Procédures modérées
Traitement des conséquences neuropathologiques de la déficience en méthionine synthase
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester un traitement pharmacologique contre les troubles neurologiques liés à une carence génétique en vitamine B12, 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré : 20 femelles reproductrices qui reçoivent le composé par voie orale et leurs 40 descendants. Chaque souriceau subit une biopsie de peau dès l'âge de six jours pour déterminer son génotype, puis six tests comportementaux étalés sur trente et un jours. Les 40 descendants seront tués à 36 jours pour prélèvement de tissus, les 20 mères étant gardées vivantes et proposées à d'autres projets. Le porteur qualifie ces six tests de standardisés et non invasifs sans jamais dire lesquels.
Objectifs
Une carence en vitamine B12 est associée à de nombreux troubles neurologiques et comportementaux. Cependant, les mécanismes mis en jeu sont encore mal connus, et les traitements souvent inefficaces. C’est pourquoi nous avons développé au laboratoire un modèle animal où la carence est reproduite par invalidation d’un gène qui correspond à la maladie humaine. Ce gène joue un rôle central en lien avec la vitamine B12 et des troubles neurologiques variés (retard développemental, atrophie cérébrale, hypotonie, crises d'épilepsie, ataxie). Nous proposons un nouveau traitement pharmacologique qui a déjà été testé avec succès sur cultures cellulaire. Ce traitement non toxique semble plus efficace que le traitement actuel basé sur une « simple » compensation en vitamine B12. Il est maintenant nécessaire de l’évaluer sur individu vivant.
Bénéfices attendus
Actuellement, le traitement de référence de la déficience génétique liée à la carence en vitamine B12 est représenté par des injections intra-musculaires de vitamine B12. Cependant les patients jeunes enfants « bons répondeurs » à ce traitement représentent un très faible pourcentage. Ainsi, les conséquences pour les enfants malades sont délétères à moyen terme et de nombreux décès sont constatés après quelques mois ou années tout au plus. La nouvelle approche via le nouveau traitement pharmacologique pourrait, d'après les résultats positifs sur cultures cellulaires, maintenir la survie cellulaire, et empêcher la dégradation de l’activité neuronale.
Procédures
Les souris femelles reproductrices seront traitées par administration orale d'un faible volume de solution pharmacologique. Les descendants seront testés dans 6 tests comportementaux standardisés non invasifs de 5 jours à 36 jours d'âge. L'objectif de ces tests est de quantifier l'activité générale, l'état de stress éventuel, les capacités de mémoire et l'état psychique. Les tests durent de 2 à 5 minutes maximum et seulement 1 test sera effectué par jour avec un étalement sur 31 de ces 6 tests (pas de cumul journalier).
Impact sur les animaux
La genèse d'animaux qui miment les effets génétiques humains n'engendre pas d'effet physique notable. La croissance des individus est identique entre les individus expérimentaux et témoins. L’administration pharmacologique chez les femelles adultes génitrices pourrait être considéré comme inconfortable, cependant réalisé par une personne habilitée et expérimenté dans ce geste, elle est de courte durée (quelques secondes) et la répétition correspondra à une habituation. Le fond génétique des souriceaux devant être connu, un prélèvement de peau dit biopsie est réalisé sur chaque individu à partir de 6 jours d’âge. Ce prélèvement peu générer une douleur légère de courte durée. Les tests comportementaux pourraient ponctuellement générer des effets, cependant ceux-ci ont déjà été proposés et validés dans de précédents projets. Ces tests sont standardisés en neurobiologie, sont observationnels plutôt que interventionnistes sur l’animal et ne génèrent pas ou très peu de stress ou inconfort. La forte caractéristique d'exploration des rongeurs permet de supposer un intérêt de ceux-ci pour la découverte de nouveau environnements (dispositifs expérimentaux), par rapport aux cages d'hébergement.
Devenir
Les 20 mères souris seront gardées en vie et soit retournées à l'animalerie, soit proposées pour d'autres projets. Les 40 descendants seront mis à mort à 36 jours d'âge pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Ce projet est centré sur les mécanismes liés aux dysfonctionnements comportementaux ; aussi il n’est pas possible d’investiguer autrement qu’avec des individus vivants. Une étude sur animal entier est nécessaire pour évaluer l'effet du traitement pharmacologique. Une étude de non-toxicité a déjà été effectuée sur culture cellulaire de patients atteint de cette pathologie.
Réduction
Nos précédents résultats ne montrent pas d'effet du sexe, ainsi dans ce projet, nous ne considérons pas le sexe comme un paramètre de premier ordre pour évaluer les effectifs. Nous prévoyons 2 groupes de traitement (contrôle et médicament), et 2 génotypes (contrôle et muté), donc 4 sous-groupes à comparer entre eux. Grace à un logiciel prédictif, nous obtenons par calcul un effectif total de 40; d’où 10 souris par groupe. Pour obtenir cet effectif, et selon le génotype des animaux de croisement, il est difficile de prévoir strictement le nombre de descendants obtenu de chaque génotype. Nous prévoyons d'utiliser jusqu'à 20 femelles adultes pour la reproduction et réparties également selon les deux groupes expérimentaux : contrôles et traitées par médicament. Dès l'obtention de 10 descendants par groupe expérimental (40 descendants au total), nous cesserons les croisements. Les animaux géniteurs retournerons dans l’effectif d’animaux d'élevage ou seront proposés pour d'autres projets de recherche ou d'enseignement.
Raffinement
Les animaux seront hébergés, en cycle de lumière 12:12h normal (non-inversé), dans une animalerie dotée d'un contrôle de tous les paramètres nécessaires à leur bien-être. Un enrichissement des conditions d'hébergement est prévu avec buchettes de bois et du papier absorbant propice à la construction de nids. Une procédure spécifique à l’estimation de l’inconfort et la douleur sera mise en place avec une surveillance quotidienne. Les points limites sont fixés selon une grille d'évaluation des signes de mal-être établie dans notre laboratoire et validée par notre vétérinaire référent.
Choix des espèces
La souris est particulièrement utilisée pour générer des animaux modèles de maladies génétiques humaines. Nous disposons déjà au laboratoire des géniteurs possédant les mutations nécessaires pour mimer la maladie telle qu'elle existe chez l'Homme. Nous envisageons d’étudier les effets d’un traitement avant la naissance, donc il nous faut prévoir des mères adultes en gestation qui seront traitées ou non et d’étudier les descendants.
Évaluation de la résistance au parasitisme gastro-intestinal chez des agnelles en fonction de la souche de parasites et du niveau d’alimentation de l’hôte
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infestées volontairement par un parasite hématophage, Haemonchus contortus, et pour une partie d'entre elles rationnées, 96 agnelles subissent huit prises de sang de 5 ml et six prélèvements de fèces en sept semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Âgées de trois mois, choisies parce que leur système immunitaire encore peu développé les rend plus vulnérables au parasitisme, elles retourneront toutes ensuite à la production dans l'élevage. L'objectif déclaré est de vérifier si la sélection génétique pour la résistance aux parasites tient encore quand les brebis sont sous-alimentées et exposées à une souche résistante aux vermifuges. Le porteur écrit que les signes cliniques de l'haemonchose, léthargie, anémie, tachycardie, ne sont généralement pas observés en conditions contrôlées, tout en annonçant une surveillance accrue justifiée par ces mêmes conditions nouvelles.
Objectifs
Le projet expérimental présenté ici a pour objectif général d’évaluer l’efficacité de la sélection génétique sur la résistance au parasitisme gastro-intestinal face à des contraintes auxquelles les élevages ovins seront fréquemment confrontés dans les prochaines années. La sélection sur la résistance de l’hôte a depuis longtemps été identifiée comme une des voies majeures pour mettre en œuvre une gestion intégrée du parasitisme. Cette voie est de plus en plus plébiscitée par les éleveurs car une forte réduction de l’utilisation des antiparasitaires s’impose désormais. En effet, une utilisation trop importante a favorisé le développement de populations parasitaires résistantes aux molécules anthelminthiques, ce qui peut maintenant conduire les élevages à des situations d’impasse thérapeuthique. De plus de nombreuses molécules antiparasitaires présentent une écotoxicité dans les milieux naturels. Parmi les alternatives aux traitements, l’utilisation d’animaux génétiquement résistants (présents naturellement dans les populations) a une efficacité démontrée. Cependant, en France la sélection sur la résistance de l’hôte s’appuie sur un phénotypage à partir d’infestations contrôlées, avec une souche de parasite sensible à toutes les principales molécules anthelminthiques et dans des milieux très favorables, notamment sur le plan alimentaire (i.e. distribution de concentrés à volonté en bergerie). Dans ce contexte, l’utilisation de la sélection génétique repose donc sur l’hypothèse que l’expression du caractère de résistance de l’hôte n’est pas fortement atténuée face à des conditions plus contraignantes. Or cette hypothèse clé n’a pas encore été validée. Dans ce projet, nous visons à tester cette hypothèse en évaluant la résistance de jeunes ovins issues de lignées résistante ou sensible au parasitisme face à deux contraintes qui seront prépondérantes dans les élevages : (1) une baisse du niveau d’alimentation en lien avec la raréfaction des ressources liée au changement climatique et la nécessité de diminuer la dépendance aux aliments concentrés dans les élevages ovins, et (2) l’infestation par des parasites issues de populations résistantes à certaines molécules antiparasitaires qui tendent à se propager rapidement ces dernières années dans de nombreuses régions d’élevage.
