Procédures modérées

Greffées d'une tumeur dans le cerveau, gavées quinze fois en trois semaines, irradiées jusqu'à six fois et passées jusqu'à cinquante-deux fois sous imagerie en un an, 223 souris immunodéficientes subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une ataxie, une perte d'appétit et de poids, de la prostration et des pertes d'équilibre à mesure que la tumeur grossit, et, plus rarement, une exorbitation des yeux ou une atteinte de l'oreille interne liées à la pression dans le crâne. Toutes seront tuées pour l'analyse de leur cerveau, dans un test d'efficacité d'une molécule sur un sous-type de gliome de la ligne médiane. Les actes se répartissent entre "certains animaux" sans que le nombre concerné par chacun soit jamais donné, et les effectifs par lot sont justifiés par la seule expérience antérieure de l'équipe.

Objectifs

Les gliomes diffus de la ligne médiane ou DMG sont un sous-groupe de gliome ayant une localisation spécifique (ligne médiane du cerveau), sont très infltrants et actuellement incurables. Ils sont divisés en sous-types présentent des altérations spécifiques qui pourraient représenter des vulnérabilités possibles pour identifier de nouveaux traitements. Récemment, nous avons accumulé des résultats démontrant qu'un sous type de gliomes portant 2 mutations spécifiques ont un meilleur pronostic. En nous appuyant sur ces résultats, nous souhaitons approfondir notre caractérisation de ces tumeurs pour mieux comprendre leur développement, leur évolution particulière et identifier d'éventuelles vulnérabilités ainsi que le mécanisme par lequel ces mutations améliore le pronostic des patients. Pour cela nous allons : (i) Comparer l’évolution des cellules de plusieurs modèles greffés chez la souris en inhibant ou non les effets liés à la mutation spécifique de ces gliomes. Nous chercherons de plus à savoir si cette inhibition à un effet sur la vitesse de croissance (ii) Tester l’efficacité d’une molécule activant la voie mutée dans ces gliomes seule ou en combinaison avec de l’irradiation (qui est le traitement classique actuel de ces tumeurs) dans les modèles de gliome dans lesquelles elle ne l'est pas à l'oigine pour savoir si l’on est capable de reproduire l’amélioration pronostic retrouvée dans ces tumeurs.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension du développement et comportement des gliomes diffus de la ligne médiane et une possible amélioration des traitements pour ces types spécifiques de gliome.

Procédures

Lors des expériences préliminaires, certains animaux subiront un prélèvement de sang. Ce prélèvement unique prend environ une minute sur animal anesthésié (anesthésie générale). Certains animaux subiront une greffe de cellules tumorales dans le cerveau. La procédure dure entre 5 et 10 minutes par animal sur animal anesthésié (anesthésie générale avec analgésie adaptée). Les animaux qui seront traités par gavage le seront 15 fois (5 jours par semaines pendant 3 semaines). Gaver une souris dure quelques secondes sur animal vigile. Des animaux qui seront irradiés le seront maximum 6 fois à faible dose, étalé sur 2 semaines. Cela prend environ 2 minutes par irradiation sur animal anesthésié. Certains animaux auront des séances d'imagerie sous anesthésie générale, durée maximum 10 minutes, nombre maximum : 52 (séances hebdomadaires pendant un an au maximum).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées à la greffe d'une tumeur dans le cerveau. La greffe, sous anesthésie générale occasionnera une petite plaie sur le dessus du crâne, qui entraînera une gêne légère et temporaire. Par la suite, on pourra éventuellement observer des symptômes neurologiques qui sont fréquemment observés en présence d’un volume tumoral conséquent (ataxie), perte d'appétit et donc perte de poids, prostration des animaux, perte d’équilibre. L’augmentation de la pression intracrânienne peut exceptionnellement entraîner des symptômes tels que l'exorbitation des yeux, l'atteinte de l’oreille interne qui entraineraient l'arrêt immédiat de la procédure. L'irradiation et l'imagerie n'entraînent qu'un inconfort temporaire et léger dû à la préhension avant anesthésie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour analyses post-mortem sur les cerveaux.

Remplacement

Une singularité des gliomes pédiatriques de la ligne médiane (composée du thalamus, du pont et de la moelle épinière), résulte dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures de la ligne médiane dans un premier temps, puis plus largement de tout le cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur environnement qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite. De plus, la barrière hématoencéphalique, qui isole le cerveau du reste de l’organisme, est une limitation très importante dans le traitement de cette maladie (barrière non rompue) et il est nécessaire de développer des modèles de greffes afin d’évaluer une nouvelle médication avant les phases cliniques. Les molécules utilisées ont été testées sur des modèles de cultures cellulaires afin de valider leur efficacité. Nous ne pouvons pas utiliser de modèles de substitution comme les organoïdes car ils ne représentent pas la réalité de la barrière hémato encéphalique et les difficultés de traitement qui y sont liés.

