Procédures modérées
Évaluation de nouveaux traitements candidats pour le cancer du foie chez un modèle murin transgénique développant spontanément des carcinomes hépatocellulaires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Sous anesthésie, les souris passent jusqu'à un examen aux rayons X par semaine et cinq séances d'imagerie de 30 minutes au plus en 21 jours, et une partie reçoit des candidats médicaments par injection ou par voie orale jusqu'à deux fois par jour pendant 21 jours, éveillée et en contention. 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris transgéniques développent d'elles-mêmes des tumeurs du foie, parfois des métastases pulmonaires, à partir de 30 à 40 semaines selon leur génotype, et le projet teste sur elles de nouvelles combinaisons de traitements. Le porteur prévoit que les tumeurs peuvent causer une perte d'appétit et de poids, les anesthésies répétées des difficultés respiratoires, et la voie orale une irritation de l'œsophage. Les souris qui vont au bout des procédures sont tuées pour récupérer leurs tissus. Celles qui, sans tumeur, sortent du projet en bonne santé pourront être réutilisées dans un autre projet, et 80 sont déclarées réutilisées.
Objectifs
Le cancer du foie est le troisième cancer le plus mortel au monde. Sa prise en charge tardive et l’efficacité limitée de l’oncothérapie actuelle rendent inévitable l'acquisition d'une résistance aux médicaments et la formation de métastases, responsables du taux élevé de morbidité et de mortalité du cancer du foie. Il est donc urgent d'identifier des cibles et des combinaisons médicamenteuses puissantes et efficaces. Un modèle de souris unique génère spontanément un cancer du foie similaire au cancer humain en termes d’hétérogénéité des tumeurs, de résistance aux médicaments actuellement utilisés et d’interaction entre cellules cancéreuses et cellules immunitaires. Le modèle est également croisé avec d’autres souris, ce qui permet 1) d’avoir un modèle murin ayant les mêmes caractéristiques que les patients atteints de tumeurs du foie avec un type de mutation génétique spécifique ; 2) d’avoir un modèle où la fréquence et/ou le début de la formation des tumeurs est augmentée et/ou accélérée. Ainsi, ces modèles de souris de cancer du foie sont adaptés pour le criblage de nouvelles thérapies combinatoires dans un contexte de résistance aux médicaments actuellement utilisés. Le but de ce projet est d’évaluer de nouveaux candidats médicaments qui permettraient une meilleure réponse au traitement des tumeurs.
Bénéfices attendus
La détection et le traitement précoce du cancer du foie, ainsi qu’un suivi rigoureux, contribuent à augmenter l’efficacité des traitements. L’évaluation de nouveaux candidats-médicaments permet d’augmenter les taux de réponses et de cibler un maximum de la population atteinte du cancer du foie et ainsi de réduire le nombre de décès par an provoqués par ce cancer.
Procédures
Les animaux auront des imageries à rayons X (durée 4 minutes, sous anesthésie) une fois par semaine au maximum et des imageries fonctionnelles permettant de suivre le métabolisme ou la vascularisation(5 fois sur 21 jours, durée maximum de 30 minutes par imagerie, sous anesthésie). Une partie des animaux aura des administrations de candidats médicaments soit par injections soit par voie orale (maximum 2 fois pas jours pendant 21 jours, durée en moyenne 1 à 2 minutes, sur animal vigile en contention) et certain auront des prélèvements sanguins au niveau de la queue (2 fois maximum, sous anesthésie, 2min).
Impact sur les animaux
Au cours du projet, les animaux sont susceptibles d’expérimenter ce qui suit : (1) Douleur et inconfort : l’apparition spontanée de tumeurs du foie peut engendrer une diminution de l’appétit chez l’animal, conduisant à une perte de poids et à une augmentation du stress. Les traitements réalisés sur les animaux vigiles peuvent entraîner des petites plaies cutanées. (2) Les anesthésies gazeuses répétées peuvent entrainer des difficultés respiratoires lors de l’anesthésie, ainsi que des difficultés d’endormissement et de réveille au cours du temps. (3) l’administration des traitements par voie orale peut entrainer du stress dû à la contention de l’animale et une irritation de l’œsophage.
Devenir
Tous les animaux qui iront au bout des procédures seront mis à mort afin de récupérer les tissus d'intérêts et de pouvoir compléter l’études avec des expérimentations biologiques, biochimiques et moléculaires. Les animaux qui n'auront pas généré de tumeurs qui seront sortis du projet en bonne santé pourront être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
Des stratégies sont mises en place pour limiter l’utilisation des animaux : (1) Les études préliminaires sont réalisées sur des cellules et des mini-tumeurs en culture pour identifier les mécanismes clés et les cibles. (2) Seuls les traitements prometteurs sont ensuite testés sur des organismes vivants pour confirmer leur efficacité dans un contexte physiologique. Ce projet final nécessite un organisme entier : des souris génétiquement modifiées, qui est le modèle le plus adapté pour étudier les effets des traitements sur les tumeurs du foie.
Réduction
Dans cette étude, nous utiliserons des appareils d'imagerie adaptés à la taille des rongeurs, comme des scanners ou des caméras spécialisées, similaires à ceux utilisés chez les patients. Ces outils permettent de suivre l'évolution des animaux, notamment la croissance des tumeurs, sur plusieurs semaines et de recueillir différentes mesures. Cela réduit le nombre d'animaux nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. Pour limiter davantage le nombre d'animaux, nous avons calculé qu’un maximum de 10 par groupe suffira pour garantir des données exploitables. Enfin, chaque animal sera étudié au maximum en réalisant des analyses supplémentaires sur leurs tissus (foie, tumeurs) après l’étude.
Raffinement
Les injections intraveineuses et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse pour minimiser le stress des animaux et permettre un réveil rapide. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter l’hypothermie. Avant les traitements, une semaine d’habituation à la contention sera réalisée pour réduire leur stress. Les traitements nécessitant un gavage seront effectués avec une sonde vétérinaire adaptée, à embout arrondi, pour protéger l’œsophage et l’estomac. La technique « d’administration de médicament guidée par micropipette » sera utilisée si possible : les souris apprendront à boire du lait concentré, puis le médicament y sera mélangé, évitant ainsi le stress de la contention. Les souris, qui développent spontanément des tumeurs hépatiques et parfois des métastases pulmonaires, seront suivies par scanner et imagerie spécialisée. Une fois les tumeurs détectées, leur évolution sera surveillée chaque semaine. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié. En cas de signe de souffrance (difficulté à respirer, isolement, perte de poids), des compléments alimentaires ou des soins adaptés seront apportés. Si la situation ne s’améliore pas ou si la perte de poids dépasse 20 %, l’animal sera retiré du protocole et euthanasié rapidement pour éviter toute souffrance inutile. Les souris seront hébergées en groupes (5 maximum par cage), avec accès libre à la nourriture et à l’eau, dans des conditions enrichies (dômes, tubes, bâtons à ronger, matériaux pour faire un nid) et un cycle jour/nuit de 12 heures. Cela permet de limiter les comportements répétitifs et de favoriser leur bien-être.
Choix des espèces
Les modèles de souris transgéniques générés et étudiés : 1) récapitulent l’hétérogénéité du cancer du foie chez les patients ; 2) permettent de tester de nouvelles thérapies. Il représente par conséquent un modèle d’une grande valeur d’un point de vue expérimental pour mieux comprendre le cancer du foie et ainsi évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie humaine. Pour étudier la formation et l'évolution de tumeurs dans le foie et des tumeurs secondaires dans le poumon, les souris seront utilisées au stade adulte. Les premières tumeurs apparaissent entre 30 ou 40 semaines en fonction du génotype de souris utilisé. Elles sont donc utilisées à partir de ces stades.
Test d’efficacité d’une molécule pharmacologique sur un modèle murin de la Maladie de Niemann-Pick type C (NPC)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une partie d'entre elles porte une mutation qui reproduit la maladie de Niemann-Pick de type C1, avec perte de poids, perte de coordination motrice et une durée de vie moyenne de 125 jours. Selon les procédures, les souris reçoivent à partir de 10 jours de vie trois injections sous la peau puis une injection dans l'abdomen chaque semaine pendant 6 ou 12 semaines, et subissent des prises de sang sous anesthésie ainsi que des tests de coordination motrice, de marche, d'activité locomotrice et d'anxiété, et d'inhibition de la préimpulsion. Le traitement espéré pour les patients passe encore par un développement thérapeutique puis une preuve clinique chez l'humain. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de "modèles non-animaux" capables de reproduire une neurodégénérescence fatale. La molécule testée a été choisie au préalable sur des cellules.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de tester l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de maladie de Niemann-Pick de type C1 (NPC1), qui récapitule le tableau clinique de la pathologie humaine.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet nous permettra d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine. À plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir la preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de NPC1.