Bénéfices attendus
A court-terme, le projet va permettre de connaitre l’efficacité de la résistance génétique au principal parasite gastro-intestinal (H. contortus) dans des conditions défavorables par rapport à celles utilisées pour la sélection. Par ailleurs, le suivi de la croissance des agnelles au cours des infestations permettra d’évaluer les éventuels compromis entre les caractères de résistance et de production. Ainsi, le projet fournira des connaissances essentielles sur l’intérêt et les limites d’utiliser des animaux résistants dans les élevages, notamment lorsqu’ils sont confrontés à des parasites résistants aux anthelminthiques et que les animaux sont rationnés. Si les résultats du projet montrent que l’efficacité de la résistance est signifiquement altérée dans des conditions d’infestation très défavorables (e.g. groupe « Rationné - souche Resistante ») alors le projet permettra d’envisager un ajustement du protocole de phénotypage de la résistance dans les centres de sélection ovines ou bien de formuler des recommendations en matière de conduite d’élevage des animaux résistants (ex : ajustement de l’alimentation). A plus long-terme, la confirmation de l’intérêt de la sélection pour la résistance contribuera à l’essor de cette voie. En s’intégrant dans une gestion durable du parasitisme, la sélection contribue à la performance des élevages herbagers. Il s’agit d’un enjeu du point de vue de la transition agroécologique (via la réduction de la consommation de concentrés). L’élevage à l’herbe apporte aussi un bénéfice du point de vue du bien être des animaux dans la mesure où le pâturage favorise généralement l’expression des comportements naturels des ovins par rapport à l’élevage en bergerie. Par rapport à un phénotypage d’animaux au pâturage exposés à des infestations naturelles, la stratégie de sélection actuelle basée sur un phénotypage à partir d’infestation artificielles dans des conditions contrôlées permet d’évaluer la résistance de façon plus précise, moins risquée sur le plan de la santé et du bien-être, et à partir d’effectifs limités. Enfin, un bénéfice attendu du projet est de contribuer à la réduction de l’utilisation de traitements antiparasitaires en élevage.
Procédures
Sur l’ensemble de la période expérimentale de 7 semaines, chaque animal aura 6 prélèvements de fécès ( 10 à 20 g/prélèvement)et 8 prélèvements de sang (5ml/prise de sang). La durée de chaque prélèvement est estimée à une dizaine de secondes au maximum.
Impact sur les animaux
L’infestation des jeunes agnelles par H. contortus produit nécessairement des effets négatifs sur la santé des animaux. L’haemonchose se traduit par une léthargie, un manque d’appétit, une augmentation de la prise de boisson, une tachycardie, une augmentation de la fréquence respiratoire et une anémie liée à l’activité hématophage du parasite. Cependant, la plupart de ces signes cliniques ne sont généralement pas observés lors d’infestations en conditions contrôlées. Dans ce contexte, la faiblesse des effets négatifs sur la santé s’explique par le nombre limité d’infestations à dose unique, la faible durée de ces infestations (par rapport à des périodes de pâturage) et les conditions d’élevage en bergerie. Néanmoins les animaux font l’objet d’une surveillance accrue dans ce projet en raison des conditions d’infestation testées (nouvelle souche de parasites resistante, resriction alimentaire).Les prélèvements de sang peuvent engendrer un hématome ainsi qu’une légère douleur au niveau du site de prélèvement. Enfin il y aura un léger stress des animaux liés à la contention.
Devenir
Toutes les agnelles poursuivront leur carrière de production dans l’élevage.
Remplacement
On ne peut pas remplacer l’hôte (ovin) pour la réalisation du cycle parasitaire et l’étude de l'impact de la sélection à la résistance aux parasites sur les autres fonctions biologiques de l’hôte. Les données expérimentales serviront à la calibration d’un modèle mathématique dans le projet dont cette expérimentation fait partie. Le modèle permettra d’utiliser la simulation numérique plutôt que l’expérimentation animale pour explorer les réponses sur une plus large gamme de conditions d’infestations.
Réduction
Le nombre d’animaux prévus dans le projet est déterminé de façon à avoir un effectif garantissant l’interprétation des données (10 à 12 animaux de chaque lignée dans chacun des quatres groupes expérimentaux). L’analyse statistique des mesures répétées des différentes mesures permettra d’estimer la variation de ces caractères au niveau intra-individuel et d’estimer plus précisemment la valeur de l’index de résistance et des autres caractères exprimés pendant l’infestation. Le dispositif contribue ainsi à réduire le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Les agnelles sont hébergées sur une litière paillée en lots pour favoriser leurs interactions sociales et elles sont habituées à être manipulées par du personnel. Une phase d’habituation de deux semaines est mise en place pour les adapter aux outils de phénotypage, les distributeurs automatiques. Cette période exige une surveillance individuelle afin d’assurer la réussite de l’expérimentation. Adaptation au ditributeur automatique : L’objectif est que tous les animaux apprennent à accéder à l’aliment via trois étapes : Mangeoire en accès libre (porte ouverte en permanence) . Porte activée par détection de présence. Porte activée par identification animale. Les animaux récalcitrants bénéficient d’un entraînement spécifique, incluant un apprentissage en duo avec un animal tuteur ou, en dernier recours, une assistance humaine douce. Les individus trop craintifs sont exclus du protocole. Adaptation au distributeur d'eau : Le but est que les agnelles s’abreuvent quotidiennement et posent leurs 4 pattes sur le plateau de pesée, via trois étapes : Abreuvoir avancé au maximum sur le plateau . Abreuvoir reculé au 1er cran. Abreuvoir reculé au 2e cran si nécessaire. Pour encourager l’adaptation, un seau d’eau est temporairement placé sur le plateau. Les interventions humaines sont limitées pour respecter la grégarité des agnelles. Manipulations et prélèvements : Pour habituer les animaux à la présence humaine, des passages simulant des prélèvements (sang et fèces) sont effectués avec renforcement positif (granulés). Les prises de sang alternent entre les jugulaires droite et gauche, avec application d’un baume en cas d’hématome. Les prélèvements de fèces avec lubrifiant sont réalisés avec soin par du personnel formé. Bien-être et suivi : Le milieu est enrichi avec des disques à mordiller. Une surveillance accrue est menée en raison des nouvelles conditions expérimentales (nouvelle souche parasitaire, restriction alimentaire). Les comportements inhabituels sont détectés grâce au suivi automatisé des consommations d’eau et d’aliments. En cas de symptômes alarmants (fièvre, anorexie, perte de poids…), les animaux sont traités et sortis de l’expérimentation. Ces protocoles garantissent une adaptation optimale tout en préservant le bien-être animal et la fiabilité des données expérimentales.
Choix des espèces
Les parasites gastro-intestinaux sont spécifiques de leur hôte et H. contortus est le parasite provoquant le plus de dégâts en France. Comme nous souhaitons sélectionner les ovins sur la résistance au parasitisme, l’utilisation de l’espèce ovine dans cette expérience est la plus pertinente. D’autre part, des lignées divergentes sur la résistance à H. contortus n’existent que chez les ovins. Les animaux sont âgés de 3 mois au début de l’expérimentation. Les agneaux représentent la catégorie d’animaux la plus plus sensible au parasitisme car leur système immunitaire est peu développé par rapport à des ovins adultes. Par ailleurs, cette phase peut mettre en jeu un compromis entre l’immunité et la fonction de croissance corporelle. En pratique la sélection génétique pour la résistance des ovins allaitants cible prioritairement les agneaux en croissance.
Elevage et caractérisation génétique (par des prélèvements de tissus) de souris génétiquement modifiées utilisées dans l’étude du développement leucémique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 800 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit au sevrage, trois semaines après la naissance, une biopsie de la queue ou de l'oreille destinée à lire son génotype. Le projet ne produit pas de résultat par lui-même, il alimente d'autres travaux sur la leucémie en animaux porteurs des mutations recherchées, les souris étant décrites comme "prévues pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques". Sur le remplacement, le porteur indique que la culture cellulaire ne reproduit pas la complexité du microenvironnement tumoral, et il dit réfléchir à des méthodes moins invasives, par le poil, la salive ou les fèces, sans les avoir mises en place.
Objectifs
L'objectif du projet est d'identifier en fonction de leur génotype les souris génétiquement altérées modèles d'étude du développement leucémique
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension des différents stades et acteurs de la leucémogénèse.
Procédures
Prélèvement de queue, une seule fois. Prélèvement possible à l'oreille, une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont celles liées au prélèvement de biopsie de queue pour génotypage: douleur légère et stress lié à la contention. Ces nuisances sont passagères et n'entrainent pas de complication majeure. Par ailleurs, la biopsie est toujours effectuée par du personnel expérimenté maîtrisant le geste, assurant une limitation efficace de ces nuisances. Pour le modèle de développement leucémique, les symptomes peuvent être observés au delà de 12 semaines. Ces souris seront alors observées régulièrement afin de détecter l'apparition éventuelle de signes d'affaiblissement (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Enfin, pour les modèles immunodéficients, les animaux sont fragilisés d’un point de vue immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptées.
Devenir
Les animaux sont prévus pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques. La biopsie de queue ou d'oreille permet le génotypage et en fonction des croisement effectués permettra d'identifier les animaux utiles aux études.
Remplacement
La caractérisation des évènements géniques impliqués dans le développement leucémique ne peut être réalisée que partiellement in vitro puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire la complexité du microenvironnement tumoral (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) même si nous travaillons en parallèle à les développer afin d'avoir recours aux animaux uniquement sur les dernières étapes de notre projet.
Réduction
Le nombre d'animaux qui vont subir le prélèvement pour génotypage est réduit à son minimum: La production est lié aux besoins des projets scientifiques. Les schémas d'accouplement sont optimisés pour ne produire que des animaux "utiles" porteurs de modifications génétiques d'interet.
Raffinement
Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule préhension). Le prélèvement de tissu est réalisé par une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée (biopsie de queue) de façon à limiter les effets indésirables (stress et douleur). En cas de signes de stress ou de douleur, du Douxocalm pourra être appliqué. Jusqu’à présent la méthode de biopsie de queue était la plus efficace pour identifier génétiquement les animaux. Cependant nous réfléchissons à mettre en place des méthodes alternatives moins invasives tel que le génotypage via prélèvement de poils, de salive ou de fécès. La difficulté d’une méthode non invasive est qu’elle soit applicable pour tous ce qui n'est pas le cas dans toutes les équipes de recherche. Les souris présentant une immunodéficience ont besoin d'un hébergement en portoirs ventilés sous un statut sanitaire SPF. Celles-ci, ainsi que l'ensemble des élevages de cette demande sont maintenus en portoirs ventilés.
Choix des espèces
Le modèle murin est le plus utilisé actuellement pour étudier le microenvironnement tumoral. De nombreux outils sont disponibles pour l’étude des structures anatomiques, cellules, et gènes dans cette espèce (anticorps, séquence de référence…). De plus le modèle que nous utilisons mime de façon remarquable le développement leucémique humain avec une acquisition de mutations secondaires identiques ou avec des effets similaires que chez l'homme. Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule préhension). En cas de problème technique sur le prélèvement (défaut d'extraction de l'ADN par exemple), un deuxième prélèvement pourra être réalisé entre 5 et 12 semaines.
