Procédures modérées

Anesthésiés pour une IRM cérébrale d'une heure, puis réanesthésiés trois à sept jours plus tard pour une ouverture de la boîte crânienne et l'implantation de sondes pendant cinq à sept heures, 20 cochons de moins de 15 kg ne se réveillent pas. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, alors que la seconde se termine sans réveil. Il s'agit de tester des sondes capables de mesurer le froid ou la lumière délivrés dans le cerveau, pour des dispositifs destinés à l'épilepsie, à la maladie de Parkinson et à l'ablation de tumeurs. Leur cerveau est prélevé pour mesurer les lésions produites, et le porteur indique que 14 animaux suffiraient si les résultats attendus arrivent.

Objectifs

L’utilisation de sondes enregistrant l’activité cérébrale est indispensable dans l’étude de diverses pathologies neurodégénératives, comme la maladie de Parkinson par exemple, mais également dans l’identification des foyers épileptiques pour déterminer la zone à retirer par chirurgie. Actuellement ces sondes sont uniquement munies de capteurs permettant l’enregistrement de l’activité électrique des neurones ou permettant la stimulation pour identifier les zones fonctionnelles impliquées. Concernant les études portant sur l’épilepsie, une nouvelle thérapeutique portant sur l’utilisation de l’effet du froid au niveau du foyer épileptique pour stopper les crises semble émerger. Des équipes ont réussi à arrêter des crises chez les rongeurs en utilisant des électrodes refroidissantes sans pour autant produire de lésions locales. Ces caractéristiques font du refroidissement par sonde une bonne alternative à l’électrostimulation. L’utilisation de froid à des températures cryogéniques (-40°C) est une technique qui consiste à détruire les tumeurs par cryoablation. Ce type de sondes ne dispose pas de capteurs permettant la mesure in vivo de cette température, ce qui permettrait de mieux comprendre comment le froid se propage dans le tissu et ainsi améliorer la délimitation de la zone ciblée Dans la maladie de Parkinson, un essai clinique en cours évalue l’effet de la lumière proche infra-rouge dans le traitement de la maladie, ainsi que la sécurité de l’implant produisant la lumière et l’absence d’effets secondaires dus à cette lumière. Dans ce cas, il s’agit d’une sonde disposant uniquement d’un système émettant de la lumière sans système de mesure de la lumière diffusée dans le cerveau. L’objectif scientifique de notre étude est de proposer de nouvelles sondes multimodales qui devraient permettre d’acquérir plus de données simultanées pour mieux comprendre le fonctionnement de la structure cérébrale visée, la thérapeutique appliquée et également mieux maitriser les doses utilisées (la dose de lumière proche infra-rouge, la dose de froid appliquée en profondeur, mieux définir le foyer épileptique).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer de nouveaux capteurs et senseurs qui pourraient être intégrés dans des dispositifs implantables chez l'humain pour le traitement de diverses pathologies cérébrales, telles que la maladie de Parkinson, l’épilepsie, le mapping chirurgical et l’ablation de tumeur. Les sondes de refroidissement auront une double utilité : arrêter les crises en refroidissant le foyer épileptique dans le cadre de l’épilepsie ou réaliser l’ablation d’une tumeur à des températures extrêmement basses, bien en dessous de 0 °C, tout en intégrant des fonctionnalités de monitoring permettant de délivrer précisément la dose de froid nécessaire. De plus, les nouveaux implants optiques et biochimiques permettront d'analyser les tissus autour des sondes et d’ajuster les doses de lumière à délivrer en conséquence.

Procédures

Les animaux seront soumis à une imagerie par IRM sous anesthésie générale (injection intramusuclaire pour la sédation et intraveineuse pour le produit de contratse) d'une durée d'environ 1 heure. Entre 3 et 7 jours après, une seconde anesthésie (injection intramusuclaire pour la sédation voir intraveineuse pour l'anesthésie), accompagnée d'analgésie par injection sous cutanée, sera réalisée pour procéder à une chirurgie d'implantation de sondes dans le cerveau après ouverture de la boite cranienne, d'une durée de 5 à 7 heures, sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La procédure envisagée a été imaginée pour réduire le plus possible les effets indésirables sur les animaux. Cette procédure en 2 étapes (imagerie puis chirurgie d’implantation sans réveil) se déroulera sur 2 semaines afin de permettre d’avoir une étape de 4 jours d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement lors de leur arrivée suivie d’un délai de 3 à 7 jours avant leur utilisation dans le 2nde protocole. Le protocole 2 étant une chirurgie sans réveil elle sera forcément accompagnée d’effets indésirables telles que la douleur qui est prise en charge par l’utilisation d’analgésiques appropriés. Dans un objectif de réduction de stress pour l’animal, ce protocole 2 sera réalisé pour chaque animal sur plusieurs jours consécutifs afin de ne pas laisser d’animaux seuls plus de 24h.

Devenir

A la fin des expérimentations et à la suite d’une procédure sans réveil, nous devrons euthanasier les animaux afin de prélever leur cerveau pour analyser le degré de lésion produit par les dispositif en vue d’un passage à un dispositif implantable chez l’Homme.

Remplacement

Il n’existe à ce jour malheureusement aucun modèle alternatif in vitro ou in silicone permettant de réaliser de tels tests fonctionnels. Par voie de conséquence, le projet doit être mené sur un modèle animal. Nous utilisons un modèle de mammifères de grande taille afin de nous permettre de tester nos dispositifs adaptés à la taille humaine sans devoir les réduire. Ceci diminuera ainsi une source d’incertitude reconnue dans l’évaluation des dispositifs médicaux lors de l’évaluation de certains dispositifs médicaux humains sur des modèles rongeurs de petite taille et permettra ainsi un transfert rapide à l’homme. Ce choix vient de fait également réduire le nombre d’animaux à utiliser pour mener à bien les tests des dispositifs.

Réduction

Ce projet cherche à évaluer de nouvelles sondes multimodales innovantes, utilisées pour diverses applications médicales. En procédant de cette manière, nous réduisons le nombre total d'animaux nécessaires en évitant de réaliser des tests séparés pour chaque technologie. Pour déterminer combien d'animaux sont nécessaires, nous avons utilisé une méthode statistique rigoureuse, en prenant en compte plusieurs points de mesure dans le cerveau. L'une des stratégies consiste à utiliser l'hémisphère opposé du cerveau comme référence, ce qui nous permet de limiter le nombre d'animaux requis. Selon nos calculs, le nombre maximal d'animaux prévu est de 20 individus, en tenant compte de la complexité des chirurgies. Cependant, nous n'en réaliserons que 14 si nous obtenons les résultats scientifiques attendus.