Réduction

Les animaux sont, tout au long des manipulations suivis par bioluminescence, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés (suivi longitudinaux, augmentation de la puissance statistique). Dans le projet nous utiliserons des Go/NoGo. En effet si aucun effet anti-tumoral n’est démontré sur la première lignée ou qu’aucun passage de la barrière hémato encéphalique des molécules ne peut être démontré nous ne poursuivrons pas les manipulations selon ce protocole. De plus les expériences d’escalade de doses permettent de réduire au maximum le nombre d’animaux en écartant les doses potentiellement inefficaces et toxiques. Les nombres d'animaux par lot ont été basés sur l'expérience antérieure que nous avons de ces modèles tumoraux sur ces souris. Ils minimalisés pour permettre des analyses statistiques pertinentes des différents paramètres étudiés au décours des procédures.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la chirurgie, les animaux recevront une injection d’analgésique avant la chirurgie, puis une autre injection par la suite si des signes de souffrance sont détectés. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale . La température de l’animal est maintenue grâce à une plaque chauffante durant la chirurgie et le réveil. Une injection de sérum physiologique à la température de l’animal est réalisée avant la chirurgie pour maintenir l’hydratation de l’animal. Un gel oculaire est également utilisé pour éviter la sécheresse oculaire et un désinfectant est appliqué au site d’incision pour éviter tout risque d’infection. Suite à la chirurgie, les animaux sont surveillés le temps de leur réveil complet (quelques minutes) et sont par la suite replacés en hébergement en groupe où ils reçoivent nourriture et boisson ad libitum. Les examens cliniques sont quotidiens. Les animaux sont hébergés en cage de 5 avec nourriture et eau ad libitum ainsi que deux enrichissements comme des maisonnettes ou tunnels en carton, des bâtons de bois à ronger ainsi que du papier pour nidification. Des pooints limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'espèce souris, et en particulier la souris immnodéficiente est un très bon modèle de référence pour l'étude des gliomes humains dans un organisme entier. Nous utilisons des souris adultes car le développement des tumeurs chez la souris étant de plusieurs mois, il n'est pas pertinent de prendre des souris très jeunes qui supporterait mal la chirurgie.

750 souris et 1 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans le canal biliaire, parfois complétée d'un cathéter dans le duodénum et d'un autre dans la veine fémorale, jusqu'à deux heures d'opération, puis vingt-quatre heures d'isolement en cage à métabolisme avec privation d'eau ou de nourriture. Le porteur indique que certains animaux sont tués parce que l'isolement de vingt-quatre heures rend difficile leur retour dans un groupe social. Il présente comme bénéfice pour les rats et les souris eux-mêmes une "amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée", et l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'humain.

Objectifs

L'évaluation de l'élimination et de la toxicité sont des étapes obligatoires au cours du développement d'un nouveau candidat médicament. Chaque étude de ce projet a pour but d’évaluer les différentes voies d'élimination (hépatique, rénale, gastro-intestinale, sanguine) d'un candidat médicament et sa toxicité sur les principales voies métaboliques de l'organisme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (rat et souris) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les souris de ce projet pourront subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour l’implantation d’un cathéter dans le canal biliaire (30 min à 1h) . Cette chirurgie pourra comprendre l’implantation d’un ou deux cathéters supplémentaires un dans le duodénum et/ou un dans la veine fémorale (1h30-2h). Les rats de ce projet pourront également subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte de bile et/ou d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats avec les 2 ou 3 cathéters pourront être mis à 2 reprises en cage à métabolisme séparées d’environ 1 semaine. Les animaux de ce projet pourront subir une chirurgie pour l'implantation d'une minipompe servant à la délivrance en sous cutané, intraveineux ou intrapéritonéal d'une substance (20 à 45 min), suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). La mesure de la diurèse sur 24h pourra être effectuée au maximum 1 fois/semaine sur un maximum de 3 semaines après contrôle de l’état de santé de l’animal (poids et hydratation). La mesure de la diurèse sur 16h pourra être répétée au maximum 2 fois/semaine sur un maximum de 3 semaines après contrôle de l’état de santé de l’animal (poids et hydratation).