Exploration de l’homéostasie glucidique chez la souris : diagnostic du diabète
- Enseignement supérieur
100 souris vont être utilisées, chacune soumise à deux tests de tolérance au glucose de deux heures trente, avec six prélèvements de sang et deux prélèvements d'urine par test. Une partie reçoit deux injections abdominales d'un agent qui déclenche un diabète, avec la soif, l'émission d'urine accrue et la perte de poids qui l'accompagnent, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La finalité est un enseignement : des travaux pratiques pour six étudiants par séance, chaque souris étant utilisée une deuxième fois pour un autre groupe. Le porteur qualifie l'induction du diabète de "strictement nécessaire", et toutes les souris sont tuées à l'issue.
Objectifs
Ce projet est destiné à des étudiants à l’Université et est dispensé sous la forme de séances de travaux pratiques. Cet enseignement vise à apprendre aux étudiants à diagnostiquer via l’analyse des paramètres sanguins et urinaires, le diabète dans un modèle de souris rendues diabétiques.
Bénéfices attendus
Ces séances de travaux pratiques sont organisées et encadrées par des personnels qui ont suivi une formation initiale et sont à jour de leur formation continue. Elles visent à familiariser les étudiants à l'analyse in vivo de l'homéostasie glucidique des souris et de les sensibiliser aux problèmes éthiques et méthodologiques de ce type d'expérimentation qui a pris une place centrale dans les stratégies d'élucidation de mécanismes physiopathologiques à la suite du développement de modèles animaux transgéniques. Plus globalement, ces séances de travaux pratiques permettent de familiariser les étudiants à la manipulation des animaux dans des conditions réglementaires et à l’utilisation raisonnée des animaux dans le cadre de la recherche (réduire au maximum le nombre, raffiner les expérimentations et remplacer l’utilisation d’animaux autant que cela est possible).
Procédures
Une partie des animaux recevra un agent induisant un diabète par deux injections intrapéritonéales sur 2 jours sur animal vigile (quelques secondes par animal) effectuée après une mise à jeun de courte durée (4h). L’autre partie des animaux recevra deux injections intrapéritonéales d’un placebo sur 2 jours sur animal vigile. Un prélèvement sanguin de faible volume (une goutte) effectué 3 jours après la dernière injection permettra de confirmer l’induction du diabète. Ce prélèvement sera effectué sur animal vigile et durera 5 secondes par animal. A la fin des traitements, les souris seront soumises à un test pour évaluer la tolérance au glucose. Pour cela, après une mise à jeun de courte durée (6h), du glucose sera administré par voie orale (quelques gorgées, 10 secondes par animal vigiles). 6 prélèvements sanguins de faible volume (une goutte/prélèvement sanguin, 5 secondes par animal vigile) et 2 prélèvements urinaires (une goutte/prélèvement, 5 secondes/animal vigile) seront réalisés pour mesurer l’évolution des concentrations en glucose sanguin et urinaire au cours du temps (2h30 maximum pour chaque test effectué, 2 tests par souris à 2 jours d’intervalle). Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sur les souris concernent principalement l’induction d’un diabète. Le diabète est associé à une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et une perte de poids. L’induction de cette pathologie est malheureusement strictement nécessaire pour étudier les méthodes de diagnostic du diabète. Le traitement repose sur deux injections intrapéritonéales réalisées 2 jours successifs sur animaux à jeun, pouvant ainsi induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Le traitement pourrait induire une production accrue d’insuline, entrainant des épisodes d’hypoglycémies modérées chez les souris non diabétiques. D’autres effets secondaires pourraient être observés mais sont difficiles à prévoir et une surveillance accrue des souris sera réalisée quotidiennement. Lors de l’expérience, les animaux pourraient subir un inconfort lié à la mise à jeun, un stress dû à la préhension, une douleur (ou au minima un inconfort) causée par les prélèvements de sang et d’urine.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. Les animaux ne pourront pas être réutilisés par la suite à des fins de recherche.
Remplacement
Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (études de films, analyses d'articles scientifiques, méthodes in vitro, ...) est préféré. Toutefois, l'un des objectifs des travaux pratiques est notamment de former les étudiants à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent les différentes fonctions physiologiques et pathologiques chez les animaux ou l’humain. De ce fait, l'utilisation de rongeurs reste nécessaire : l'étude de l'homéostasie glucidique et l'évaluation de l'efficacité des méthodes utilisées pour diagnostiquer le diabète ne peut se faire que sur un animal. Durant les expérimentations, une attention particulière sera portée pour sensibiliser les étudiants au principe de remplacement. Cette sensibilisation éthique et réglementaire est essentielle pour la poursuite de leur activité et leur choix carrière.
Réduction
Le projet impliquera un total de 100 animaux. Chaque année, l'effectif est volontairement limité à très peu d’étudiants afin de réserver cet enseignement uniquement aux étudiants qui désirent faire de la recherche en physiologie et par conséquent, limiter le nombre d'animaux. Afin de réduire encore ce nombre, chaque souris sera utilisée une deuxième fois pour des groupes d’étudiants. De plus, nous diminuons au maximum le nombre d’animaux par groupe expérimental, tout en conservant un nombre suffisant permettant l’obtention de résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (changement de cages 1 à 2 fois par semaine si nécessaire lié à la polyurie, etc.). Les animaux fragiles identifiés après injection de l’agent induisant un diabète seront soumis à une vigilance accrue, notamment via l’établissement de points limites, qui entraineraient l’euthanasie de l’animal. Les séances seront sous l’encadrement d’une enseignante possédant une formation réglementaire à jour et une expertise de plus de 20 ans dans la manipulation des animaux. De plus, le nombre des étudiants est extrêmement réduit (6 étudiants par séance) pour limiter le stress des animaux et augmenter la disponibilité et le contrôle de l’encadrement de chaque étudiant.
Choix des espèces
Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris en raison de l'existence de nombreuses données publiées dans la littérature concernant les effets d’un agent inducteur de diabète sur l'homéostasie glucidique. De plus, la maitrise de l’utilisation d’un modèle tel que la souris sera un atout supplémentaire pour le futur des étudiants. En effet, le modèle souris est le plus couramment utilisé dans les laboratoires de recherche. Des souris seront rendues diabétiques à l’âge adulte et des tests métaboliques sont réalisés 1 semaine après l’induction du diabète. Nous avons choisi de travailler sur des animaux adultes car c’est un stade de développement qui montre des résultats tranchés en termes d'homéostasie glucidique.
Impact de la perte de fonction d’un gène sur la longévité chez des souris transgéniques immunocompétentes
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour mesurer combien de temps vivent des souris privées d'un gène soupçonné d'intervenir dans le vieillissement, 480 d'entre elles sont maintenues en cage jusqu'à leur mort, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Aucune intervention n'est prévue au-delà d'un examen de cinq minutes toutes les six semaines à partir de dix-huit mois, jusqu'à la fin de vie. Elles développent les atteintes propres au grand âge, tumeurs, dermatites, difficultés à se déplacer, sans médication sauf avis vétérinaire. Certaines meurent dans leur cage, les autres sont tuées quand une grille de fragilité indique qu'un point limite est franchi, et leurs organes sont ensuite prélevés.
Objectifs
Le vieillissement et les pathologies liées à l’âge deviennent des thématiques prioritaires en recherche car ils ont un fort impact sur la santé publique. Réduire le vieillissement et étendre l’espérance de vie en bonne santé est un enjeu économique majeur. Ce projet de recherche s’inscrit dans cette thématique. Nous avons mis en évidence, via des études in vitro, que notre gène d’intérêt est impliqué dans le vieillissement. L’objectif de ce projet est de valider in vivo cette hypothèse via une étude de longévité qui évaluera la mesure de l’espérance de vie des animaux transgéniques déficientes pour ce gène. Les expériences in vivo réalisées sur un modèle rongeur permettront de démontrer l’impact de notre gène d’intérêt sur la santé des animaux vieillissant.
Bénéfices attendus
L’étude de la longévité est un enjeu actuel majeur. Cette étude: i) mettra en évidence le rôle clef joué par notre gène d’intérêt dans le vieillissement physiopathologique chez les souris mâles et femelles ; ii) avancera la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires du vieillissement via l’identification des acteurs de la sénescence. Cela nous permettra de développer des nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter certaines pathologies liées à l’âge comme la neuro-dégénération ou le cancer et ainsi étendre l’espérance de vie en bonne santé.
Procédures
Étude de longévité incluant uniquement le maintien des animaux à long terme en conformité avec la réglementation et incluant un suivi avec établissement d’un score (5 min par animal - 1x toute les 6 semaines à partir de 18 mois et jusqu’à la fin de vie).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une contrainte liée à la contention lors de leur évaluation et, également, les effets indésirables inhérent au vieillissement (éventuelle possible apparition de tumeurs, dermatite, difficulté à se déplacer).
Devenir
Dans le cadre de cette étude de vieillissement, certains animaux seront susceptibles de décéder naturellement au cours de cette procédure de longévité ou seront euthanasiés en cas d’atteinte des points limites définis. Des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Notre projet vise à définir les conséquences de la modification avec l’âge de la signalisation moléculaire et cellulaire. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire les interactions inter-organes et la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors du vieillissement. L’utilisation d’un modèle petit rongeur, comme la souris, se justifie par l’espérance de vie relativement courte de ces animaux, permettant la réalisation du projet dans le temps imparti (5 ans).
Réduction
Le projet impliquera un total de 480 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Nous appliquerons un test statistique approprié pour comparer la survie des animaux. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et bâtons à ronger). L’aliment sera mis dans les cages pour les animaux fatigués ou avec des problèmes d’accessibilité à la nourriture. En collaboration avec la cellule du bien être animale de la structure, un changement d’aliment sera envisagé pour les animaux très vieux. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Nous avons inclus dans le protocole de longévité des grilles d’évaluation de la fragilité des animaux, incluant des observations cliniques et le suivi de poids des animaux. Les animaux fragiles identifiés seront soumis à une vigilance accrue, notamment via l’établissement de points limites, des signes de souffrance, qui entraineraient l’euthanasie de l’animal. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées en cas d’atteinte des points limites préétablis. Il n’y aura pas de médication utilisée dans le cadre de cette étude de longévité sauf avis vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. Tout d’abord, la souris est un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à celui de l’homme, ce qui en fait un modèle pertinent. De plus, sa génétique est bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront suivis pendant toute leur vie afin d’évaluer l’espérance de vie maximale des individus.
