Procédures modérées

Mis en reproduction une nuit, puis soumis à un frottis vaginal sans anesthésie pour dater la gestation, 220 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié des femelles gestantes passent les vingt-deux jours de gestation sous régime pauvre en protéines, avec inactivité et perte de poids attendues. Au seizième jour, chacune subit une laparotomie pour une électroporation in utero de quarante minutes, dont le réveil peut être suivi de douleurs pendant deux à trois jours. Les nouveau-nés sont maintenus en vie jusqu'au prélèvement de leurs tissus à trois, huit ou trente jours. Les mères et les petits surnuméraires sont proposés en interne pour un autre projet avant d'être tués.

Objectifs

Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. C’est une pathologie caractérisée par un retard de croissance général du fœtus en développement qui représente la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. Touchant près de 3 à 9% des naissances dans les pays développés, c’est une insuffisance placentaire qui est le plus fréquemment mise en cause mais il peut également résulter d’une carence alimentaire de la mère dans les pays moins développés. Un tel retard dans le développement du fœtus entraine des déficits cognitifs à long terme caractérisés par des troubles de la concentration, de l’attention, une hyperactivité, un quotient intellectuel plus faible ainsi que des désordres moteurs. Le cortex ainsi que son réseau neuronal est le siège des fonctions cognitives de haut niveau. Ce projet consistera à utiliser le modèle de rat de RCIU pour appliquer une technique innovante qui permet de marquer de manière très claire des neurones isolés pour nous permettre d’apprécier d’une part les morphologies neuronales et d’autre part les interactions des neurones avec les vaisseaux sanguins environnants que l'on pourra mettre en évidence par des techniques classiques d'histologie.

Bénéfices attendus

Etudier les conséquences d’un RCIU sur l’intégrité du système nerveux central et plus précisément sur l’intégrité de ces réseaux neuronaux est indispensable pour mieux comprendre la mise en place de ces déficits cognitifs observés à long terme, afin d’envisager des stratégies thérapeutiques applicables dès la naissance pour limiter ces troubles cognitifs.

Procédures

Deux prélèvements sont effectués dans le cadre de ce projet. Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et deux femelles par cage maximum) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation (22jours). Une chirurgie expérimentale appelée électroporation in utero est appliquée sur chacune de ces femelles au 16e de gestation. La chirurgie ne dure pas plus de 40 minutes à partir de l’anesthésie jusqu’au réveil.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Le régime n’induit pas de perturbation du système digestif, si ce n’est des fèces d’une couleur plus claire. Ces effets indésirables n’ont pas de conséquences sur la mise bas des femelles d’après les projets déjà évalués. La taille des portées issues d’un RCIU peut être plus petite mais aucune mortalité supplémentaire n’est observée. La laparotomie appliquée à ces mêmes femelles au 16e jour de gestation peut également entrainer des changements dans le comportement de la femelle. Le réveil suite à la chirurgie peut être source de stress et suivie d’une inactivité et de douleurs. Ces observations ne durent pas plus de 2 à 3 jours selon les projets déjà évalués.