Procédures
Injections sous-cutanées (3/animal, 1 x par semaine, 1 min par injection) puis injections intrapéritonéales (1 x par semaine pendant 12 semaines, 1 min par injection), prélèvements sanguins (intracardiaque, 5 min par prélèvement sous anesthésie générale ; 3 fois à la veine temporale sous anesthésie gazeuse, 3 minutes par prélèvement). Tests comportementaux : Observations cliniques et évaluation des fonctions sensori-motrices 15 minutes chaque semaine (7 à 16 semaines d'âge), mesure de l'activité locomotrice et anxiété 5 fois 30 min, mesure des troubles de la marche (5 sessions de 3 jours, 5 minutes par jour), test de coordination motrice 4 fois 20 minutes, mesure de l'inhibition de la préimpulsion 3 fois 45 min. Amendements : injections intrapéritonéales : 1 x par semaine pendant 6 semaines pour l'étude précose ou 12 semaines pour l'étude tardive, 1 min par injection.
Impact sur les animaux
Les souris mutés présentent un phénotype dommageable ; ce modèle animal présente une perte de poids, une diminution de la coordination motrice, une mortalité prématurée avec une durée de vie moyenne de 125 jours. Pour la première procédure, ces animaux seront mis à mort suite à une anesthésie (nuisance légère). Pour la procédure deuxième, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées indusiant une légère nuisance (1 par semaine pendant 3 semaines). Pour la troisième, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées (1 par semaine pendant 3 semaines) puis 1 injection intrapéritonéale par semaine pendant 12 semaines induisant une nuisance modérée. Les souris subiront 3 prélèvements sanguins d’environ 3 minutes induisant une nuisance modérée. Amendements : Pour l'étude précose, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées induisant une légère nuisance (1 par semaine pendant 3 semaines) puis 1 injection intrapéritonéale par semaine pendant 6 semaines induisant une nuisance modérée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever les tissus en vue d'analyse post-mortem, excepté pour l'étude pilote ou seul le sang sera prélevé.
Remplacement
L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que les maladies neurodégénératives ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèles non-animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexes à l'œuvre dans la mise en place d'une neurodégénérescence fatale, comme dans la maladie de Niemann-Pick de type C1. Cependant, le choix de la molécule optimale testée dans cette étude a préalablement été réalisé sur un modèle cellulaire.
Réduction
Ce projet implique des souris homozygotes présentant la mutation induisant la maladie de NPC1 et des souris non mutés qui seront considérées comme des contrôles ne présentant pas la maladie de NPC1. Dans l’étude précoce, les groupes expérimentaux seront constitués comme suit : 5 souris homozygotes mutées traitées avec le véhicule et 5 souris contrôles traitées avec le véhicule, pour chaque sexe, seront nécessaires à la caractérisation préliminaire du modèle dans le laboratoire. Dix souris homozygotes mutées traitées avec le composé, 10 souris homozygotes mutées traitées avec le véhicule et 10 souris contrôles traitées avec le véhicule, pour chaque sexe, seront nécessaires à la vérification des caractéristiques décrites dans le papier princeps. Le nombre de souris défini dans l’étude précoce repose sur les conditions nécessaires optimales à l’analyse des biomarqueurs. Il intègre à la fois la taille des effets attendus (diminution de 80 % de la protéine NPC1 chez les souris mutés, effet du traitement 40-45 % espéré) et la variabilité technique connue (30 %). À chaque étape, la variabilité réelle obtenue sera calculée. Dans le cas où l’étude précoce mettrait en évidence une « surestimation » par rapport à la variabilité technique théorique, une réduction du nombre d’animaux lors de l’étude d’efficacité tardive sera envisagée. Pour l’étude d’efficacité tardive afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons décidé de ne pas réaliser de groupe contrôle non muté. Le groupe muté non traité permet d’évaluer les caractéristiques liées à la pathologie. Les résultats du groupe muté traité seront préférentiellement rapportés aux souris du groupe muté (point de départ de la pathologie). En cas de « situation optimale », les souris mutés sous traitement auront des niveaux de protéine NPC1 équivalents aux souris WT. Le choix de 16 animaux par groupe a été défini en fonction de la haute variabilité des tests comportementaux.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une étude toxicologique préliminaire a été réalisée afin de déterminer la dose maximale non toxique de la molécule à administrer aux animaux. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites, le cas échéant, pouvant entraîner l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, de boisson et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâton et balles à ronger). Si un animal présente un trouble locomoteur, de la nourriture mouillée et un biberon à longue tétine seront ajoutés à la cage. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique.
Choix des espèces
La souris est l’animal de choix pour la création et l’étude de modèles avec une perte de fonction d’un gène (mutation). De plus, la souris est un modèle animal adapté à l’étude de la locomotion, phénotype d’une dégénérescence neuronale. Enfin, il n’existe pas de modèles in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier un phénotype locomoteur et/ou la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. Le traitement avec la molécule médicament débutera à 10 jours post-natal et sera donné 1 fois par semaine. Dans la littérature, l'ensemble des études ayant testé l'efficacité de notre molécule dans différentes pathologies ont commencé le traitement avant le sevrage des animaux, c'est pourquoi nous allons suivre ce même schéma expérimental.
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
4 850 cochons vont être utilisés, chacun infecté volontairement par un agent pathogène, circovirus, virus du SDRP, grippe porcine, mycoplasme, rouget ou parvovirus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Prises de sang hebdomadaires, écouvillons nasaux et fécaux, température rectale relevée chaque jour rythment des épreuves qui durent de trois jours à quatre semaines. Les truies gestantes infectées par le parvovirus sont anesthésiées vers le quatre-vingt-dixième jour de gestation puis tuées, l'anesthésie provoquant la mort des fœtus par manque d'oxygène avant leur observation. Le porteur décrit le cochon comme un animal "sociable et intelligent", curieux et joueur, et 50 individus seulement seront réutilisés, tous les autres étant tués.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité de substances d’essai destinées au porc (comprenant notamment des animaux gestants et de jeunes animaux), après administration d’un agent pathogène (induisant le développement d’une pathologie). Les études d’efficacité après immunisation suivie de l’ administration de l’agent pathogène sont des obligations règlementaires menées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de différents guidelines (dont Veterinary International Conference on Harmonization VIGH Guidance Documents, Organisation mondiale de la santé animale OIE) et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. Elles servent à la constitution de dossier d’Autorisation d Mise sur le Marché (AMM). Avant de réaliser les études règlementaires d’efficacité par épreuve, il est nécessaire de mettre au point les modèles d’épreuve et parfois d’amplifier le pathogène in vivo pour constituer un stock suffisant de souche d’épreuve. Dans un but d’amélioration continue, en fonction de l’évolution des connaissances (apparition de nouvelles souches pathogènes, définition de nouveaux paramètres , …), de nouvelles études peuvent être réalisées pour optimiser le modèle d’épreuve. Cette optimisation permet d’obtenir un modèle plus fiable, plus reproductif et plus représentatif de la pathologie dans son développement réel. La connaissance des caractéristiques d’un vaccin en termes d’efficacité est nécessaire à l’évaluation du bilan risques/bénéfices avant sa mise sur le marché. Le projet décrit ici a pour but d’évaluer l’efficacité de substances d’essai destinées au porc (comprenant notamment des animaux gestants et de jeunes animaux), après administration d’un agent pathogène (induisant le développement d’une pathologie). La finalité des études menées au sein de ce projet est la mise au point de vaccins d’un niveau d’efficacité satisfaisant. Les vaccins sont essentiels en élevage afin de protéger les animaux contre les maladies infectieuses, de diminuer l’usage des antibiotiques et de garantir les performances zootechniques et économiques.
Bénéfices attendus
Ces études sont avant tout menées afin de répondre aux exigences du règlement UE 2019/6, de la Pharmacopée Européenne, et de différentes autres exigences réglementaires (VICH guidelines, OIE, …) voir d’exigences spécifiques à un pays (FDA, USDA , Pharmacopée Chinoise, …), tout en restant conforme à la Directive européenne 2010/63/UE relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. La finalité des procédures décrites dans ce projet est de valider l’efficacité de produits immunologiques en présence de pathogènes porcins représentant des maladies dont les effets sanitaire et économique sont souvent dévastateurs. La disponibilité de produits efficaces permet de contrôler plus efficacement la dispersion géographique d’une pathologie, ainsi que de protéger l’animal en tant qu’individu, et de réduire le nombre d’animaux affectés et/ou la gravité de la maladie, ce qui augmente la protection au niveau du troupeau. Généralement, dans le cadre de certaines des pathologies porcines décrites ici, l’efficacité sur animaux a permis de réduire rapidement et fortement la pression du pathogène, limitant du même coup la gravité de la pathologie ainsi que sa diffusion. Si la disponibilité de produits efficaces permet la protection des animaux d’élevage, au niveau individuel et au niveau troupeau, elle débouche également sur la protection des élevages et des éleveurs. Intervient à ce niveau le bénéfice sanitaire « One Health », d’abord dans le cas de zoonoses, ici, par exemple, le Rouget du Porc, mais également une protection indirecte, car en protégeant contre la Grippe porcine, on diminue les possibilités de recombinaison entre influenza virus porcins et humains. Finalement, le développement de vaccins efficaces chez le porc entraîne une diminution de l’utilisation d’antibiotiques en médecine vétérinaire, limitant donc les possibilités d’émergence de nouvelles antibiorésistances. La vaccination des porcs a donc une importance primordiale dans un objectif « One Health ».