Raffinement

Les protocoles se dérouleront sous anesthésie et analgésie, et les animaux ne seront pas réveillés après la chirurgie, ce qui minimisera leur inconfort. Une attention particulière sera portée aux animaux pendant la période entre l'IRM et la chirurgie sans réveil. Avant l'IRM, les animaux seront d'abord sédatés, puis placés sous anesthésie, qui sera maintenue pendant toute la durée de l'examen. Pour la chirurgie, une prémédication sera administrée afin de préparer les animaux, et des médicaments seront utilisés pour réduire la salivation et faciliter l'intubation. La veille de la chirurgie, l'animal recevra un anxiolytique modéré pour réduire son stress. Pendant l'opération, une analgésie sera administrée pour contrôler la douleur avant l'incision, avec des doses supplémentaires administrées dès les premiers symptôme de douleurs. L'anesthésie générale sera maintenue tout au long du protocole, complétée par une anesthésie locale.

Choix des espèces

Nous souhaitons utiliser des dispositifs qui soient de la même taille que ceux qui pourraient être utilisés chez l’homme ce qui exclut le recours à un modèle rongeur. Le transfert technologique chez l’homme impose des tests préalables dans un modèle de grands mammifères, au plus près possible des conditions de mise en œuvre clinique. Le porc est un modèle pertinent de par les similitudes anatomiques et constitutives avec le cerveau humain. La physiologie de son système nerveux et ses caractéristiques spatiales sont suffisantes pour faire la preuve de concept des solutions techniques que nous proposons. Pour leur stade de développement, ce projet nécessite de travailler avec des animaux d’un poids inférieur à 15 kg (environ 8 semaines à la réception), afin de permettre l’imagerie des sujets dans l’IRM.

Gavées chaque jour pendant trois semaines, irradiées, greffées par injection dans le sinus de l'œil ou dans la veine de la queue, 1 048 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Un amendement ajoute à 400 d'entre elles une greffe sous-cutanée de cellules tumorales, suivie de deux séances d'imagerie par semaine pendant vingt et un jours et de mesures de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. Le projet vise à accélérer la reconstitution du système immunitaire après greffe de cellules souches chez des malades du sang, en la ramenant de deux ans à trois mois. Pour ces souris porteuses de tumeurs, le porteur annonce des points limites entraînant une mise à mort anticipée, sans préciser lesquels.

Objectifs

La greffe de cellules souches offre des perspectives de guérison aux patients atteints d’hémopathies malignes (cancer du sang) et à d'autres troubles hématologiques comme les déficits immunitaires. La transplantation avec des cellules souches peut être autologue (provenant des propres cellules du patient) ou allogénique (provenant d’un donneur sain et compatible avec le receveur). La greffe allogénique est limitée par le manque de donneurs compatibles. Lorsqu’un patient est atteint d’un cancer du sang, celui-ci subira des chimiothérapies et/ou irradiation réduisant à néant son système immunitaire avant d’être injecté par des cellules souche. Mais la durée de restauration d’un système immunitaire efficace et fonctionnel après la greffe peut aller jusqu’à deux ans. Durant cette période, le patient n’a pas d’immunité pleinement fonctionnelle et peut contracter de multiples infections représentant une des principales causes de mortalité. Nous proposons de réduire cette période de risque chez les patients en proposant une approche thérapeutique innovante pour accélérer la reconstitution d’un système immunitaire fonctionnel. De cette façon, le délai de reconstitution est réduit à 3 mois (au lieu de deux ans) permettant de réduire les durées d’hospitalisation et les risques d’infections opportunistes. Dans cette perspective, les résultats précliniques doivent être consolidés par des données pharmacologiques dans un modèle murin adulte mimant la condition clinique des patients. La souris représente un modèle pertinent pour l’étude. Ces souris nécessitent un conditionnement par chimiothérapie et/ou irradiation comparable à ceux utilisés chez les patients avant d’être greffés. Ces souris représentent un modèle indispensable afin de tester in vivo les stratégies thérapeutiques proposées dans des conditions similaires à celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable à l’application de nouvelles stratégies innovantes dans les protocoles cliniques. Le projet se déroulera sur deux EU différentes.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant l’injection de cellules immunitaires pour lutter contre les cancers du sang. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. De plus, les études de régénération d’un thymus chez les souris âgées peuvent ouvrir la voie à une nouvelle perspective thérapeutique chez les patients souffrant de complications liées au processus de vieillissement, au SIDA, ou aux radiations dues à une catastrophe nucléaire. En effet, dans tous les cas cités, les personnes sont susceptibles de perdre leurs systèmes immunitaires et l’approche thérapeutique proposée permettrait de régénérer de façon rapide et efficace une défense immunitaire fonctionnelle. AMENDEMENT : Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des progéniteurs lymphoïdes qui pourront avoir un éventuel effet antitumoral.

Procédures

Les interventions se limiteront à : 1. Irradiation : L’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles. 48 souris seront irradiées 1 fois (EU1). 2. Une seule injection intraveineuse dans le sinus orbitale gauche et/ou droit sous anesthésie générale. L’injection durera 1 minute / animal sur 128 souris (EU1) 3. Une injection intraveineuse dans la veine caudale de la queue des souris vigiles maintenues dans un tube de contention. L’injection durera

Impact sur les animaux

De façon général, les médicaments de chimiothérapies et/ou irradiation peuvent occasionner chez l'animal des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress nécessitant une anesthésie générale au préalable. Le gavage peut provoquer un stress et une douleur au niveau de l’œsophage chez l’animal. AMENDEMENT : L’injection sous-cutanée de tumeurs peut entrainer un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. La manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux. Le transport entre les deux animaleries peut également engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience pour le prélèvement et l’analyse des organes nous permettant de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

Des études de différenciation in vitro ont été réalisées afin d’optimiser les conditions de préparation des cellules à injecter et de s’assurer de leur potentiel à donner des cellules fonctionelles. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus expérimental de mises au point. Les études précliniques de pharmacologie (mode d’administration, effet dose-réponse, efficacité de colonisation du thymus âgés) sont demandées par les autorités règlementaires avant les essais cliniques et ne peuvent pas être substituées ou mimés in vitro.

Réduction

La méthode de chimiothérapie et/ou irradiation la plus adaptée sera préalablement choisie avant les études de dose réponse. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et ainsi de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Le nombre d’animaux par groupe dans les différentes procédures a été calculé selon une méthode fiable et très utilisée dans la littérature permettant de fournir des données statistiquement exploitables. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Une partie des animaux pourra ne pas être utilisée en fonction des résultats obtenus pour permettre l’ajustement de la dose des traitements (168 souris potentielles). AMENDEMENT : L’utilisation de l’imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort sequentielle d’animaux.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de l'étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés. La mise à mort sera précédée par une anesthésie générale pour éviter le stress et la souffrance. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires au sinus retro-orbital chez les animaux greffés. Toute chimiothérapie et/ou irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de la mise à mort de l'animal. AMENDEMENT : Des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Lors du transfert, les souris seront transférées dans des boites de transport avec de l’enrichissement et de la nourriture, les 2 établissements étant sur le même palier. Des mesures analgésiques adaptées seront mises en œuvre avec le vétérinaire pour limiter la douleur.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement du systéme immunitaire. En effet, le système immuno-hématologique murin est très similaire au système humain dans sa fonctionnalité et son développement permettant une extrapolation des résultats obtenus. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une grande homogénéité génotypique. Souris adultes de 6 à 12 semaines (et souris adultes âgées de plus de 9 mois) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier son développement.