Devenir

Tous les animaux subissent la chirurgie d’électroporation in utero. En revanche, la moitié des femelles gestantes de ce projet ne sont pas soumis à un régime hypo-protéinée durant la période de gestation pour constituer un groupe contrôle. Après la mise à bas, les nouveau-nés seront maintenus en vie jusqu’au prélèvement des tissus à différents temps (P3, P8 ou P30). Parce que des différences métaboliques et une réaction inflammatoire influençant le développement du système nerveux central peuvent être observées entre les portées d’une femelle ayant déjà subi une intervention chirurgicale et notamment une laparotomie, nous ne réutiliserons pas ces mêmes animaux pour produire d’autres portées. En revanche, les femelles ainsi que les petits surnuméraires seront proposées en interne pour une réutilisation dans un autre projet avant de les mettre à mort.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières hémoencéphaliques (cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier de façon concomitante la mise en place des réseaux neuronaux et vasculaires. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro, et la maturation des neurones ainsi que leur connectivité (entre eux mais aussi avec le réseau vasculaire environnant) ne peuvent être étudiés qu’in situ, dans un animal vivant. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal pour étudier la pathologie. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec un nombre minimal d’animaux, mais nous devons garantir une pertinence statistique significative. Des calculs statistiques de puissance, ainsi que les expériences passées du laboratoire démontrent que 10 animaux par groupe permettent d'obtenir des résultats significatifs à la suite de tests statistiques bilatéraux non paramétriques sur des échantillons indépendants. Les expériences passées dans le laboratoire ainsi que des recherches bibliographiques démontrent un taux d’efficacité d’électroporation moins important chez le rat que dans les modèles murins à partir desquelles le projet s’est inspiré. Cela signifie qu’un nombre plus important de femelles est nécessaire pour obtenir suffisamment d’embryons pour lesquels l’électroporation a été efficace, positive. Ce nombre est néanmoins réduit car il nous sera possible d’utiliser les résultats des animaux du groupe contrôle d’un projet déjà existant utilisant la même procédure pour deux stades dedévelopement. Notre approche expérimentale nous permet d’analyser plusieurs dizaines de neurones ainsi que leur réseau vasculaire sur un même animal. Par ailleurs, les mêmes cerveaux pourront être utilisés pour d’autres marquages immunohistochimiques, permettant ainsi de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Il existe dans le laboratoire un système de préservation jusqu’à plusieurs années de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissus permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisé. Les mères ayant subi cette procédure, ainsi que les petits surnuméraires, sont proposés en interne pour être réutiliser dans le cadre d’un autre projet.

Raffinement

De nombreuses actions de raffinement seront mises en place lors de ce projet. La mise en reproduction s’effectue en respectant les normes d’hébergement. Nous réunissons au maximum deux femelles et un mâle par cage pour une nuit seulement. Nous surveillons leur comportement et si la moindre violence est observée alors les animaux sont immédiatement séparés. Les femelles gestantes sont pesées tous les trois jours afin de prévenir d’une perte de poids trop importante associée au régime alimentaire. Nous mettons fin au protocole si la femelle perd plus de 10% de son poids initial (pesée le jour de la mise en reproduction). Toute procédure de chirurgie sera accompagnée d’utilisation d’anesthésiques et/ou d’analgésiques, et d’un suivi journalier des animaux afin de détecter et traiter immédiatement tout signe d’inconfort.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans l’équipe pour plusieurs projets. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les électroporations in utero seront effectuées à 16.5 jours embryonnaires (E16.5) pour nous permettre le ciblage des progéniteurs donnant naissance aux neurones corticaux superficiels. Les animaux seront mis à mort à 3 jours postnatal (P3), P8 et P30. Ces différents temps nous permettront d’analyser l’organisation des réseaux neurovasculaires au cours du développement postnatal et ainsi apprécier des modifications qui persisteraient à long terme.

Un gavage jusqu'à deux fois par jour, une injection intrapéritonéale quotidienne et trois mesures de glycémie par semaine, vingt semaines durant : 11 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus. Certaines injections se font dans la veine de l'œil, sous anesthésie. Il s'agit de tester des composés dans trois modèles de diabète auto-immun, dont des souris rendues diabétiques par transfert de cellules immunitaires ou par la streptozotocine. Le porteur décrit la souris NOD comme un modèle "très performant" et juge le recours à la souris "incontournable", au motif qu'aucun modèle in vitro ne permettrait d'étudier ces mécanismes immunitaires.

Objectifs

Le diabète représente un enjeu majeur de santé publique dont l’importance ne cesse de s’accroitre. Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune complexe qui résulte de la destruction spécifique des cellules pancréatiques qui produisent l'insuline et de la perte de la capacité à contrôler le niveau de glucose dans le sang. La maladie survient suite à une réaction anormale du système immunitaire. Ce projet vise à tester des composés dans 3 modèles de diabète auto immun. Ce travail pourrait permettre de trouver de nouveaux traitements du diabète de type 1.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de diabète de type 1.