Procédures
L’administration d’une souche d’épreuve est réalisée, quelque soit la procédure, en une seule administration, en utilisant la voie intra nasale pour les pathogènes respiratoires (Circovirus, SDRP, grippe, Pneumonie enzootique). L’épreuve rouget demande quant à elle une administration intra dermique sur chacun des flancs. Cette administration est réalisée après tranquillisation des animaux. L’administration de la souche d’épreuve Parvovirus Porcin est réalisée par voie parentérale, en fonction de l’historique des différentes souches utilisées. Procédure Circovirose, durée 4 semaines : 15 animaux vaccinés et contrôles sont soumis à l’épreuve. Ils vont subir un prélèvement sanguins hebdomadaire (avec un maximum de 15% VSC sur 28 jours), et des prélèvements par écouvillonage (écouvillon fécal, ou nasal). Les animaux sont pesés de façon hebdomadaire, et leur température rectale est relevée une fois par jour. SDRP : 15 animaux vaccinés et contrôles sont soumis à l’épreuve. Ils vont subir des prélèvements sanguins et par écouvillonage avec une fréquence plus rapprochée (J0, J3, J7, J10, J14 ) avec un maximum de 15% VCS prélevés sur 28 jours. Les animaux seront pesés au début et à la fin de l’épreuve. Pneumonie enzootique : les animaux vont être prélevés de façon unique au début de l’épreuve pour suivi sérologique. Il est possible de prélever des écouvillons nasaux et salivaires de façon hebdomadaire. Les animaux seront pesés au début et à la fin de l’épreuve. Grippe Porcine :l'épreuve est très courte. Les animaux vont être prélevés de façon unique au début de l’épreuve. Il est possible de prélever des écouvillons nasaux et salivaires de façon quotidienne (soit sur 3 jours) pour suivre la charge virale excrétée. La température rectale des animaux sera relevée pendant les trois jours de l’épreuve. Rouget :l'épreuve est courte (7 jours). les animaux vont être prélevés de façon unique au début de l’épreuve. La température rectale des animaux sera relevée pendant les 7 jours de l’épreuve. Ils seront également pesés au début et à la fin de l’épreuve. Parvovirose porcine : A la fin de l’épreuve, à environ 90 jours de gestation, les femelles sont anesthésiées, puis euthanasiées pour subir une hystérectomie suivie d’une hystérotome afin de permettre l’observation des fœtus de visu. L’anesthésie des femelles provoque un endormissement parhypoxie chez les fœtus suivi de leur mort. Les administrations, prises de sang, écouvillons et pesées durent entre 1 et 2 minutes maximum
Impact sur les animaux
Les différentes procédures décrites dans ce document vont avoir des effets directs et indirects sur les animaux en épreuve. Les effets directs des procédures découlent de l’effet des manipulations nécessaires à la contention, l’administration de produits et la collecte d’échantillons sur des animaux par essence craintifs. Les effets indirects découlent des effets potentiels (spécifiques ou pas) des substances d’épreuve administrées. Le porc est un animal sociable et intelligent (curieux, joueur). C’est aussi un animal victime de prédation à l’état naturel, et qui va donc adopter instinctivement des comportements innés d’évitement, de fuite, ainsi que des vocalisations. La contention, même légère, par exemple lors de manipulation d’un jeune animal pour une pesée, va souvent provoquer stress, gène, inconfort, définis par une vocalisation de l’animal, un comportement de fuite et, une une gesticulation et , avec retour à un comportement normal immédiatement après la fin du stimulus.
Devenir
PCV2, SDRP : euthanasie pour prélèvements terminaux PPV : euthanasie réglementaire à environ 90 jours de gestation Rouget : euthanasie ou réutilisation si vaccins multivalents Pneumonie enzootique Mycoplasma hyopneumoniae et grippe porcine : euthanasie pour observations des poumons et charges virales pulmonaires (critères réglementaires Pharmacopée EU)
Remplacement
L’espèce porcine, utilisée ici, est l’espèce cible des substances d’essai testées. Les essais réalisés dans ce projet doivent être conduits chez l’animal afin de répondre aux exigences règlementaires.
Réduction
Pour les études règlementaires, le nombre d’animaux requis est souvent déterminé par les textes (pharmacopées et/ou autres textes règlementaires concernés). Lors des phases de recherche en amont des études réglementaires, les effectifs sont évalués au plus juste (bibliographie guidelines analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à limiter le nombre d’animaux utilisés et les études non conclusives.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, dans des environnements à température, luminosité et atmosphère contrôlées. L’hébergement des animaux est également enrichi afin que les animaux puissent exprimer au mieux leur comportement naturel. La Structure chargée du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques et des conditions de vie pour les animaux. Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique est prévue dans un but d’habituation avec l’environnement et le personnel, ce afin de limiter le stress des animaux et de stabiliser leur état physiologique (sauf cas exceptionnels subordonnés au protocole expérimental- animaux devant être manipulés au moment du sevrage, et que l’on préfère laisser le plus possible avec leur mère). Des points limites, spécifiques ou non des pathologies décrites dans ce document, ainsi qu’un suivi adapté (observations quotidiennes, bi-quotidiennes) sont mis en place afin de prendre en charge les animaux le plus rapidement et efficacement possible lors du développement de pathologies entrainant une potentielle douleur chez l’animal. Ces critères sont en constante évolution afin qu’ils reflètent au mieux l’état des connaissances vétérinaires actuelles. Une gêne peut également être occasionnée en fonction de l’occurrence des administrations et/ou prélèvements. Afin de réduire cet inconfort, les opérateurs hautement qualifiés réalisent une contention adaptée (potentiellement incluant anesthésie et /ou analgésie) de l’animal et une alternance des sites d’administrations et/ou de prélèvements peut être mise en place.
Choix des espèces
L’évaluation chez l’espèce cible est une exigence règlementaire. Les animaux utilisés peuvent être des nouveau-nés, de jeunes animaux en croissance et/ou des adultes (y compris des femelles gestantes). L’âge dépend des besoins pour les études d’efficacité (exemple : de très jeunes animaux dans le cadre de transfert d’immunité maternelle), de production de souches et/ou d’études de mise au point de modèle d’épreuve. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, du produit testé et répondent à l’exigence expérimentale d’utilisation du produit mis sur le marché et des exigences des autorités.
Efficacité et toxicité de candidats médicaments impliqués dans le traitement du cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Immunodéficientes, immunocompétentes ou humanisées à l'aide de cellules souches issues de cordons ombilicaux, 30 128 souris vont être utilisées sur quatre ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des greffes de fragments tumoraux ou des injections de cellules cancéreuses, subissent des chirurgies du fémur, du foie, du poumon ou une castration de cinq à trente minutes, des prises de sang quotidiennes pendant cinq jours au minimum et parfois plusieurs semaines, ainsi que des prélèvements vaginaux. Le chiffre de 30 128 est établi sur le nombre d'études des années antérieures et sur l'anticipation d'une croissance annuelle, "en accord avec le plan commercial". Toutes seront tuées, le porteur indiquant qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines implantés sur des souris immunodéficientes (diminution de l’état d’immunité de l’organisme), immunocompétentes (≠immunodéficience, capacité normale de l’organisme à se défendre contre une infection) ou humanisées à l’aide de cellules souches issues de cordons ombilicaux humains ou de cellules sanguines provenant du sang périphérique (PBMC). Différentes stratégies d’implantations des tumeurs pourront être réalisées en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir la fonctionnalité d’un candidat médicament dans un modèle se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'Homme.
Procédures
Injection par voie intraveineuse : 2 fois maximum. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Chirurgie avec implantation de fragments de tumeurs : moins de 5 minutes. Injection de cellules tumorales : moins de 5 minutes. Autres chirurgies (castration, fémur, foie, poumon, …) : entre 5 à 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, tumorale, dermique, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie d’une durée comprise entre 10 et 45 minutes. Le suivi de l’état de santé des animaux se fera par score clinique (aspect des poils, mobilité, état corporel, …) ou bien par palpation (ou autre geste technique). Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire d’établissement et figurera dans le protocolé d’étude. Des prélèvements vaginaux pourront également être effectués. La fréquence des prélèvements est quotidienne, pendant au minimum 5 jours de suite, pouvant aller jusqu'à plusieurs semaines de suite si nécessaire pour bien caractériser le cycle en entier, surtout si les souris ne sont pas synchronisées. Le geste durera quelques secondes.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être induites par les injections, les chirurgies, le développement de tumeurs et des éventuelles métastases, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques injectés et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer. Le prélèvement vaginal pourrait entraîner une légère irritation locale transitoire, une inflammation minime ou un stress temporaire.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils auront été implantés avec des cellules tumorales ou des fragments de tumeurs dérivées de patients ou auront développé une tumeur. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 30128 souris seront utilisées, couvrant une période de 4 ans et permettant de réaliser environ 600 études précliniques de 50 souris et 2 études précliniques de 64 souris chacune pour la castration. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction du type d’étude. Des études pilotes pourront être réalisées afin de déterminer le nombre d’animaux à utiliser afin d’obtenir un résultat interprétable.