Avant qu'un implant vasculaire ou un implant libérant un médicament ne soit mis sur le marché, la réglementation impose d'en tester la tolérance sur des animaux non-humains. 90 lapins vont être utilisés pour cela, tous tués à l'issue du suivi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit sous anesthésie générale, en une intervention d'une trentaine de minutes, plusieurs injections de biomatériau dans la peau et dans les muscles, en différents sites, puis jusqu'à huit prélèvements sanguins de 2 mL en vingt-quatre heures sur animal vigile. Le porteur reconnaît des démangeaisons et des douleurs au site d'implantation dues à une inflammation ou à une nécrose locale, et présente le cumul des implants sur un même lapin comme une mesure de réduction.

Objectifs

Les biomatériaux sont des matériaux conçus pour interagir avec les systèmes biologiques, qui participent à la constitution d'un dispositif à visée diagnostique, d’assistance fonctionnelle ou thérapeutique. Ils peuvent être de différente nature (métaux, céramiques, polymères) et remplir des fonctions très variées : valves cardiaques, stents, implants dentaires, lentilles, prothèses, sutures, organes artificiels, etc. Tous doivent répondre à des exigences de biocompatibilité et de performances en lien avec leur utilisation. Dans le cadre de ce projet, on s’intéresse plus particulièrement à de nouveaux biomatériaux polymériques synthétiques ou naturels. Ces matériaux se présentent sous la forme de particules solides ayant une taille de quelques dizaines de microns à quelques millimètres, ou sous forme de gel liquide. Deux utilisations sont à l’étude : agent d’occlusion vasculaire, pour dévasculariser des tumeurs ou des saignements par voie endovasculaire, et vecteur de principe actif pour libérer une substance active sur une période contrôlée (anticancéreux, anti-inflammatoire, analgésique). L’implantation de ces biomatériaux chez l’homme et chez l’animal est réglementairement précédée d’une phase au cours de laquelle ces biomatériaux sont évalués en termes de sécurité pour la personne ou l’animal qui les recevra. Le projet a pour objet l’évaluation de la biocompatibilité et de la libération de principes actifs de ces biomatériaux

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont d’ordre scientifique et technologique. Les études menées doivent permettre de vérifier la bonne tolérance de futurs produits de santé destinés à une utilisation chez l’homme ou chez les animaux, tels que des implants vasculaires ou des implants libérant de façon prolongée des molécules actives telles que des anti-douleurs. Elles correspondent à une obligation réglementaire pour le développement et la mise sur le marché de dispositifs implantables et produits combinant un agent pharmacologique.

Procédures

Les animaux subissent une intervention chirurgicale unique correspondant à l’injection du matériau sous forme de suspension en différents sites (ex. intradermique, intramusculaire). La procédure est réalisée sous anesthésie générale et dure environ 30 min. Des prélèvements sanguins peuvent ensuite être effectués pour doser une molécule libérée par le matériau ou doser un marqueur de l’état de l’animal (maximum 8 prélèvements de 2 mL sur 24h, puis repos sur une semaine). Ces prélèvements sanguins sont réalisés sur l’animal vigile et durent moins de 5 min.

Impact sur les animaux

Outre le stress engendré par la contention et la manipulation des animaux, il est possible que l’implantation des biomatériaux, la réaction de l’organisme à ces matériaux ou les doses de médicament libérées par le matériau engendre des effets indésirables sur les animaux, tels que des démangeaisons et des douleurs au site d’implantation dues à une inflammation ou une nécrose locale (événement très rare). D’une façon générale et moins sévère, l’appétit des animaux peut être diminué pendant les premières 24 à 48 h suivant la procédure d’implantation.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la période de suivi et des échantillons sont collectés pour analyse microscopique de l’implant et des tissus environnants;

Remplacement

Des études de cytotoxicité sur cultures cellulaires in vitro sont réalisées au préalable dans les étapes précoces du développement du biomatériau. Des essais de libération de principes actifs dans différentes conditions sont également effectués pour les implants chargés. Cependant, les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse d’un organisme entier face à l’administration d’un implant ou d’une molécule thérapeutique. La réaction immunitaire, la pharmacocinétique d’un médicament ne peuvent être reproduites dans des modèles in silico ni dans des modèles in vitro. Ces modèles sont aussi insuffisants pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Le recours à des essais sur animaux vivants apporte des données à la fois supplémentaires et indispensables sur le comportement des biomatériaux dans les tissus vivants;

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est déterminé d’après les recommandations des normes applicables (ex ISO10993-6 préconisant 3 animaux et 10 échantillons d’essais pour une implantation sous-cutanée) afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques comparatives. On inclut parmi les implants des biomatériaux contrôle (matériaux référence ou produits commerciaux) dont les effets locaux sont connus. Le nombre total d’animaux est réduit d’une part en posant sur le même animal plusieurs types d’implants, en implantant le même biomatériau au même animal plusieurs fois en différents sites, et en effectuant plusieurs prélèvements sur le même implant au moment de l’analyse histologique.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale. Un protocole de suivi des animaux et de prise en charge de la douleur et des traitements analgésiques systématiques et symptomatiques sont mis en place. Des points-limites avec évaluation des paramètres de suivi sont utilisés afin de réduire au maximum la douleur animale. Une visite de minimum une fois par jour est effectuée pour évaluer ces paramètres. Les animaux sont hébergés et suivis dans des conditions qui respectent leur bien-être : température et hygrométrie de l’environnement contrôlés, espace suffisant, présence systématique d’enrichissement du milieu (bâtons de bois à ronger, jouets, plateformes) et alimentaire (foin, persil, carottes), nourriture et eau à volonté

Choix des espèces

• La taille et l’anatomie du lapin permettent d’utiliser le même matériel que dans les plupart des procédures cliniques sur espèces cibles. • La procédure d’implantation est simple et rapide. • Plusieurs biomatériaux et plusieurs sites d’implantation peuvent être étudiés sur le même animal • Les prélèvements sanguins peuvent être répétés sans sacrifice de l’animal, ce qui permet d’obtenir une cinétique plasmatique sur un animal et de réduire le nombre total d’animaux utilisés par rapport à des espèces plus petites. • L’espèce est couramment utilisée et référencée pour ce type de tests, qu’il s’agisse de médicaments ou dispositifs médicaux. Animaux jeunes adultes, âgé de 4 à 12 mois, de 3.5 kg ou plus. Les animaux devront avoir plus de 4 mois pour avoir atteint un poids qui permet d’injecter une plus grande quantité de matériaux que chez des animaux plus jeunes et ainsi diminuer le nombre total d’animaux utilisés. On évite également les animaux plus jeunes car les tissus sont encore en croissance. On limite l’âge maximum à 12 mois car les animaux plus âgés ne sont généralement pas disponibles chez les fournisseurs, ou bien ponctuellement avec des écarts d’âge importants ou des historiques différents, introduisant une hétérogénéité au sein du lot et un risque de biais des résultats. Tous les animaux inclus dans un protocole donné devront être du même âge à +/- 1 mois et du même poids à +/- 500g pour avoir un groupe homogène.

