Procédures modérées

Pour tester si le rétablissement du rythme naturel de sécrétion de l'hormone de croissance freine l'atteinte du foie, 48 souris rendues malades d'une glycogénose vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. À sept jours de vie, un morceau de queue leur est prélevé pour le génotypage, puis viennent cinq jours d'injections, une chirurgie de trente minutes pour poser un cathéter dans la veine jugulaire et une pompe programmable, cinq jours de perfusion et un jeûne de six heures avant la mise à mort. La glycémie se mesure sur une goutte de sang obtenue en sectionnant l'extrémité de la queue, ce que le porteur décrit comme douloureux. Il indique que ces souris peuvent faire des hypoglycémies sévères avec un mal-être important, et que la gestion de l'élevage laisse subsister 1 à 2 % de décès, généralement la nuit.

Objectifs

Alors que le diabète se caractérise par trop de sucre (glucose ; hyperglycémies) dans le sang, la glycogénose de type 1 est une maladie métabolique rare qui entraine des hypoglycémies (baisse du glucose dans le sang) pouvant être fatales. Elle est due à des mutations génétiques d’une enzyme qui permet à l’organisme de produire du glucose en dehors des périodes de prise alimentaire, pour maintenir un taux de glucose sanguin stable (1g/L). Une prise en charge nutritionnelle est basée sur la consommation de sucres complexes comme la Maïzena et sur une prise alimentaire régulière y compris la nuit. Ces patients développent aussi un foie gras, et environ 80% de ces patients présentent des tumeurs du foie. Contrairement à ce qui est observé chez la plupart des diabétiques, la maladie hépatique ne progresse pas avec la même incidence entre les femmes et les hommes et n’évolue pas vers le stade de cirrhose. Grâce au développement d’un modèle de souris viables reproduisant toute la pathologie du foie de la glycogénose, il a été montré un défaut de sécrétion de l’hormone de croissance. Cette hormone, produite par l’hypophyse, a la particularité d’être sécrétée différemment chez les mâles (de façon pulsatile) et les femelles (en continu à faible niveau), ce qui lui confère des effets sexe-dépendants sur un de ses organes cibles qu’est le foie. Cette pulsatilité de sécrétion est perdue chez les souris mâles atteints de glycogénose, ce qui pourrait expliquer l’évolution particulière de la maladie du foie dans cette maladie. Notre projet consiste à évaluer l’effet de la libération physiologique de l’hormone de croissance en rétablissant la pulsatilité de sécrétion de l’hormone de croissance chez des souris atteintes de glycogénose. Ceci sera réalisée grâce à une mini-pompe programmable délivrant l’hormone dans la circulation sanguine. L’importance de la pulsatilité sera évaluée par comparaison à des souris traitées avec une dose supra-physiologique quotidienne unique, qui reflète le mode de traitement administré chez l’homme. Le non-respect de la pulsatilité pourrait avoir un impact non négligeable sur l’évolution à long terme de la maladie hépatique de la glycogénose.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie hépatique associée à la glycogénose. A partir de nos données préliminaires démontrant un défaut de sécrétion de l’hormone de croissance, nous avons émis l’hypothèse que le rétablissement de sa sécrétion à des rythmes physiologiques devrait permettre de retrouver un contexte hépatique similaire à ce qui est observé chez les patients diabétiques obèses qui présentent aussi un foie gras. Dans le cadre de la glycogénose, quelques rares données suggèrent des perturbations hormonales, en particulier une diminution de la sécrétion de l’hormone de croissance. Ceci explique les retards de croissance observés chez ces patients. Notre étude devrait mettre en évidence que ces perturbations hormonales ont un impact plus large, en particulier sur la progression de la maladie hépatique. Nos résultats pourraient être importants pour la prise en charge d’autres pathologies puisque la pulsatilité de la sécrétion de l’hormone de croissance n’est jamais prise en compte dans les traitements chez l’homme. Une délivrance plus physiologique de cette hormone pourrait éviter les effets secondaires liés à son injection chronique à des doses supra-physiologiques.