Raffinement
En début d’étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles dans le but de synchroniser le cycle œstral de la souris. En plus de ces conditions minimums légales, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées régulièrement à la présence humaine. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, de la perte de poids, et le cas échéant du volume tumoral ou de l’apparition d’une ulcération tumorale.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Etude des mécanismes pathogènes et des facteurs environnementaux dans un modèle de sclérodermie chez la souris 1/3
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Vingt-quatre injections dans l'abdomen, quarante gavages, deux instillations dans la gorge et une chirurgie de quinze minutes s'enchaînent sur deux mois pour chaque souris concernée. 1 214 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, dont une partie du seul fait qu'elles n'ont pas le génotype recherché. Le modèle repose sur une lignée génétiquement modifiée qui développe une fibrose de la peau et des poumons, à laquelle le projet ajoute des contaminants de l'environnement comme la silice, pour tester des molécules bloquant l'activation immunitaire. Les souris circulent entre trois établissements, et le porteur ne précise ni en quoi consiste l'acte chirurgical ni comment il arrive à 1 214 animaux.
Objectifs
La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.
Procédures
Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.
Impact sur les animaux
Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.
Devenir
Une partie des animaux seront mis à mort car sans génotype d'interêt. L'autre partie seront mis à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques.
Remplacement
Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.
Etude fonctionnelle des vésicules extracellulaires dans la cachexie associée au cancer colorectal EU2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
544 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Une partie reçoit sous la peau une greffe de cellules cancéreuses colorectales connues pour provoquer une cachexie en deux semaines, avec fonte musculaire, perte de poids, gonflements de la muqueuse intestinale et saignements sur la fin. Elles passent tous les deux à trois jours sur un appareil de résonance magnétique qui mesure leur masse maigre, et subissent des tests comportementaux. Le porteur écrit vouloir tout mettre en œuvre pour assurer leur bien-être, et précise dans la même phrase qu'aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne pourra leur être administré, ces produits risquant d'altérer les marqueurs du cancer.
Objectifs
Le cancer colorectal prend naissance dans les cellules du côlon ou du rectum. La tumeur cancéreuse (maligne) est un groupe de cellules cancéreuses qui peuvent envahir les tissus voisins et les détruire. Avec près de 45 000 nouveaux cas et 18 000 décès par an, le cancer colorectal reste le 2e cancer le plus meurtrier en France. La cachexie est un affaiblissement profond de l'organisme (perte de poids, fatigue, atrophie musculaire, etc. ) lié à une dénutrition très importante. Dans le cas du cancer colorectal avancé, jusqu'à 60 % des patients souffrent de cachexie qui est fortement associée à un mauvais pronostic de survie. L’impact dévastateur de la cachexie sur le patient et ses proches souligne l'urgence de ce besoin médical non satisfait. La fonction musculaire est également profondément altérée au cours de la cachexie cancéreuse, avec une forte réduction de la force musculaire squelettique. Cependant, les mécanismes impliqués dans le développement de la cachexie liée au cancer colorectal restent incompris. Il a été décrit que des vésicules étaient produites par les tumeurs, assurant une communication entre la tumeur et des organes. Démêler la communication entre le muscle squelettique, le tissu adipeux et la tumeur constitue un enjeu capital pour mieux comprendre les origines de la cachexie cancéreuse. Trouver des biomarqueurs capables d’être détectés avant l’apparition de la cachexie devient primordial pour améliorer la prise en charge et le bien-être des patients. Notre équipe étudie les fonctions d’une protéine régulatrice qui pourrait jouer un rôle dans le développement de la cachexie associée au cancer colorectal en influençant les tissus musculaires distants. Le but de ce projet, qui se déroulera dans deux établissements différents, est de démontrer le rôle de notre protéine dans le développement de la cachexie associée au cancer colorectal.
Bénéfices attendus
Cette étude s’appuie sur des résultats précédents obtenus sur des lignées cellulaires en culture. Cependant l’étude du phénomène cachectique n’est possible que grâce à l’utilisation de modèles murins qui ont fait leur preuve dans la littérature. Ces modèles modifiés permettront d’aller voir plus en avant les effets de la protéine d’intérêt
Procédures
Une pesée de tous les animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées tous les 2 à 3 jours à l'aide d'un appareil RMN (Résonnance magnétique) qui permet d’obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent moins de 2 minutes par souris et sont réalisées sur des animaux vigiles pendant toute la durée des procédures (2 semaines, ou 4 semaines selon les animaux). Ils auront à disposition une roue d’activité spontanée pendant la durée des procédures et seront libres de courir ou non. Ils réaliseront des tests comportementaux (3 fois 5 minutes et 3 fois 10 secondes / deux sessions pour tous les animaux). 432 animaux vigiles recevront une injection unique (5 secondes). En fin d’expérience, tous les animaux du projet (544) recevront une injection d’anesthésique et d’analgésique (5 secondes) avant d’être euthanasiés.
Impact sur les animaux
Le développement tumoral induit un état de cachexie progressif s'accompagnant d'une réduction de masse maigre et d'une perte de poids corporel. Les tumeurs colorectales peuvent provoquer des gonflements de la muqueuse intestinale et des saignements qui apparaîtront les deux dernières semaines de l’étude. Les animaux pourront être stressés lors des mesures de poids et de la taille de la tumeur (mesure hebdomadaire pendant 15 jours), lors de l’évaluation de la composition corporelle (tous les 2 jours pendant 2 ou 4 semaines) et lors des tests comportementaux. Les mesures de tumeur et les injections peuvent également générer une légère douleur pour l'animal.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés. Cette mise à mort limite la souffrance des animaux. Nous prélèverons le sang et différents tissus afin d’analyser les marqueurs et l’avancement de l’état cancéreux.
Remplacement
Bien que nous menions en parallèle des études sur des cultures de cellules adipeuses et musculaires, la cachexie liée au cancer est un syndrome global qui implique des échanges complexes entre les organes. Les vésicules extracellulaires font partie des messagers qui permettent cette communication. Afin de tester l'effet de différentes vésicules sur la physiologie et le métabolisme, nous ne pouvons pas nous passer de tests chez l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au minimum après calcul à l’aide d’un logiciel pour études statistiques. De plus, nous mutualiserons les données issues d’une étude d’une autre équipe qui sera réalisée en même temps, ce qui nous évite d’inclure deux groupes contrôles de 14 animaux.
Raffinement
Le syndrome cachexique cancéreux induisant un affaiblissement de l'organisme (perte de poids, fonte musculaire, etc.) nous effectuerons un suivi quotidien des animaux grâce à une grille de score et appliquerons des points limites définis. L’alimentation sera déposée directement dans la cage pour faciliter l’accès et permettra de contrôler la perte de poids. Nous utiliserons des tapis anti-escarres lors des examens des animaux et au fond des barquettes de pesées ce qui apporte confort et chaleur le temps de la mesure (pesée dynamique, 5s). Les animaux seront préalablement habitués aux tests comportementaux. Pour le change et les tests, les animaux seront déplacés à l’aide d’un tunnel de contention auquel ils seront habitués (enrichissement présent dans les cages). Ce tunnel permet aussi l’habituation à la mesure de composition corporelle où l’animal est maintenu dans un système équivalent le temps de la mesure (moins de deux minutes). Tout sera mis en œuvre pour assurer le bien-être des animaux même si aucun médicament anti-douleur ou anti-inflammatoire ne pourra être administré aux animaux car susceptible d’altérer les biomarqueurs du cancer.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur trois modèles murins. Le premier modèle consiste à injecter des vésicules chez des souris âgées de 10 semaines. Le deuxième modèle consiste à greffer des cellules murines colorectales cancéreuses sous la peau de souris âgées de 10 semaines. Les cellules cancéreuses utilisées, une fois greffées, sont connues dans la littérature pour induire la cachexie dans les deux semaines suivant la greffe. Nous prenons des jeunes adultes car les animaux auront atteint un poids suffisant qui permet d’observer une cachexie sans entraîner une perte de poids trop rapide. Le troisième modèle est constitué de souris génétiquement modifées répondant spécifiquement à nos besoins en terme d’expression des protéines d’intérêt. La mutation de notre protéine d’intérêt dans ce modèle permettra d’évaluer son rôle dans l’apparition de la cachexie. Ce modèle génère lui aussi la cachexie à partir de l’âge de 16 semaines, âge que nous avons choisi pour débuter nos observations.
Effet d’un nouveau médicament sur la croissance des tumeurs gastriques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Tester une immunoglobuline administrée par la bouche sur des tumeurs de l'estomac suppose ici d'implanter la tumeur : 260 souris reçoivent des cellules cancéreuses injectées dans l'estomac au cours d'une chirurgie de dix à quinze minutes. Toutes seront tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite un gavage quotidien pendant dix à quinze jours, une injection dans le ventre chaque jour pendant dix jours, et des séances d'imagerie sous anesthésie répétées. Le seul bénéfice avancé tient à la commodité de la prise orale pour les patients, et le porteur juge le recours aux animaux "indispensable" tout en indiquant avoir déjà vérifié in vitro la pertinence du modèle et l'absence de toxicité du produit.
Objectifs
Le développement des nouvelles thérapies pour le traitement des cancers reste un enjeu majeur. Parmi les nouvelles molécules thérapeutiques il y a les immunoglobulines de classe A qui ont un tropisme de distribution et d’action dans toutes les muqueuses de l’organisme dont le tractus digestif. Une de ces molécules a déjà montré des résultats encourageants chez des souris porteuses d’une tumeur d’adéno-carcinome colorectale avec une diminution de la tumeur. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de cette molécule sur des souris porteuses d’une tumeur à l’estomac.