Etude de l’impact des inhibiteurs de points de contrôles en présence de cytokines anti-tumorales sur la réponse anti-cancéreuse.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Greffées d'une tumeur sous la peau du flanc ou directement dans la glande mammaire, 3 069 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une chirurgie de trente minutes puis restent endormies deux à trois heures pour de l'imagerie, et toutes sont manipulées chaque jour pour mesurer la tumeur. Le projet cherche à comprendre pourquoi les immunothérapies ne guérissent qu'une minorité de patients, moins de 30 % selon le porteur. Celui-ci écrit que les immunothérapies ne sont pas toxiques et que la tumeur ne gênera l'animal ni pour bouger ni pour s'alimenter, tout en fixant un volume tumoral au-delà duquel la souris est tuée.
Objectifs
Ces dix dernières années, les immunothérapies ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant nos défenses immunitaires à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards de chimiothérapie et radiothérapie. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra d’apporter des connaissances essentielles sur le mode d’action d’immunothérapies actuellement utilisées en clinique ou en cours de développement pour le traitement des cancers solides (ex : cancer du sein, de la peau, du colon, lymphome de la peau, etc) et pour lesquelles une majorité des patients rechutent ou ne répondent pas. Comprendre les raisons pour lesquelles ces immunothérapies guérissent seulement une petite fraction des patients est alors primordial afin d’en générer des nouvelles de plus grande efficacité ou d’identifier les patients à même de répondre positivement au traitement. A court terme, ce projet nous permettra de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques capables de contourner les limitations que nous aurons identifiées et donc avec une meilleure efficacité. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles thérapies pour traiter la majorité des patients atteint de cancer solide et améliorer leur espérance de vie.
Procédures
La greffe de la tumeur consistera en une injection de quelques secondes au début de l’expérience. Les animaux seront ensuite manipulés quotidiennement pour mesurer la pousse de la tumeur. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30 minutes pour effectuer de l’imagerie et seront ensuite maintenus endormis pendant 2 à 3h.
Impact sur les animaux
Notre projet propose d’étudier les immunothérapies anti-tumorales et nécessite donc la greffe de tumeur aux souris en sous-cutanée au niveau du flanc et en orthotopique au niveau de la glande mammaire. Pour l’injection dans la glande mammaire, les souris seront anesthésiées. La piqûre d'aiguille en sous cutanée ou en orthotopique dans la glande mammaire pour l’injection de tumeur entraîne une douleur légère de courte durée. Il en est de même pour les injections en intra-veineuse des immunothérapies ou des d’autres molécules. Les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention et une introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. La pousse de la tumeur pourra engendrer un inconfort pour la souris qui sera léger et pris en charge.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales.
Remplacement
De nombreuses expériences seront validées au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires en 2 dimensions ou des organoïdes (structures en 3 dimensions mimant certains aspects des tumeurs solides in vivo) et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier le mode d’action de la thérapie in vivo. Différentes doses seront utilisées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier le mode d’action de la thérapie in vivo. Une telle approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieu in vivo. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action de certaines thérapies.
Réduction
L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet un suivi longitudinal d’un même animal. Dès que possible, les différents tests seront effectuées sur les mêmes animaux et les expériences de séquençage entier ou d’ARN aussi, afin de limiter leur utilisation. D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé́ les nombres d'animaux par groupe qui nous permettra d'utiliser les tests statistiques robustes. Selon les procédures, les paramètres évalués seront variables, cela entraine des nombres de groupes variables que nous avons optimisés et réduits au maximum pour obtenir des résultats significatifs tout en prenant en compte la variabilité de la croissance tumorale ainsi que les effets cages. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de cancer et auront reçu un traitement anti-tumoral.
Raffinement
Les immunothérapies ne sont pas toxiques à la différence des traitements conventionnels. Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites précoces et spécifiques sont établis pour raffiner les procédures et les mettre à mort si le point limite est atteint. En cas de déshydratation, les souris pourront être réhydratées. Un suivi fréquent sera réalisé pour évaluer l’état de l’animal et la pousse de la tumeur. L’animal sera mis à mort si le volume de la tumeur atteint le point limite. Cette limite est idéale pour limiter l’impact de la tumeur sur le bien-être de l’animal qui ne rencontrera aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Pour pallier l’inconfort de la pousse de la tumeur, une litière douce sera utilisée pour le bien être des animaux. Après l’administration de l’immunothérapie, la température corporelle de l’animal sera mesurée afin de s’assurer d’une bonne tolérance au traitement. En cas d’hypothermie, les cages seront chauffées. Dans les cas d'exérèse de la tumeur mammaire chez certaines souris, une administration d’’analgésique pourra avoir lieu, afin de prévenir la douleur.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain. Les souris sont l’espèce la plus appropriée pour nous éclairer sur les mécanismes d’action des immunothérapies pour le traitement des cancers chez l’humain. Par ailleurs, l’imagerie intravitale en temps réel peut être réalisée relativement facilement sur des souris. Tous les animaux utilisés dans ce projet de recherche seront adultes (>5 semaines). Notre étude s’effectue sur un système immunitaire adulte afin de se rapprocher au mieux de la clinique et des patients porteurs de ces cancers.
Evaluation comportementale et neurochimique des effets de nouvelles entités pharmacologiques dans des modèles d’autisme chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
5 060 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 3 360 en gravité sévère. Des femelles gestantes reçoivent une injection destinée à faire naître une descendance présentant des symptômes proches de l'autisme, puis sont tuées après le sevrage parce qu'elles ne développent pas elles-mêmes ces troubles. Leur descendance passe jusqu'à quinze tests comportementaux en cinq mois, avec jusqu'à vingt heures de jeûne, vingt-trois jours de cage individuelle, une exposition à une lumière et un bruit forts, et des stimuli aversifs douloureux. Seules 900 souris, celles qui n'ont reçu aucun traitement et ne sont approchées par les autres que lors des tests de sociabilité, seront réutilisées ailleurs, le porteur affirmant que la complexité des troubles autistiques impose le recours à des modèles in vivo.
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique (TSA) sont considérés comme des maladies du développement du système nerveux qui se manifestent dès la petite enfance. Ces pathologies se traduisent par des troubles du comportement, de l’interaction sociale, par des problèmes de communication, qui ne sont pas systématiquement associés à des retards intellectuels. Afin de chercher des pistes thérapeutiques contre les TSA, il est nécessaire de passer par des modèles animaux. Cependant, aucun modèle animal ne récapitule l’ensemble des symptômes des TSA, c’est pourquoi nous utiliserons 4 modèles souris dans ce projet. Notre objectif sera donc de tester par des études comportementales (évaluation de l’anxiété, compulsivité, sociabilité, mémoire… des souris) et/ou neurochimiques (évaluation des contenus en différents neurotransmetteurs dans le cerveau des souris) de nouvelles molécules issues de notre centre de recherche sur ces modèles souris de TSA. Nous utiliserons deux modèles d’autisme induits pendant la gestation, et deux modèles génétiques, avec en particulier un modèle du syndrome de l’X Fragile qui portera la même mutation que chez l’humain, et qui entraîne un TSA chez 10 à 30% des patients.Ce projet nous permettra ainsi de mener 50 études (chaque étude permettant de tester l'efficacité de 3 candidats médicaments ou de 3 doses d'un même candidats) sur 5 ans dans nos 4 modèles d'autisme.
Bénéfices attendus
A court terme, les procédures mises en œuvre permettront de caractériser les différents modèles d’autisme chez la souris et d’évaluer la capacité de nouvelles entités pharmacologiques à moduler les symptômes autistiques observés. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques indispensables au processus de développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests cliniques.
Procédures
Des souris femelles gestantes vont recevoir une unique injection d’un produit pharmacologique afin d'obtenir une descendance présentant des symptômes proche des troubles du spectre autistique. La détermination des symptômes autistiques chez les souris se fera grâce à une série de tests comportementaux (activité locomotrice, sociabilité, anxiété, compulsivité, mémoire…). Ces tests seront d’une durée maximale de 30 minutes par animal et par jour, et dans la limite de 15 tests sur 5 mois. La majorité des tests se fera sur une seule journée, avec un seul test par semaine, et au maximum une même souris sera testée sur 5 jours consécutifs. Une administration de candidats médicaments sera effectuée avant chaque test, avec dans la majorité des tests une seule administration par semaine, pouvant aller jusqu’à 4 par semaine dans le cas d’un test. Les délais d’administration avant les phases de test seront de 0 à 4h. Pour chaque administration une courte contention de quelques secondes sera nécessaire. Pour un test impliquant une dérogation de la mise à jeun, les animaux seront mis à jeun pendant maximum 20h. Dans un autre test impliquant une dérogation à l’hébergement, les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une période maximale de 23 jours (incluant une phase d’habituation aux conditions expérimentales d’au moins 7 jours).
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les souris, on aura le stress de la courte contention le temps de l’administration de produits, qui pourra également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. Un test de comportement nécessitera que les souris soient hébergées en cages individuelles, ce qui est source de stress pour les souris qui sont des animaux sociaux. Cependant, l'enrichissement sera maintenu (appareil de nidification...) ainsi que le contact visuel, olfactif et auditif avec les congénères afin de limiter ce stress. D’autres tests comportementaux utilisés pour caractériser les symptômes autistiques de nos modèles souris pourront par ailleurs induire d’autres types de stress brefs de durées maximales inférieures à 30 minutes. De plus, dans le cadre d’un protocole spécifique, les souris pourront être soumises à une courte période de restriction alimentaire. Pour un autre protocole, la lumière et le bruit ambiant seront forts pour motiver la recherche d’un refuge dans un labyrinthe, et seront donc source de stress chez les animaux. De plus, un protocole comprend des stimuli aversifs qui sont susceptibles de causes une douleur passagère chez les rongeurs.
Devenir
Les femelles ayant reçu un traitement pharmacologique durant la gestation sont mises à mort après sevrage des petits. En effet, ces femelles ne peuvent pas être incluses dans les procédures car elles ne développent pas de troubles autistiques. A la fin de tous les tests comportementaux et neurochimiques toutes les souris appartenant à nos 4 modèles autistes sont mises à mort, puisqu’une analyse des contenus en neurotransmetteurs dans leur cerveau (nécessitant une mise à mort) pourra être réalisée dans le cadre d’une procédure de ce projet, et si ce n’est pas le cas elles ne pourront être réutilisées.. Seules les souris utilisées comme stimulus social (et n’ayant subi aucun traitement) dans un de nos tests comportementaux pourront être réutilisées dans d’autres projets au sein du centre de recherches.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur les troubles du spectre autistique dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. La nature des troubles du spectre autistique mettant en jeu des processus complexe et intégré qui requière la mise en place de modèles in vivo afin de pouvoir apporter des données comportementales et une efficacité potentielle d’un candidat médicament.