Sevrés à huit semaines, vaccinés deux fois à quatre semaines d'intervalle, puis infectés au cinquantième jour par le virus de la leucose féline sous anesthésie, 24 chatons européens subissent ensuite au moins dix-huit prélèvements sanguins à la jugulaire sur vingt-deux semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le test compare deux formulations de vaccin vétérinaire pour le compte d'un fabricant. Aucune réaction sévère n'est attendue, la leucose mettant six mois à plusieurs années à se déclarer. Comme les vaccins candidats ne garantissent pas la protection et que la maladie peut apparaître bien plus tard, tous les chats sont tués à la fin de l'étude, ce que le porteur qualifie d'"éthiquement nécessaire".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité, via la couverture immunitaire, de deux différentes formulations de vaccins vétérinaires (134.21 candidat 1 ou candidat 2) contre le FeLV (leucose féline) chez le chat européen.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise à disposition de nouveaux vaccins félins permettant de protéger les chats face à la leucose féline (FeLV) tout en diminuant les effets secondaires pouvant être liés à des adjuvants.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées : - Administrations de vaccin sur animaux vigiles selon la posologie, la fréquence et la voie d’administration recommandée par le fabricant et conforme à la réglementation. Chaque animal recevra 2 vaccinations espacées de 4 semaines par voie sous-cutanée, durée inférieure à la minute. - Une seule administration du virus sous anesthésie générale par administration intranasale et orale, durée de l'administration de l'ordre de la minute - Prélèvements de sang sur animaux vigiles : Chaque animal fera l’objet de plusieurs prélèvements sanguins espacés de façon régulière durant toute la durée de l’étude. Ces prélèvements seront réalisés sur les veines jugulaires des animaux en alternant les côtés le plus possible. Ces prélèvements seront réalisés avant chaque administration vaccinale et le jour de l'administration du virus (soit 3 prélèvements sanguins sur les 50 premiers jours de l’étude, espacés de minimum 20 jours les uns des autres) puis seront réalisés chaque semaine, une fois, à partir de l'administration du virus (D50) et jusqu’à la fin de la phase animale. Il y aura donc à minima 18 prélèvements sanguins sur 22 semaines (maximum 1 prélèvement/semaine) d'un durée:

Impact sur les animaux

Aucune réaction sévère liée à l’inoculation du vaccin ou du virus n’est attendue durant cette étude, le développement de symptômes liés au virus de la leucose féline prend généralement plus de 6 mois à plusieurs années (exemple : immunodépression, anémie sévère, développement de cancers tels que le lymphome). Les nuisances attendues liées aux administrations sous cutanées et intramusculaire et aux prélèvements sanguins des animaux sont celles liées au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille sous la peau ou dans le muscle entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction. Cependant, un suivi de tolérance locale sera réalisée après chaque vaccination et ce pendant plusieurs jours afin de monitorer la zone (le flanc de l'animal) et les potentielles réactions cutanées ou douleurs suite à l'administration du candidat vaccin. Pour l'inoculation du virus, les animaux seront sous anesthésie générale, cela peut engendrer du stress lié à l'endormissement et au réveil.

Devenir

Après l'administration du virus, les vaccins tests dans cette étude sont au stade recherche et ne garantissent pas la protection des animaux contre la leucose féline. Cette maladie peut se déclarer longtemps après c'est pour cela qu'il est éthiquement nécessaire d'euthanasier les animaux à la fin du projet.

Remplacement

Le recours aux chats sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du candidat vaccin et qu'il n’existe pas de méthode alternative à ce jour pour ce type de test. L’étude sur l’espèce cible est une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché d’un nouveau vaccin.

Réduction

Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum pour que chaque test inclut le nombre d’animaux requis afin d’obtenir des résultats interprétables, selon les guidelines européennes le cas échéant.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets suspendus, tunnel/plateforme). Les animaux pourront être hébergés dans un milieu conventionnel incluant des précautions supplémentaires prises par le personnel pour éviter toute contamination des animaux non vaccinés du reste de la colonie présente sur le site. Tout au long de la procédure, les animaux auront accès à volonté à l'eau ainsi qu’à une nourriture adaptée à leur âge et répondant à leur besoin énergétique. La procédure expérimentale commence sur de jeunes chatons qui seront préalablement sevrés à l’âge standard qui est de 8 semaines et auront une période d’acclimatation aux conditions environnementales du site d’au minimum 1 semaine . Les volumes et les fréquences de sang prélevés et les doses administrées respecteront le bien-être animal et les recommandations du Gircor . En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique sévère chez l’animal (exemple : vomissements très intenses à répétition, prostration de l’animal, difficultés respiratoires, choc anaphylactique …), il sera pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra recevoir un traitement adapté pour le soulager et si nécessaire être exclus de la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Le recours aux chats sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du candidat vaccin et qu'il n’existe pas de méthode alternative à ce jour pour ce type de test. L’étude sur l’espèce cible est une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché d’un nouveau vaccin. Jeunes chats sevrés âgés d’environ 9 à 10 semaines.

Sur 304 macaques crabiers utilisés dans ce projet, 116 seront transférés vers d'autres projets après accord du vétérinaire et 188 tués pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit de une à quinze administrations d'un candidat médicament, subit jusqu'à neuf prélèvements sanguins par semaine, des prises de température rectale, une télémétrie sur vingt-quatre heures et un examen ophtalmologique sous anesthésie. Le nombre d'animaux, de un à trois par sexe et par dose, ne repose sur aucun calcul statistique. Le porteur conclut qu'il est "indispensable" de passer par une espèce non-rongeur avant la première administration chez l'humain.