Procédures

Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un petit morceau (1mm) de tissu sera prélevé à l’extrémité de la queue pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. A l’âge de 6-8 semaines, les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris). Environ 4 mois après le développement de la glycogénose, une partie des souris subira une chirurgie afin de poser un cathéter en veine jugulaire et une pompe programmable permettant la délivrance pulsatile d’hormone de croissance. La chirurgie devrait durer au maximum 30 min. Après une période de récupération post-opératoire d’au moins 1 semaine, les souris seront perfusées soit avec une solution d’hormone de croissance, soit avec du sérum physiologique, de façon pulsatile (changement de débit toutes les 3h), pendant 5 jours. Un autre lot de souris subira 1 injection quotidienne d’hormone de croissance pendant 5 jours (quelques secondes/souris). Un groupe de souris saines injectées avec du sérum physiologique constituera le groupe de référence (quelques secondes/souris) pendant 5 jours. En fin de protocole (5 jours après le début des traitements à l’hormone de croissance), les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Une mesure de glycémie sera réalisée à partir d’une goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue dès 2h30 de jeûne. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. Le prélèvement durera environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

A l’âge de 7 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie de la queue afin de les génotyper. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. L’induction de la glycogénose sera obtenue après une série d’injections en sous-cutané pendant 5 jours, à l’âge de 6-8 semaines, pouvant engendrer une légère douleur. L’immobilisation de la souris ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Ces souris peuvent développer des hypoglycémies sévères si elles ne s’alimentent pas régulièrement. Dans ce cas, les souris présentent un mal-être important lié à l’hypoglycémie. Actuellement, la gestion de l’élevage permet de limiter les décès liés aux hypoglycémies sévères, mais 1 à 2% de décès peuvent être rencontrés généralement durant la nuit. Les hypoglycémies peuvent être plus fréquentes lors de l’anesthésie et lors de la mise à jeun en fin de protocole. La glycémie sera mesurée à partir d’une goutte de sang obtenue après section de l’extrémité de la queue ce qui entraine de la douleur Au-delà de 15 mois de maladie, ces souris peuvent développer des tumeurs du foie. Dans ce projet, les souris seront mises à mort au plus tard 6 mois après l’induction de la maladie. Après 4 mois d’induction de la maladie, certaines souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un cathéter en veine jugulaire et d’une pompe programmable permettant la délivrance pulsatile d’hormone de croissance. Le risque d’hémorragie lors de la chirurgie est très faible et la chirurgie est susceptible de provoquer de la douleur. Un autre lot de souris subira 1 injection/jour pendant 5 jours, ce qui peut induire une légère douleur. L’immobilisation de la souris pour ces injections ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. La piqure entraine une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et les testicules afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires

Remplacement

Même s’il est maintenant possible de produire des petits organes en culture qui intègrent les différents types de cellules du foie, la pathologie hépatique de la glycogénose met en jeu un dialogue complexe entre ces cellules du foie et les cellules du système immunitaires de la circulation sanguin ainsi que des régulations hormonales. Une étude préliminaire réalisée in vitro sur des cellules du foie de souris traitées avec de l’hormone de croissance de façon cyclique a permis de valider notre hypothèse de travail. Cependant, il est important maintenant de conserver la physiologie de l'organisme pour comprendre les mécanismes initiés par la pulsatilité de l’hormone de croissance sur le foie. Ce projet nécessite donc de travailler avec un modèle animal permettant de maintenir les interactions inter organes. Dans le cadre de cette étude, l’hypothalamus, l’hypophyse, les testicules, le foie et le sang seront prélevés pour étudier en détail l’ensemble des régulations à l’échelle de l’organisme.

Réduction

-Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 10 souris maximum, permettront de réaliser à la fois les études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. -Dans le but de réduire le nombre d’animaux à produire, certains animaux sont des souris déjà utilisées dans un autre protocole, sans avoir subi de procédures sévères entrainant un mal-être ou une douleur importante. -Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera au maximum 48 souris, incluant l’obtention de 22 nouvelles souris transgéniques et de 26 souris « réutilisées ».

Raffinement

-La pathologie est induite uniquement dans le foie des souris à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies sévères qui peuvent être fatales et de passer la période néonatale. -Contrôle des risques d’hypoglycémie en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes dans la cage et tétines de biberon longue). En cas d’hypoglycémie, une solution de sucre (glucose) sera administrée à la souris et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle. Les animaux seront entraînés à recevoir du glucose à la pipette par voie orale avant l’induction de la maladie. -Afin de limiter la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones qui peuvent être douloureuses. -Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Elle sera réalisée dans des conditions d’asepsie afin d’éviter tout risque d’infection. Afin de limiter au maximum le risque d’hypothermie pendant la chirurgie, un module permettant de chauffer la boîte à induction et un tapis chauffant seront utilisés. La glycémie sera aussi contrôlée régulièrement afin d’intervenir au plus tôt pour administrer une solution de sucre. Enfin, tout le suivi post-opératoire se fera dans une pièce permettant de garder les souris à thermoneutralité. Un suivi de poids hebdomadaire, puis quotidien pendant la période post-opératoire permettra d’identifier une perte de poids anormale de l’animal. La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet.