Bénéfices attendus
Développement d’un nouveau médicament dont la prise orale facilite le traitement des patients.
Procédures
Chirurgie au niveau de l’estomac sur animal anesthésié : injection de cellules cancéreuses dans l’estomac, durée 10-15 minutes, geste réalisé 1 fois. Administration par voie orale sur animal vigile : durée 30 secondes, geste réalisé une fois par jour pendant 10 ou 15 jours. Injection dans le ventre sur souris vigile : durée 10 secondes, geste réalisé une fois par jour pendant 10 jours.
Impact sur les animaux
De façon plutôt rare, une infection de la plaie peut arriver suite à la chirurgie. Sinon, les nuisances peuvent provenir de : 1) Développement de la tumeur : douleur, gêne, impact sur l’appétit, perte de poids. 2) Le gavage répété : douleur lié au geste, impact sur l’appétit, perte de poids, stress. 3) Les injections intrapéritonéales : stress lié à la contention, douleur au site d’injection. 4) Les séances d’imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention, hypothermie.
Devenir
Les souris seront euthanasiées afin de récupérer des prélèvements post-mortem qui seront analysés ultérieurement.
Remplacement
Nous souhaitons tester l’efficacité d’un médicament administré par voie orale sur la croissance d’une tumeur de l’estomac. A l’heure actuelle il n’existe pas de modèles in vitro permettant de reproduire l’ensemble du tractus digestif dans un organisme aussi complexe que le corps. L’utilisation des animaux est donc indispensable. Néanmoins la pertinence du choix de notre modèle a été validé par des tests in vitro et l’absence de toxicité du produit a déjà été vérifiée.
Réduction
La 1ère étude de ce projet est une étude pilote qui permettra d’attester de l’efficacité ou non du nouveau médicament sur notre modèle. Si le résultat est négatif nous n’irons pas plus loin dans ce projet. Nous travaillerons à la fois sur des mâles et des femelles. Le suivi de la croissance tumorale et donc la visualisation de l’effet du traitement sur la taille de la tumeur se fera par imagerie non invasive permettant de faire un suivi longitudinal sur un même animal. Un test statistique sera réalisé. Le nombre d'animaux pour l'étude a été déterminé en utilisant un logiciel dédié.
Raffinement
Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant. Les actes expérimentaux seront réalisés sous anesthésie quand cela est nécessaire et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Une analgésie est mise en place au moment de la chirurgie et aussi en suivi post-opération si des signes de souffrance sont visibles. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix en imagerie optique. De plus cette espèce permet d’obtenir des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées à partir d’un âge de 7 semaines correspondant à de jeunes adultes. A cet âge elles ont une taille raisonnable facilitant leur manipulation.
Etude de l’effet d’un traitement par RST-01 dans un nouveau modèle chronique de trouble de stress post-traumatique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Soumises à une stimulation électrique produisant un stress intense, puis ramenées quatre fois à ce même épisode pendant quatre minutes à chaque séance, 765 souris développent les symptômes recherchés d'un trouble de stress post-traumatique. Elles passent ensuite une série de tests comportementaux de cinq à quinze minutes et subissent plusieurs prélèvements sous contention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. L'objet est de tester un dérivé de la mémantine contre ce trouble, puis de le comparer à la fluoxétine et à la sertraline, sans que les tests comportementaux employés soient nommés. Toutes sont tuées à la fin pour prélever tissus et fluides.
Objectifs
En 2024, 3,9 % de personnes sont atteintes de Trouble de Stress Post-Traumatique (TSPT) dans le monde selon l'Organisation Mondiale de la Santé dont 2 femmes pour 1 homme. Pour réduire les symptômes de ce trouble, de nombreux anti-dépresseurs sont utilisés. C'est le cas de la Kétamine qui a révélé des effets positifs chez des patients atteints de TSPT. Cependant elle a pu aussi mettre en avant chez le patient des effets secondaires important tels que des effets dissociatifs. D'autres molécules sont actuellement utilisées pour lutter contre la dépression telle que la Fluoxetine et la Sertraline. La recherche pharmacologique explore donc activement d'autres pistes, la première d'entre elles étant de mettre au point des molécules similaires mais avec un bénéfice pharmacologique plus actif et sans effets secondaires. Une des pistes de traitement s'articule autour d'un dérivé direct de la Mémantine qui a eu des effets positifs sur des modèles de TSPT. Une question essentielle pour envisager le développement clinique de ce composé est de bien comprendre les spécificités et les conséquences pharmacologiques de ce traitement dans le TSPT. Ce projet a pour objectif de valider un nouveau modèle de TSPT chronique basé dans le but d’étudier la robustesse de l’induction de symptômes de TSPT chez la souris. Des marqueurs biologiques spécifiques du TSPT seront également analysés afin de caractériser le modèle. Une fois le protocole validé, le but sera de traiter les animaux avec ce dérivé à différentes doses et de la comparer dans un deuxième temps à la Fluoxetine et la Sertraline. Les marqueurs spécifiques qui reflètent la présence du TSPT dans le cerveau des souris seront analysés afin de déterminer si le traitement par ce dérivé de la Mémantine est susceptible de les modifier.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de valider un nouveau modèle de TSPT chronique et de révéler un effet positif de ce dérivé de la Mémantine sur les symptômes chronique de TSPT comparé aux molécules actuelles, et ainsi de faire progresser le développement pré-clinique d'un traitement plus efficace que celui utilisé aujourd'hui. A ce jour il n’existe aucun traitement pour le TSPT. Seuls les symptômes associés comme la dépression sont pris en charge. Il est donc important de trouver un traitement efficace suite à l’échec de la Kétamine en clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à un test de comportement suivi de 4 rappels afin d’induire les symptômes de TSPT (durée moyenne : 4-5min par test). Puis une série de plusieurs tests de comportement pour évaluer les différents symptômes de TSPT développés sera réalisée (durée moyenne : 5-15min par test). Plusieurs prélèvements sous contention seront effectués (durée : moins de 5 min). Une anesthésie générale sera réalisée pour effectuer des prélèvements sur l'animal (durée : moins de 15 min) puis lors de la mise à mort un prélèvement sera effectué.
Impact sur les animaux
Afin d’induire les symptômes de TSPT, certains animaux seront soumis à une stimulation électrique produisant soit un stress intense ou léger. Puis des séances de rappels seront réalisées pour réactiver ces éléments, produisant un stress léger à modéré pendant 4 minutes/rappel. Durant ces expériences, des prélèvements de sang auront lieu et engendreront un stress léger et sans lésion à l'animal. A la suite du protocole d’induction de TPST, plusieurs tests de comportement auront lieu, tests qui engendreront un stress léger de 5 à 15 minutes. Après ces tests de comportement, une anesthésie générale sera effectuée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter les tissus et fluides pour analyse et ainsi déterminer l’impact du traitement sur les marqueurs de la pathologie de TSPT.
Remplacement
L’utilisation de modèles murins pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours «in vivo» pour mîmer les symptômes pathologiques du TSPT et rechercher des biomarqueurs associés. En effet pour mîmer le TSPT chez l'humain et mesurer les différents paramètres évoluant lors de ce stress, certains points tels que le stress encouru, les impacts sur la mémoire, l'anxiété, la sociabilité, la perception douloureuse mais aussi le contexte de l'évènement traumatique (odeur, lieu) et les rappels de cet évènement ne peuvent être effectué que sur des modèles "in vivo".
Réduction
Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux à 16 par groupe et par sexe pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les analyses de variances. Tous les tests comportementaux sont effectués sur les mêmes lots de souris pour limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous avons mis des options en fonction des résultats obtenues dans le but de réduire au maximum l’utilisation d’animaux pour notre étude.
Raffinement
Nous avons mis une option en fonction des résultats obtenues sur la perception douloureuse dans le but de réduire au maximum l’utilisation d’animaux pour notre étude mais surtout de s’assurer du bien-être de nos animaux. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 5 minutes par souris avant le début des expériences. Les animaux ayant subi un stress intense développent un phénotype anxieux mais on s’attend à ce que celui-ci soit modéré. Il sera révélé lors des différents tests comportementaux mais ne se traduit pas par des symptômes spontanés dans la cage d'hébergement. Si une altération de l'état est observée, une grille de score est utilisée pour identifier les points limites et déterminer la conduite à tenir.
Choix des espèces
Afin de refléter les symptômes du TSPT, la souris reste à ce jour un des modèles se rapprochant au plus près de l'humain et dont les capacités de mémoire, de stress, d'anxiété, de sociabilité et de perception douloureuse peuvent être étudiées en laboratoire. Les expériences débuteront sur des animaux de 10 semaines, âge adulte des souris.
ONCO-OT-Prostate : Evaluation de thérapies anti-cancéreuses sur des modèles de tumeurs greffées dans la prostate.
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 350
Jusqu'à 15 % d'animaux en plus sont inclus dans chaque étude pour former des groupes homogènes après la chirurgie. 2 800 souris et 350 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée directement dans la prostate sous anesthésie générale, une partie des animaux étant castrée lors d'une seconde intervention, avant des IRM d'une heure sous anesthésie et des traitements répétés par injection ou par voie orale. La société qui porte le projet se présente comme prestataire de services en recherche préclinique et affirme que les méthodes sans animaux ne permettent pas de prévoir l'efficacité d'un candidat médicament, les reconstructions de tumeurs en 3D restant selon elle "marginales".
