Procédures modérées

Issus autant que possible d'études antérieures et destinés à d'autres études ensuite, 40 cochons et 40 chiens vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le personnel en formation s'exerce sur eux aux gestes techniques du laboratoire, sans produire de connaissance. Sur animal vigile, ils reçoivent des injections par voie orale, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse et jusqu'à quatre prises de sang de 0,5 à 2 mL, dans la limite de 20 % du volume sanguin sur 24 heures, et sous anesthésie une ponction de liquide céphalorachidien d'environ une heure. Le porteur affirme que les méthodes de substitution "n'existent pas ou, si elles existent, elles ne sont pas suffisantes", les gestes exigeant selon lui un animal vivant pour évaluer les critères de réussite.

Objectifs

L’objectif du projet est la formation du personnel en contact avec les animaux aux gestes techniques réalisés sur les chiens et les cochons. Il s'inscrit dans le cadre de l'acquisition de la compétence des expérimentateurs (arrêté du 1er février 2013, Bonnes pratiques de laboratoire, AAALAC). Ce projet reprend un certain nombre de gestes techniques couramment utilisés au sein du laboratoire et devant être acquis par les expérimentateurs. Cette formation permettra une totale maitrise des gestes techniques lors de l’inclusion en études des animaux. Ces gestes sont réalisés par du personnel en formation sous la supervision d'un expérimentateur formé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la maitrise de gestes techniques à réaliser sur les chiens ou les cochons par les expérimentateurs. La formation initiale des personnes doit être complétée par une fomation spécifique en fonction des études qu'elles seront amenées à faire pour maitriser les gestes en toute sécurité

Procédures

Dans ce projet, les animaux auront des injections par différentes voies (orale, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse) avec -2 min par administration. Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’animal vigile (2 minutes par prélèvement) et des prélèvements de liquide céphalo-rachidien seront réalisés sur animal anesthésié (durée d’environ 1h). Les prélèvements de sang seront en général de 0.5 à 2 mL, avec un maximum de 4 prélèvements et/ou dans la limite de 20% du volume sanguin total sur 24h. Les prélèvements de liquide céphalo-rachidien seront d’un volume maximal de 0,2 ml sur 7 jours. Pour le chien, le prélèvement d'urine sera à une fréquence de 2 fois sur 24h d'une durée totale de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux de ce projet pourront subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors de l'administration ou de l'anesthésie ou de prélèvement sanguin. Les gestes techniques enseignés et réalisés sous la supervision d’un expérimentateur formé ne doivent pas affecter la bonne santé / l'état général des animaux utilisés. En cas de mauvaise réalisation du geste concerné et/ou d'impact négatif sur l'animal, un échange se fera avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d'observation/de manipulation des animaux.

Devenir

Réutilisation des animaux dans une étude ayant un dégré de sévérité sans réveil ,léger ou modéré, après accord du vétérinaire.

Remplacement

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs éducatifs du projet. Avant tout début de formation, la formation débute par une partie théorique avec une personne expérimentée et certains gestes pourront être réalisés sans animaux. Les gestes à acquérir, par du personnel déjà formé aux techniques de base de l'expérimentation animale, imposent que l’animal soit vivant pour évaluer les critères de réussite.

Réduction

Dans la mesure du possible, les animaux seront issus d'études et seront utilisés, après avis du vétérinaire, pour plusieurs gestes techniques de ce projet. Une supervision étroite garantira une utilisation des animaux en minimisant le risque d'erreur.

Raffinement

Les procédures seront réalisées par du personnel compétent déja formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire, mais devant acquérir une expertise supplémentaire. Ce personnel de formation sera sous la supervison d'une personne experte. Le raffinement sera obtenu par • La mise au point de procédures rigoureuses, , • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel ses signes cliniques et des points limites, •Des protocoles d'anesthésie et d'analgésie adaptés et maitrîsés, un suivi de l'état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés pour permettre une bonne récupération, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages. • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire. Ces phases de formation servent également de training et/ou de maintien d'exercice de travail afin que les animaux ne perdent pas leur niveau d'habituation acquis lors d'étude antérieur et pouvant servir lors d'étude postérieure.

Choix des espèces

Les espèces (porcs, chiens) qui seront utilisées dans ce projet correspondent aux espèces cibles autorisées pour l’établissement utilisateur, que les personnes en formation auront à manipuler au cours des expérimentations. Les animaux qui seront utilisés seront adultes. Pour les porcs, les animaux seront sevrés en croissance. Ce projet ayant pour but la formation du personnel, il n'aura pas pour objectif d'étudier d'autres stades de développement.