Choix des espèces

En ce qui concerne la régulation de la glycémie, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux, comme la souris, dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle de souris transgéniques reproduit toute la pathologie humaine de la glycogénose, y compris le développement de tumeurs. Le protocole sera débuté chez des souris adultes âgées d’au minimum 6 à 8 semaines. L’induction de la glycogénose sera réalisée à l’âge adulte ce qui permet d’éviter l’apparition de retard de croissance dû à la maladie et de passer la période périnatale sans phénotype dommageable. Les perfusions seront réalisées 4 mois après le développement de la glycogénose. Seule la biopsie caudale pour génotypage sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7 jours.

4 800 souris et 1 440 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, un même groupe passant jusqu'à trois des cinq protocoles, et les souris modèles de trisomie 21, de syndrome de l'X fragile ou de narcolepsie les cinq, parce qu'elles sont disponibles en quantités limitées. Souris et rats sont placés dans le labyrinthe de Barnes, le labyrinthe en Y, le test de reconnaissance de nouvel objet, le rotarod et le test des trois chambres, avec pour une version une restriction alimentaire sur huit jours et, pour une autre, une lumière et un bruit forts destinés à les pousser vers un refuge. Des candidats médicaments leur sont administrés à différents moments du protocole. 1 320 animaux contrôles pourront être réutilisés dans d'autres projets, les autres sont tués, à commencer par ceux dont le traitement risquerait d'interférer avec une expérience ultérieure.

Objectifs

Il existe de multiples formes de mémoire chez l’humain, avec notamment la mémoire déclarative (ou explicite, que l’on peut verbaliser), qui est perturbée dans de nombreuses pathologies telles que la maladie d’Alzheimer, la schizophrénie, l’autisme, ou encore des maladies génétiques telles que la trisomie 21, le syndrome de l’X Fragile… Afin de chercher des pistes thérapeutiques à ces pathologies, il est nécessaire de passer par des tests chez l’animal, et donc de pouvoir évaluer leur mémoire déclarative de manière objective, car ils ne peuvent pas la verbaliser. Différents types de tests comportementaux ont été mis au point dans ce but, en utilisant des stratégies distinctes. Un première stratégie vise à approcher la mémoire déclarative humaine chez l’animal en mettant en jeu un sous-type de cette forme de mémoire, la reconnaissance/familiarité, qui peut être évaluée chez le rongeur. Le test le plus utilisé est celui de reconnaissance de nouvel objet, que nous utiliserons dans ce projet. Une seconde stratégie utilisée pour évaluer la mémoire chez l’animal repose sur un parallèle existant entre mémoire déclarative humaine et mémoire spatiale animale, qui reposent toutes les deux sur les mêmes structures cérébrales et qui partagent des mécanismes. Divers dispositifs ont été validés dans la littérature afin d’étudier cette mémoire spatiale chez la souris et le rat, et nous en utiliserons deux dans ce projet : le labyrinthe de Barnes et le labyrinthe en Y. Grâce à ces trois tests comportementaux évaluant des types de mémoire différents, nous avons pour objectif de tester l’effet sur la mémoire de nouveaux candidats médicaments développées dans notre centre de recherche (dont la majorité ont pour cible des récepteurs du système nerveux central). C’est pourquoi nous travaillerons tout d’abord sur des animaux standards dans un contexte physiologique afin de tester l’effet sur la mémoire des composés en conditions basales. Nous prévoyons aussi d’utiliser des modèles murins de pathologies génétiques (Trisomie 21 et syndrome de l’X Fragile) afin d’étudier l’effet bénéfique potentiel de nos composés pour réduire les déficits cognitifs présents dans ces modèles.

