergiques sera étudiée via 5 traceurs ciblant différents récepteurs (5 traceurs x 3 doses d’aripiprazole = 15 scans par animal). Ces imageries s’étendront sur une période de plus d’un an. (iii) Implantation chirurgicale d’un plot de tête et d'une chambre avec craniotomie sous anesthésie générale (1 fois,

Impact sur les animaux

La partie pharmaceutique du projet impliquant un traitement chronique par aripiprazole ne constitue pas une source potentiel de nuisances importantes. L’aripiprazole est une molécule fréquemment utilisée en clinique humaine avec très peu d’effets secondaires nuisibles, il est rapporté un effet sédatif et orexigène (augmente l’appétit) bien moindre que pour les autres neuroleptiques. Les imageries cérébrales vont nécessiter l’injection d’un produit de contraste pouvant induire des élévations du taux de fer sanguin et potentiellement des troubles hépatiques. Pour limiter ces risques, les imageries seront espacées d’au moins deux semaines et des analyses sanguines seront réalisées pour contrôler les enzymes hépatiques. Ainsi, aucun effet nuisible significatif n’est spécifiquement prévu suite à l’accumulation des imageries sur animal anesthésié. La partie électrophysiologique du projet implique l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement par l’intermédiaire de vis en titane chirurgicalement implantées sur la tête de l’animal. La chambre d’enregistrement donnera sur une craniotomie (10 x 10mm) permettant l’accès à la dure-mère et au cerveau pour pouvoir y positionner une électrode au moment des sessions d’expérimentation. La présence de cette chambre d’enregistrement constitue une source potentielle d’infection requérant une attention particulière, avec des soins fréquents adaptés. De potentiels lésions cérébrales engendrées lors de la pénétration de l’électrode dans le cerveau sont à prévoir avec la répétition des sessions d’enregistrement. Le suivi comportemental quotidien des animaux nous informera sur la présence ou non d’une lésion débilitante. Cette possibilité demeure toutefois extrêmement rare. Il n’est pas démontré que l’effet cumulatif entre les phases d’imagerie, de pharmacologie et d’électrophysiologie de l’étude soit délétère pour la santé de l’animal. La partie de l’étude intégrant les examens d’imagerie et le traitement par aripiprazole étant classée en procédure légère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure modérée pour les animaux.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives sur écran tactile. Les animaux ayant une chambre implantée seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant des approches invasives telles que l’électrophysiologie ou des perturbations intracérébrales. De ce fait, nous ne prévoyons pas de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude pré-clinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec de l’électrophysiologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle du cerveau. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Enfin, certains radiotraceurs TEP utilisés dans cette étude ne sont disponibles et utilisables que chez le primate non-humain, faisant de ce modèle un élément irremplaçable pour la conduite de cette étude.

Réduction

Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 6 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=4) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques pharmacologiques chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2). Nos approches seront réversibles et complémentaires, ce qui permettra de répéter les tests et de comparer différentes doses d’agents pharmacologiques sur les mêmes animaux pour ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les données électrophysiologiques recueillies sur quatre animaux permettront également d’atteindre un échantillon de neurones striataux importants le plus représentatif possible en fonction des différents territoires cérébraux étudiés.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Un suivi quotidien des animaux sera effectué permettant de contrôler différents facteurs tels que le poids, la prise de nourriture, le comportement social et la mobilité. Dépendamment du score des animaux sur notre grille d’évaluation comportementale, un traitement adapté sera fourni et l’étude pourra être suspendue, voir définitivement arrêtée si les points limites sont atteints. L’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’activité neuronale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères. En combinant simultanément différentes modalités d’imagerie grâce à une caméra hybride, nous allons réduire (/2) le nombre de scans pour pouvoir collecter un jeu de données suffisants. Les animaux ne seront implantés qu’au moment d’initier la phase d’électrophysiologie de l’étude. La craniotomie réalisée chirurgicalement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Des traitements analgésiques seront utilisés en périodes pré-, per- et postopératoires. Notre grille d’évaluation de la douleur permettra d’adapter le traitement et le protocole si nécessaire en fonction de divers points limites. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes fuselées à faible diamètre (150microm) pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiqueront comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Phylogénétiquement, ce modèle animal préclinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. -Différents troubles comportementaux ont déjà pu être induits chez le macaque suite a une perturbation d’activité localisée au niveau du striatum antérieur. -Des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. -Toute information physiologique ou physiopathologique obtenue chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les animaux reçus sont généralement des adolescents (3 ans). Ils arrivent souvent déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. Une recommandation sera formulée en ce sens auprès de nos fournisseurs pour favoriser des groupes sociaux compatibles.