Les souris qui se grattent trop sont tuées sur-le-champ, le porteur écartant tout anti-inflammatoire au motif qu'il fausserait la réponse étudiée. 360 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever oreilles, peau du dos, ganglions, rate et sang. Elles sont rasées au ventre puis au dos, badigeonnées d'un produit allergisant et irritant, mesurées aux oreilles cinq fois par semaine sous anesthésie gazeuse pendant deux semaines, exposées à une lumière violette qui provoque une brûlure comparable à un coup de soleil, et pour certaines injectées dans le sinus de l'œil. L'objet est de suivre le devenir de cellules immunitaires de la peau, dans l'espoir déclaré de traitements empêchant les récidives d'eczéma.

Objectifs

Les eczémas allergiques tels que l’eczéma de contact (colorants, produits chimiques, nickel…) ou l’eczéma atopique (acariens, moisissures, poils de chien/chat…) se caractérisent par des lésions cutanées et sont dues à une réaction allergique. Ces eczémas touchent plus de 15% de la population. La cause des eczémas est complexe et reste mal comprise à ce jour. Ces dernières années, une population de cellules immunitaires (appelées Trm), ayant une fonction de mémoire à long terme et résidant dans les tissus a été mise en évidence. Ces cellules particulières patrouillent dans la peau à l’interface entre l’organisme et l’environnement. Il a été montré que ces cellules sont impliquées dans la récidive et la sévérité de l’eczéma. En effet, une des caractéristiques cliniques de l’eczéma est qu’il se développe sous forme de poussées, entrecoupées de périodes de rémission. Lors des poussées, dont la sévérité augmente généralement au cours du temps, les lésions reviennent préférentiellement sur les sites antérieurement atteints. Cette étude vise à évaluer le devenir des Trm au cours du temps (et notamment leur capacité à recirculer dans l’organisme). Puisqu’il a été montré que les Trm sont impliqués dans la récidive et la sévérité de l’eczéma, nous espérons que mieux connaitre le devenir de ces cellules nous permettra à terme de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées. En effet, les traitements actuels préconisés dans ces eczémas (notamment les dermocorticoïdes (anti-inflammatoires)), bien que permettant de soulager les symptômes de l’eczéma, ne permettent pas d’empêcher les récidives de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’eczéma et une meilleure compréhension du cycle de vie, et en particulier du devenir des cellules responsables des poussées d'eczéma.

Procédures

Dans toutes les procédures : les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 4 jours après, tous les animaux seront rasés et dépilés au niveau du dos, sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes). Le lendemain, tous les animaux recevront une application de produit allergisant sur leurs oreilles et sur leur dos. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie profonde (durée de l'anesthésie : environ 40 minutes), induite après injection d'un produit anesthésiant (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Dans toutes les procédures, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine, pendant 2 semaines maximum. Ces mesures seront effectuées sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes). Dans toutes les procédures, les animaux seront pesés 1 fois (durée de la pesée : 30 secondes). Dans toutes les procédures, les animaux recevront des injections à l'abdomen (procédures 1, 2 et 3 : 1 injection ; procédures 4 et 5 : 2 injections). Ce traitement sera réalisé sur animal vigile (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Dans toutes les procédures, les oreilles et la peau du dos des souris seront exposées à une lumière violette pendant une durée maximale de 10 minutes. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 10 minutes maximum). Dans les procédures 4 et 5, les animaux recevront une injection dans le sinus de l'oeil (durée de l'injection : 30 secondes). Cette procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes), après application d'un anesthésiant local (durée de l'application de l'anesthésiant : 30 secondes). Dans les procédures 4 et 5, les animaux seront également soumis à un prélèvement sanguin (durée du prélevement : 30 secondes), après application d'un anesthésiant local (durée de l'application de l'anesthésiant : 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur au point d’injection lors des injections dans l'abdomen et dans le sinus de l'oeil ; ii) le stress généré par l’anesthésie et/ou l'application d'une molécule allergisante sur la peau ; iii) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang et les injections dans le sinus de l'oeil ; iv) une légère inflammation au niveau de l'oeil suite à l'injection ; v) une légère inflammation (pouvant induire un grattage léger) au niveau des oreilles ou du ventre, après application de la molécule allergisante ; vi) une légère brûlure type coup de soleil au niveau des zones de peau exposées à la lumière violette.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever leurs oreilles, la peau du dos, leurs ganglions (et éventuellement leur rate et leur sang). Ces différents organes sont ensuite utilisés pour analyser la réponse immunitaire.