Bénéfices attendus

A court terme, et à l’échelle du laboratoire dans le développement préclinique de nouvelles entités pharmacologiques, ce projet permettra de caractériser l’effet de ces entités sur différents types de mémoire (reconnaissance d’objet, reconnaissance spatiale et sociale, mémoire à court ou long terme, flexibilité cognitive, mémoire procédurale). En travaillant tout d’abord chez des animaux standard en condition physiologique, on pourra ainsi sélectionner des composés présentant des effets pro-mémoire intéressants pour des applications dans des pathologies comportant des déficits mnésiques (exemples : maladie d’Alzheimer, schizophrénie, autisme…). Où à l’inverse, nous pourrons par exemple exclure du développement préclinique des molécules ayant un effet néfaste sur la mémoire. D’autre part, ce projet inclus trois modèles murins de maladies génétiques (trisomie 21, syndrome de l’X Fragile et narcolepsie), qui permettront de tester l’effet de nos nouvelles entités pharmacologiques sur les déficits cognitifs présents dans ces pathologies. Ainsi, à plus long terme et à l’échelle du développement clinique, ce projet pourrait permettre de fournir des données scientifiques précliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments.

Procédures

Ce projet comporte 5 protocoles différents et indépendants. Dans le cas d’utilisation de souris et de rats standards, un même groupe de souris pourra être testé au maximum dans 3 des 5 protocoles. En revanche, dans le cas de l’utilisation des 3 modèles souris de la trisomie 21, du syndrome de l’X Fragile et de la narcolepsie, les mêmes souris seront soumises aux 5 protocoles car ces souris sont disponibles en quantités limitées. Le premier protocole est le test du labyrinthe de Barnes. Ce protocole sera déroulera sur plusieurs jours (une à deux semaines), et pour chaque journée chaque animal ne sera testé dans le labyrinthe qu'une à trois fois pour une durée de 3 minutes maximum chacune. Le second protocole est le test du labyrinthe en Y, qui pourra se décliner en 3 versions différentes. La première version se fera en un seul essai de 8 minutes ; la seconde version impliquera une restriction alimentaire légère (pour motiver la recherche de récompenses alimentaires) et se déroulera sur 8 jours avec au maximum 3 essais par jour de quelques minutes ; la troisième version aura lieu sur 1 à 2 jours avec 2 essais de 5 min séparés de 1h à 24h. Le troisième protocole de ce projet est le test de reconnaissance de nouvel objet. Ce test a lieu sur 2 jours, avec trois phases de 5 à 10 minutes chacune au sein du dispositif et séparées de 4-5h à 24h. Le quatrième protocole est le test de rotarod qui comporte 2 à 5 jours d’apprentissage comportant 1 à 4 essais par jour, avec un test de rappel composé de 1 à 4 essais 2 à 7 jours plus tard. La durée de chaque essai sera inférieure à 5 minutes. Le cinquième et dernier protocole est celui du test des 3 chambres, qui comporte 3 phases de 10 minutes, avec un délai entre les deux dernières phases allant de 1 min à 24h. Pour chacun des 5 protocoles de ce projet, des candidats médicaments seront administrés aux rongeurs à différentes phases du protocole (avant l’entraînement, avant le test de mémoire…) selon l’effet recherché.

Impact sur les animaux

Parmi les effets indésirables attendus sur les rongeurs, on aura le stress de la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. De plus, dans le cadre d'un protocole spécifique, les rongeurs pourront être soumis à une courte période de restriction alimentaire. Pour un autre protocole, la lumière et le bruit ambiant seront forts pour motiver la recherche d'un refuge dans un labyrinthe, et seront donc source de stress chez les animaux. Enfin, toutes nos procédures impliquent une manipulation des animaux pour les introduire dans les différents dispositifs, ce qui est source de stress, mais qui sera atténué par une habituation préalable et par le transport dès que possible via des tunnels ou sur le bras de l'expérimentateur pour éviter le soulèvement par la queue.

Devenir

Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort, tout comme les souris modèles de pathologies génétiques qui ne peuvent pas être réutilisées dans d'autres projets. Cependant, les animaux contrôles standards pourront être réutilisés dans d’autre projets selon les objectifs de recherche. La décision sera prise par le responsable projet (ou par une personne compétente désignée par lui) ou par le vétérinaire.

Remplacement

Ce projet ayant pour but de tester l’action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire normale et pathologique, il est nécessaire de passer par des modèles animaux avant toute administration à l’homme. En effet, l’évaluation d’un processus aussi complexe et intégré que la mémoire, mettant en jeu de multiples aires cérébrales ne peut être réalisée in vitro ou in silico.