Réduction
Un effectif minimum de 16 souris par groupe expérimental est prévu pour la robustesse des tests statistiques, au vu de la variabilité attendue du comportement des rongeurs dans nos tests comportementaux. Ces tests statistiques nous permettront en effet de déterminer pour chaque expérience s’il existe bien une différence entre notre groupe contrôle et notre/nos groupe(s) traités avec des composés pharmacologiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement (tunnel, igloo, appareil de nidification…) et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Seule un test comportemental nécessite un hébergement en cages individuelles des souris et toujours avec un enrichissement maintenu et un contact visuel et olfactif avec des congénères. Autant que possible, les animaux seront placés de manière transitoire dans des cages de transfert individuelles après l’administration des produits et/ou le test afin de réduire le stress induit par le replacement de l’animal au sein de ses congénères. Lors du change des cages hebdomadaire, les animaux font l’objet d’un suivi par l’expérimentateur avec entrée des observations (et des éventuelles action prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-Etre Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux.. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à une familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et aux dispositif, phase de familiarisation aux manipulations...). De plus, des points limites adaptés (impliquant l'arrêt des expériences sur l'animal concerné), suffisamment prédictifs et précoces, ont été définis afin de limiter la douleur des animaux à son minimum.
Choix des espèces
La souris est déjà grandement caractérisée d’un point de vue comportemental et neurochimique et possède un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez la souris et les caractéristiques du comportement humain. Cette espèce est la plus couramment utilisée pour évaluer les troubles du spectre autistique. De plus, la souris est une espèce pour laquelle il est possible d’avoir des effectifs permettant d’avoir une robustesse des résultats statistiques, et pour laquelle les quantités nécessaires de lots de recherche synthétisés par la chimie sont minimes. Dans deux de nos modèles d’autisme induits pendant la gestation, les injections de produits se font entre le 9ème et le 15ème jour de gestation, d’après les données de recherche qui suggèrent qu’ils s’agit d’une fenêtre critique pour l’induction des symptômes autistiques dans la descendance. Les études comportementales et/ou neurochimiques menées sur la descendance dans ces deux modèles, mais également dans nos deux modèles génétiques de l’autisme, se feront sur des souris jeunes adultes à partir de 7 semaines (animaux sevrés depuis plus de 3 semaines et suffisamment âgés pour avoir un comportement social élaboré).
Rôle des cellules dendritiques dans le développement et la progression du cancer du pancréas
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 442 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune ouverte au niveau de l'abdomen pour recevoir une injection de cellules cancéreuses directement dans le pancréas. 244 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, les 2 198 autres d'un niveau modéré. À la chirurgie s'ajoutent jusqu'à cinq séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie et seize gavages, tandis que la tumeur pancréatique provoque des douleurs abdominales et, chez quelques individus, des métastases au foie ou au côlon. Le porteur vise l'identification de cibles moléculaires susceptibles d'améliorer un jour la réponse à la chimiothérapie, dans un cancer dont il rappelle qu'il a le plus mauvais taux de survie à cinq ans.
Objectifs
Le cancer du pancréas a le plus mauvais taux de survie à 5 ans de tous les types de cancer et est souvent résistant à la chimiothérapie classique. Il est donc urgent de trouver des options thérapeutiques innovantes. Les tumeurs sont des systèmes complexes constitués d'une multitude de populations cellulaires immunitaires et non immunitaires différentes, qui forment ensemble le microenvironnement tumoral. Au cours de la dernière décennie, il est devenu évident que les cellules dendritiques jouent un rôle clé dans l'initiation des réponses immunitaires anti-tumorales en absorbant les antigènes tumoraux et en amorçant les cellules T cytotoxiques dans les ganglions lymphatiques. Cependant, les études les plus récentes montrent que les cellules dendritiques sont généralement sous-représentées dans le microenvironnement tumoral de différents cancers et qu'elles sont peu performantes. Chez l'homme, les patients présentant un nombre élevé de cellules dendritiques dans le microenvironnement tumoral ont une meilleure survie et une meilleure réactivité au traitement, quel que soit le type de cancer en question. Cependant, le mécanisme qui cause la rareté et le dysfonctionnement des cellules dendritiques dans le microenvironnement tumoral est inconnu. L'objectif du projet est donc de comprendre l'hétérogénéité et la composition du microenvironnement de la tumeur pancréatique et la manière dont cela affecte la fonction des cellules dendritiques en ce qui concerne le développement et la progression de la tumeur. Sur le plan technique, une technologie de pointe permettra de caractériser la composition et le positionnement des cellules immunitaires dans le microenvironnement de la tumeur pancréatique au cours des différentes étapes de l'apparition et du développement du cancer dans un modèle de souris couramment utilisé pour le cancer du pancréas. L'objectif final est d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles permettant d'améliorer l'efficacité anti-tumorale des thérapies actuellement disponibles et de nouvelles options thérapeutiques centrées sur les cellules dendritiques.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous visons à caractériser les cellules immunitaires et en particulier les cellules dendritiques dans le microenvironnement tumoral de l'adénocarcinome pancréatique à différents stades de l'apparition et du développement du cancer. Les cellules dendritiques sont souvent sous-représentées dans le microenvironnement tumoral et ne parviennent pas à exercer leur fonction normale, à savoir la présentation d'antigènes dérivés de la tumeur aux cellules immunitaires T dans les ganglions lymphatiques et l'induction de réponses immunitaires antitumorales. Notre objectif est d'identifier les interactions entre les cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral qui sont à l'origine de la rareté et du dysfonctionnement des cellules dendritiques dans l'adénocarcinome pancréatique. Ensuite, nous utiliserons les connaissances acquises pour sélectionner des cibles moléculaires potentielles qui pourraient aider à améliorer la réactivité à la chimiothérapie et à la thérapie par 'checkpoint' immunitaire.
Procédures
Les animaux auront une injection chirurgicale de cellules dans le pancréas. Durée 15 min par animal, sous anesthésie générale et analgésie adaptée.. Les animaux auront des injections d'analgésiques en sous-cutanée (3 en tout) Avant les injections sous-cutanées, un anesthésique local sera utilisé pour anesthésier la peau. Imagerie in vivo : une fois par semaine, durée 15 min par animal, (n=5 au maximum) sous anesthésie générale, avec injection d'agent pour la luminisecence (1 fois par séance, sous anesthésie générale). Gavage oral pour certaines souris : deux fois pendant des jours consécutifs, 8 sessions, soit 16 gavages, 1 min par animal. Prises de sang : un animal par groupe sera prélevé sous anesthésie générale, 1 fois, durée 3 minutes.
Impact sur les animaux
La chirurgie d'injection de cellules dans le pancréas induira par elle même des nuisances légères dues à la préhension puis à la cicatrisation de la plaie (inconfort, douleur légère). La croissance des tumeurs dans le pancréas induira pour la majorité des individus des nuisances modérées (potentiellement : douleurs abdominales) du fait du suivi clinique et en imagerie (arrêt de la procédure à une taille limitée). Pour certains individus (rares), il pourra y avoir des métastases hors du pancréas (foie, colon). Dans, ce cas, les conséquences pourraient être éventuellement sévères (douleurs, anorexie potentielle). Le nuisances liées aux gavages, injections et prises de sang seront légères et temporaires (inconfort, stress temporaires).
Devenir
Tous les animaux participant à cette étude subiront une chirurgie abdominale pour introduire l'adénocarcinome pancréatique. Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever la tumeur et différents organes (sang, ganglions lymphatiques) pour différents types d'analyses immunologiques. La réutilisation des animaux n'est pas possible.
Remplacement
Ce projet nécessite l'établissement de l'adénocarcinome pancréatique dans toute sa complexité au niveau systémique. À l'heure actuelle, les approches organoïdes (= 3 D structure composée de cellules et ressemblant à un organe) existantes pour l'adénocarcinome pancréatique ne parviennent pas à reproduire la diversité des cellules immunitaires infiltrant et existant dans le microenvironnement tumoral. En outre, le projet nécessite la présence de une formation de cellules sanguines dans la moelle osseuse, d'une circulation sanguine et de ganglions lymphatiques. Dans notre cas, cela est important car les cellules dendritiques proviennent de la moelle osseuse et atteignent le pancréas via la circulation sanguine. Après avoir absorbé les antigènes tumoraux, les cellules dendritiques migrent de la tumeur vers les ganglions lymphatiques pour induire des réponses immunitaires antitumorales. Nous rechercherons régulièrement des stratégies de remplacement dans la littérature. De futures questions scientifiques, par exemple l'essai de médicaments qui ciblent les cellules ou les molécules identifiées dans ce projet, pourraient permettre de passer à une approche in vitro d'organoïde 3D à l'avenir.
Réduction
Nous avons pris en compte de multiples facteurs qui nous permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour répondre aux questions scientifiques sous-jacentes. Tout au long du projet, nous adhérons à des normes largement acceptées dans la littérature internationale et continuons à réviser nos approches. Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expérimentaux est maintenu aussi bas que possible afin de pouvoir tirer des conclusions valables et significatives des expériences proposées. En outre, pour répondre à nos questions scientifiques, nous utiliserons des méthodes à haut débit impartiales qui maximisent les connaissances acquises à partir d'une petite cohorte d'animaux. En outre, nous planifierons et exécuterons les expériences de manière réfléchie afin de combiner le plus grand nombre possible de tissus d'intérêt et de groupes de contrôle. Grâce à ces stratégies, nous visons à réduire le nombre d'animaux au minimum, tout en garantissant des résultats scientifiquement pertinents.