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet de récapituler de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. En effet, les cellules que nous étudions dans ce projet sont des cellules initialement circulantes, qui pénètrent dans le tissu suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal et recirculent ensuite progressivement dans l'organisme.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe expérimental est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. En effet, le nombre d’animaux nécessaire pourra diminuer en fonction des résultats obtenus. Par exemple, l'une des procédures sera scindée en 2 parties et la 2ème partie ne sera réalisée qu'en cas d'échec de la 1ère. D'autre part, seules 3 procédures sur les 5 seront réalisées dans ce projet (le choix des procédures réalisées dépendra du nombre d'animaux génétiquement modifiés obtenus (et de leur âge)).

Raffinement

Afin d'optimiser le bien-être des souris, nous réaliserons une observation clinique des animaux 5 fois par semaine (durant les 2 premières semaines de chacune des procédures) puis de manière hebdomadaire jusqu'à la mise à mort des animaux. Nous attacherons ainsi une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés (anesthésie volatile, profonde ou locale) pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non. L'application d'un produit anti-inflammatoire ou cicatrisant n'est pas envisageable pour les souris présentant des lésions d'eczéma car cela risquerait de perturber le déroulé de la réponse inflammatoire et donc d'impacter les cellules étudiées dans cette étude. Dès lors, les animaux présentant des signes de grattage excessif seront immédiatement mis à mort. D'une manière générale, les points limites de toutes les procédures ont été définis précisemment et consciencieusement afin d'éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier les pathologies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes et en raison de l’existence d’une grande variété de lignées transgéniques. De plus, de nombreux produits, spécifiques à l'immunologie ne sont disponibles que chez la souris. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de molécules inflammatoires ou l’induction de différentes populations de cellules mémoires. De plus, les travaux de recherche sur les cellules étudiées dans ce projet sont également réalisés chez la souris. Dès lors, dans l’optique de pouvoir confronter nos résultats à ceux obtenus par d’autres, l’utilisation du modèle murin est indispensable à notre étude. Nous utiliserons des animaux adultes de 6 semaines à 12 mois pour pouvoir induire une réponse immunitaire chez des animaux possédant un système immunitaire complètement mature. Nous avons choisi d'inclure des animaux de tous âges afin d’utiliser au mieux les animaux transgéniques qui seront disponibles et parce que nous savons, grâce à des expériences antérieures, que la réponse immunitaire que nous étudions est comparable chez des souris de 12 mois et chez des animaux plus jeunes.

208 rats des sables, des rongeurs diurnes de l'espèce Psammomys obesus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous seront tués pour des analyses de leur rétine. Sous anesthésie générale et locale, ces jeunes rats âgés de 10 à 20 jours reçoivent une injection sous la rétine destinée à inactiver, dans un œil, le gène en cause dans la maladie de Stargardt, puis ils sont transportés entre deux établissements pour des examens de la vision. Électrorétinogramme, tomographie et fond d'œil se font tous sous anesthésie, pour obtenir leur immobilité, alors que chez l'humain le premier se pratique sous anesthésie locale et les deux autres sans anesthésie, selon le porteur. "Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l'injection sous rétinienne et l'étude des cônes", conclut-il, en invoquant une rétine plus grande que celle de la souris et riche en cônes, 40 % contre 3 %.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte l’œil, et constitue la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche souvent des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, nommément la macula qui est riche en cônes. Les mécanismes pathogènes ont été largement analysés dans une souche de souris modifiée qui n‘exprime pas le gène responsable. Néanmoins, ces souris ne présentent pas les déficits observés chez les patients. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne appelé Rat des Sables (Psammomys obesus) présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa rétine riche en cônes ressemble fortement à celle de l’homme. L’objectif du projet qui est un projet multisite se déroulant dans deux établissements utilisateurs est de développer un nouveau modèle animal dans lequel le gène responsable sera invalidé spécifiquement dans la rétine. Les conséquences de la mutation induite seront étudiées par des méthodes non-invasives permettant de suivre la dégénérescence lente de la rétine grâce à l’évaluation longitudinale de la fonction de la rétine et à l'obtention d'images de l’œil. Des analyses cellulaires et moléculaires viendront compléter l’étude. Ainsi, ce modèle permettra d’éclaircir les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie de Stargardt. Si le modèle récapitule les caractéristiques principales de la maladie il sera utilisé dans une deuxième phase pour tester une thérapie génique, potentiellement capable de contrecarrer la dégénérescence et maintenir la fonction des photorécepteurs.