Réduction

Un effectif minimum de 16 souris/12 rats par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques, au vu de la variabilité attendue du comportement des rongeurs dans nos tests comportementaux. Ces tests statistiques nous permettront en effet de déterminer pour chaque expérience s’il existe bien une différence entre notre groupe contrôle et notre/nos groupe(s) traités avec des composés pharmacologiques.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 5 jours après l’arrivée des animaux est prévue avant le début des expérimentations. Tout au long des études, les animaux sont hébergés e, groupe dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, igloo, appareil de nidification…), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), et font l’objet d’un suivi du bien-être par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Chaque animal est manipulé et pesé quotidiennement en phase active de protocole afin de diminuer le stress induit par la manipulation. Autant que possible, les animaux seront placés de manière transitoire dans des cages de transfert individuelles après l’administration de produits afin de réduire le stress induit par le replacement de l’animal au sein de ses congénères.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont très classiquement utilisés dans la littérature au sein de tests comportementaux évaluant la mémoire, et les protocoles sont bien établis pour ces deux espèces, en particulier pour les trois tests utilisés dans ce projet. De plus, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire telle qu’elle est testée chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire humaine, avec même des tests mnésiques réalisés chez la souris qui peuvent être transposés de manière très fidèle chez l’humain. D’autre part, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d’avoir des effectifs permettant d’avoir une robustesse des résultats statistiques, et pour lesquelles les quantités nécessaires de lots de recherche synthétisés par la chimie sont minimes. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. En effet les tests de mémoire sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités cognitives et d’attention fonctionnelles.

Une goutte ophtalmique dans l'œil droit chaque jour pendant douze à vingt-quatre jours, une biopsie de queue chez les nouveau-nés, un examen des yeux sous anesthésie générale puis un prélèvement sanguin : 2 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent une mutation qui les rend progressivement aveugles, et sont utilisées pour tester quatre composés contre la dégénérescence rétinienne. Les souris dont le génotype ne correspond pas à celui attendu sont tuées dès l'élevage, comme les femelles une fois accouplées. L'effectif de 2 650 n'est rattaché à aucun calcul, le porteur indiquant seulement que les accouplements ont été calculés d'après les expériences antérieures.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de 4 composés dans le traitement de la dégénérescence rétinienne, due au défaut d’un gène, dans des modèles de souris porteurs de mutation de ce gène.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’efficacité d’un ou plusieurs composé(s) chimique(s) pour traiter la dégénérescence rétinienne provenant de mutations génétiques connues et représentant une cible thérapeutique majeure pour la dégénérescence rétinienne. Ce composé a déjà montré des résultats prometteurs in vitro et in vivo après une administration intrapéritonéale.

Procédures

Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue de 1 à 2 millimètres sera prélevée. Les animaux seront soumis à 1 goutte ophtalmique dans l’œil droit (environ 10 secondes/administration) tous les jours pour une durée allant de 12 à 24 jours. Les animaux seront soumis à une évaluation de l’état des yeux par un examen ophtalmologique réalisé le dernier jour de traitement, sous anesthésie générale et sur un tapis chauffant (environ 15min/examen). Enfin, à la fin de l’examen ophtalmologique, chacun des animaux sera soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie générale (30 secondes/prélèvement).

Impact sur les animaux

La maladie provoque une atteinte de la vue progressive allant jusqu'à la cécité. Ce phénotype est dommageable même si les souris aveugles ont un comportement tout à fait normal, sans souffrance apparente. Administrations ophtalmiques répétées : risque d’inflammation oculaire. Injection intrapéritonéale d’anesthésique : léger stress et risque d’hypothermie Examen ophtalmologique : risque de cataracte transitoire Prélèvement submandibulaire : léger stress

Devenir

A l’issue de la procédure d’élevage les animaux sont mis à mort après accouplement ou si leur génotype n’est pas celui attendu. Concernant les protocoles thérapeutiques, les animaux sont mis à mort et les organes seront recolletés post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Les recherches préliminaires ayant permis l’identification des molécules thérapeutiques qui font l’objet de cette étude ont été menées sur des cellules issues des patients afin de limiter le recours à l’expérimentation animale. Néanmoins, compte tenu de l’absence de modèle cellulaire permettant l’étude d’une rétine, il n’a pas été possible de substituer des approches cellulaires aux modèles de souris impliqués dans ce projet à visée thérapeutique.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien à nos expériences. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux. De plus, un seul œil sera traité, permettant de conserver l’œil controlatéral comme contrôle interne.