Impact sur les animaux

Les souris de ce projet pourront subir une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h) pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la mise à jeun. Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à l'anesthésie gazeuse, un stress postopératoire (une légère douleur/inconfort est possible malgré les analgésiques), un stress lié à la contrainte du bouton dermique lié au cathéter pour le recueil de la bile et/ou du duodénum et/ou de la veine fémorale, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la privation d'eau et/ou de nourriture.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure du fait soit des prélèvements nécessaires à l'étude soit de leur isolement pendant 24h et de la difficulté à les remettre en groupes sociaux ensuite qui sera vérifiée au cours de la mise au point du modèle de rat avec les cathéters bilaires, duodénal (et/ou fémoral ou carotide) maintenu en vie 8-10 jours.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme hépatique, intestinal et/ou rénal. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat ou la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 4 à 8 / par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les souris et les rats font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale et les études de médecine comparative en raison de leur similarité anatomique, physiologique et génétique avec l'homme (les rats, les souris et les humains partagent environ 95% de gènes). Les rongeurs sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec un cycle de vie court et pour lesquels il existe une abondance de leurs ressources génétiques. Le rat et la souris sont donc les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer le métabolisme d'un produit et sa toxicité sur les voies d'élimination de ce produit. Animaux adultes, à partir de 7 semaines. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Une injection dans l'abdomen chaque jour pendant deux, cinq ou quatorze jours, puis une anesthésie gazeuse sans réveil : 990 souris transgéniques de cinq semaines vont être utilisées dans des procédures déclarées de niveau modéré. Elles seront toutes tuées pour prélèvement d'organes destinés à des analyses de biologie moléculaire sur le syndrome de détresse respiratoire aiguë. Le porteur ne décrit pourtant qu'une douleur légère de courte durée au point d'injection et un stress bref lié à la contention, et il annonce sept animaux par groupe sans jamais rapprocher ce chiffre du total de 990. Il conclut qu'aucune méthode in vitro ne peut remplacer l'animal parce que le métabolisme et la réponse immunitaire forment des "systèmes intégrés".

Objectifs

Le syndrome de détresse respiratoire aigüe (SDRA) est une forme gravissime d'insuffisance respiratoire avec une mortalité élevée (30-40%) sans traitement curatif disponible. Les patients atteints de SDRA présentent une altération des réponses immunitaires qui participent à la gravité de ce syndrome et donc au taux de mortalité. Nous avons pu mettre en évidence chez ces patients que l’altération de leur réponse immunitaire pourrait être liée à des anomalies métaboliques. Nos objectifs sont donc de préciser le rôle du métabolisme dans l’altération des réponses immunitaires afin d’identifier des cibles thérapeutiques pertinentes visant à corriger ces anomalies. Ce syndrome complexe et sévère fait intervenir plusieurs types cellulaires et seule l'expérimentation animale nous permettra de retrouver l'ensemble des acteurs au sein d'un même modèle.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels le métabolisme pourrait influencer la dysimmunité dans le SDRA pourrait aider à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou permettre de développer des outils pour la prise en charge et le suivi de l'évolution clinique des patients.

Procédures

Interventions: - 1 injection intra-péritonéale/jour, sous anesthésie locale, pendant 2, 5 ou 14 jours en fonction de la molécule injectée (donc

Impact sur les animaux

Les injections induisent une douleur légère de courte durée limitée par l'application d'un anesthésique local. La contention nécessaire pour effectuer l'injection induit un stress de courte durée. L'induction de l'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée.

Devenir

Euthanasies pour prélèvement d'organes à l'issue de la procédure pour des études de biologie moléculaire.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux dans l’étude du syndrome de détresse respiratoire aigüe est nécessaire pour reproduire au mieux ce syndrome. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive qui permette un remplacement in vitro car le métabolisme et la réponse inflammatoire et immunitaire représentent des systèmes intégrés qui ne peuvent être étudiés qu’in vivo. En effet, l’utilisation d’animaux permettra d’étudier de manière simultanée les interactions de plusieurs organes et types cellulaires : d’un côté le poumon, en particulier les cellules endothéliales pulmonaires, le parenchyme pulmonaire, les cellules immunes résidentes au niveau du poumon; de l’autre côté, les facteurs circulants, les médiateurs inflammatoires, les adipokines, les hormones et les cellules immunes circulantes ; enfin, le tissu adipeux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un test statistique de puissance qui permet de garantir l’observation de résultats exploitables. Grâce à ce test, nous obtenons n = 7 animaux par groupe.

Raffinement

Les souris bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, raffinant ainsi leurs conditions de vie. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Les injections seront précédées d'une anesthésie locale afin de diminuer au maximum la douleur pouvant être engendrée. Pour la réalisation de la procédure, des points limites précoces ont été établis au moyen d'un score et seront appliqués si nécessaire, comme défini dans la description de la procédure. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de veiller à leur bien-être.

Choix des espèces

En ce qui concerne le modèle, nous avons choisi avec attention le modèle le plus pertinent pour notre projet parmi les 10 modèles qui miment le syndrome de détresse respiratoire aigu chez l’Homme. En ce qui concerne l’espèce, nous avons choisi la souris car nous prévoyons d’utiliser des animaux transgéniques. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des souris âgées de 5 semaines et pesant 20 grammes chacune seront utilisées.