Procédures

1) Mesure de glycosurie grâce à une bandelette, 3 fois par semaine, test rapide en prélevant naturellement une goutte d’urine lorsque l’animal urine, en 10 sec sur animal vigile. 2) Dosage glycémique avec un lecteur de glycémie capillaire, 3 fois par semaine et pendant 20 semaine à l’apparition d’une glycosurie positive. Test rapide par une goutte de sang prise à la queue (piqure avec une aiguille fine), en 10 sec sur animal vigile. 3) Dosage de la glycémie lors d’un test de tolérance au glucose réalisé une fois par étude : 4 mesures réalisées en 10 secondes sur 2 heures de test sur animal vigile 4) L’injection de splénocytes ou lymphocytes en intraveineux est réalisé en 20 sec sous anesthésie et après traitement antalgique au niveau de l’œil. 5) Les composés ou leur solvant seront administrés par gavage (maximum deux fois par jour), par voie intraveineuse (maximum trois fois par semaine) ou intrapéritonéale (une fois par jour) pendant 20 semaines maximum: moins d’une minute à chaque administration, vigile. 6) Trois autres prélèvements au maximum dans une journée, veine saphène médiale ou submentale (n’excédant pas en tout 150μL, répartis sur 1 ou 2 jours, 15 minutes en tout, vigile) pour l’analyse de la pharmacocinétique des composés.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Le diabète est une pathologie silencieuse qui ne déclenche pas de signe clinique douloureux. Il peut être responsable d’une augmentation de la soif et d’une déshydratation et tardivement une perte de poids. Ces manifestations sont précédées d’une augmentation du taux de sucre dans le sang et les urines. Les injections intrapéritonéales ou intraveineuse et les prélèvements sanguins au niveau de la veine de la queue induisent une douleur de courte durée. L’animal peut subir un stress au cours de l’anesthésie ou lors de l’administration par gavage ou par le injection intrapéritonéales.

Devenir

Les souris seront mises à mort. Les tissus seront collectés post-mortem pour l’analyse de la physiopathologie.

Remplacement

Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l’étude des mécanismes immuno-pathologiques. Aucun modèle alternatif in vitro n’est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun. La souris NOD représente un modèle très performant et hautement informatif. Étant donné que le paramètre principal étudié dans ce projet est la survenue d’une maladie résultant d’un ensemble complexe d’acteurs cellulaires et de médiateurs solubles, l’utilisation du modèle de la souris est incontournable.

Réduction

Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique.

Raffinement

Les points finaux pour chaque procédure ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés dans des cages adaptées, 3-5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une surpopulation. L’environnement est enrichi par des objets. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux et par les expérimentateurs. Les injections intraveineuses à l’œil sont réalisées sous anesthésie générale avec un analgésique. Les injections à la queue et les prélèvements à la queue sont effectuées sous anesthésie locale.

Choix des espèces

L'utilisation de la souris est basée sur une littérature abondante décrivant les différents modèles de diabète de type 1 chez la souris. La souris NOD ou encore induit par le transfert de splénocytes ou de lymphocytes à des souris immunodéficientes ou encore traité avec de la streptozotocine. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés d’intérêt à visée anti-inflammatoire sur un système immunitaire mature.

Greffées avec des cellules de lymphome humain, 581 souris reçoivent ensuite jusqu'à vingt gavages, vingt injections et cinq séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie l'implantation de la tumeur d'intervention chirurgicale "légère" et décrit les traitements comme sources d'une douleur "légère à court terme", tout en prévoyant de peser et d'observer les souris deux fois par semaine pour les mettre à mort avant leur mort "naturelle". La mise à mort sert à récupérer les organes et les tumeurs.