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer de la prostate est le deuxième plus mortel (environ 398 000 décès en 2022 pour environ 1,5 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer de prostate greffés directement au niveau de la prostate, les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
La greffe de la tumeur est faite sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min). La castration des animaux sera réalisée sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min) L’IRM est réalisée sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure. Les animaux sont traités par injection (intraveineuse ou intrapéritonéale) ou par voie orale. Les traitements seront réalisés de préférence sous anesthésie générale (isoflurane), mais les animaux pourront être immobilisés ponctuellement par une contention douce ou à l’aide d’un tube à contention si l’anesthésie est contre-indiquée. Les animaux seront immobilisés par une contention douce pour mesurer la taille des tumeurs (inférieur à 30 secondes) Les prélèvements de sang (1 minute) seront réalisés de préférence sous anesthésie générale (isoflurane) mais les animaux pourront également être immobilisés ponctuellement par une contention douce ou à l’aide d’un tube à contention si le geste est rapide (inférieur à 30 secondes) et génère moins de stress à l’animal que l’anesthésie générale elle-même.
Impact sur les animaux
- La castration pourra entrainer une douleur et une gêne modérée pendant 1 ou 2 jours - L’évolution de la tumeur pourra entraîner une douleur lié une gêne, un envahissement de la cavité abdominale ou pelvienne, de l’ascite. Il est possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs, du poids et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. -A la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger de 1 à 2 jours. -Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés dans différents schémas d’administration qui pourront induire un stress léger. L’injection intraveineuse, intrapéritonéale ou per os pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.
Devenir
Sachant que les animaux sont porteurs de tumeurs, les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (poids ou imagerie). Le nombre de groupes sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera deux groupes avec tumeur, un groupe contrôle (non traité ou traité avec le véhicule) et un groupe traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés sera testé au cours de la même étude afin de ne pas multiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de la chirurgie et afin de pouvoir former des groupes homogènes il sera en général nécessaire d’inclure jusqu’à 15% d’animaux surnuméraire. Le nombre d’animaux par groupe se situera entre 5 à 15 animaux. Il s’agit d’un nombre minimum d’animaux permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et nombre/volume de métastases déterminés par imagerie).
Raffinement
Les animaux sont pesés et le volume tumorale est estimé 2 fois/semaine minimum. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond des cages après les chirurgies et dès l’observation d’une perte de poids >10%. Une réhydration sera mis en place par perfusion sous cutanées et/ou alimentation humide pour les souris si necessaire. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. Les chirurgies sont réalisées sur matelas chauffants jusqu’au réveil de l’animal. La greffe est réalisée en condition aseptique sous anesthésie générale avec administration préalable d’un analgésique opiacé 30 min avant et un anesthétique local. Les animaux reçoivent une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien en pré-opératoire et post-opératire et des soins adaptés.. Les administrations/prélèvements sont réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible. Certaines administrations sont réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements sont effectués en suivant les recommandations de la SBEA. Dans le cas de chirurgie sans réveil une anesthésie profonde est réalisée avec administration d’un analgésique local (lidocaïne et bupivacaïne), d’un alpha2 agoniste et d’un opiacé débutée 30min avant la chirurgie. Les principaux points limites sont listés en détail dans les procédures. Si des signes cliniques sont observés, l’animal est mis en observation et un traitement est mis en place si possible. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines minimum lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter le développement tumoral ainsi que les éventuels effets secondaires des composés testés.
Développement de modèles de souris humanisées pour étudier la transformation de cellules sanguines humaines normales en leucémies aiguës pédiatriques et identifier des nouvelles possibilités thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Irradiées puis greffées avec des cellules sanguines humaines, 960 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 480 d'entre elles portant deux mini-os humains implantés sous la peau. Pour 240 souris, le protocole prévoit vingt injections, quarante administrations par voie orale et quinze séances d'imagerie sous anesthésie, et 480 subissent un prélèvement de moelle osseuse au fémur. Le porteur écrit qu'il est facile de mesurer la souffrance de la souris et d'y remédier rapidement, et indique dans la même demande que le développement de la leucémie entraîne une paralysie du train arrière. Toutes seront tuées pour prélever moelle osseuse, rate, colonne vertébrale et ossicules.
Objectifs
L’hématopoïèse est un processus finement régulé qui aboutit à la production de toutes les cellules sanguines, à partir de cellules souches et de progéniteurs (CSPH) localisés, chez l’adulte, dans la moelle osseuse. Nous souhaitons tester l’hypothèse selon laquelle certaines anomalies génétiques décrites dans des leucémies de l’enfant peuvent transformer des CSPH humaines normales. Il est établi que les caractéristiques fonctionnelles et d'expression des CSPH changent durant le processus de formation du système sanguin, débutant dans l'embryon et se concluant à l'âge adulte. Nous avons également montré que des facteurs solubles produits notamment par la moelle osseuse participent grandement au développement leucémique. La poursuite de notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes du développement leucémique à partir de cellules humaines sensibles à la transformation, ainsi que d’évaluer plus précisément la contribution de la moelle osseuse, dans ce processus et dans la réponse aux traitements. Pour cela, nous utiliserons des CSPH humaines dans lesquelles sera exprimée génétiquement une fusion entre deux gènes, découverte dans des leucémies de l’enfant et distinctes de celles de l’adulte, nous les transplanterons dans des modèles de souris receveuses permissives aux greffes de cellules d’origine étrangère dans lesquelles nous aurons implanté ou pas des petits fragments de moelle osseuse humaine normale (appelés ossicules). Les objectifs du projet sont les suivants : Objectif 1 : Définir la cellule à l’origine de la transformation leucémique chez l’enfant Nous voulons définir la ou les CSPH humaines sensibles au développement leucémique sous l’influence de la fusion génique d’intérêt, afin de mieux comprendre dans quel type cellulaire la pathologie est initiée. Objectif 2 : Etudier le rôle la moelle osseuse humaine sur le développement leucémique Nous voulons étudier l’influence de moelle osseuse humaine, avec des modèles appelés ossicules, sur le développement de la leucémie induite par l’anomalie génique étudiée. Objectif 3 : Etudier le rôle de la moelle osseuse humaine sur la réponse à des traitements Nous étudierons l’influence des modèles, appelés ossicules, sur la réponse des cellules leucémiques à une thérapie ciblée identifiée récemment.
Bénéfices attendus
Les leucémies pédiatriques liées à une anomalie génétique spécifique touchent surtout les très jeunes patients, et malheureusement, il n'existe pas encore de traitement ciblé pour ces cas. Dans nos recherches précédentes, nous avons découvert que les cellules sanguines fœtales sont plus sensibles au développement de la leucémie que des cellules sanguines post-natales, et que l'environnement autour de ces cellules joue un rôle important dans ce processus. Cependant, de nombreuses questions sur la manière dont cette transformation se produit restent encore sans réponse. Le projet que nous souhaitons développer vise à mieux comprendre cette maladie. Les modèles que nous proposons sont essentiels pour découvrir comment la leucémie se développe à partir de cellules humaines et permettront de mieux refléter la complexité de cette maladie dans un organisme vivant, comme la souris. Dans le cas de la leucémie associée à l’anomalie génétique étudiée, notre projet pourrait également aider à mettre au point et tester de nouveaux traitements spécifiques qui doivent d'abord être validés sur des modèles précliniques avant de pouvoir être proposés aux patients. À plus long terme, ces modèles pourraient également être adaptés pour étudier d'autres maladies infantiles, notamment des leucémies liées à d'autres anomalies génétiques. Cela permettrait de proposer de nouveaux protocoles de traitement, essentiels pour ces différentes maladies infantiles.
Procédures
1 Irradiation en vigile : 2min, 960 animaux 1 Injection de cellules humaines sous anesthésie : 2min, 960 animaux 1 Prélèvement de moelle osseuse sous anesthésie : 5min, 480 animaux 1 Prélèvement de sang sous anesthésie : 3 min, 720 animaux 1 Injection de cellules humaines qui constitueront les mini-os humanisés sous anesthésie : 5min, 480 animaux 20 Injections de molécules sur animal vigil : 1min, 240 animaux 2x20 Traitements par la voie orale sur animal vigil : 2min, 240 animaux 15 Suivis du traitement sous anesthésie par bioluminescence : 10min, 240 animaux
Impact sur les animaux
-L'irradiation avant la transplantation provoque une anémie qui dure environ dix jours. - Les prélèvements de sang et de moelle osseuse à l’os du fémur peuvent causer des douleurs localisées, précocement après que le geste ait été fait. -Les mini-os humanisés implantés sous la peau des souris peuvent causer une gêne localisée. -le suivi de la progression de la maladie par bioluminescence peut entrainer un stress -les traitements par gavage ou injection sous-cutanée peuvent entrainer stress et inconfort/douleur localisé (point d’injection) -le développement de la leucémie entraine une paralysie du train-arrière.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédures. Les tissus/organes hématopoïétiques (moelle osseuse, rate, colonne vertébrale, ossicules) seront prélevés et les cellules qui y sont contenues seront soumises à une caractérisation qui nous permettra d’identifier la quantité et la qualité des cellules leucémiques présentes dans les organes en question. Cela permettra de comparer les différents groupes de souris afin de pouvoir tirer les conclusions suite à nos observations.