Objectifs

Il reste encore de nombreuses pathologies pour lesquelles les besoins thérapeutiques ne sont pas satisfaits. L’objectif principal de la Recherche Pharmaceutique est de développer de nouvelles molécules à visées thérapeutiques qui seront évaluées durant des essais cliniques. Pour cela, un profil de sécurité de ces nouvelles molécules doit être établi conformément à la réglementation. Les études préliminaires vivo de sécurité non clinique interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique et ne sont réalisées que sur des molécules testées au préalable sur les méthodes alternatives disponibles. Ces études préliminaires sont généralement de courte durée (entre 1 jour et 2 semaines, peuvent exceptionnellement aller jusqu’à 4 semaines dans le cas de molécule de type biologique) et utilisent un nombre restreint d’animaux. Leur objectif est d’identifier le profil cinétique, les potentiels effets secondaires et de cibler la gamme de doses à tester dans les futures études réglementaires. La conception de ces études est optimisée de manière à obtenir un maximum d’informations pour rendre plus efficace l’utilisation de ces animaux. En effet, en fonction des données disponibles du médicament, les examens pourront inclure certains paramètres cliniques (suivi du comportement, de la température, du poids, de la consommation alimentaire), hématologiques, biochimiques et cinétiques nécessitant des prises de sang ou encore histopathologiques par autopsie. Ces analyses seront adaptées à la molécule étudiée et à la pathologie concernée. Les études réalisées dans ce cadre ont pour but d’aider à choisir les doses pour les études réglementaires précliniques et, à terme, permettre de sécuriser la première administration du candidat médicament chez l’humain. Dans le cadre de ce projet, différents médicaments (molécule chimique ou biologique, thérapie génique, anticorps) pourront être testés en fonction des études réglementaires à réaliser.. Cela pourra inclure l'évaluation de médicaments avec une indication en cardiologie, en oncologie, en neuropsychiatrie ou pour le traitement de pathologies métaboliques et maladies auto-immunes. Liste des études concernées - Etudes précoces d’évaluation du profil cinétique et/ou du métabolisme chez le macaque cynomolgus - Etudes précoces d’évaluation de la toxicité de courte durée chez le macaque cynomolgus - Evaluation du profil toxicologique et toxicocinétique chez le macaque cynomolgus

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’évaluer très précocement la toxicité éventuelle de candidats-médicaments en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental des études réglementaires (diminution des contraintes pour l’animal). Détecter le plus précocement possible des effets potentiellement toxiques des candidats-médicaments en développement permettra en plus d’assurer la réduction du nombre d'animaux qui seront utilisés à des fins de recherche pour sécuriser in fine l’utilisation chez les patients.

Procédures

Les études incluses dans ce projet ont une durée de 1j à 4 semaines selon le mode d’administration prévu chez l’humain. Les voies d’administrations (orale ou parentérale) sont celles prévues chez l’Homme. Des examens réguliers seront faits à l’aide de matériel adapté à l’espèce et incluent : observations cliniques, prise de température corporelle (mesure rectale), prélèvements de sang pour vérifier les paramètres hémato-biochimiques et vérifier le passage du médicament dans le sang, examen cardiologique (ECG ou mesure de pression artérielle généralement par télémétrie non invasive sur 24h maximum), collecte d’urines sur 24h maximum (via des entonnoirs placés sous les unités d’hébergement), examen ophtalmologique (sous anesthésie, technique non invasive, en début et en fin d’étude : 30minutes maximum/examen ). Administration des traitements : voie IV (de quelques secondes à 30 minutes si perfusion) et PO (moins d’une minute) et sous-cutané (moins d’une minute); en fonction de la procédure, 1 à 15 administrations max Prélèvements sanguins : durée du prélèvement (moins de cinq minutes) 9 temps maximum sur plusieurs jours par semaine en fonction du type de candidat médicament (exemple : anticorps). Le volume total prélevé par semaine ne dépassera jamais à 7.5 % du volume total circulant

Impact sur les animaux

En fonction de la classe des produits et de la dose, on pourrait s’attendre à avoir, comme mentionné dans notre grille des points limites, des changements ou modifications de l’apparence (ex : absence de toilettage), du rythme respiratoire, de la consommation alimentaire et hydrique, de la température corporelle, de l’activité comportementale, des fonctions digestives et poids corporel. On s’assurera que la somme des observations ne dépassera le degré de sévérité mentionné dans chacune des procédures en mettant des actions correctives avec le support du vétérinaire du centre.

Devenir

L’euthanasie des animaux est envisagée pour effectuer des prélèvements d’organes et analyse histologique/biochimique post-mortem des tissus. Les autres animaux gardés en vie pourront être réutilisés dans d’autres projets après accord du vétérinaire 304 animaux au total dont 116 réutilisés et 188 euthanasiés.

Remplacement

Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives à l’utilisation d’animaux pour définir les marges « sécurité » d’un candidat-médicament. Il est indispensable de passer sur une espèce non-rongeur pour sécuriser le passage d’un composé en développement clinique (demande réglementaire).

Réduction

Pour ces études, on utilise 1 à 3 animaux/sexe/dose en tenant compte de la disponibilité de données historiques pour de nombreux paramètres étudiés et de leur variabilité. Le choix du nombre d’animaux dépend de la variabilité des paramètres étudiés. Il n’y a pas d’études statistiques utilisées dans ce cas. Le nombre d’animaux est classiquement défini pour répondre à l’objectif de ces études.

Raffinement

Dans les études de sécurité non clinique, il est rarement fait usage de médicaments qui risquent d’interférer avec le produit à étudier et on s’appuie sur les fiches de point-limite pour prise de décision rapide (arrêt de la dose, euthanasie de l’animal etc…). Cependant, ponctuellement, le vétérinaire peut intervenir et décider de la mise en place de soins spécifiques (adaptés à l’observation notée). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie suite à l’administration d’un traitement) et mettre en place des techniques de raffinement telles que l’habituation par renforcement positifs (training) Une grille de points limite est employée afin de limiter la souffrance inutile de l’animal en permettant de mettre des actions correctives.Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (enregistrement télémétrie ou signes cliniques nécessitant l’hébergement individuel) ou éthologiquement (incompatibilités), avec de l’enrichissement adapté aux besoins des primates.

Choix des espèces

Les études de sécurité non-clinique n’ayant pas pour but de d’étudier un modèle de pathologie ni un effet thérapeutique mais de prédire au mieux les effets indésirables secondaires liés aux candidats médicament chez l’Homme, des PNH sains peuvent être sélectionnés à la place d’une autre espèce non-rongeur parce qu’ils sont plus proche de l’humain en considérant la totalité des paramètres listés ci-dessous : - Pharmaco et toxicocinétique : exposition plasmatique au médicament, élimination, fraction libre du médicament … - Métabolisme : type et quantité relative de métabolites produits - Pharmacodynamie : homologie, présence, affinité et répartition de la cible pharmacologique - Physiologique : le PNH ne doit pas présenter de réactions physiologiques spécifiques non pertinentes pour évaluer la sécurité chez l’Homme (ex : pH gastrique). - Techniques expérimentales : formulation et excipients tolérés, voie d’administration possible - Expérience des médicaments compétiteurs de la même catégorie. Les animaux utilisés dans ce projet seront de jeunes adultes ou adultes, conformément aux requis réglementaires.