Pour mesurer quelles cellules immunitaires entourent une tumeur osseuse selon la quantité d'une protéine de détoxication qu'elle produit, 46 souris reçoivent une injection de cellules d'ostéosarcome dans le muscle de la cuisse. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour l'analyse de la tumeur primaire et des poumons. Le porteur annonce des expériences n'excédant pas deux semaines et une tumeur qui gênerait légèrement les mouvements sans entraver l'accès à l'eau ni à la nourriture. La surveillance repose sur un examen clinique et une pesée deux fois par semaine, avec des points limites dont le contenu n'est pas précisé.

Objectifs

Nos travaux précédents ont identifié la corrélation inverse entre le niveau d'expression du gène d'intérêt et la réponse des cellules d'ostéosarcome aux chimiothérapies. La prétine étudiée est une protéine de détoxication, produite par une cellule en présence de composés jugés dangereux tels que la chimiothérapie dans notre cas. Concrètement, elle peut neutraliser physiquement certains composés avant qu’ils puissent agir. Elle est ainsi parfois impliquée dans la résistance aux chimiothérapies. Une autre fonction de cette protéine est de servir de réservoir/distributeur de zinc intracellulaire. Le zinc est essentiel au bon fonctionnement de centaines de protéines cellulaires et en particulier d'une autre protéine, qui joue un rôle clé dans la décision d’induction de mort de la cellule. Nous avons montré que lorsque notre protéine d'intérêt est en grande quantité dans la cellule, elle provoque une déficience en zinc et empêche l'autre protéine d’induire la mort de la cellule tumorale sous chimiothérapie. Nos travaux plus récents suggèrent que la prétéine étudiée peut sortir de la cellule et provoquer une déficience en zinc extracellulaire autour de la cellule. Cela influencerait l'activité des cellules immunitaires au contact de la tumeur, pour favoriser un environnement immunosuppressif. Ce projet de validation préclinique vise à analyser, à l’échelle de la cellule unique, la qualité et quantité des cellules immunitaires au sein de tumeurs exprimant peu ou beaucoup la protéine étudiée. Il permettra de compléter les données déjà obtenues in vitro, et viendra confirmer l'implication de cette protéine dans la tolérance immunitaire des tumeurs d'ostéosarcome. Il informera également des conséquences d’une forte expression de cette protéine sur la possible résistance aux immunothérapies (en essai clinique actuellement).

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des informations clés sur les populations immunitaires sensibles à la présence de la protéine étudiée et orientera sur des possibles résistances aux traitements par immunothérapie. Des stratégies thérapeutiques pourraient alors être envisagées afin d’optimiser les immunothérapies, voire prévenir ou contrebalancer la résistance.

Procédures

L'injection unique en intra-musculaire, dans la cuisse, des cellules tumorales se fera sous anesthésie gazeuse. Les souris ne seront anesthésiées que pendant quelques minutes. Aucun prélèvement ne sera effectué avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Nuisances : douleur potentielle après l’injection des cellules tumorales par voie intra-musculaire: modérée au maximum. Effets indésirables : développement tumoral pouvant gêner légèrement les mouvements des souris sans entraver leur déplacement ni leur accès à la nourriture ou la boisson. Aucun effet systémique attendu.

Devenir

Tous les animaux devront être euthanasiés pour analyses des tumeurs primaires et des poumons.

Remplacement

Ce projet nécessite d’utiliser un organisme vivant dont le système immunitaire est intact, complet et fonctionnel. Les relations et communications entre les différentes populations immunitaires sont cruciales pour une réaction complète contre la tumeur. La construction de modèles in vitro ou ex-vivo récapitulant l’ensemble des interactions est actuellement impossible du fait de leur complexité. Des simulations in silico ne sont pas encore possibles car cela nécessite de compiler un grand nombre de données or les ostéosarcomes sont des tumeurs rares, très hétérogènes et encore mal connues. Ce projet fait suite à de nombreuses analyses in vitro ayant apporté des arguments solides en faveur d’une influenced'une protéine d'intérêt sur certaines cellules immunitaires et sur leur comportement vis-à-vis des cellules d’ostéosarcome. Cependant ces expériences in vitro montrent rapidement leurs limites car elles n’impliquent ni l’ensemble des populations immunitaires, ni les interactions dynamiques et temporelles entre les cellules pendant le développement d’une tumeur. Le caractère incontournable du recours à l’animal vivant entier est donc établi. Ceci nous permettra d’étudier la modulation des populations immunitaires dans leur ensemble. Notre modèle cellulaire est une lignée issue d’une tumeur spontanée chez la souris. Cela nous permet d’implanter ces cellules tumorales à des souris de la même espèce c’est-à-dire dont le système immunitaire n’est pas modifié et réagit normalement.