Bénéfices attendus

L’utilisation du modèle rongeur Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme chez l’homme, va permettre d’étudier les mécanismes de la maladie de Stargardt et de tester une potentielle thérapie génique. Il est évident que si des effets bénéfiques suite à l’administration de la thérapie géniques ont constatés, cela ouvre des perspectives importantes pour les patients atteints de la maladie de Stargardt, qui est actuellement sans traitement.

Procédures

Les procédures décrites dans ce projet comprennent une injection sous-rétinienne (EU1/2) et une analyse fonctionnelle de la vision à l'aide de méthodes non invasives, nommément électrorétinogramme (ERG, EU1/2), tomographie par cohérence optique (OCT, EU2/2) et fond d'œil (EU2/2). L'injection sous-rétinienne s’effectue sous anesthésie gazeuse suivie d’une anesthésie locale et de l’application d’un gel limitant le dessèchement de l’œil. Sa durée est d'environ 10 minutes pour chaque animal. ERG (< 60 minutes), OCT et fond d'œil (< 15 minutes) sont des méthodes non invasives, réalisées sous anesthésie car elles nécessitent l’immobilité de l’animal. Chez l’homme, elles sont réalisées sous anesthésie locale (ERG) ou sans anesthésie (OCT et fond d’œil).

Impact sur les animaux

L’injection sous-rétinienne chez les nouveaux nés de Psammomys obesus, n’engendre, en général, aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. Toutefois nous ne pouvons exclure l’apparition d’une infection, d’une inflammation ou de dommages à l’œil injecté lors de son développement ou d’une douleur transitoire. L’ERG et l’imagerie sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière mais une inflammation de l’œil n’est pas à exclure suite à l’ERG, même si son occurrence est minimisée à travers l’utilisation de gel ophtalmique. Le transport entre les deux EU pourra induire un stress aigu transitoire chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses ultérieures moléculaires et cellulaires de la rétine.

Remplacement

A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles (ce qui nous concerne ici). Toutefois, la technique de modification du gène responsable de la maladie de Stargardt a été validée par analyse génomique et par nos observations expérimentales précédentes.

Réduction

Pour la majorité des expériences chaque animal est son propre contrôle. A savoir un œil est injecté avec une construction contrôle et l’autre avec une construction qui permet d'obtenir l’inactivation du gène impliqué dans la maladie de Stargardt. Le nombre d'animaux a été évalué au maximum en prenant en compte le risque potentiellement engendré par l’injection, ainsi que la variabilité interindividuelle pour aboutir à des résultats significatifs lors de la comparaison entre l’œil contrôle et l’œil traité. Il s'agit également d'une étude où le même animal est suivi à plusieurs temps après injection (étude longitudinale) ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux utilisés. Dans cet avenant le nombre total d’animaux de la procédure 1 a été réduit car les données obtenues ont permis de déterminer que la dégénérescence débute précocement et que les temps de mise à mort tardifs initialement prévus ne sont pas nécessaires.

Raffinement

Afin de respecter / stimuler les interactions sociales, les animaux sont hébergés avec leur mère et leur fratrie jusqu’au sevrage, puis ensuite par groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe. L’environnement est enrichi (matériel de nidification, bâton à ronger, tunnel) afin de stimuler leur activité motrice. . Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum, qui est adaptée selon l’état physiologique des animaux (mère allaitante, animaux sevrés, adultes). Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux au stade de développement P10-20 sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale, à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’œil. Après l’intervention, l’application d’un gel ophtalmique permet d’éviter un desséchement de la cornée. Lors de l’ERG, de l'OCT et du fond d'œil, les animaux sont placés sous anesthésie, complétée d’une analgésie locale pour l’ERG. L’application de gel ophtalmique permet ici aussi d’éviter tout desséchement de l’oeil. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être : deux fois par jour le jour d’une intervention (injection, FO + OCT, ERG), puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté. En cas d’infection ou de douleur manifeste, les animaux seront mis à mort immédiatement selon une méthode adaptée à l’âge de l’animal. Les deux sites expérimentaux sont distants de moins de 10 km. Les animaux sont transportés entre sites expérimentaux, en présence de la personne habituée à les manipuler, dans des boites de transport pour animaux de laboratoire contenant litière et enrichissements type bâton et frisure, nourriture et eau gélifiée. Lors du précédent projet, les animaux n'ont montré aucun signe de stress à leur arrivée dans chacun des sites.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne Psammomys obesus. Par comparaison avec la souris, la rétine de Psammomys obesus est de plus grande taille et est enrichie en cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) de type cônes (40% versus souris 3%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’injection sous rétinienne et l’étude des cônes, qui sont impliqués dans la maladie de Stargardt. Nous utiliserons des animaux aux stades postnataux P10-20 (jours après la mise bas), car ce stade correspond à la période où la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans), et la protéine ciblée n’est encore que peu exprimée dans les photorécepteurs.