Les souris sont tuées quand le volume de leur tumeur atteint le maximum toléré, ou plus tôt en cas de nécrose ou d'ulcération de la tumeur, de poil hérissé, de dos voûté ou de déshydratation. 1 466 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur système immunitaire est d'abord affaibli par une irradiation à 2 grays ou neuf jours de gavage à la ciclosporine, avant la greffe de cellules tumorales humaines et des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie. Le porteur affirme que la croissance tumorale ne semble pas induire de douleur jusqu'à cette limite, tout en citant la nécrose et l'ulcération parmi les motifs d'arrêt.

Objectifs

Les lymphomes cutanés à cellules T (CTCL) touchent environ 1/100 000 adultes chaque année. On estime que l’incidence a triplé en 30 ans. Des données préliminaires ont démontré que deux traitements (anti-CCR8 et anti-PAR2) sont capables de recruter des cellules immunitaires ce qui permet d’induire la mort des cellules tumorales. Pour aller en phase I d’essai chez l’Homme, nous devons tester l’efficacité de ces traitements sur des souris. Pour cela nous devons avoir une souris qui possède un système immunitaire (nos deux traitements reposent sur une coopération avec le système immunitaire) et qui permet une prise des cellules tumorales dans l’organisme. Nous allons tester 3 modèles de souris différents pour réussir à avoir des souris xénogreffées avec un système immunitaire. Nous testerons les 3 possibilités et nous garderons in fine qu’une seule de ces 3 méthodes en fonction des résultats (prise de la greffe, nombre de cellules immunitaires). Nous testerons ensuite les deux traitements, ciblant CCR8 ou PAR2, sur le modèle le plus efficace. Le but de ce projet étant de prouver, in vivo, l’efficacité de ces nouveaux traitements contre les lymphomes cutanés à cellules T.

Bénéfices attendus

Le projet vise à proposer des immunothérapies innovantes pour les lymphomes cutanés à cellules T). Les lymphomes sont des maladies rares avec un manque de traitements. Ce projet nous permettra de démontrer l’efficacité de ces deux traitements grâce aux cellules immunitaires présentes dans ces souris qui permettent de détruire les cellules tumorales liées aux anticorps que nous testons. Si les résultats sont concluants, et en association avec les résultats de toxicologie, ce projet pourra conduire à un essai de phase I d’essai chez l’Homme.

Procédures

Pour réussir à greffer des cellules tumorales dans des souris, nous allons devoir diminuer le système manière de façon transitoire, pour cela nous irradierons les souris. Pour visualiser l’effet des traitements sur les cellules tumorales, nous allons prélever de façon hebdomadaire 75uL de sang. Pour cela, les souris seront préalablement anesthésiées pour réduire leur douleur.

Impact sur les animaux

Dans notre protocole, soit nous irradions des souris, soit nous injectons de la cyclosporine par gavage pendant 9 jours avant la greffe de cellules tumorales humaines. Les souris seront irradiées une fois 24h ou 48h avant la greffe à 2 grays. Cette faible dose de radiation induit une perte de poids à 7-10 jours avant que les souris reprennent leurs poids initiaux. Selon la littérature, cette dose n’affecterait pas la durée de vie de la souris. Si le protocole d’irradiation ne fonctionne pas, nous allons traiter les souris oralement avec de la cyclosporine. Le gavage se fera sur souris anesthésiées par isoflurane. Il est attendu une perte de poids au jour 5 avant un retour aux poids initiaux à jour 12. Ensuite, nous injecterons des cellules tumorales humaines aux souris en intrapéritonéales. Au bout de 2 semaines nous prévoyons la formation de tumeur. Nous injecterons en intrapéritonéale des cellules immunitaires ce qui provoquera une douleur modérée. Dans toutes les contritions, nous injecterons les deux traitements en intrapéritonéale ce qui provoquera une douleur modérée. Nous arrêterons le protocole quand le volume de leur tumeur sera trop important ou que l’animal présente des signes de mal-être (poil hérissé, dos vouté, déshydratation) ou en cas de nécrose ou d’ulcérisation des tumeurs. Nous prélèverons du sang toutes les semaines pour doser les cellules tumorales circulantes dans le sang. Les souris seront alors anesthésiées et 75uL de sang sera prélevé de façon hebdomadaire.

Devenir

Pour l'ensemble de ces procédures, les souris seront mises à mort quand le volume tumoral attendra le maximum tolérable. À noter, ces modèles de lymphome sont largement documentés et la croissance tumorale ne semble pas induire de douleur pour l'animal jusqu'à cette limite. En cas de non-développement ou de régression de la tumeur, les souris seront conservées pour une durée de 6 semaines après traitement (durée la plus couramment publiée) puis mis à mort pour analyse.

Remplacement

Nous utilisons différentes lignées humaines de lymphomes ainsi que des cellules de patients. Ces cellules nous ont permis d’obtenir nos données préliminaires, et de confirmer l’activité anti-tumorale des anticorps en question. Nous devons donc maintenant tester les deux traitements dans des modèles in vivo. Pour cela nous souhaitons utiliser deux modèles de souris immunodéficientes pour confirmer l’intérêt thérapeutiques des anticorps et leur capacité à induire une forte régression tumorale. Nous pourrons également obtenir par ces modèles, des données pharmacocinétiques (demi-vie de l’anticorps, concentration dans le sang) et des données d’histopathologie. Cela nous permettra ainsi d’aller en essai de phase I chez l’Homme.

Réduction

Pour limiter le nombre de souris utilisées, des tests préliminaires in vitro ont été fait pour démontrer l’effet des deux traitements sur des lignées cellulaires. Ces tests nous ont permis d'évaluer l'efficacité et la toxicité des traitements et de sélectionner les combinaisons les plus prometteuses, réduisant ainsi le nombre de tests nécessaires sur les souris. Pour déterminer le nombre de souris nécessaires, nous avons utilisé des calculs statistiques ce qui nous a permis de déterminer le nombre de souris par groupe par traitement. Ainsi, nous avons besoin d'au moins 11 souris par groupe pour garantir la validité des tests.

Raffinement

Afin de limiter la douleur des animaux, des points limites précis ont été définis (volume maximum de la tumeur, perte de poids...). Aussi, lors des phases d'implantation de cellules tumorales dans des souris, les souris seront anesthésiées sous isoflurane. Nous mettons en place des conditions d'hébergement optimales et des stratégies de raffinement rigoureuses pour améliorer le bien-être des souris. Les cages sont spacieuses et équipées de litières absorbantes et non toxiques, renouvelées régulièrement pour assurer un environnement propre. Nous fournissons également des enrichissements environnementaux, tels que des tunnels, des roues d'exercice, et des matériaux de nidification, pour favoriser les comportements naturels et réduire le stress. Les souris sont maintenues à une température et une humidité contrôlée, avec un cycle lumière/obscurité approprié pour respecter leur rythme circadien. De plus, nous effectuons des évaluations régulières de la santé et du comportement des animaux, et ajustons les conditions d'hébergement en fonction des besoins spécifiques identifiés. Ces pratiques de raffinement sont essentielles pour garantir le bien-être des souris tout en obtenant des résultats expérimentaux fiables et reproductibles.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris pour vérifier l’efficacité des traitements et obtenir des données pharmacocinétiques. Cela permet de voir si les traitements vont diminuer la taille des cellules tumorales. Toutes les études préliminaires ont été mises en place sur des cellules de patients ou des lignées cellulaires. Les souris sont génétiquement modifiées pour être partiellement ou totalement immunodéficientes ce qui permet de greffer de tumeurs humaines, y compris les lymphomes T humains et d'éviter les réactions de rejet de greffes. Nous allons sélectionner des jeunes adultes de 6 à 10 semaines. Ces souris ont fini leur croissance et refléteront au mieux la physiopathologie du lymphome cutané à cellules T dont les tumeurs surviennent principalement chez l'adulte. La standardisation de l'âge permettra une meilleure reproductibilité expérimentale.