Réduction

Une étude pilote sur un nombre restreint de souris permettra de déterminer le temps optimum pour l'arrêt des procédures, ce qui permettra de limiter le nombre total d'animaux du projet. En second lieu, nous procèderons à l'étude comparative. Afin de n’utiliser qu’un nombre minimal d’animaux tout en gardant une validité statistique de l’étude, nous avons déterminé le nombre mnimal de sujets par groupe. Ce projet utilise un nombre limité d'animaux qui a été soigneusement et scientifiquement déterminé.

Raffinement

Les animaux bénéficieront systématiquement de plusieurs enrichissements. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Ce projet fait l'objet de procédures rigoureuses réalisées par un personnel formé et vigilant quant à la détection de points limites (suivi quotidien de l’état de santé des animaux, examens cliniques et contrôle du poids 2 fois par semaine). L’injection des cellules tumorales sera réalisée par une voie qui permet le développement homogène des tumeurs. L’utilisation d’analgésiques limitera toute souffrance aux animaux. Les expériences du présent projet n’excéderont pas 2 semaines. Les animaux feront l'objet d'une surveillance quotidienne et d'examens cliniques adaptés à leur évolution. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Afin d'étudier le comportement du système immunitaire dans un environnement physiologique naturel, nous implantons des cellules tumorales dérivant d'un ostéosarcome spontané chez la souris dans un animal de même espèce et de la même souche : souris de souche Balb/c (= modèle syngénique). Ces animaux sont immunocompétents c’est-à-dire que leur système immunitaire est complet, fonctionnel et non modifié. Les souris seront âgées de 5-7 semaines au début de l’expérimentation. Un âge de jeune adulte améliore en effet la croissance tumorale.

580 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour éviter la souffrance liée à la croissance de la tumeur. Chacune reçoit une injection de cellules de glioblastome humain directement dans le cerveau, parfois accompagnée de la pose d'un implant, avec un suivi par IRM hebdomadaire. Une partie d'entre elles fait, à chaque séance de radiothérapie, un trajet routier de 95 kilomètres entre deux établissements, soit deux heures de transport aller et retour. Le porteur écrit qu'il n'existe "pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques" pour ses questions, après avoir décrit les études protéomiques et la modélisation informatique déjà conduites sur cellules.

Objectifs

L’identification récente de nouvelles "cibles", pouvant constituer de véritables moteurs de la maladie cancéreuse fait naitre de nouveaux espoirs de prise en charge du glioblastome (GB), tumeur du cerveau la plus fréquente et la plus agressive chez l’homme. L'objectif de ce projet est : - dans un premier temps d'étudier la tumorigénicité et la radiorésistance, en utilisant la radiothérapie externe aux rayons X en tant que traitement de référence, des cellules de Glioblastome humaines exprimant ces "cibles" et en parrallèle, de concevoir des thérapies spécifiques dirigés contre ces "cibles" - dans un second temps d'appliquer ces thérapies dans le GB pour anéantir la fonction tumorigénique de ces "cibles". Deux modalités d’administration locorégionale sont envisagées : l’injection directe sur la tumeur en place et l’application d'implants pour une délivrance « long terme » au sein des cavités de résection. Ce projet permettra d’explorer davantage ces "cibles" dans le GB et de qualifier de nouveaux outils afin si possible d’ouvrir la voie à des essais chez l’homme. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (ici référencés EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique par le ciblage de nouvelles cibles thérapeutiques sur une tumeur en place. Mais également une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavités d'éxérèse dans le glioblastome en synergie avec d'autres thérapeutiques pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) réalisée à l'EU1 - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose d'implants (durée d'environ 1h30) réalsiée à l'EU1 - l'injection intracérébrale de thérapies spécifiques (durée d'environ 30 minutes) réalisée à l'EU1. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 2. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire à l'EU1. L'un des actes, la radiothérapie externe sera réalisé à l'EU2 et inclut un transport d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure) pour aller à de l'EU1 à l'EU2 et la même durée pour revenir à l'EU1.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe 1. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.

Devenir

Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.