Injectées de cellules tumorales puis irradiées localement à faible dose sous anesthésie générale, 1 765 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées pour analyse des organes. Elles reçoivent jusqu'à cinq injections de traitement, deux gavages et une ponction sanguine. Le projet cherche à comprendre pourquoi seuls 10 à 30 % des patients répondent à l'association radiothérapie-immunothérapie, à partir d'une observation faite sur des malades dont l'intestin avait été irradié par erreur. Le porteur écrit que cette irradiation "n'induit pas de nuisance" et range la croissance des tumeurs greffées sous une "gêne locale modérée".

Objectifs

Les principales méthodes de traitement du cancer sont la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie et l'immunothérapie. La radiothérapie tue les cellules cancéreuses en provoquant directement des dommages définitifs à l'ADN. Elle peut également déclencher une réponse immunitaire anti-tumorale. La combinaison de la radiothérapie et de d'une immunothérapie pourrait donc avoir un effet antitumoral synergique. Cette nouvelle combinaison thérapeutique a d'abord été testée dans des modèles précliniques, puis validée dans quelques essais pionniers chez l'Homme avec des résultats prometteurs. Depuis, des centaines d'essais ont été lancés pour examiner cette combinaison thérapeutique dans divers cancers. Toutefois, il convient de noter que seuls 10 à 30 % des patients participant à ces essais ont présenté une réponse objective à ce traitement. Les mécanismes qui sous-tendent la résistance des patients au traitement restent insaisissables. De nouvelles stratégies sont nécessaires pour améliorer les résultats pour les patients. Nous avons mené un essai clinique de phase II pour évaluer l'efficacité thérapeutique d'un type de radiothérapie en combinaison avec l'immunothérapie dans le cancer métastatique. Le suivi à long terme suggère qu'environ 20 % des patients bénéficient du traitement avec une survie globale supérieure à 24 mois. L'objectif du projet est de tenter de déterminer les mécanismes de résistance mis en cause et d'améliorer la proportion de patients répondant bien au traitement.

Bénéfices attendus

L'étude de l'ADN des échantillons fécaux des patients traités indique que les répondeurs sont associés à un enrichissement de l'abondance des espèces bactériennes immunogènes. En outre, la moitié des patients recrutés dans cet essai ont subi une exposition hors cible de la zone intestinale à l'irradiation lorsque l'irradiation a été administrée à des métastases hépatiques. Il est frappant de constater que le nombre de patients ayant une survie à long terme est plus élevé dans le sous-groupe des patients ayant subi une irradiation non voulue que dans le sous-groupe des patients n'en ayant pas subi (38 % contre 5). Notre hypothèse est que cette irradiation pourrait stimuler la réponse des patients à l'immunothérapie en modulant la composition du microbiote intestinal. L'étude de cette irradiation pourrait fournir des indications importantes sur le traitement personnalisé du cancer et ouvrir la voie à de nouvelles thérapies. Nous nous attendons à trouver que la combinaison de cette irradiation et une immunothérapie conduisent à un effet synergique sur le contrôle de la tumeur. Cette étude fournira donc des informations importantes sur le traitement individualisé du cancer pour les patients et aidera à développer de nouvelles thérapies pour améliorer leurs résultats.