Toutes tuées pour prélèvement d'organes et de tissus, 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales par injection, jusqu'à soixante injections de traitement, une par jour tant que la tumeur ne régresse pas, et deux séances d'irradiation sous anesthésie générale. Le porteur attend une baisse d'appétit, une réduction de l'activité, des signes de fatigue et des altérations du comportement social liés à la progression des tumeurs et aux effets secondaires. Les bénéfices annoncés, surmonter les limites des thérapies conventionnelles et réduire les effets secondaires chez les patients, restent au conditionnel, et le porteur affirme que suivre les cellules immunitaires dans la tumeur exige un "modèle animal vivant entier".

Objectifs

Nous allons étudier une nouvelle stratégie thérapeutique qui combine une radiothérapie à faible dose (LDRT), un traitement immunologique (inhibiteur de PD-L1) et des traitements qui favorisent ou bloquent un type spécifique de mort cellulaire appelé ferroptose. Le but principal de ce projet est de comprendre si cette combinaison peut être plus efficace pour traiter les tumeurs et déclencher des effets à distance, appelés effets abscopaux, provoqués par la radiothérapie. La LDRT, qui utilise de très faibles doses de rayons (entre 0,5 et 2 Gy par séance), aide à stimuler les défenses immunitaires du corps et à réduire l’inflammation, tout en limitant les effets secondaires sur les tissus sains. Des études récentes montrent que la ferroptose, une forme de mort cellulaire contrôlée qui dépend du fer, peut rendre les cellules tumorales plus sensibles à la radiothérapie et renforcer la réponse immunitaire du corps contre les tumeurs. En combinant cette approche avec un traitement immunologique, nous espérons améliorer les effets bénéfiques, augmenter la survie des souris et comprendre les mécanismes derrière ces résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer les avantages et les effets synergiques possibles de la combinaison de la radiothérapie, de l’immunothérapie et des agents modulant la mort cellulaire programmée (comme des inhibiteurs ou des inducteurs). Cette approche intégrative, appliquée dans un cadre préclinique de traitement multimodal, permettrait de surmonter les limites des thérapies conventionnelles et d’améliorer l’efficacité thérapeutique globale. En modulant les réponses immunitaires dans le microenvironnement tumoral et les mécanismes de mort cellulaire des tumeurs, cette stratégie pourrait augmenter significativement la réponse tumorale globale et offrir des bénéfices supplémentaires, notamment par l’optimisation des effets abscopaux. En outre, cette méthode à multiples facettes promet de générer des approches plus efficaces pour le traitement antitumoral, tout en réduisant les effets secondaires souvent associés aux thérapies actuelles.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de cellules tumorales (n=1, 25 secondes) et à des injections de traitements (tous les jours jusqu’á régression de la tumeur ou fin de la procédure , durée 25 secondes), sous anesthésie locale, au maximum 60 injections. Les animaux vont recevoir une anesthésie générale afin de les placer dans les dispositifs qui permettent la réalisation des irradiations localisées au niveau des tumeurs (n=2, durée 12 minutes en tout).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir un stress léger dû à leur manipulation fréquente par l’expérimentateur, notamment lors des interventions telles que les injections ou l’administration de traitements. Ils peuvent également ressentir de la douleur et un inconfort légers à modérés, provoqués par des injections pour l’implantation des tumeurs, des traitements de radiothérapie ou l’administration de médicaments par injection. Par ailleurs, en raison de la progression des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements comportementaux légers ou modérés comme une diminution de l’appétit, une réduction de l’activité physique, des signes de fatigue ou des altérations du comportement social.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer l'effet thérapeutique du ciblage de la ferroptose combinés à la radiothérapie et à des immunomofulateurs sur la réponse tumorale. Ceci exige donc un système immunitaire dynamique complet (composé de toutes les cellules immunitaires) en interaction direct avec le stroma tumoral. L’étude du recrutement et de la réponse des cellules immunitaires dans la tumeur ainsi que leurs interactions complexes nécessite le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être réalisé in vitro ni in silico.

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique a priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc réduire le nombre d’animaux. Le critère de jugement principal pour le calcul de puissance est la taille tumorale. La randomisation est réalisée de façon à avoir la même moyenne taille tumorale dans chaque groupe de traitement. Nos calculs de puissance statistique nous ont permis de minimiser le nombre d’animaux tout en obtenant des différences significatives.Ces calculs visent à optimiser le nombre d’animaux requis tout en garantissant la pertinence des résultats expérimentaux.

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux normes les plus élevées pour minimiser la douleur et le stress chez les animaux. Une anesthésie générale ou locale adéquate sera utilisée pendant les expériences pour soulager ou éliminer la douleur en particulier lors des injections . Les conditions d'hébérgement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaires. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limite précoces seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. De plus, pour des raisons de taille, de prix et de temps nous avons choisi cette espèce. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures.