Raffinement

Les souris seront surveillées par les membres qualifiés de l'animalerie et par les responsables du projet afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, du coton, des maisonnettes en carton et des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger seront ajoutés dans la cage. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum et sont surveillés après l’intervention pour vérifier qu’ils sont bien réacceptés par leur mère. Les examens ophtalmologiques seront réalisés sur une surface chauffante, sous anesthésie générale après injection d’un mélange de produits anesthésiques adaptés. L’application de points limites stricts et spécifiques au projet conduira à prendre en charge la douleur et la souffrance éventuelle des animaux.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, l’œil est un organe facilement accessible et l’organisation structurale de la rétine d’une souris est très proche de celle de l’homme. La validation thérapeutique du composé sera initiée à 6 jours de vie (avant l’ouverture des yeux et le début de la dégénérescence rétinienne) et sera poursuivie jusqu’à un stade suffisamment évolué de la maladie pour différencier les souris contrôles des souris porteuses de la maladie, mais suffisamment précoce pour observer un effet thérapeutique, soit 18 ou 21 jours pour le modèle présentant une atteinte rétinienne précoce ou 30 jours pour celui présentant une atteinte rétinienne progressive.

100 rats porteurs de mutations du gène CLCN4 vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils passent une batterie de tests entre douze et vingt semaines d'âge, activité locomotrice et anxiété pendant trente minutes, coordination, force musculaire, comportement compulsif, apprentissage et mémoire sur huit jours, plus trois nuits d'isolement en cage individuelle pour évaluer un état dépressif. La mise à mort sert à prélever les organes pour des analyses histologiques et protéomiques. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de comprendre cette maladie neurodéveloppementale rare par un modèle animal, et conclut que seul l'animal permet d'en caractériser les symptômes, les approches in vitro se limitant selon lui aux mécanismes.

Objectifs

La maladie liée au gène d'intérêt est une maladie neurodeveloppementale rare liée au chromosome X. Elle affecte les deux sexes et est associée à une déficience intellectuelle, à l'épilepsie, à des problèmes gastro-intestinaux et à des troubles du mouvement et du comportement. Ce gène code pour une protéine dont la fonction et le mode d'action n'est pas encore bien compris. Ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie de ce syndrome et les développements thérapeutiques potentiels. Les besoins médicaux des patients souffrant de cette pathologie restent largement insatisfaits. Seules des thérapies multidisciplinaires de soutien sont disponibles. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie en utilisant un modèle animal approprié.

Bénéfices attendus

Étant donné l'absence actuelle de modèle animal approprié pour cette pathologie, nous pensons que si la caractérisation des modèles de rats montre une récapitulation précise des symptomes associés à cette maladie, les résultats du travail proposé auront un impact significatif : Cela ouvrira la voie à une analyse plus approfondie des aspects génétiques, fonctionnels et cliniques de la maladie, avec la possibilité de générer des données significatives et translationnelles, et ainsi mieux comprendre la physiopathologie. Ce projet nous permettra ainsi d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie du syndrome et les développements thérapeutiques potentiels.

Procédures

Nous allons réaliser les tests d'exploration fonctionnelle suivants de 12-20 semaines d'âge, chacun des tests étant réalisé une seule fois : Mesure de l'activité locomotrice et anxiété (30 minutes) observations cliniques (5 à 10 minutes); tests de coordination (4 sessions de 20 minutes maximum en 2 jours + 18 minutes au total sur 3 jours); test de force musculaire (5 minutes environ); test pour évaluer des troubles compulsifs (30 minutes); test d'apprentissage et mémoire (45 minutes au total en 8 jours); AMENDEMENT-1 - ajout d'un test pour évaluer la dépression (3*16h); test pour évaluer la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie; le suivi du poids des animaux (1X/semaine); prélèvement des fécès (30 secondes) et prélèvement sanguin (30 secondes) sous contention rapide AMENDEMENT-1 - sous anesthésie. L'ensemble des animaux de l'étude recevront pour le test de la fonction musculaire, une injection d'anesthésique et une autre de son réversant. AMENDEMENT-2: Le prélèvement et fixation des organes sera réalisé sous anesthésie profonde