Remplacement
Dans le cadre de l’étude des leucémies, l’expérimentation sur des animaux, comme les rongeurs, est essentielle pour comprendre comment la maladie se développe dans un patient. Les méthodes de culture cellulaires (in vitro) ne permettent pas de reproduire fidèlement tous les mécanismes qui se ont lieu dans un corps vivant. Les modèles animaux, et notamment les souris, sont les seuls à pouvoir imiter fidèlement les processus complexes comme la migration et le développement des cellules sanguines, qu’elles soient saines ou malades. Bien que nous utilisions des systèmes de culture en laboratoire aussi souvent que possible, ils ne reproduisent pas toutes les étapes du développement de la leucémie, que ce soit dans la moelle osseuse ou dans d'autres organes. En plus, ces modèles de culture ne démontrent pas le processus complet de transformation en leucémie, contrairement aux modèles vivants (in vivo). C'est pourquoi les expériences sur les rongeurs sont indispensables et complètent les stratégies de culture en laboratoire. En plus de cela, ce projet vise à proposer un traitement qui devra être testé sur ces modèles animaux avant de pouvoir être utilisé chez les patients.
Réduction
Nous avons à cœur de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Les groupes d’étude comprendront entre 8 et 10 souris par groupe. Chaque expérience sera réalisée 2 ou 3 fois de manière indépendante afin d’obtenir des résultats fiables d’un point de vue statistique. Si les résultats de deux expériences sont statistiquement significatifs, nous pourrons décider de ne pas réaliser une troisième expérience. Lorsque nous devons tester plusieurs traitements en suivant la même procédure, nous réaliserons les expériences en même temps pour comparer tous les groupes avec un seul groupe témoin. Cela permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’utilisation du modèle d’ossicules (mini-os humanisés) permet aussi de limiter le nombre d’animaux. Chaque souris portera 2 ossicules (un sur chaque flanc), ce qui nous permettra d’augmenter le nombre d’ossicules testés sans avoir besoin d’utiliser plus de souris.
Raffinement
Les animaux utilisés pour atteindre les objectifs du projet seront régulièrement surveillés par l’équipe et le personnel animalier afin de repérer tout changement de comportement et éviter autant que possible toute douleur, souffrance ou stress inutile. Afin d’améliorer le bien-être des souris vis-à-vis des potentiels souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement dans la cage en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons pour plus de confort. Un analgésique sera donné lors du prélèvement de sang et de moelle osseuse réalisé pour apprécier le développement leucémique. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale. Des critères, appelés points limites, seront définis pour assurer le bien-être des animaux et limiter leurs souffrances en cas de progression irréversible de la maladie.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère facile à élever et à reproduire en captivité. Comme sa génétique et son comportement sont bien connus, il est facile de mesurer son bien-être, sa souffrance et son stress et d’y remédier rapidement. Cela en fait un excellent modèle pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. De plus, la souris partage 99% de ses gènes avec l’être humain, ce qui permet de transposer plus facilement les résultats obtenus chez la souris aux pathologies humaines, aidant ainsi à améliorer leur compréhension et leur traitement. Enfin, les souris reproduisent les étapes principales du développement des leucémies, ce qui en font de bons modèles d’étude, en particulier de traitements. Les souris que nous utiliserons dans ce projet sont des souris immunodéficientes (qui n’ont pas de système immunitaire fonctionnel), qui peuvent recevoir des greffes de cellules sanguines humaines, qu’elles soient normales ou leucémiques. Ces souris, élevées dans des conditions spécifiques, ne présentent pas les défauts associés à leur immunodéficience. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, qui, selon les recherches de notre laboratoire, montrent une excellente capacité à accepter des greffes après injection, que ce soit pour des cellules normales ou malades.
Étude de l’impact des anticorps anticontactine 1 sur la fonction rénale chez le Hamster
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Un rein retiré chirurgicalement en début d'expérience pour concentrer l'effet des anticorps sur celui qui reste : 42 hamsters dorés vont être utilisés pendant 77 jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent six injections d'anticorps humains dans le sang, subissent des prélèvements de sang et d'urine deux fois par semaine, et sont isolés quatre heures à chaque recueil urinaire. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer un syndrome néphrotique, avec œdèmes, perte de poids, troubles du rythme cardiaque, hypertension et perte de motricité. Le hamster a été retenu après le constat que souris, rats, lapins et cobayes n'expriment pas la protéine visée dans le rein, le porc l'exprimant aussi mais étant jugé moins facile à élever.
Objectifs
La polyneuropathie démyélinisante chronique (PIDC) est une maladie auto-immune qui affecte le système nerveux. Des recherches ont identifié plusieurs cibles d’anticorps auto-immuns, notamment des protéines présentes à la surface des neurones, comme la contactine 1. Chez certains patients, une PIDC survient en parallèle d’une maladie auto-immune rénale appelée glomérulopathie extramembraneuse (GEM), une pathologie dont l’évolution clinique peut être variable, allant parfois jusqu’à une perte totale de la fonction rénale. Bien que la co-occurrence de ces deux maladies ait été fréquemment observée, leur lien direct n’a jamais été formellement établi dans la littérature scientifique. Récemment, la contactine 1 a été détectée dans les petits amas de vaisseaux sanguins qui participent à la filtration rénale. Par ailleurs, des anticorps dirigés contre la contactine ont été identifiés simultanément dans le nerf et le rein, renforçant l’hypothèse d’un mécanisme commun. L’objectif principal de ce projet est de confirmer, à l’aide d’un modèle hamster, le rôle des anticorps anti-contactine 1 dans le développement de cette maladie rénale. Il s’agit également d’analyser les dysfonctionnements cliniques et tissulaires provoqués par ces anticorps afin de mieux comprendre cette pathologie. Les résultats de cette étude pourraient permettre d’améliorer les outils de diagnostic et de proposer des traitements adaptés pour les patients humains souffrant de cette maladie complexe.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de confirmer l'implication des anticorps anti-contactine et leur lien avec le développement d’une atteinte rénale induisant des modifications biochimiques et histologiques. Ce travail de recherche ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la glomérulopathie extramembraneuse ainsi que dans le développement de tests de dépistage et d’évaluation de la maladie si le rôle pathogène des anticorps est confirmé et si leur concentration a une valeur pronostique.
Procédures
Les animaux seront impliqués dans une seule procédure qui se déroulera en plusieurs étapes sur une durée de 77 jours. Des injections d'anticorps dans la circulation sanguine des animaux auront lieu 6 fois au cours des 77 jours pour induire une maladie rénale. Des prélèvements sanguins et urinaires auront également lieu deux fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude. Les injections et les prélèvements réalisés deux fois par semaine ne dureront pas plus de 10 minutes. Les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention afin d'éviter la douleur et diminuer leur angoisse. L'un des deux reins des animaux sera retiré en début d’expérimentation pour optimiser l’action des anticorps sur le rein restant. Cette chirurgie ne durera pas plus d'une heure et sera réalisée sous anesthésie générale avec une gestion rigoureuse de la douleur.
Impact sur les animaux
Les hamsters pourront ressentir un léger stress lors des injections de substances (anesthésiques, anticorps) ou des prélèvements. Les injections d'anticorps pourraient entrainer l'apparition d'un syndrome néphrotique . Ainsi, ces injections peuvent provoquer différents symptômes : fatigue, oedèmes, perte de poids, troubles du rythme cardiaque, hypertension artérielle ainsi que des atteintes neurologiques et une perte de la motricité des animaux. La chirurgie visant à réaliser une néphrectomie peut provoquer des douleurs post-opératoires, un risque d'infection, des anomalies de la coagulation, des troubles électrolytiques, une anorexie, une léthargie et une déshydratation. De plus, les animaux seront isolés en moyenne deux fois par semaines pendant 4 heures afin de prélever leurs urines, cela pouvant provoquer du stress et de l'angoisse chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure puisque leurs organes sont nécessaires à l'étude de la pathogénicité des anticorps anti-contactine1.
Remplacement
L’objectif principal de cette étude est de démontrer que l’injection des anticorps anti-contactine1 humains induit chez le Hamster des altérations neurologiques et de la fonction des reins similaires à celles observées chez l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif.
Réduction
Le modèle de Hamster visant à recréer une maladie rénale avec des injections d'anticorps étant unique, il est difficile de prévoir quels seront les changements sur les différents paramètres cliniques et anatomopathologiques testés. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum à 14 animaux par groupe en utilisant les données publiées chez l’homme.
Raffinement
Nous attachons une importance majeure sur les conditions d’hébergement et la qualité de vie des animaux. C’est pourquoi, une période d'acclimatation d'une semaine sera mise en place à l’arrivée des animaux. Ils seront hébergés en groupe afin de limiter leur stress. Pour les phases d'injections de substances et de prélèvements, une anesthésie sera réalisée afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un antidouleur sera administré à l’animal. Dans le but de préserver le bien-être des animaux, nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basées sur des paramètres mesurables non invasifs.