200 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit une ovariectomie de trente minutes sous anesthésie générale, toutes reçoivent une injection de produit inflammatoire dans la face, puis passent chaque jour des tests censés mesurer leur douleur. Le porteur attend de l'injection une hypersensibilité douloureuse, et de l'ablation des ovaires une douleur post-opératoire, un risque d'infection, un risque d'hémorragie et des modifications de l'appétit et du comportement social. Les retombées annoncées se limitent à la recherche préclinique elle-même, au conditionnel, et les tests comportementaux quotidiens ne sont jamais nommés.

Objectifs

Ce projet comporte deux objectifs : 1) Évaluer l’influence du cycle hormonal dans le développement d’une hypersensiblité douloureuse lors d’une stimulation tactile normalement non-douloureuse 2) Évaluer l’influence du cycle hormonal dans l’inflammation faciale et la réactivité cellulaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre le dimorphisme sexuel dans l'inflammation et le développement de douleur chronique faciale. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique s'intéressant aux douleurs chroniques.

Procédures

Groupe 1: 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale + tests de mesure de la douleur en comportement (1 fois par jour) Groupe 2: 1 ovariectomie (30 min) sous anesthésie générale + 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale + tests de mesure de la douleur en comportement (1 fois par jour) Groupe 3: 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale tests de mesure de l’inflammation(1 fois par jour) + stimulation (10min) sous anesthésie générale Groupe 4: 1 ovariectomie (30 min) sous anesthésie générale + 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale + tests de mesure de l’inflammation(1 fois par jour) + stimulation (10min) sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Les opérations chirurgicales d'ovariectomie chez la rate peuvent entraîner plusieurs nuisances : - douleur et inconfort (modéré): Comme pour toute intervention chirurgicale, l'ovariectomie peut provoquer une douleur post-opératoire. Les animaux peuvent montrer des signes d'inconfort, tels que des vocalisations, une agitation ou une diminution de l'activité. -infection (modéré) : Il existe un risque d'infection au site chirurgical, ce qui peut entraîner des complications supplémentaires. Les signes d'infection incluent une rougeur, un gonflement, une chaleur ou un écoulement au niveau de l'incision. -hémorragie (modéré) : Des saignements peuvent survenir pendant ou après l'opération, ce qui peut nécessiter des interventions supplémentaires pour contrôler l'hémorragie. -changements hormonaux (modéré) : L'ovariectomie entraîne une diminution des hormones sexuelles, ce qui peut affecter le comportement et le métabolisme de l'animal. Cela peut se traduire par des changements d'appétit, de comportement social ou d'activité. Suite à l’injection du produit inflammatoire (sujet de l'étude), nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse (modéré).

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique. Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales. Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections, comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats sont préalablement anesthésiés. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.

480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune amputée de deux millimètres de l'extrémité de la queue au sevrage, à quatre semaines, pour lire son génotype. Une des deux lignées élevées développe spontanément une maladie rénale chronique, avec une dégradation de la fonction rénale à partir de dix semaines, une perte de poids, des poils hérissés et une posture anormale. Le projet ne produit aucun résultat par lui-même, il fournit des souris adultes à un second projet mené dans un autre établissement. Le porteur qualifie le maintien de ces deux lignées d'"indispensable" et annonce que les hétérozygotes non utilisés seront proposés à d'autres équipes ou transférés vers d'autres centres.

Objectifs

La maladie rénale chronique (MRC) conduit à la rétention de toxines urémiques qui s’accumulent dans le sang et les tissus au lieu d'être excrétées par les reins. Certaines de ces toxines agissent grâce à un récepteur et sont associées à la mortalité cardiovasculaire. Notre but est de comprendre le rôle de l'activation du récepteur aux toxines in vivo dans les maladies touchant les vaisseaux et nécessite la gestion et l’utilisation de modèles animaux. Nous utiliserons un modèle génétique de MRC qui développe spontanément la maladie et un autre modèle génétique pour l’étude du récepteur aux toxines. Ces 2 lignées de souris sont disponibles commercialement et nous avons pour objectifs dans ce projet d’élever ces deux lignées. Ce projet d'élevage et de maintien de souris génétiquement modifiées permettra de mettre en œuvre des modèles in vivo pour l'étude du rôle des toxines urémiques au cours de la maladie rénale chronique. Les souris de ce projet d’élevage seront utilisées dans un projet déjà expertisé et validé (projet n°2) pour un autre établissement utilisateur.