Raffinement
Des contrôles seront effectués quotidiennement. En outre, les chercheurs évalueront fréquemment (deux fois par semaine) les souris sur le plan clinique selon les critères définis précis. Les critères scientifiques de suivi sont atteints avant que la souffrance ne dépasse les points limites définis par l’éthique. En détail, les critères scientifiques de suivi sont sélectionnés pour couvrir chaque étape du développement de la tumeur. Les points temporels précoces et intermédiaires sont sélectionnés pour étudier le remodelage des tissus et l'établissement de la tumeur. Les points temporels longs (> 28 jours) sont sélectionnés pour assurer la croissance de la tumeur. Quand le point limite est atteint, les souris sont immédiatement retirées de l'étude . En ce qui concerne la manipulation des souris, celles-ci disposeront de suffisamment de temps pour s'acclimater à leur nouvel environnement, y compris pour entrer en contact avec les chercheurs avant le début des expériences. Nous appliquerons des méthodes visant à réduire le stress induit par la manipulation des souris, par exemple en évitant de les attraper par la queue et en optant plutôt de les recuperer aux creux des de nos mains ou tunnels. Les procédures seront effectuées dans un environnement stérile et des mesures appropriées seront prises pour éviter les infections post-procédure. L'anesthésie et l'analgésie seront pratiquées chaque fois que nécessaire pour réduire le stress et la douleur. Dès que les souris montrent de l'inconfort, la fréquence de surveillance sera augmentée et des mesures seront prises pour soulager le stress/la douleur. Les cages contiendront des enrichissements sous la forme de sizzlenest et de maisons ou tunnels en carton. Après le début de l'expérience (= injection de cellules tumorales), les souris resteront dans leur habitat habituel et seront continuellement hébergées en groupes sociaux.
Choix des espèces
- grande similitude avec l'homme en ce qui concerne la génétique et la complexité du système immunitaire - disponibilité d'une large gamme de modèles de souris génétiquement modifiées - disponibilité d'un modèle de tumeur murine bien établi - large éventail de techniques de laboratoire établies pour les souris Souris sexuellement matures, 8 et 12 semaines. Il est nécessaire d'utiliser des souris sexuellement matures entre 8 et 12 semaines pour s'assurer que a) la taille et le poids des souris sont suffisamment élevés pour supporter la croissance de la tumeur, b) la taille du pancréas est suffisamment grande pour l'injection de cellules tumorales et la croissance de la tumeur, c) le système immunitaire est mature.
Etude des effets de la défaite sociale sur le sommeil et des mécanismes neuronaux sous jacents chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Choisies pour leur comportement territorial pleinement développé, des souris CD1 de neuf à quatorze semaines sont mises face à d'autres souris mâles, cinq minutes durant, pour leur infliger une défaite sociale. 1 275 souris vont être utilisées au total, dont 806 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies crâniennes sous anesthésie, l'une de deux heures et l'autre de quatre à six heures, l'implantation d'électrodes et de fibres optiques, cinq prélèvements de sang à la queue, puis des enregistrements de dix heures pendant son sommeil. Toutes sont tuées, pour prélever leur cerveau ou vérifier les sites d'injection.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre l’impact du stress sur le sommeil, en particulier le sommeil paradoxal, souvent perturbé dans les troubles psychiatriques comme le stress, l’anxiété et les troubles du stress post-traumatique. Nous utilisons un modèle de “défaite sociale” chez la souris, qui reproduit des symptômes similaires à ceux observés chez les humains souffrant d’anxiété. L’objectif est de déterminer comment ce stress affecte le sommeil en étudiant l’activité de cinq types de cellules cérébrales réparties dans des régions spécifiques du cerveau connues pour réguler le sommeil et le stress. Des techniques avancées seront utilisées pour observer et manipuler l’activité de ces cellules avant, pendant et après une situation de stress, afin de mieux comprendre leurs rôles dans les troubles du sommeil liés au stress.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à clarifier comment le stress perturbe le sommeil, en identifiant les cellules cérébrales impliquées. Ces connaissances sont cruciales pour développer de nouveaux traitements pour les troubles du sommeil et les maladies psychiatriques associées, telles que la dépression et le syndrome de stress post-traumatique. En comprenant mieux les mécanismes du sommeil, nous espérons améliorer la qualité de vie des personnes touchées par ces troubles.
Procédures
Les animaux seront soumis à quatre types d’interventions principales : prélèvements sanguins, chirurgies, et une procédure de stress psychosocial couplée à des enregistrements comportementaux et physiologiques. 1/ Prélèvements sanguins : Ces prélèvements rapides (moins de 5 minutes) se feront au niveau de la queue, trois fois au maximum sur une seule journée avant le stress, puis à deux moments précis après celui-ci (1 heure et 8 heures). Cette approche permet de suivre les réponses physiologiques au stress tout en minimisant les manipulations. 2/ Chirurgies : Deux interventions sous anesthésie générale sont prévues pour la majorité des animaux. La première est une intervention préparatoire d’environ 2 heures. La seconde, plus complexe, réalisée au moins 7 jours plus tard, dure entre 4 et 6 heures. 3/ Stress psychosocial : certains groupes d’animaux participeront à une session unique d’interaction sociale contrôlée pour induire un stress modéré. 4/ Enregistrements comportementaux et physiologiques : Après une phase d’habituation post-chirurgicale, des enregistrements de 10 heures seront réalisés, principalement durant le sommeil des souris. Ces enregistrements seront répétés après l’exposition au stress, sur une durée totale ne dépassant pas 10 semaines après la chirurgie. Enfin, tous les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues concernent l’implantation d’électrodes, de fibres optiques, et l’usage d’implants. Ces procédures, couramment pratiquées, ont démontré une excellente tolérance chez les animaux, sans inconfort significatif ni modifications comportementales. Cependant, certaines nuisances pourraient apparaître: - Court terme (0 à 24h après la chirurgie) : Les risques incluent les réactions à l’anesthésie, l’hypothermie, et les hémorragies, tous systématiquement gérés par nos procédures opératoires. - Moyen terme (1 à 7 jours) : Les risques sont liés à des infections locales du tissu cérébral ou à l’ischémie suite à l’implantation d’électrodes ou de fibres. Nos suivis montrent une tolérance élevée des implants et des électrodes, avec un risque très faible d’infection ou de lésion cérébrale. - Long terme (au-delà de 15 jours) : Bien que l'implantation puisse théoriquement induire des nuisances liées à la présence physique de l'implant, telles que des chocs ou des difficultés de mouvement, notre expérience montre que ces événements sont rares. L'isolement nécessaire à la protection des implants peut conduire à des répercussions émotionnelles. Cet isolement est géré avec des périodes d'interaction sociale sous supervision pour maintenir un équilibre social. Les implants sont conçus pour être légers et compacts. Cette conception minimise tout désagrément et assure que la liberté de mouvement des animaux reste intacte. L'usage de câbles connectant l'implant au matériel d'enregistrement, bien que potentiellement restrictif, est attentivement géré à travers une surveillance constante durant les sessions d'enregistrement. Cette approche permet d'ajuster le dispositif en temps réel pour éviter tout inconfort, assurant une acclimatation progressive des souris au système. Dans le cadre du protocole de défaite sociale, la souris testée peut être exposée à un risque de blessure lors de l’interaction avec une souris dominante. Cependant, une surveillance attentive pendant les 5 minutes d’exposition permet d’intervenir rapidement pour prévenir toute violence excessive, assurant ainsi la sécurité des souris. Nos méthodes éprouvées garantissent un contrôle efficace des interactions, ce qui permet de collecter des données fiables sur le comportement induit par le stress.
Devenir
À l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés, certains pour permettre la récupération des cerveaux en vue d’analyses histologiques, et d’autres pour vérifier avec précision les sites d’injection.
Remplacement
Notre objectif est d’étudier les mécanismes neuronaux responsables de l’adaptation des états de vigilance après un stress. Ces études ne peuvent pas, pour le moment, être réalisées in vitro, ex vivo ou in silico. Les invertébrés, avec leur système nerveux simplifié, ne fournissent pas non plus un modèle adéquat pour notre étude. Nous examinons des réponses électrophysiologiques et des paramètres physiologiques essentiels, tels que la respiration et le rythme cardiaque, qui nécessitent un organisme complexe et proche physiologiquement de l’être humain pour des comparaisons pertinentes. Les comportements spécifiques, les cycles de sommeil, et l'existence de souris génétiquement modifiables font de ce modèle le plus adapté pour explorer l'impact du stress sur le sommeil. La souris est donc indispensable pour notre projet, étant le seul modèle qui satisfait à l'ensemble de ces exigences.
Réduction
Afin de minimiser l’utilisation d’animaux, nous améliorerons l’efficacité des différentes procédures chirurgicales et le suivi longitudinal des animaux. Nous couplerons également les différentes techniques à l’analyse électrophysiologique systématique. Cela nous permettra d’avoir des données complémentaires pour chaque souris. L’utilisation de différents sites d’implantation des électrodes nous permet de récolter un nombre conséquent de données par animal, permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour répondre à différentes questions. Quand cela est possible scientifiquement, les animaux sont utilisés dans différentes conditions expérimentales (condition sans stress vs après stress) afin qu’ils soient son propre contrôle et ne pas doubler le nombre d’animaux. Le nombre d'animaux requis pour ces expériences sera réduit au minimum nécessaire pour pouvoir réaliser des tests statistiques à partir de nos résultats avec une puissance suffisante. Étant donné que nos résultats dépendent du taux de succès des expressions des constructions permises grâce aux injections virales, de la qualité des signaux recueillis par les électrodes implantées, de la bonne position des fibres et de la qualité des signaux fluorescent obtenues, nous nous attendons à un taux global de succès situé au alentour de 70%. Ce chiffre prend en compte l’implantation optimale des électrodes, le maintien de l’intégrité du connecteur et de la fenêtre crânienne et la variabilité des expériences comportementales. Actuellement, le comportement de défense de territoire, essentiel au protocole de défaite sociale, n'est pas clairement établi chez les femelles, nous conduisant à utiliser uniquement des souris mâles. Cette spécificité réduit davantage le nombre d'animaux nécessaires à notre étude.