Chaque souris peut recevoir jusqu'à quatre-vingt-dix injections dans l'abdomen et quatre-vingt-dix gavages au cours d'une même procédure, plus dix prélèvements sanguins, un prélèvement dans le fémur et une greffe de cellules leucémiques par voie rétro-orbitale. 668 souris sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur range ces effets parmi une gêne oculaire, un boitement transitoire et une gêne transitoire. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leurs organes, la mort étant confirmée par l'absence de réflexes et de signes cardiaques.

Objectifs

La Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) est un cancer du sang dû à l’apparition d’une anomalie dans la cellule souche sanguine, cellule à l’origine des différentes cellules du sang. Cette anomalie entraîne une sur-production de globules blancs (un des premiers symptômes de la LMC). Dans les années 2000, des médicaments ont été développés et permettent d’empêcher la sur-production de globules blancs. Ces traitements ont été révolutionnaires mais ils provoquent chez certains patients des effets secondaires tels que des nausées, des douleurs musculaires, des œdèmes ou des diarrhées. Des essais cliniques visant à arrêter le traitement après plusieurs années ont permis de montrer que 40% des patients restent sans traitement et sont donc guéris. Cependant, 60% des patients rechutent démontrant la persistance de cellules souches sanguines leucémiques dans leur moelle osseuse qui n’ont pas été éliminées par le traitement. Ce médicament seul ne suffit donc pas. Notre but est d’identifier et les cellules souches leucémiques qui persistent lorsque l’on traitera nos souris avec les médicaments utilisés chez l’homme. Puis, nous essaierons de trouver de nouveaux médicaments qui pourraient éliminer ces cellules souches leucémiques persistantes.

Bénéfices attendus

Modéliser la leucémie myéloïde chronique est un enjeu majeur pour « guérir » la LMC dans les années à venir. En effet, ce modèle va permettre d'identifier et caractériser les cellules souches leucémiques persistantes à l’origine des rechutes observées dans les études d’arrêt de traitement et trouver d’autres médicaments.

Procédures

Prélèvements sanguins sur animaux vigiles – 5 à 10 fois/procédure – durée 1min Prélèvements intrafémoraux sur animaux anesthésiés – 1 fois par procédure – durée

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un stress dû à la contention/préhension des animaux, 2/ une gêne oculaire suite à l’injection en retro-orbitale pour les greffes, 3/ un perte de poids transitoire lors des traitements, 4/ un boitement transitoire lors des prélèvements intrafémoraux 5/ une gêne transitoire lors des injections intrapéritonéales. 6/ Les animaux peuvent subir une perte ou une prise de poids transitoire en fonction des traitements. 7/ potentiels effets secondaires des molécules injectées.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par du personnel expérimenté afin de prélever les organes cibles et ainsi réaliser les analyses phénotypiques, moléculaires et histologiques nécessaires à la conclusion de l'étude. La mort des animaux sera confirmée par l’absence de réflexes, de signes respiratoires et cardiaques.

Remplacement

Les leucémies sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal. Cependant, des analyses ex vivo réalisées à partir de moelle osseuse provenant de nos souris leucémiques nous ont permis de valider et déterminer l’efficacité des différents traitements seuls ou en combinaison et de ne choisir que les plus efficaces pour les traitements in vivo.

Réduction

Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d’animaux. Les lignées transgéniques utilisées comportent 1. des systèmes inductibles qui vont permettre à la fois d’induire l’expression des transgènes dans un tissu spécifique mais également à un temps donné et 2. des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules leucémiques et ainsi permettre de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour chaque expérience en utilisant un test de puissance et des tests statistiques seront utilisés post expérimentation pour évaluer la significativité de nos résultats.

Raffinement

Les lignées transgéniques utilisées comportent des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules leucémiques et ainsi permettre de détecter l’apparition de cellules leucémiques très précocement ce qui permettra d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide. Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, Les animaux recevront des analgésiques et des anesthésiques en pré et/ou post opératoire Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. C’est la raison pour laquelle l’ensemble des techniques de la transgénèse chez les mammifères a débuté chez la souris. De surcroit, toute la collection des systèmes inductibles nécessaires à nos études n’existe que chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines lorsqu’elles ont atteint leur maturité sexuelle.

Dès l'âge de 4 ou 6 semaines et jusqu'à 60 semaines, des souris, des rats et des hamsters dorés reçoivent une alimentation hypercalorique, avec ou sans boissons enrichies en fructose, en éthanol ou en composé pro-inflammatoire, pour provoquer obésité, diabète ou stéatose du foie. 4 750 rongeurs, soit 2 750 souris, 500 rats et 1 500 hamsters dorés, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés testés une à deux fois par jour, par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen ou dans une veine sous anesthésie, subissent trois prises de sang et passent à trois reprises 40 heures seuls en cage sans enrichissement, et 24 heures sur grille en cage métabolique en fin de projet. Le porteur retient le hamster parce qu'il "consomme spontanément" l'éthanol, et invoque la hausse de la consommation d'alcool depuis la pandémie de COVID-19. En fin de projet, tous sont tués pour prélever leurs tissus et leur sang.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, le rat et le hamster, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Au 125e jour d'une gestation de 145 jours, des brebis sont opérées pendant environ quatre heures sous anesthésie générale, et leur fœtus est équipé de cathéters vasculaires. 212 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et dès le quatrième jour après la chirurgie, une même brebis est utilisée pour plusieurs expérimentations, avec huit prises de sang sur le fœtus par journée de manipulation. Le projet compare l'effet d'une césarienne, d'une anesthésie générale ou d'une péridurale sur le cœur et le sang du fœtus, en vue d'adapter l'analgésie des femmes qui accouchent. Le porteur écrit qu'à la fin des procédures les moutons sont tués, alors que 20 sont déclarés adoptés. Il ne décrit comme effet indésirable que la douleur modérée de la brebis pendant et après la chirurgie, sans rien dire de ce que subit le fœtus.