Bénéfices attendus

le maintien de ces deux lignées est indispensable car elles apporterons de nouvelles connaissances dans la compréhension du rôle des toxines urémiques et de leur récepteur dans les complications liées à la maladie rénale chronique conduisant potentiellement à de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Au moment du sevrage des souris, un seul prélèvement de tissu sera réalisé (2 mm) au niveau de l'extrémité de la queue pour le génotypage. Les souris seront attrapées en les saisissant près de la base de la queue avec une main et en saisissant la peau de la nuque avec la main opposée. Pour sécuriser et contrôler l’animal, la queue sera placée entre les doigts. Afin d'identifier les animaux, un prélèvement de tissu sera réalisé (2 mm) à l'extrémité de la queue à l'aide de ciseaux. Cette biopsie sera conservée dans un tube à -80°C pour le génotypage ultérieur des souris par PCR. Cette intervention durera quelques secondes afin de limiter le stress et la douler des animaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont liées à la biopsie pour le génotypage qui nécessite de couper l'extrémité de la queue (codectomie) au moment du sevrage à 4 semaines (douleur et stress), ainsi qu'à la détérioration de la fonction rénale à partir de 10 semaines dans le modèle génétique de maladie rénale chronique. Chez ces souris, nous nous attendons à observer une perte de poids qui est un des premiers signes de la maladie, et à une apparition plus précoce des points limites par rapport à l’apparence physique (poils hérissés, dos courbé ou posture anormale), aux signes cliniques (augmentation de la fréquence respiratoire par exemple) et aux comportements non provoqués (attitude prostrée par exemple).

Devenir

Tous les animaux seront en utilisation continue et seront gardés en vie dans ce projet qui concerne l'élevage et le maintien de lignées pour l'étude du rôle d'un récepteur aux toxines urémiques dans la maladie rénale chronique.

Remplacement

Les animaux de ce projet ne peuvent pas être remplacés car il n'y a pas de remplacemment possible sur le projet de prélèvement de tissu. De plus, Il n'existe pas de modèles in vitro suceptibles d'apporter le même niveau d'information pour létude de la maladie rénale chronique ainsi que des ses conséquences cardiovasulaires. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux génétiquement altérès à phénotype dommageable afin d'envisager des approches thérapeutiques transposables à l'homme.

Réduction

Dans ce projet, nous génotyperons tous les animaux. La production de tous les animaux, y compris ceux avec un phénotype dommageable (KO col4a3), sera adapté et réduit au minimum nécessaire sans compromettre la puissance statistique dans les procédures du projet n°2. Des accouplememts homozygotes seront mis en place afin de réduire le nombre d'animaux hétérozygotes produits. Les animaux hétérozygotes non utilisés seront mis à disposition d'autres équipes et pourront également etre transférés dans d'autres centres de recherche s'intéressant à la maladie rénale chronique (modèle Col4a3) et/ou à AhR.

Raffinement

La procédure °1 qui correspond à un prélèvement invasif au niveau de la queue est un méthode précise et standardisée qui dure quelques secondes ce qui limite les effets indésirables liées au stress et à la douleur. En ce qui concerne la procédure n°2, les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux ayant une maladie rénale chronique (modèle MRC). Ces animaux resteront sous surveillance journalière pendant la durée entière du projet. La douleur ou la détresse de l’animal constitueront des points limites. Par exemple, une perte importante de poids constituera un point limite et nécessitera l’euthanasie de l'animal. La douleur ou la détresse de l'animal sera évaluée sur différents paramètres : poids, apparence physique externe, signes cliniques, changement dans les comportements non provoqués, réponses comportementales aux stimuli externes. Des scores seront établis en fonction de ces observations et grâce à une grille d’évaluation de la douleur (cf annexe), un score sera déterminé. Selon le score, nous agirons en conséquence en fournissant à l’animal une analgésie (cf annexe). L’euthanasie de l’animal sera envisagée (scores 10 à 14) voire immédiate (score supérieur à 14). Pour les souris MRC, nous serons particulièrement attentifs à la perte de poids qui est un symptôme lié à la détérioration de la fonction rénale ainsi qu’à leur apparence physique et les mesures citées précédemment seront mises en œuvre en fonction du score d’évaluation de la douleur.

Choix des espèces

Les modèles animaux de maladie rénale chronique sont essentiels pour l’étude des évènements pathophysiologiques permettant ainsi des études translationnelles dont le but est d’améliorer la prise en charge des patients présentant une maladie rénale chronique. L'espèce animale utilisée sera la souris car c’est le modèle le mieux maitrisé pour la modification d'un gène dans le but de l'étudier dans un contexte physiopathologique. De plus les lignées de souris utilisées dans ce projet sont disponibles commercialement. Les prélèvements de tissu en vue du génotypage auront lieu entre 3 et 4 semaines de vie, au moment du sevrage. Les animaux obtenus dans ce projet seront élevés jusqu'à 8-10 semaines avant d'être utilisés dans les procédures du projet n°2 pour lequel des souris adultes sont nécessaires. En effet, la maladie rénale chronique est une pathologie qui touche principalement les sujets humains adultes et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle murin au même stade.