Choix des espèces
Nous avons préalablement recherché in vitro la contactine dans les reins des animaux utilisés en routine dans les animaleries souris, rats, lapins et cochons d’Inde mais aucun d’entre eux n’exprime la contactine dans le rein. Seul le Hamster et le porc expriment cette protéine dans leur reins. Notre choix s'est ensuite porté sur le modèle hamster car plus facile à élever. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 10-14 semaines, pour des raisons techniques (poids entre 100-120g), permettant des groupes homogènes.
Développement d’un modèle murin induit de sclérodermie systémique (SSc) et de colonisation par la bactérie Porphyromonas gingivalis (Pg) pour évaluer l’impact de la parodontite expérimentale sur la physiopathologie de la SSc
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, 132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées de bléomycine cinq jours par semaine pour provoquer un durcissement de la peau, une inoculation quotidienne de Porphyromonas gingivalis dans la bouche, et pour une partie d'entre elles la pose de ligatures autour de quatre molaires trois fois par semaine sous anesthésie générale. Le porteur décrit la pose des ligatures comme non douloureuse et précise dans la même rubrique qu'aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré, ces médicaments risquant d'interférer avec les résultats. Sur le remplacement, il écrit que la règle "n'est pas applicable dans le cas de ce projet".
Objectifs
La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune rare qui touche près de 10000 personnes en France, principalement les femmes. Elle est caractérisée par une fibrose des tissus (la peau notamment), des anomalies des vaisseaux et une dérégulation du système immunitaire. La cause n’est pour le moment pas connue. Un dérèglement du microbiote, avec un déséquilibre entre les bactéries positives et négatives de notre flore microbienne (appelé dysbiose), a été impliqué dans le développement de nombreuses maladies autoimmunes, dont la sclérodermie systémique. La parodontite est une pathologie inflammatoire d’origine infectieuse très répandue dans la population mondiale, puisqu’elle touche plus de 50% de la population âgée de plus de 50 ans. Elle se caractérise par une infection et une inflammation des tissus de soutien des dents appelé parodonte, qui comprend la gencive, l’os alvéolaire et le ligament alvéolodentaire. La parodontite aboutit au déchaussement, voire à la perte des dents. Elle est la conséquence d’un déséquilibre du microbiote parodontal. La bactérie Porphyromonas gingivalis joue un rôle clé dans cette pathologie. Notre hypothèse est que la dysbiose du microbiote parodontal et en particulier la présence de la bactérie Porphyromonas gingivalis pourrait représenter un facteur de risque et avoir un impact sur le développement de la sclérodermie systémique. L’objectif de ce projet est de développer un modèle de souris permettant d'étudier l'impact de la dysbiose du microbiote parodontal dans le développement de la sclérodermie systémique.
Bénéfices attendus
La cause de la sclérodermie systémique n’est pour le moment pas connue, mais les facteurs environnementaux, et notamment certains microorganismes, jouent un rôle dans le déclenchement de la maladie. La mise en évidence de l’implication d’une dysbiose du microbiote parodontal, et en particulier de la bactérie Porphyromonas gingivalis, dans le développement de cette maladie autoimmune rare permettra ainsi d’améliorer la compréhension de la sclérodermie systémique, ce qui nécessaire pour pouvoir développer de nouveaux traitements dans le futur. Il n’existe en effet pour le moment pas de traitement permettant de guérir cette pathologie, qui a un fort impact sur la qualité de vie et la survie des patients
Procédures
Les animaux sont soumis à une injection sous-cutanée de bléomycine (réalisée 5 jours par semaine), qui est une molécule ayant pour effet de provoquer une fibrose de la peau, afin de reproduire la sclérodermie systémique. La réalisation de ces injections est rapide (moins de 2 minutes). Pour induire la dysbiose du microbiote parodontal, une partie des souris sera soumise à une inoculation quotidienne avec une solution contenant la bactérie Porphyromonas gingivalis, qui sera appliquée uniquement au niveau de la bouche à l’aide d’une canule à bout mousse. Chez l'autre partie des souris, une pose de ligatures imbibées avec une solution contenant la bactérie Porphyromonas gingivalis sera en plus réalisée autour des molaires maxillaires 3 fois par semaine, afin de reproduire une parodontite. La pose des ligatures au niveau de 4 molaires est un geste nécessitant un temps d'une dizaine de minutes en tout. Les animaux seront également soumis à des prélèvements sanguins qui seront réalisés toutes les 2 semaines et qui nécessitent un temps inférieur à 5 minutes. La plupart de ces procédures (injections initiales de bléomycine, pose des ligatures, prélèvements sanguins) sera réalisée sous anesthésie générale, à l’exception de l’inoculation buccale de la bactérie Porphyromonas gingivalis, qui est une application rapide d’un petit volume de solution au niveau de la bouche de l’animal, et des injections de bléomycine après habituation de l’animal à une récompense.
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanées de bléomycine initiales, le placement des ligatures imbibées de la bactérie Porphyromonas gingivalis, et les prélèvements de sang au niveau de la veine submandibulaire seront réalisés sur animal anesthésié (anesthésie générale par injection de kétamine/xylazine ou anesthésie gazeuse à l'aide d'isoflurane). Les nuisances liées aux anesthésies répétées sont inhérentes a toute anesthésie. L'utilisation de l'isoflurane pour l'anesthésie présente un aspect aversif pour la souris, cependant l'anesthésie génère un stress moins important que de réaliser les gestes à l'état vigile. La bléomycine est glycopeptide qui induit une inflammation et une fibrose cutanée progressive lorsqu’il est injecté par voie sous-cutanée. Les animaux vont donc développer une fibrose au niveau de la zone d’injection, c’est-à-dire au niveau du haut du dos. Porphyromonas gingivalis est une bactérie qui est impliquée dans le développement d’une inflammation gingivale. L’induction de la parodontite par Porphyromonas gingivalis n’est cependant pas assez longue pour obtenir une destruction complète de l'os qui soutient les dents et donc une mobilité ou une perte de dents chez les souris. La parodontite induite n’entravera pas l’alimentation des souris. Un suivi quotidien du bien être des animaux et de leur poids sera mis en place dès le début des procédures grâce à une grille de suivi comprenant des points limites.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans les procédures sera mis à mort à la fin des procédures (prélèvement post mortem de différents organes afin de réaliser les différentes analyses) ou en cas d'atteinte des points limites.
Remplacement
La règle du remplacement n'est pas applicable dans le cas de ce projet. En effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier l’impact de la bactérie Porphyromonas gingivalis sur la physiopathologie de la sclérodermie systémique. Nous étudions notamment les réponses immunitaires et la production d'autoanticorps, qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la rate et les ganglions. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à l'utilisation de modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire ainsi que les mécanismes physiopathologiques parodontaux, car les connaissances et les outils d’analyse chez la souris sont très développés dans les domaines de l'immunité et de la parodontologie.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été décidée. Nous nous basons sur des protocoles déjà bien établis dans la littérature. La pertinence des résultats sera évaluée à l'aide de tests statistiques appropriés. Le nombre minimal d'animaux par groupe expérimental pour chaque question posée a été calculé et il est de 5 à 14 animaux par groupe. Toujours dans un souci de réduction, le nombre d’animaux exact nécessaire pour chaque procédure sera commandé auprès de fournisseurs agrées et nous ne réaliserons pas de croisements.
Raffinement
Nous porterons une attention particulière au bien-être animal notamment via le raffinement des conditions d’hébergement. Les groupes de souris utilisés pour les expériences seront placés dans les cages expérimentales à couvercle filtrant (6 maximum par cage) avec enrichissement (tubes en polycarbonate rouge translucides, nids, frisures de carton...) sur des portoirs ventilés deux semaines avant le début des procédures, afin de réduire au maximum le stress animal. Une habituation à la manipulation sera réalisée de façon quotidienne après la première semaine d’acclimatation, jusqu’au début de la procédure. Certaines procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront pesés et suivis quotidiennement à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, décritz pour chaque procédure, afin de les soustraire à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites specifiques. Des soins péri- et post-opératoires seront également réalisés. Les souris anesthésiées seront placées sur une plaque chauffante (37°C) immédiatement après les anesthésies afin de maintenir leur température corporelle jusqu’à leur réveil de l'anesthésie. Une application de gel au niveau des yeux sera réalisée à intervalles réguliers jusqu’au réveil pour lubrifier la surface oculaire et de prévenir la déshydration, ainsi que l’apparition d’éventuelles lésions de la cornée. La pose des ligatures au niveau des molaires n'est pas une procédure douloureuse. Elle nécessite cependant d’être réalisée sous anesthésie générale car elle nécessite le maintien d'une ouverture buccale de la souris pendant quelques minutes. Nous ne pourrons cependant pas administrer d'anti-inflammatoires en cas de douleur, car ces médicaments pourraient interférer avec les expériences réalisées. Cependant, les gestes réalisés et notamment la pose de ligatures ne sont pas des gestes douloureux et ne nécessitent pas la mise en place d'un traitement antalgique.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé en immunologie, en particulier dans le domaine de l'auto-immunité, le système immunitaire des souris étant proche du système immunitaire humain. Nous disposons de nombreuses techniques d'analyse du système immunitaire chez la souris et de l'expérience requise pour le suivi des réponses immunitaires chez la souris, ce qui nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 12 semaines, qui sont des souris avec système immunitaire complètement mature et chez qui la croissance osseuse du maxillaire et la physiologie du parodonte sont établies.