Impact sur les animaux

Une des mutations ponctuelles induit un léger phénotype, les mâles sont notamment plus chétifs, plus agressifs, ils peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Lors des injections d'anesthésique, les animaux sont maintenus en contention rapide de quelques secondes le temps d'injecter le produit, ce qui peut stresser un court instant l'animal avant d'être relaché dans sa cage. De même, la prise de sang pour les animaux qui ne seront pas perfusés au paraformaldéhyde (PFA), sera réalisée sous contention durant quelques secondes. AMENDEMENT-1 - une prise de sang sera effectuée sous anesthésie sur l'ensemble des animaux. AMENDEMENT-1 - Le test de préférence du saccharose nécessite d'isoler les animaux pendant 3 nuits, tout en gardant le contact visuel avec leurs congénères: les animaux seront placés seuls dans des cages d'hébergement de 17h à 9h le lendemain matin pendant 3 jours. De 9h à 17h, les animaux retrouveront leur cage et leur congénère d'origine. AMENDEMENT-2: Le prélèvement et fixation des organes sera réalisé sous anesthésie profonde.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques et de protéomique)

Remplacement

L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant des mutations dans le gène d'intérêt et d'observer si ces modèles sont représentatifs de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, déficience intellectuelle, hypotonie, troubles neurologiques, anomalies cérébrales, anxiété, comportement compulsif, déficit d'attention, constipation, difficultés d'alimentation, petite taille et microcéphalie. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptômes de la pathologie associés au gène d'intérêt.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 64 animaux mutants (16 mâles mutation 1 + 16 femelles mutation 1 + 16 mâles mutation 2 + 16 femelles mutation 2) et 32 animaux contrôles (16 mâles + 16 femelles) pour évaluer le phénotype des animaux. Les animaux contrôles seront mutualisés pour les deux mutations, permettant ainsi de réduire le nombre total de rats. Ce nombre de rats permettra d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes. Afin de monter les cohortes expérimentales, nous allons réaliser un type de croisement qui va générer des animaux tous potentiellement constitutifs de la cohorte expérimentale, ce qui permet de limiter fortement le nombre d'animaux générés.

Raffinement

Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâton à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. Le type de croisement choisi pour monter cette cohorte expérimentale permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer la cohorte et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs dans la colonie et ainsi ne pas avoir d'animaux avec un potentiel phénotype dommageable (puisque seul les mâles sont atteints). Les animaux auront passé une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors des différents transferts de leur cage d'hébergement vers les différents tests. Dans le test impliquant de l'eau, les rats après les séances, seront séchés à l'aide d'une serviette puis placés sous une lampe chauffante afin d'être parfaitement secs au moment du retour dans leur cage d'hébergement. Lors de l'anesthésie, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur. AMENDEMENT-1 - L'isolement des animaux lors du test de préférence du saccharose (3*16h) se déroulera dans des cages d'hébergement avec enrichissement (nid, bâton et balle à ronger). Ces cages sont transparentes et les animaux continueront d'avoir un contact visuel avec leurs congénères.

Choix des espèces

Le modèle rat portant des mutations dans le gène d'intérêt permet de reproduire tout ou partie des symptômes de la pathologie observés en clinique humaine (données préliminaires). Par ailleurs, le gène d'intérêt du rat se trouve sur le chromosome X comme chez l'Homme, contrairement à la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le calendrier échelonné des divers tests de phénotypage démarrera à l'âge de 12 semaines, et durera 6-8 semaines pour réaliser l'ensemble des tests.

Biopsie de la queue sur le souriceau vigile, puis à l'âge adulte une chirurgie d'une heure et demie sous anesthésie, ou deux chirurgies d'une heure espacées de deux semaines. Une semaine plus tard commencent les tâches de locomotion fine, un jour sur deux pendant six semaines, jusqu'à dix-huit séances et dix-huit heures par animal. 2 151 souris passent par ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 477 d'entre elles et modéré pour 674, afin de cartographier une voie nerveuse reliant le cortex à la moelle épinière. Deux lignées reproduisent la sclérose latérale amyotrophique : les animaux sont utilisés avant l'apparition des symptômes, les reproducteurs gardés quelques jours au-delà des premiers signes, et tous sont tués pour prélèvement.