Remplacement

Le projet ici proposé a pour but l’étude de "cibles" et leur ciblage par une thérapeutique innovantes sur tumeur en place et au travers de bio-implants polymères sur cavité d'exérèse pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes finales de caractérisation des "cibles" (tumorigénicité, radiorésistance des lignées) et celle d’élimination (au travers de l’application de procédures de traitement par SiRNA et ASOs sur tumeur en place et sur la cavité d'exérèse), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Des études protéomiques et la modélisation informatique de ces données ont été faites sur des cellules hors du contexte animal. Par ailleurs justement pour ces dernière validation dans le contexte réel, il n'y a pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.

Réduction

En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces lignées cellulaires contrôles et exprimant les "cibles" ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables.

Raffinement

Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu. Les mesures de raffinement pour le transport des animaux incluent : l’évaluation de la santé des animaux pour ne transporter que les animaux en bonne santé, le choix des contenants appropriés, la température et humidité contrôlées (véhicules climatisés), l’alimentation et hydratation, la minimisation du stress et la planification de l’arrivée.

Choix des espèces

Nous étudions la tumorigénicité de "cibles" d'intérêts dans des lignées cellulaires humaines qui nécessite donc que ce modèle soit utilisé chez la souris CB17-SCID. Les souris seront utilisés à 8 semaines car elles seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.

Le taux de nucléotides à incorporer dans les aliments industriels pour poissons est l'objet réel de ce projet, motivé par le remplacement de la farine de poisson par de la farine de soja dans les rations d'élevage. 315 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements. Pendant dix jours, le volume d'eau du bassin est réduit une heure par jour pour provoquer un entassement, avec pour effets attendus une perte de poids, une baisse d'appétit et des blessures aux nageoires pectorales et caudales. Le porteur annonce que les résultats permettront aux producteurs d'améliorer les conditions d'élevage, un objectif qui revient à ajuster les rations d'animaux non-humains dont l'entassement a été reproduit ici délibérément.

Objectifs

Les nucléotides participent aux fonctions physiologiques et biochimiques essentielles et sont considérés comme des nutriments semi-essentiels du fait qu’ils soient synthétisés par l’organisme. Cependant face aux conditions d’élevage actuelles plus stressantes, avec des densités élevées et des manipulations plus fréquentes, les besoins en nucléotides sont accrus et ne peuvent plus être uniquement satisfaits par la synthèse endogène et doivent être apportés par l’alimentation. La nutrition nucléotidique joue ainsi un rôle clé dans l'optimisation des performances de production et la résistance au stress chez les poissons. En effet, il a été démontré que la supplémentation alimentaire en nucléotides améliore la croissance, la résistance aux maladies et les réponses immunitaires. Cependant, le remplacement progressif de la part de la farine de poissons par d’autres sources de protéines végétales telle que la farine de soja s’est intensifié dans l'alimentation aquacole. Cela a entrainé une réduction de la part de nucléotides dans la ration alimentaire. En effet, la concentration en nucléotides dans la farine de soja ne représentant qu'environ la moitié de celle de la farine de poisson. La supplémentation avec des nucléotides libres directement disponibles pour l’animal s’avère une stratégie nutritionnelle bénéfique afin d’optimiser la physiologie du poisson et les fonctions du système immunitaire en réponse à des conditions de stress. Malgré l’importance des nucléotides dans le maintien des fonctions physiologiques, peu d’études ont été réalisées pour déterminer les modalités de supplémentation en nucléotides exogènes chez les salmonidés. Les recommandations précédemment établies pour les niveaux d'inclusion de nucléotides sont probablement sous-optimales pour des formulations alimentaires modernes et des conditions d’élevage intensifiées. L’objectif de ce projet est de déterminer les taux optimaux d’incorporation de nucléotides libres dans la ration alimentaire des truites arc en ciel pour palier à la diminution de nucléotides dans les régimes commerciaux actuels bas en farine de poisson. Il vise également à étayer les données sur leurs effets bénéfiques sur les fonctions du système immunitaire en réponse à des conditions de stress.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront à court terme de mieux comprendre les effets bénéfiques observés avec des taux d’incorporation alimentaires élevés en nucléotides libres sur la capacité des poissons à faire face à des conditions de stress. La mise à disposition des résultats et leur interprétation permettra aux producteurs de poisson d’améliorer les conditions d’élevage et de participer à une pisciculture plus raisonnée et plus accessible.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 16 jours, dont 10 jours de stress d'entassement et 6 jours de récupération. Au cours du stress, le volume de l'eau dans le bassin sera diminué une heure par jour pendant 10 jours. Les sorties hors de l’eau pour la pesée des poissons par groupe (7 fois en trois mois, moins de 30 secondes) ne seront pas dommageables pour les poissons. Stress chronique avec une densité plus élevée due à la diminution du volume d’eau pour simuler un entassement des poissons (10 fois en deux semaines ; 60 minutes). Prélèvements sanguins avant l’application du stress (J0), 10 jours post stress (J10) et après 6 jours de récupération (J16). A chaque temps, un volume sanguin nécessaire et suffisant sera prélevé sur chaque poisson anesthésié pour l'analyse de la concentration plasmatique en lactate, glucose et cortisol. Pour chaque prise de sang, le temps ne dépassera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