Procédures

Nous prélèverons le sang des souris par ponction (1 fois) sous anesthésie générale, durée une minute. Les souris recevront également une injection de cellules tumorales (1 fois, durée une minute), les souris recevront jusqu'à 5 injections pour traitement (durée 1 minute), sous anesthésie locale. Certains animaux auront des administrations par gavage (n=2), durée 1 minute. Les souris recevront une irradiation localisée sous anesthésie générale (durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans certaines procédures les souris seront irradiées localement à faible dose. L'irradation limitée et localisée n'induit pas de nuisance. L'implantation tumorale (1 fois) par injection sous anesthésie locale entraîne une douleur légère et transitoire. La croissance des tumeurs peut entraîner une gêne locale modérée. Les traitements peuvent entraîner des pertes de poids (assez rare, car selon nos études précédentes, il n'y a pas eu de perte de poids notable). Les administrations orales entraînent une contrainte transitoire légère de courte durée due à la préhension et au geste lui même.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Il n'y a pas de modèle de remplacement, car il est impossible de récapituler et reproduire toutes les interactions immunologiques dans l'organisme in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est donc indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un cadre de cancer du colon, avec toutes les interactions nécessaires notamment les effets de l'irradiation sur la partie intestinale, impossible à reproduire in vitro. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet de l'administration orale d'un composé sur différents organes, sur l'expression de gènes et protéines mais surtout sur la migration de cellules immunitaires entre ces différents organes.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D Après un calcul de puissance, nous avons pu déterminer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. Les tests statistiques utilisés pour suivre la croissance tumorale et la survie des animaux ont été préalablement définis. Au vu du nombre d'animaux utilisé par groupe, des tests statistiques non paramétriques seront utilisés.Les concentrations de traitements ont déjà été établies par notre laboratoire et sont donc optimisés pour réduire au maximum les animaux en procédure.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis quotidiennement pour effectuer un examen clinique et observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement adéquat. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

Les souris comme les humains font partie des Mammifères, ce qui les rend génétiquement proches de l’Homme. De plus, leur petite taille, leur reproduction rapide et leur espérance de vie étant plus petite, font d'elles de parfaits organismes-modèles. Les modèles tumoraux existants sont issus de lignées cellulaires murines et plus particulièrement avec un fond génétique utilisé. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, c'est à partir de cet âge, qu'elles sont catégorisées comme adulte et donc ayant un métabolisme fonctionnel et une immunité normale.

Pour savoir si le blocage d'une protéine des vaisseaux réduit l'atteinte cardiaque qui suit une atteinte rénale, 279 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. On leur bouche l'artère rénale puis on rétablit la circulation, une opération de 45 minutes qui doit leur faire perdre environ 10 % de leur poids en deux jours. Suivent six injections intraveineuses, une échographie cardiaque par semaine pendant quatre semaines sous anesthésie, des prélèvements de sang et d'urine à sept dates, des passages en cage métabolique et un transport de douze heures entre deux établissements. Le porteur intègre au calcul d'effectif une mortalité de 3 % imputable à la chirurgie et prévoit de retirer de l'étude et de tuer tout animal dont les complications ne peuvent être traitées.

Objectifs

Nous étudions la survenue et l’évolution d'une atteinte cardiaque aiguë en conséquence d'une atteinte rénale aiguë initiale. Nos récents travaux ont permis d’identifier le rôle important d’une première protéine nommée P1 dans cette atteinte cardiaque aigüe ; en effet, lorsque P1 est augmentée dans l’organisme, il y a augmentation de l’inflammation et de la fibrose dans le myocarde. Néanmoins, lorsque P1 est génétiquement ou pharmacologiquement diminué, l’inflammation et la fibrose sont également moindres. Nos travaux ont également montré que cette protéine P1 interagissait avec une deuxième protéine (P2) et que cette interaction favorisait la sécrétion de cytokines (protéines inflammatoires). Il semblerait donc que cette protéine P2 ait également un rôle important dans l’atteinte cardiaque aigüe suite à une atteinte rénale aigüe. Notre projet a donc pour but d’étudier l’inhibition de cette protéine P2 afin de voir si nous réduisons l’inflammation et la fibrose cardiaque suite à une atteinte rénale aigüe. Cette protéine P2 est retrouvée dans la membrane des cellules des vaisseaux sanguins mais elle peut également se détacher de la membrane et se présenter sous forme soluble pour se retrouver dans la circulation sanguine. Nous essaierons donc, dans une première procédure, de bloquer génétiquement l’expression de P2 grâce à une molécule T qui se fixe directement dans les cellules des vaisseaux sanguins, et dans une seconde procédure de bloquer la forme soluble de P2 grâce à un anticorps. Ensuite nous procéderons à une atteinte rénale aigue sur les souris et nous observerons l’apparition et l’évolution de la dysfonction cardiaque. Si notre hypothèse s’avère exacte, la protéine P2 deviendrait alors une potentielle cible thérapeutique dans cette pathologie cardio rénale. Ces travaux de recherche se dérouleront dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de déterminer l'intérêt de la protéine P2 dans l’atteinte cardiaque aigüe suite à une atteinte rénale aigüe. Si nos hypothèses s'avèrent exactes, nous pourrions considérer cette molécule comme une cible thérapeutique potentielle pour cette pathologie.