Objectifs

Le projet vise à caractériser le rôle d’une connexion entre le cortex et la moelle épinière via une région appelée formation réticulée, dans la motricité des pattes postérieures de la souris. Cette connexion existe mais est peu étudiée. Nous cherchons maintenant à caractériser son anatomie plus précise (cartographie), ainsi que le rôle de ces neurones dans une situation physiologique, chez l’animal éveillé libre de ses mouvements. Plus pécisément, nous avons pour objectif de : 1) effectuer la cartographie complète de cette voie, 2) analyser les conséquences de perturbations de cette voie (inhibition ou ablation) sur les comportements moteurs des souris, 3) identifier les neurones de cette voie en enregistrant leur activité électrique grâce à des électrodes, , et corréler leur activité avec le comportement observé, 4) identifier si cette voie est impliquée dans des modèles animaux de sclérose latérale amyotrophique.

Bénéfices attendus

Les fonctions de la connexion entre le cortex et la moelle épinière via une région appelée formation réticulée sont encore mal connues, mais elle pourrait servir à compenser l’atteinte d’autres voies (celle directe entre le cortex et la moelle épinière) lors de situations pathologiques (sclérose latérale amyotrohique, lésion traumatique de la moelle épinière, etc.). Notre projet permettra de caractériser l’activité de ces neurones dans le cadre d’un comportement moteur, et ainsi de poser des hypothèse sur les conséquences de leur atteinte en situation pathologique.

Procédures

Les souriceaux seront soumis à une biospie de queue réalisée sur animal vigil (durée: quelques secondes). Les animaux adultes subiront, sous anesthésie, soit une chirurgie unique durant environ 1,5 heure, soit deux chirurgies à 2 semaine d'écart, chacune durant au plus 1 heure. Au minimum une semaine après la dernière chirurgie, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine. Ces tâches durent une dizaine de secondes et sont répétées pendant un maximum 1h, à raison d’un jour sur deux, pendant jusqu’à 6 semaines. Au maximum chaque animal sera donc testé 18 fois, pendant 18 heures au total.

Impact sur les animaux

La biospie de queue entraine une douleur légère de courte durée. Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours. Les tests comportementaux envisagés peuvent également être source de stress pour les animaux. Deux lignées de souris modèles de la sclérose latérale amyotrophique sont utilisées. Toutefois, nous nous intéressons à ce qui se passe avant le développement des symptômes de la maladie, donc les animaux utilisés pour les expériences de comportement et les enregistrements ne présenteront pas de symptômes. Seuls les animaux nécessaires à la reproduction pourront être gardés quelques jours après l’apparition des tous premiers symptômes (position anormale ou tremblement du membre postérieur lors du test de suspension par la queue, ou arrêt de la prise de poids), tant qu’il n’y a pas de paralysie ou d’atteinte de la locomotion.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Le projet porte sur la voie cortico-reticulo-spinale, c’est-à-dire un circuit complexe comprenant plusieurs noyaux du cerveau et la moelle épinière. Un tel circuit est impossible à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doit être intact pour pouvoir être étudié. Il est impossible à modéliser numériquement car les propriétés des différents éléments sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et obtenir des résultats spécifiques de genre. Les expériences seront effectuées de façon séquentielle, afin de disposer des résultats de la cartographie et des expériences pilotes avant d’effectuer les expériences de comportement. Un arbre décisionnel précis permet de n’effectuer ensuite que les lots pour lesquels la faisabilité est avérée, ce qui permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de necessite des decisions seront prises en accord avec le veterinaire, la Structure chargee du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour une prise en charge adaptee des animaux. Des animaux qui ne subissent par les chirurgies sont herbergés avec les animaux tests. Ils sont présents sur la plateforme d’arrivée des tests de comportements, réduisant ainsi le stress des animaux tests et les motivant à faire les tâches sans qu’une restriction hydrique soit nécessaire.

Choix des espèces

L’étude de la communication entre le cortex et les circuits locomoteurs spinaux requiert l’utilisation de mammifère. La souris est un modèle largement utilisé dans l’étude du cortex moteur, et des comportements locomoteurs. De plus, nous avons la possibilité de mimer chez la souris les mutations génétiques que l’on peut retrouver dans les formes familiales de sclérose latérale amyotrophique, ce qui n’est pas possible dans d’autres espèces. Les animaux sont utilisés à partir de 30 jours après la naissance, car c’est l’âge à partir duquel la voie de communication entre le cortex et la moelle a fini son développement