Objectifs

La majorité des patientes en salle de naissance bénéficie d’une analgésie devant les douleurs entraînées par les contractions utérines lors du travail. Leur mise en place peut provoquer une instabilité de la fréquence cardiaque et de la tension artérielle maternelle transitoire lors de l’injection des médicaments, et entraîner des anomalies du rythme cardiaque fœtal. L’impact d'une césarienne ou d'une anesthésie générale ou d'une péridurale maternelle sur l’hémodynamique fœtale et le retentissement sur le système nerveux autonome reste peu connu, et sa compréhension est nécessaire afin de diminuer la morbi-mortalité fœtale.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à observer une modification des paramètres fœtaux sanguins et cardiaques plus importante en cas d’analgésie type césarienne par rapport aux autres analgésies. L’impact serait en pratique clinique d’adapter l’analgésie maternelle pour diminuer le risque d’hypoxie foetale et ses complications (lésions cérébrales anoxo-ischémiques). Cette étude permettra également de déterminer l’effet sur le coeur et la tension artérielle des sédations foetales lors d’une réanimation à cordon intact afin d’optimiser la prise en charge des nouveaux-nés vulnérables.

Procédures

Chaque brebis sera soumise à une chirurgie sous anesthésie générale d'une durée d'environ 4 heures, une seconde anesthésie cette fois loco régionale sera réalisée sans objectif d' incision mais uniquement pour les prélèvements sanguins chez le foetus, ces prélèvements serviront pour la vérification des gaz du sang (valeur de pH, quantité d’oxygène et de dioxyde de carbone dans le sang etc), et l’évaluation du retentissement de l’anesthésie effectué. Les quantités prélevées seront de 0,3 ml à raison de 8 prélèvements par journée de manipulation. Chez la brebis ces prélèvements serviront à évaluer le retentissement son état sanguin en comparaison à l'état sanguin de son foetus.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu serait la douleur modérée pendant et suite à la chirurgie de la brebis gestante, dont la prise en charge de la douleur est optimisée pendant les manipulations et par un protocole anti douleur après les manipulations durant 3 jours par Buprénorphine.

Devenir

Après une évaluation de l’état général des brebis à l’issue de la chirurgie par l’expérimentateur (sensibilisé au bien-être animal) et les zootechniciens, les animaux ne seront pas euthanasiés en vue de l’expérimentation chronique. Ils seront hébergés dans une animalerie conventionnelle et agréée. après manipulation et si nécessaire, une euthanasie peut être effectué par une injection médicamenteuse des brebis et des agneaux (en cas de signe de souffrance ou d’infection) A la fin de ces procédures expérimentales, les animaux sont euthanasiés.

Remplacement

L’étude du fœtus humain n’est possible qu’en cas d’expérimentation non invasive et après validation des hypothèses au préalable chez l’animal. En effet d’un point de vue éthique, il n’est pas justifié de réaliser une expérimentation qui comporte un risque de perte fœtale (la réalisation de prélèvements sanguins ou la mesure de façon invasive de la pression artérielle moyenne sur le fœtus par abord cordonal est techniquement possible mais avec un risque de perte fœtale de 3 à 10%). Aucun modèle non animal ne pourrait permettre de réaliser ce projet.

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales sont incluses dans ce projet. Les fœtus d’agneau seront leur propre témoin ce qui limitera le nombre d’animaux nécessaires pour le protocole. L’étude consistera à comparer l’état de base des paramètres de fréquence cardiaque et pression artérielle des foetus, de leur signal cérébral et des paramètres sanguins à la réponse obtenue lors d’une analgésie et sédation maternelle et fœtale. La réponse des fœtus d’agneau étant habituellement très reproductible d’un animal à l’autre, un effectif faible (environ 8 à 12 animaux par groupe expérimental) est suffisant.

Raffinement

Chaque brebis arrive 10 jours au moins avant la date de la chirurgie afin de s'acclimater à son nouvel environnement. Les brebis sont livrées au minimum par 2 afin de réduire le stress du transport. Les brebis sont hébergées à plusieurs en permanence dans les box et aucune brebis ne sera seule hébergée afin de réduire le stress lié à la solitude. La manipulation sera effectuée sous anesthésie générale avec un protocole spécifique d'anesthésie, d'anti douleur et d'antibiotique préventif. Les expérimentations seront débutées 4 jours après la chirurgie et une même brebis sera utilisée pour plusieurs expérimentations afin d’optimiser au maximum l’utilisation de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle animal doit avoir des caractéristiques morphologiques et physiologiques proches du modèle humain. C’est le cas de la brebis, qui est un mammifère avec une gestation de singleton ou de jumeaux, dépendante du placenta et de la circulation foeto-placentaire. Le poids et la circulation du fœtus d’agneau sont proches de ceux du fœtus humain. Sa taille est suffisante pour permettre la pose de cathéters vasculaire, en limitant le risque de perte fœtale liée à la chirurgie. Des études sur plusieurs jours sont possibles chez le fœtus d’agneau instrumenté ce qui permet de limiter le nombre d’animaux par projet. Ce modèle est reconnu par la communauté scientifique comme le modèle animal le plus proche pour étudier la physiologie fœtale, ce qui justifie la pertinence de notre choix. Notre protocole de recherche est sur le foetus. Il est donc nécessaire d’utiliser des brebis gestantes. Notre expéri-mentation aura lieu lors du dernier tiers de la gestation (intervention à 125 jours pour un terme de 145 jours). Cet âge gestationnel est nécessaire pour que le fœtus soit suffisamment gros pour la chirurgie, pour la pose de cathé-ters vasculaires (2500 à 3000 g) et pour limiter les risques de perte fœtale per opératoire.

Toutes tuées à l'issue pour que leur cerveau soit analysé, 400 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cent d'entre elles reçoivent deux chirurgies cérébrales successives, lésionnelle puis implantation de sondes, de deux à deux heures trente chacune, espacées de dix jours. Suivent trente jours d'hébergement individuel, la coupe des vibrisses et une restriction alimentaire d'une vingtaine de jours qui les ramène à 85 % de leur poids initial, condition posée par le porteur pour qu'elles exécutent la tâche comportementale. Il affirme que ces mécanismes ne peuvent s'étudier que chez des animaux vigiles et qu'aucun modèle in vitro ne peut être utilisé ici.

Objectifs

La prise de décision dirigée par la perception est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette intégration des fonctions sensoriels et de la motricité fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à une restriction alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). La finalité des tests comportement est d’étudier la prise de décision lorsqu’elle est dirigée pas la perception. Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes pendant 30 jours.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie.● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour qu’elles atteignent 85% de leur poids initial, soit une réduction maximal de 15%. •La coupe des vibrisses.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Les animaux sont hébergés et manipulés dans le cycle jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Pour respecter leur rythme de vie et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit hébérgés avec de la lumière. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle jour/nuit inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase nocturne, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent effectivement dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. Des points limites spécifiques suffisamment précoces seront définis.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.