Une biopsie de la queue est pratiquée sur chaque raton âgé de huit à dix jours, sous anesthésie locale, pour lire son génotype. 1 250 rats issus de ce programme de reproduction vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 250 étant gardés comme reproducteurs et les autres tués dès les résultats connus s'ils n'entrent dans aucun projet. Maintenir cette lignée porteuse de la mutation de la maladie de Stargardt, qu'aucun fournisseur ne propose, permet de la mettre à disposition d'équipes académiques et privées. Le porteur qualifie la biopsie d'indolore à cet âge, tout en décrivant des vocalisations possibles, un défaut de reptation, un isolement du reste de la portée et un retard à la tétée dans les jours qui suivent.

Objectifs

La maladie de Stargardt (STGD1) est une maladie des yeux qui touche environ 1 personne sur 8 000 à 10 000, affectant surtout la macula, la partie de l'œil responsable de la vision de jour. La perte des cellules visuelles appelées cônes dans cette région peut mener à la cécité. Les photopigments, formés par la vitamine A et une protéine appelée opsine, rendent les photorécepteurs sensibles à la lumière. Cependant, le processus de détection de la lumière crée des sous-produits toxiques. La protéine ABCA4 aide à transporter ces toxines pour qu'elles soient éliminées. Des mutations dans le gène ABCA4 empêchent ce transport, causant l'accumulation de toxines et la mort des photorécepteurs et d'autres cellules oculaires. Actuellement, il n'existe pas de traitement pour cette maladie. Les modèles animaux actuels pour la STGD1 sont principalement des souris modifiées génétiquement, mais elles ne montrent que peu de symptômes de la maladie. Pour cette raison, nous avons décidé de créer un rat transgénique portant la mutation la plus fréquente dans la maladie de Stargardt. Utiliser des rats présente plusieurs avantages par rapport aux souris. Lors des injections dans l'œil des souris, il est difficile de contrôler la quantité de liquide injecté sans qu'il s’échappe vers d'autres parties de l'œil. Les rats ont des membranes oculaires plus robustes, ce qui permet un meilleur contrôle des injections et réduit le risque de fuite. De plus, lors de longues anesthésies, les souris peuvent développer une opacité du cristallin (semblable à une cataracte) qui complique les examens oculaires. Ce problème est beaucoup moins fréquent chez les rats. Le modèle de rat que nous avons créé reflète bien la maladie humaine sans affecter significativement le rat lui-même. Les changements observés chez ces rats sont similaires à ceux de la maladie STGD1 chez l'humain. Notre projet consiste à maintenir une colonie de rats STGD en utilisant des mâles et des femelles porteurs de la mutation (hétérozygotes, HE, ou homozygotes, KO). Les rats STGD et les rats sains issus de la même portée (appelés WT) seront utilisés pour de futures études de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologique. Certains rats HE et KO seront également utilisés pour la reproduction.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de ce projet est la caractérisation génétique, par une méthode invasive, d’animaux génétiquement modifiés représentant un modèle de la dégénérescence maculaire ou de la maladie de Stargardt (rats STGD) dont la physiopathologie est similaire à celle observée en humaine. Cette caractérisation permettra d’optimiser la gestion d’élevage de cette colonie. Ce projet assurera ainsi le maintien de cette lignée, qui n’est proposée par aucun fournisseur à ce jour, et mettra à la disposition des équipes de recherche, tant académiques que privées, ce modèle animal pertinent de la STGD1. Ce modèle animal servira de support pour les futures études et projets scientifiques associées.

Procédures

Une biopsie de queue sera réalisée sur les ratons de toutes les portées issues des reproductions. L'acte sera réalisé une seule fois, précocement au cours de la vie de l’animal, afin de déterminer son génotypage, c'est à dire identifier si l'animal est atteint de la maladie de Stargardt (STGD) ou bien s'il s'agit d'un animal sain. Le prélèvement se fera sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Un génotypage sera effectué par biopsie de la queue chez des ratons âgés de 8 à 10 jours, une procédure considérée comme modérée. Une anesthésie locale est prévue lors de l'intervention. Bien que peu fréquents, certains signes de douleur pourraient apparaître dans les heures ou jours suivants, tels qu'un défaut de reptation, des vocalisations, un isolement du reste de la portée ou un retard dans la reprise de la tétée après le retour au nid.