Procédures

Les animaux subiront différents types d'injections : - Injections intraveineuses pour l'anticorps (2 fois par semaine pendant 3 semaines, soit 6 injections au total ; une injection dure 1min), elles seront effectuées dans l'EU1 - Injections intrapéritonéales pour l'anesthésie chimique avant les chirurgies d'ischémie-reperfusion rénale ou contrôles (durée de la chirurgie : environ 45min pour les ischémies et 15 min pour les contrôles), avant chaque échocardiographie prévues toutes les semaines durant 4 semaines (une échocardiographie dure environ 15min par souris) ainsi qu'avant chaque prélèvement sanguin (un prélèvement dure 1min), ces interventions seront menées dans l'EU1 - Injections intrapéritonéales de la molécule de délétion génétique durant 3 jours à raison d'une injection par jour, elles seront effectuées au sein de l'EU2. Les animaux subiront également des prélèvements : -biopsies d'environ 2mm afin d'identifier les animaux d'intérêt pour la procédure 1, une biopsie dure 30 secondes. Ces prélèvements seront réalisés dans l'EU2. - sanguins à J-14 avant la chirurgie ainsi qu'à 24h, 72h et 28j postchirurgie pour la procédure 1. A J14 avant chirurgie, puis à J10, J17, J24, J28 post chirurgie pour la procédure 2. - urinaires à J-14 avant la chirurgie ainsi qu'à 24h, 48h, 72h et 28j post-chirurgie pour la procédure 1. A J14 avant chirurgie, puis à J10, J17, J24, J28 post chirurgie pour la procédure 2. Pour les prélèvements urinaires, les souris ne resteront pas plus de 2h dans les cages métaboliques. Après chacun des prélèvements sanguins, du sérum physiologique sera injectée à chacune des souris pour les aider à récuperer. Tous ces prélèvements se dérouleront dans l'EU1.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des biopsies de 2mm afin d'identifier les animaux d'intérêt pour la procédure 1. La douleur sera légère mais de courte durée. Les animaux subiront une ischémie reperfusion rénale qui pourrait engendrer une douleur. Une perte de poids d’environ 10% est attendue dans les 2 jours suite à cette intervention. De plus, ils subiront différents types d'injections : injections intraveineuses pour l'anticorps, intrapéritonéales pour l'anesthésie chimique. Bien que ces injections ne soient pas douloureuses, elles pourraient tout de même causer une gêne à l'animal ou un stress du fait de leur répétition. Le transport de l’établissement 1 vers l’établissement 2 pourrait également être une source de stress. Les souris subiront également des prélèvements sanguins et urinaires à différents temps, ce qui pourrait engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt.