Durant la période de stress: Perte de poids, diminution du facteur de condition, baisse de l’appétence, dégradation de l’état corporel. [[Blessures au niveau de la nageoire pectorale et caudale en fin de période de stress en raison de la diminution du volume d'eau dans le bassin. Douleur transitoire à l'endroit du prélèvement de sang réalisé une fois par animal]].

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements biologiques. Ces prélèvements permettront de mieux appréhender l'effet des différentes concentrations en nucléotides sur la résistance des poissons au stress d'élevage et d'optimiser de ce fait les rations alimentaires pour leur bien être.

Remplacement

Au moment de la délivrance de cette autorisation de projet, il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico capable de mimer l’intégralité des acteurs cellulaires et acellulaires participant à la stimulation du système immunitaire pour faire face au stress d’élevage subis par les poissons. De plus l’évaluation d’un additif alimentaire, implique de connaitre son mode d’action chez l’animal auquel il est destiné impliquant l'utilisation d'animaux vivants.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d'animaux adéquat pour ce projet. Les calculs ont été faits sur la base de résultats significatifs obtenus dans d'autres études sur les paramètres du stress (réponse immune, expression de gènes…) chez la truite arc en ciel ayant subi un stress d'élevage. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d'apporter de bonnes conditions d'élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux et d'obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d'informations possibles par animal.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux sont définies afin que la densité des animaux par bassin , les paramètres environnementaux,l'enrichissement des bassins ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et rcorrespondent à la législation en vigueur. Aucun animal ne restera isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire l’angoisse et le stress des animaux. Avant toute manipulation, les truites arc en ciel sont anesthésiées. La capture et le stress dus à la sortie des bassins pour la pesée par groupe des animaux et les prises de sang sont réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’un mousse humide pour poser l’animal sur le support de contention et d’un point de pression sur le site de prélèvement . Pendant la période de stress, le poisson reste dans l'eau en permanence, seule la nageoire dorsale sort de l’eau. Les concentrations d'oxygène sont mesurées toutes les 10 minutes dans tous les bassins, ainsi que la température au moyen ds sondes placées à l'intérieur de chaque bassin avec des remontées d'alarmes si l'une des valeurs est atteinte.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la truite arc-en-ciel, en tant que modèle animal de salmonidé. La truite est un bon modèle pour les salmonidés car elle est taxonomiquement proche du saumon [[et de physiologie comparable. Les fonctionnalités nutritionnelles sont les mêmes, les deux poissons étant carnivores, les besoins nutritionnels sont les mêmes. Par conséquent, la réponse physiologique de la truite au cours de l'étude sera la même que celle des autres salmonidés, les résultats pourront donc être transposés chez le saumon]]. La truite est également un animal plus résistant aux conditions d'élevage, aux maladies, avec un taux de croissance plus élevée. Au début de l’étude les truites pèseront 250 ± 10 grammes après avoir été élevées pendant 9 semaines, puis, à 280 g les poissons seront soumis à un stress chronique pendant 10 jours. Finalement un période de récupération de 6 jours sera considérée pour arriver à une taille finale de 350 g.

180 souris femelles reçoivent dès le sevrage, à trois semaines, un régime pauvre, modéré ou riche en zinc, et le suivent pendant un an. Chacune passe seize heures en cage métabolique individuelle à trois, six, neuf et douze mois pour le recueil des urines, puis est tuée sous anesthésie pour le prélèvement des reins et du cœur. Le groupe soumis à la ration pauvre en zinc risque de développer des calcifications et une insuffisance rénale, ce que le porteur présente comme l'objet même de l'étude. Le bénéfice espéré, proposer le zinc comme traitement des calcifications pathologiques, reste une hypothèse, quand les douze mois de régime contrôlé et les quatre passages en cage métabolique sont, eux, planifiés.