Raffinement
- Une semaine avant la chirurgie, les animaux seront acclimatés pour réduire le stress. Une manipulation quotidienne sera réalisée pour les habituer aux interactions humaines. Leur environnement sera enrichi par du coton, un dôme et des tubes pour leur offrir un confort optimal. - Les interventions chirurgicales respecteront rigoureusement les normes d’anesthésie et d’analgésie. Une prise en charge spécifique de la douleur sera assurée pendant une semaine de convalescence, avec un suivi quotidien pour détecter et traiter tout signe de douleur post-opératoire. - Si une souris présente des signes de malaise ou un comportement anormal, une évaluation sera effectuée pour déterminer si des analgésiques ou, dans les cas graves, une euthanasie sont nécessaires. En cas d’infection, un traitement adapté sera administré. - Les implants utilisés sont conçus pour être légers et compacts, minimisant tout inconfort et préservant la liberté de mouvement des animaux. Pendant les sessions d’enregistrement, les câbles connectant l’implant au matériel sont surveillés en permanence, permettant des ajustements en temps réel pour éviter toute gêne et favoriser une acclimatation progressive des souris. - Dans le protocole de défaite sociale, les souris sont exposées à une souris dominante, ce qui peut présenter un risque de blessure. Pour limiter ce risque, la phase d’exposition directe est strictement limitée à 5 minutes, avec une surveillance constante pour prévenir toute violence excessive et garantir la sécurité des souris. Si une blessure survient malgré ces précautions, la souris sera immédiatement replacée dans sa cage, et la plaie désinfectée. La blessure sera surveillée, et un vétérinaire consulté en cas de cicatrisation difficile ou d’infection. - Les souris seront hébergées individuellement dans un environnement enrichi. Si des signes d’anxiété persistante ou d’inactivité sont observés, tels qu’une réduction de la mobilité, de l’apathie, un isolement comportemental ou une posture passive, un enrichissement supplémentaire sera ajouté (matériaux à ronger, sciure pour fouissage). Une manipulation humaine douce et régulière sera également effectuée. Si les symptômes persistent, des sessions d’interaction contrôlée seront organisées avec un congénère de même sexe et de la même fratrie.
Choix des espèces
Les rongeurs, en particulier les souris, sont privilégiés dans la recherche comportementale et physiologique, grâce à leur cognition complexe et leur similitude fonctionnelle avec les humains. La souris se distingue par sa capacité d'adaptation rapide, ce qui la rend particulièrement appropriée pour nos études. Cette espèce bénéficie également d'un vaste corpus de données électrophysiologiques préexistantes et d'un éventail étendu d'outils pharmacologiques et de modèles génétiques. Cette richesse de ressources facilite l'intégration avec les recherches antérieures et contribue à une réduction globale du nombre d'animaux nécessaires. De plus, les avancées en génétique de la souris permettent des manipulations ciblées des réseaux neuronaux, offrant des possibilités inégalées par d'autres modèles et essentielles pour approfondir notre compréhension des mécanismes en question. Les procédures chirurgicales seront réalisées chez des animaux de 6 à 8 semaines, âge où le développement du cerveau et du crâne est stabilisé, garantissant des coordonnées d’injection précises et cohérentes. Les enregistrements d’activité cérébrale se limiteront à 10 semaines après l’implantation des électrodes, soit jusqu’à 4 mois. Cette durée est essentielle pour préserver une qualité de signal constante et éviter les variations liées à l’usure des implants. De plus, cette limite prend en compte l’évolution de l’architecture du sommeil avec l’âge, ce qui pourrait altérer la comparabilité des données. Les souris de la lignée CD1 dominantes auront entre 9 et 14 semaines, âge où leur comportement social et territorial est pleinement développé. Cela garantit des interactions sociales standardisées et réduit les variations dues à l’immaturité ou à des changements physiologiques chez des animaux trop jeunes ou trop âgés.
Activité interaréale pendant l’apprentissage de la locomotion et de l’orientation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées une ou deux fois du crâne sous anesthésie, certaines subissant en plus une intervention de deux heures pour mesurer leur activité musculaire, 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse histologique du cerveau. Elles enchaînent ensuite une quinzaine de sessions d'enregistrement de trente à quarante minutes, jusqu'à deux par jour, la tête fixée et les mouvements limités. Le projet cherche à comprendre comment le cervelet et le cortex coordonnent la marche et l'orientation dans l'espace. Une partie des souris est hébergée seule pour protéger les implants, sans que le RNT précise combien ni pendant combien de temps, et aucun des tests comportementaux annoncés n'est nommé.
Objectifs
Dans ce projet, nous étudierons l'orientation spatiale et le contrôle moteur, ainsi que l'intégration multisensorielle et les transformations sensorimotrices nécessaires à ces processus. Nous étudierons comment le cerveau code et combine les informations provenant de sources internes et externes pour percevoir l'environnement, produire un sens de l'orientation et exécuter les réponses comportementales appropriées. Nous utilisons des approches expérimentales complémentaires à plusieurs niveaux chez les rongeurs, au niveau des cellules et des circuits in vivo. Avec nos expériences, nous voulons répondre aux questions suivantes: Comment l'activité cérébelleuse et l'interaction entre le cervelet et le cortex cérébral génèrent-elles une production motrice coordonnée et facilitent-elles l'orientation ? Comment l'activité neuronale se traduit-elle par une activation musculaire et, à son tour, par une production motrice ? Comment des sous-classes de neurones spécifiques contribuent-elles au contrôle moteur et à l'orientation ? Nous visons à étudier l'activité de la population neuronale liée aux schémas de marche spatiale et à l'orientation de la tête, révélant ainsi les mécanismes cérébraux du contrôle moteur, de la coordination, de la navigation spatiale, de la cognition et de l'apprentissage.
Bénéfices attendus
Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles qui permettent au cerveau de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment le cerveau est capable d’orienter et d’orchestrer le mouvement dans des conditions physiologiques. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre un diagnostic précoce et un traitement des pathologies neurologiques liées à des dysfonctionnements moteurs et à des déficits d'orientation.
Procédures
Dans cette étude, les souris participeront à l’une des trois approches expérimentales suivantes : Approche 1 : Étude de l’activité cérébrale pour comprendre le rôle du cervelet et de son interaction avec le cortex dans le contrôle des mouvements et l’orientation dans l’espace. Approche 2 : Enregistrement simultané de l’activité cérébrale et de l’activité musculaire pour explorer comment le cerveau contrôle les mouvements. Approche 3 : Analyse des liens de cause à effet entre l’activité cérébrale et les comportements des souris. Selon l’approche, les souris seront soumises à une ou deux interventions chirurgicales pour permettre la mesure optique ou électrique de l'activité neuronale. Ces interventions chirurgicales durent 1 heure. Quelques souris subissent une intervention chirurgicale pour mesurer l'activité musculaire qui dure 2 heures. Les souris participeront ensuite à environ 15 sessions de tests comportementaux pendant lesquelles leurs mouvements, leur activité cérébrale et, dans certains cas, leur activité musculaire ou leurs réponses optogénétiques seront mesurés. Chacun de ces enregistrements dure de 30 à 40 minutes, avec un maximum de deux par jour. Pour éviter que leurs congénères n’endommagent les dispositifs implantés, certaines souris seront hébergées individuellement après l’implantation. Pendant les enregistrements, les animaux seront placés de manière à limiter leurs mouvements pour garantir la précision des mesures.
Impact sur les animaux
Les chirurgies prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 2 à 3 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. La fixation de la tête pendant l'exécution d'une tâche motrice complexe peut induire un état de stress chez l'animal. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement anormal indésirable. Pour éviter cette situation, chaque animal subira un protocole d'habitutation progressive sur une période de 2 à 3 jours comprenant une augmentation progressive du temps passé en situation de tête immobilisée.
Devenir
Le cerveau des 500 animaux est utilisé après le protocole expérimental pour effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
L'intégration des informations sensorimotrices pendant la navigation spatiale libre implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur et l'orientation, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant et libre de ses movements afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. : Il s’agit d’un projet de neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'imagerie in vivo est réalisée avec des implants chroniques. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de nombreuses sessions d'enregistrement. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques que nous appliquerons seront adaptés aux analyses.
Raffinement
Les animaux de l'étude optogénétique sont gardés dans des cages dans l'animalerie avec leurs congénères. Les animaux sous examen électrophysiologique doivent être hébergés seuls après l'étape d'implantation afin de protéger l'implant des dommages causés par les congénères. Les cages seront enrichies de roues de course et des rouleaux pour se cacher. Les souris seront maintenues avec eau et nourriture ad libitum. Leur état général sera surveillé de façon quotidienne pendant toute la durée du protocole. Pour éviter toute souffrance, tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance régulière de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative. En combinant souris transgénique et injections virales nous serons en mesure de mesurer l’impact fonctionnel d’une population neurale spécifique. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où leur activité motrice est arrivée à son niveau mature (>P30) et pendant les deux mois qui suivent. À cet âge, la locomotion est entièrement développée et les structures cérébrales impliquées dans la locomotion et l'orientation sont matures.
Etude des réponses immunitaires et de la diminution de l’infection chez des souris vaccinées contre Besnoitia besnoiti
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Éveillées, les souris subissent quatre prises de sang, deux ou trois instillations de vaccin dans le nez et, pour certaines, une ou deux injections dans le derme et un poinçon à l'oreille. 73 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour un vaccin destiné aux bovins contre la besnoitiose, une maladie parasitaire des troupeaux. Le porteur écrit qu'"aucun modèle animal, même chez les bovins, ne permet de reproduire la pathologie", et que le choix de la souris "peut se justifier" par la présence du parasite chez des souris sauvages. Il prévoit de mesurer la multiplication du parasite et la baisse de la charge parasitaire, sans qu'aucune procédure ne décrive l'infection des souris.