Remplacement

Nous étudions un syndrome qui implique 2 organes différents, à savoir le coeur et le rein, ainsi que les interactions biochimiques et biologiques qu'il existe entre eux. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle cellulaire, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier ce syndrome.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire est calculé au vu des différences obtenues lors de nos précédents travaux afin d'obtenir une différence de 20% entre les groupes contrôle et ischémie, soit 10 souris par groupe sachant que la mortalité imputable à la chirurgie est estimée à 3%. Le calcul a été obtenu en utilisant un logiciel de puissance statistique, prenant en compte les différences observées, la puissance de comparaison et la mortalité imputable au modèle.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée après l’arrivée des animaux en provenance de l’établissement secondaire. Le transfert sera effectué par un transporteur agréé et durera 12h. Un relevé de température de l’environnement sera fourni pour vérifier les bonnes conditions de transport. Les animaux déjà blessés, stressés ou malades au sein de l’établissement secondaire ne seront pas transférés. Une administration d’analgésique en sous-cutanée, en prémédication (45min avant l'opération) puis une anesthésie en intra-péritonéale seront effectuées pour toutes les opérations chirurgicales. Du gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux des animaux avant la chirurgie pour éviter l'asséchement de leurs yeux. La prise en charge de la douleur post-opératoire durera tout l'après-midi (les opérations étant effectuées le matin) et une injection d'analgésie en sous-cutanée sera effectuée 6h après la fin de l’intervention. Une surveillance accrue (6h post chirurgie) sera réalisée après la chirurgie pour vérifier la bonne cicatrisation des animaux. Si toutefois des douleurs apparaissaient, une deuxième dose d’analgésique serait administrée avec ajout de nourriture gélifiée dans la cage. Nous utiliserons une anesthésie locale pour les prélèvements sanguins rétro-orbitaires et les injections intraveineuses. En cas de complications impossibles à traiter, l’animal serait retiré de l’étude et euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle de souris présente de nombreux avantages pour notre protocole expérimental. Outre sa petite taille et son coût avantageux, la souris permet de générer un grand nombre de descendants très rapidement. Par ailleurs, son potentiel génétique permet d'analyser l'effet d'une absence/surexpression d'un gène cible. Nous disposons de tous les outils permettant une exploration physiopathologique complète. Par ailleurs, les souris utilisées pour nos procédures expérimentales auront un fond génétique très utilisé dans la littérature pour étudier la pathologie qui nous intéresse. Les souris utilisées auront entre 2 et 4 mois pour caractériser au mieux le syndrome cardio-rénal tel qu'il existe chez l'Homme adulte. De plus, ce stade permet aux animaux une récupération optimale après les chirurgies d'ischémie reperfusion rénale.

Après cinq jours d'injections quotidiennes, 530 souris, en grande majorité des femelles de 5 semaines, sont anesthésiées pour une échographie, une chirurgie de 15 minutes et/ou une injection de cellules tumorales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le produit injecté pendant ces cinq jours n'est pas nommé, et la chirurgie liée au lymphœdème n'est pas décrite. Pour certaines, la dernière étape se déroule dans un second établissement : sous anesthésie générale, un produit injecté dans le derme de la patte atteinte de lymphœdème et de l'autre patte rend leurs vaisseaux lymphatiques visibles au microscope à fluorescence, puis elles sont tuées sans réveil. Le porteur invoque aussi la gestation, qui "ne peut être observée que sur animal vivant", sans qu'aucune procédure n'en fasse mention. Toutes les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.

Procédures

Dans le premier établissements utilisateur : dans un premier temps, une injection quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). Dans le second établissement utilisateur : les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure. Au maximum, les souris subiront 2 interventions.

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de métastases ou l'apparition du lymphoedème secondaire après curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation génique du récepteur aux oestrogènes ERα a été généré seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant à une invalidation du ERα de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

Une partie des 530 souris de ce projet est génétiquement modifiée pour ne plus exprimer le récepteur alpha aux œstrogènes dans les cellules qui tapissent leurs vaisseaux lymphatiques. Ces souris, en grande majorité des femelles qui entrent en procédure à 5 semaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : cinq jours d'injections quotidiennes, puis, sous anesthésie, une échographie, une chirurgie de 15 minutes et/ou une injection de cellules tumorales. Certaines sont ensuite transportées dans un second établissement pour une lymphographie sous anesthésie générale, avec une injection dans la patte atteinte de lymphœdème et dans la patte non opérée, avant d'être tuées sans réveil. Les autres sont tuées à la fin de leur procédure pour prélever leurs tissus. Le porteur prévoit des douleurs modérées liées aux chirurgies et aux tumeurs, et écrit dans le même passage que la chirurgie du lymphœdème "ne génère pas d'effet indésirable majeur".

Objectifs

Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateurs seront réalisées les procédures suivantes : dans un premier temps, une injection quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). Dans le second établissement utilisateur, les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure. Au maximum, les souris subiront 2 interventions

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le developpement de tumeurs vont engendrer des douleurs moderees et un leger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Les effets pleiotropies des oestrogenes, synthetisees majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modelisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours a l’experimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De meme, la croissance tumorale et le developpement de lymphoedeme secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endotheliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permet de repondre aux questions adressees par ce projet.

Réduction

Afin de reduire le nombre d'animaux utilises dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorite uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est reduit a son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calcule de maniere a donner des resultats statistiquement significatifs afin de delimiter l'effet du genotype, du temps et/ou du traitement

Raffinement

Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur.Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car c’est le seul modele pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de metastases ou l'apparition du lymphoedeme secondaire apres curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation genique du recepteur aux oestrogenes ERα a ete genere seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant a une invalidation du ERα de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procedures seront realisees de 5 a 12 semaines