Objectifs

Les calculs rénaux (lithiase urinaire) voient leur incidence augmenter, affectant près de 10 pourcent de la population mondiale. La lithiase urinaire est à l’origine de nombreuses interventions chirurgicales et hospitalisations, source d’infections parfois gravissimes. La première étape de formation des calculs rénaux est très souvent le développement de plaques de Randall : des calcifications du tissu rénal qui affectent la papille rénale. De forts taux de zinc ont été identifiés dans les plaques de Randall des souris ; ce zinc pourrait jouer un rôle d’inhibiteur de la minéralisation. L’objectif du projet est de déterminer si les apports alimentaires en zinc ont un impact sur les calcifications vasculaires et rénales au long terme. L'hypothèse est que les apports de zinc protègent contre le développement des calcifications qui surviennent avec l’âge, et ce notamment chez des sujets prédisposés (mutations génétiques) pour ces calcifications.

Bénéfices attendus

Le zinc est un oligo-élément qui a prouvé avoir des effets bénéfiques sur les calcifications des valves aortiques. De forts taux de zinc ont été identifiés dans les plaques de Randall des souris et nous supposons que ce zinc pourrait jouer un rôle d’inhibiteur de la minéralisation. L’objectif du projet est de déterminer si les apports alimentaires en zinc ont un impact sur les calcifications vasculaires et rénales. L'hypothèse est que l’administration de faibles doses de zinc aggraverait le développement attendu des calcifications rénales et vasculaires tandis que l'administration de fortes doses de zinc protègerait contre les calcifications rénales (plaques de Randall) mais également vasculaires. Cela permettrait de proposer l’administration de zinc comme traitement contre les calcifications pathologiques. En effet, la formation de calculs rénaux affectent près de 10 pourcent de la population mondiale, et est à l’origine de nombreuses interventions chirurgicales et hospitalisations. Ces calculs peuvent conduire à une insuffisance rénale chronique, voire à la mise en dialyse dans les cas les plus sévères.

Procédures

Les souris vont être à partir du sevrage (environ 3 semaines), et cela pendant 1 an, soumis à un régime spécial pouvant impacter l'évolution de la survenue de calcifications rénales et aortiques : pauvre, modéré et riche en zinc. Elles seront également mises en cage métabolique afin de doser les paramètres urinaires à 3 mois 6 mois, 9 mois et 12 mois du traitement. Cette intervention sera de 16 heures mais pourra être adaptée si un point limite de l'animal est constaté. A la fin de l'étude les animaux seront anesthésiés et analgésiés, puis soumis à un prélèvement sanguin unique et différents prélèvements de tissus / organes nécessaires aux analyses (rein, cœur, etc.).

Impact sur les animaux

Le changement de régime pourrait causer un stress (néophobie) et une baisse de la consommation de manière transitoire. Le recueil d'urine en cage métabolique individuelle peut induire un stress pour les animaux (stress social). Il y a un risque de survenue de calcifications pouvant entraîner une insuffisance rénale pour le groupe exposé à une faible concentration en zinc, ceci en fait l'objet de cette étude.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux expérimentaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

Nous souhaitons étudier l'effet du zinc sur le développement de calcifications rénales et vasculaires. Le modèle murin est particulièrement approprié pour ce projet car nous possédons au sein de l'animalerie un modèle murin prédisposé à calcifier la papille rénale. Cette étude s'intéressant à l'évolution des calcifications au sein d'organes précis, elle ne peut donc pas être réalisée sur des cellules ou des organoïdes.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir d'un calcul de puissance et des données déjà connues dans ce modèle. Le nombre d'animaux prévu est de 180 souris (femelles de 3 semaines).Des tests statistiques seront mise en oeuvre pour l'analyse des données afin de réduire le nombre d'animaux dans les prochains groupes .

Raffinement

Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), d’un dôme en cellulose et de morceaux de bois à ronger. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur. Les critères d’arrêt sont la prostration, ou la perte de dix pour cent du poids initial (les animaux seront pesés 1 fois par semaine). Le recueil d'urine n'est pas invasif et les animaux seront habitués aux cages métaboliques. Les points limites seront surveillés tout au long de la procédure.

Choix des espèces

Notre modèle de souris est le reflet de la pathologie humaine sur le développement de calcifications rénale et vasculaire. Les souris seront utilisées au sevrage (environ 3 semaines) car habituellement il y a un changement d'alimentation à cette étape de développement des animaux. Nous profitons donc de ce changement pour intégrer l’alimentation spécifique en zinc.