Objectifs
La besnoitiose, causée par le parasite unicellulaire Besnoitia besnoiti (B. besnoiti), représente une menace significative pour l’élevage bovin. Cette maladie entraîne des conséquences graves telles que l’infertilité, des atteintes cutanées, une perte de poids et une mortalité jusqu’à 10% au sein des troupeaux. Maladie ré-émergente en Europe, la besnoitiose progresse du sud vers le nord en France. Les parasites présents dans la peau peuvent être transmis par l’intermédiaire d’insectes ou d’aiguilles avec une progression jusqu’à 20% de nouveaux animaux infectés par an dans les troupeaux touchés. Une transmission par ingestion de parasites présents dans l’environnement sous forme d’oocystes est également suspectée. Aucun traitement curatif n’est disponible en Europe et les moyens de lutte sont limités au dépistage et à l’élimination des animaux malades ou à l’application d’insecticides. Le développement d’un vaccin efficace offrirait aux éleveurs une meilleure stratégie de contrôle de cette maladie. Le but de ce projet est d’évaluer l’immunogénicité et l’efficacité d’un vaccin sous-unitaire à administration nasale et dermique contre la besnoitiose. Ce vaccin est constitué de protéines et de glycolipides de B. besnoiti associés à un muco-excipient à base d’amidon. Les souris seront immunisées par voie nasale seule ou par voie nasale puis par voie intradermique afin de déterminer la meilleure stratégie d’administration pour déclencher une réponse immunitaire optimale, tant systémique que locale (cutanée). En effet, la voie nasale d’administration du vaccin devrait déclencher une réponse immunitaire muqueuse, notamment du système respiratoire et de l’intestin, permettant une protection contre une infection orale. Cependant, il n’est pas certain que cette voie d’administration déclenche une réponse immunitaire protectrice contre une infection cutanée. Dans ce cas, une administration intradermique pourrait être nécessaire. Au total, 73 souris adultes seront nécessaires. Puisque le remplacement par des méthodes in vitro n'est pas envisageable en raison de la complexité du système immunitaire et de la nécessité d'étudier l'ensemble de ses réponses, le nombre de souris a été réduit au minimum requis pour obtenir des résultats significatifs. Les souris seront hébergées conformément aux directives européennes, avec un enrichissement (cachette, matériaux à ronger, renforcement positif alimentaire). Toute médication interférant avec la réponse immunitaire est proscrite.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la mise en évidence du développement d’une immunité protectrice contre Besnoitia besnoiti associée à un effet protecteur contre une infection par le parasite. Ces résultats sont essentiels pour envisager une vaccination de bovins, cibles du vaccin anti-besnoitiose.
Procédures
Les animaux vigiles subiront 4 prises de sang et 4 pesées à 2 semaines d’intervalle et recevront 2 ou 3 instillations par voie nasale à 2 semaines d’intervalle. Certains animaux seront soumis à 1 ou 2 administrations intradermiques à deux semaines d’intervalle et certains animaux seront identifiés une fois à l'oreille. Chacune de ces interventions dure moins d’une minute.
Impact sur les animaux
La contention nécessaire pour les administrations nasales et intradermiques ainsi que pour les prises de sang peut engendrer du stress. L’identification des animaux par poinçon à l’oreille peut entrainer une douleur locale temporaire. Les prises de sang peuvent entrainer un hématome ainsi qu’une douleur localisée temporaire. L’injection intradermique peut entrainer une douleur locale temporaire. L’administration du vaccin peut entraîner une inflammation.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin d'étudier les réponses immunitaires cellulaires induites par les différentes formulations vaccinales, de déterminer la capacité du parasite à se multiplier in vivo et de déterminer la protection induite par la vaccination en terme de réduction de la charge parasitaire.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucun modèle de remplacement capable de reproduire la complexité du système immunitaire et d'étudier l'ensemble des réponses immunitaires suite à une vaccination.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience acquise sur des projets de vaccination contre des parasites de la même famille. Les analyses statistiques seront faites sur les dosages des molécules produites par les cellules du système immunitaire et sur le nombre de parasites.
Raffinement
Les souris seront hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés à raison de 4 maximum par cage, dans un environnement enrichi permanent (de type igloo pour se cacher) ou ponctuel (de type carré en cellulose pouvant être dépouillé pour la confection d’un nid) après chaque procédure. Une habituation à la prise en main sera réalisée avant le début du protocole. Un renforcement positif sous forme de récompense alimentaire (par exemple : rondelle de banane séchée, popcorn…) sera appliqué après chaque utilisation d’aiguille. Les responsables du projet ont l’habitude de pratiquer les procédures mises en place. Des points limites sont déterminés en vue de mettre fin à d'éventuelles souffrances.
Choix des espèces
Les rares essais d’infection expérimentale par Besnoitia besnoiti sont peu concluants puisqu’aucun modèle animal, même chez les bovins, ne permet de reproduire la pathologie. De plus, le parasite n’est pas détecté chez tous les individus infectés lors d’une même expérience. Le choix de la souris peut se justifier par le fait que Besnoitia besnoiti a déjà été détecté chez la souris sauvage, que les parasites ont été localisés dans la cavité péritonéale et les organes internes après infection intrapéritonéale de souris et que les parasites présentaient la même morphologie chez des souris expérimentalement infectées que chez des bovins naturellement infectés. Animaux adultes. Cette expérience ne nécessite pas un stade de développement particulier.
Modèle murin d’immuno- thrombocytopénie (ITP)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Jusqu'à 21 prélèvements sanguins par animal sur douze semaines, plafonnés à 15 % du volume sanguin total sur 28 jours : 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une maladie auto-immune leur est déclenchée par jusqu'à quatorze injections d'anticorps dirigés contre leurs plaquettes, ce qui peut provoquer pétéchies, anémie, hématomes et saignements mal contrôlés. La plupart sont tuées pour prélèvement d'organes, 300 d'entre elles pouvant être réutilisées si elles n'ont reçu qu'une administration unique et n'ont montré aucun signe clinique. Le porteur, prestataire de services en recherche préclinique, range ce modèle dans le panel qu'il propose à ses clients pour évaluer des candidats médicaments avant les essais chez l'humain.
Objectifs
La thrombocytopénie immunitaire (ITP) est une maladie auto-immune hétérogène, caractérisée par la déplétion plaquettaire médiée par des cellules immunitaires. Cette pathologie est invalidante et potentiellement mortelle et résulte de la production d'anticorps antiplaquettaires entraînant une destruction accélérée des plaquettes et par conséquent un taux de plaquettes faible (thrombocytopénie). L’objectif de ce projet est d’utiliser un modèle murin permettant de reproduire les phénomènes de la thrombocytopénie le plus prédictif possible afin de refléter la pathologie chez l’homme et de pouvoir évaluer de nouveaux traitements. Le modèle consiste en l’injection d’anticorps dirigés contre des protéines plaquettaires chez des souris. Un suivi de la concentration plaquettaire dans le sang périphérique est fait pour confirmer le déclenchement de la maladie.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveaux composés thérapeutiques pour la recherche, spécifiquement dans des maladies médiées par le système immunitaire (inflammation, maladies auto-immunes, etc). Ce projet a pour finalité la mise au point d’un modèle chez la souris qui récapitule les aspects clés de l’ITP chez l’homme, et l’évaluation de l’efficacité de candidats médicaments. Ce modèle permettra de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à un modèle préclinique prédictif permettant de transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin résoudre ou réduire la pathologie.
Procédures
Les animaux seront pesés avant induction et l’étude durera au maximum 12 semaines. L’ITP est induite par un seul ou plusieurs traitements consécutifs (maximum 1 fois par jour pendant 7 jours consécutifs, pouvant être répété après une semaine de repos entre les différentes périodes d’induction, ou une fois toutes les 48h pendant maximum 4 semaines). Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par différentes voies. Le nombre, le volume et la fréquence d’administration suivront les recommandations de SBEA (Structure du bien-être animale). Des prélèvements de sang, d’urine ou de fèces pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 15 minutes si anesthésie). Le nombre et la fréquence des prélèvements seront adaptés à la durée de la procédure et suivront les recommandations du comité d’éthique. Le volume et le nombre de prélèvements sanguins seront ajustés de manière à ne pas dépasser 10% du volume sanguin total (VST) de l'animal par prélèvement. Sur 28 jours consécutifs, le volume total prélevé sera limité à 15% du VST (ou 20% si les animaux sont réhydratés), avec un maximum de 7 prélèvements. Pour les études de durée maximale de 12 semaines, jusqu'à 21 prélèvements seront faits (soit 7 prélèvement maximum sur 28 jours consécutifs). La technique la plus éthique sera systématiquement privilégiée, et ces recommandations pourront être adaptées en fonction des effets observés sur les animaux lors de la première expérience pilote.
Impact sur les animaux
Pour déclencher la maladie, les animaux recevront l’anticorps d’induction par voie IP ou IV en une seule injection ou plusieurs injections (maximum 14 injections d’induction de la maladie) ) espacées d’au minimum 24h, et des prélèvements de sang seront réalisés, ce qui pourrait induire une douleur et un stress léger à modéré. La douleur générée sera limitée à la piqure d’une aiguille. Les animaux pourront recevoir un traitement ce qui pourra générer une douleur et un stress modéré de très courte durée. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2 jours. Bien qu’il ne soit pas décrit de signes cliniques dans la littérature, nous ne pouvons pas exclure que des signes cliniques seront constatés sur les animaux suite à l’induction de la maladie (pertes de poids modérées, pétéchies, anémie modérée, tendance aux hématomes, saignements moins contrôlés) . Le protocole sera affiné lors de l’étape pilote afin de trouver une dose ne générant pas de signes cliniques invalidants.
Devenir
Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de différents organes, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt. Pour les animaux ayant reçu une administration unique de composé ou uniquement des injections de véhicule, n’ayant pas eu de signes cliniques, et n’ayant pas besoin de prélèvements terminaux pour atteindre l’objectif de l’étude pourront être réutilisés (Avec l’accord du vétérinaire).
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments car les étapes nécessaires au développement d’un médicament, pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global, ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.
Réduction
Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. En moyenne, une étude comprendra 50 animaux (au moins 20). Nous estimons effectuer environ 10 études par an sur 5 ans. Dans le modèle, il a été démontré que 5 à 10 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévues pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et prélèvements et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.
Raffinement
Le suivi des animaux (signes cliniques transitoires éventuels pendant l’induction de la thrombocytopénie immunitaire) sera documenté et détaillé dans la procédure. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en fonction de l’évolution de la connaissance du modèle. Si l’un les signes de douleurs persistent l’animal sera mis en observation et si nécessaire un traitement antalgique opioïde mis en place. Les actes peu stressants (administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress. Ces administrations/prélèvements sont réalisées par des techniciens formés dont les compétences ont été validées et suivant les recommandations vétérinaires et du comité d’éthique Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. Après les prélèvements sanguins, une compression sur le site de prélèvement sera effectuée pour favoriser la coagulation ; les animaux seront remis dans leurs cages après vérification de la bonne coagulation. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie.
Choix des espèces
- L’induction de l’ITP chez des souris est bien documentée dans la littérature. - Les modèles d’administration d’anticorps en intrapéritonéale ou intraveineuse pour l’induction de l’ITP chez des souris sont les plus utilisés dans le domaine et ressemblent le mieux à la maladie chez l’homme. - Pour ce modèle, diverses souches de souris immunocompétentes seront utilisées. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (au moins 6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient un poids et un système immunitaire mature pour faciliter l’induction de la maladie.