Devenir

Suite au génotypage, le devenir des animaux générés lors de notre programme de reproduction sera fonction des besoins des projets dans lesquels ils seront inclus : (i)Les rats KO et WT seront inclus dans les études futures de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologiques au fil de l’eau en fonction du dynamisme de la colonie implantée. (ii)Une partie des rats (environ un à deux par portée) obtenus seront conservés en vue d'intégrer le pool des reproducteurs. (iii) Les autres animaux issus des portées et ne pouvant pas être intégrés dans un projet seront euthanasiés dès le rendu des résultats des génotypages.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux constitue, à ce jour, l'unique approche pour étudier la physiopathologie et le transfert de gènes dans la rétine, une structure complexe formée de multiples couches de neurones et de cellules nourricières, avant de passer à des études précliniques ou cliniques chez l’homme. Cette lignée de rats permettra, dans le cadre de futurs projets, d’évaluer l’effet d’un traitement à la fois dans un contexte malade (rats KO) et dans un contexte sain (rats WT), justifiant ainsi la nécessité du génotypage. Actuellement, le génotypage invasif reste une méthode simple, rapide, bien maîtrisée et capable de fournir des résultats fiables pour la caractérisation génétique des rats. Réalisée chez des ratons âgés de 8 à 10 jours, cette technique est indolore. À l’inverse, le génotypage par prélèvement salivaire, bien que moins invasif, n’est pas recommandé en raison de la complexité de sa mise en œuvre (taille inadaptée des swabs par rapport à la petite bouche des ratons à cet âge) et de la faible fiabilité des résultats obtenus. Un génotypage basé sur la collecte de bulbes pileux est actuellement en cours de validation. Cette méthode, non invasive, sera adoptée au sein de notre centre une fois sa mise en œuvre finalisée, incluant la formation du personnel à cette technique et la mise au point du génotypage à partir de bulbes de poils dans notre laboratoire.

Réduction

La détermination du nombre total d’animaux à inclure dans ce programme de reproduction a été réalisée sur la base de l'expérience de précédentes reproductions menées pour des projets de thérapie génique chez le rat STGD. Dans ce projet, afin de générer au maximum 200 rats STGD KO et 50 rats WT par an, nous estimons qu'il sera nécessaire de mettre à la reproduction environ 50 couples par an, soit un total de 250 animaux reproducteurs utilisés sur 5 ans afin de générer environ 1250 rats STGD et WT. Ce nombre est estimé en fonction de nos connaissances actuelles sur les particularités de reproduction sur ce modèle et en considérant que la lignée génèrera des portées de taille standard (Cf. schéma d’accouplement en Annexe). Les accouplements seront optimisés afin de maximiser le nombre de rats KO et d'éviter les portées de rats WT uniquement. Cette optimisation privilégiera les reproductions suivantes : KO x KOet HE x HE. Une reproduction KO x KO nous permettra d’obtenir 100% d’animaux KO, une reproduction HE x HE nous permettra d’obtenir théoriquement 50% d’animaux HE, 25% d’animaux KO et 25% d’animaux WT. Il est important de noter que cette lignée a déjà été cryopréservée. Elle est conservée tant que des projets sont en cours de planification, mais son maintien sera interrompu en l'absence de nouveaux projets.

Raffinement

Le bien-être animal passera notamment par : 1. De bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation et un suivi régulier des animaux, assuré par les techniciens animaliers (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement). 2. Les biopsies de la queue destinées au génotypage seront effectuées par des techniciens compétents et spécialement formés à ces procédures rigoureuses. Cette méthode de génotypage, bien établie, rapide et standardisée dans notre centre, permet de minimiser le stress des animaux. Une analgésie sera assurée à l'aide d'un anesthésique local (comme le TRONOTHANE ou l'EMLA). La cicatrisation sera également surveillée dans les jours suivant l'intervention afin de garantir une bonne cicatrisation. En cas de besoin, une injection sous-cutanée de Buprénorphine peut être administrée à une raison de 0.05 mg/kg. 3. Afin d’améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (Cf. annexe de la saisine).

Choix des espèces

Le rat est un bon modèle pour tester les traitements de thérapie génique des yeux. Son œil est assez grand pour permettre une distribution uniforme des fluides sous la rétine, avec moins de risque de fuite par rapport à la souris. De plus, lors de longues anesthésies, les rats ont moins de problèmes d'opacité du cristallin, qui peut compliquer les examens oculaires. Ce problème, qui ressemble à une cataracte, est courant chez les souris et est causé par le dessèchement de la cornée. La lignée de rats que nous avons développée imite bien la maladie de Stargardt chez l'humain sans nuire aux rats eux-mêmes. Les changements observés chez ces rats reflètent fidèlement ceux de la maladie humaine. Pour nos expériences, nous aurons besoin de jeunes rats adultes âgés de 2.5 mois pour la reproduction, ainsi que de rats adultes. Les rats modifiés génétiquement (KO) et les rats normaux (WT) seront généralement utilisés dans les expériences dès le sevrage. Selon les projets, les rats seront utilisés à différents âges, avec des justifications spécifiques pour chaque étude.