Objectifs

Le lymphome est le cancer du sang le plus répandu et le sixième cancer le plus répandu dans le monde. Le lymphome diffus à grandes cellules B est une forme agressive de lymphome, représentant 30 à 40 % des cas. Le traitement actuel du lymphome diffus à grandes cellules B consiste en une chimiothérapie ou une greffe de moelle osseuse ; cependant, environ 40 % des patients cessent de répondre au traitement (maladie récidivante) ou ne répondent pas au traitement (maladie réfractaire), généralement avec des conséquences fatales. Il est donc urgent de trouver des traitements plus efficaces pour ces lymphomes. Les analyses génomiques des lymphomes diffus à grandes cellules B ont montré des altérations de l'épigénome (modifications des histones et méthylation de l'ADN), ainsi que des mutations fréquentes dans les gènes ayant un rôle épigénétique. Ces connaissances ont conduit au développement de médicaments inhibant les protéines épigénétiques. Cependant, les résultats des essais cliniques testant des médicaments épigénétiques pour traiter le lymphome n’ont pas été aussi prometteurs que prévu. Nous émettons l'hypothèse que les médicaments épigénétiques ont montré une faible efficacité jusqu'à présent car ils ont été utilisés en monothérapie, ce qui plaide en faveur de l'utilisation de thérapies combinatoires. L'objectif de ce projet est d'étudier l'efficacité des thérapies épigénétiques combinatoires dans le lymphome dans le but de concevoir de nouveaux traitements prometteurs qui peuvent être testés plus avant dans des essais cliniques.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’étudier de nouveaux traitements contre le lymphome diffus à grandes cellules B . Bien qu’il existe un traitement standard pour ce type de lymphome, il n’est efficace que chez 60 % des patients et repose sur la chimiothérapie, qui est associée à des effets secondaires toxiques. Par conséquent, la découverte de thérapies plus efficaces et ciblées constituerait une avancée significative dans le traitement des patients atteints de lymphome diffus à grandes cellules B .

Procédures

Les souris qui développeront des lymphomes seront surveillées. Nous manipulerons (contention) les animaux une ou deux fois par semaine pour les peser et les observer à la recherche de signes de formation de tumeurs : perte de poids, réduction des mouvements, posture voûtée, fourrure ébouriffée, hypertrophie des ganglions lymphatiques, changements de comportement pour mettre à mort les souris avant leur mort « naturelle ». Certaines souris subiront une intervention chirurgicale légère pour recevoir la tumeur (une fois), ce qui implique l’utilisation d’anesthésie ; certaines souris recevront une injection pendant 1 minute pour transférer les cellules tumorales (une fois) ou détecter les cellules tumorales (une fois par semaine) ; et certaines souris recevront le traitement par injection ou par voie orale quotidiennement pendant 4 semaines maximum. Types d’interventions : - Contentions pour pesées et mesures : durée = 5 secondes / nombre = 12 - Intervention chirurgicale sous anesthésie/analgésie : durée = 10 minutes / nombre = 1 - Administration par gavage sur animal vigile : durée = 1 minute / nombre = 20 - Administration par injection sur animal vigile : durée = 30 secondes / nombre = 20 - Administration par injection sur animal anesthésié : 30 secondes / nombre = 1 - Imagerie corporelle non invasive sous anesthésie : durée = 5 minutes / nombre = 5

Impact sur les animaux

Les symptômes associés au lymphome comprennent : perte ou prise de poids, respiration rapide, pelage ébouriffé, posture voûtée et/ou de mouvements lents. En outre, la manipulation des souris pendant la surveillance du développement du lymphome peut induire du stress. Et il peut y avoir une inflammation au site d’injection. Les souris qui reçoivent des lymphomes diffus à grandes cellules B primaires subiront une intervention chirurgicale, qui implique l'utilisation d'anesthésie. Le traitement par injection ou par voie orale peut également provoquer du stress et des douleurs légères à court terme.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure nécessaire pour la récupération des organes et la récupération des tumeurs pour leur étude ultérieure.

Remplacement

Compte tenu de la complexité des mécanismes impliqués dans le lymphome, aborder ce problème uniquement par des analyses in vitro n’est pas suffisant et l’utilisation de modèles animaux est indispensable pour étudier cette maladie humaine. Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cellules de lymphome et les concentrations toxiques déterminées pour chaque composé contre les cellules tumorales mais pas contre les cellules saines. Il faut maintenant vérifier que cet effet se produit également in vivo en utilisant différents modèles de lymphome humain. Aucune méthode alternative n’est donc pour l’instant apte à remplacer complètement le modèle murin dans notre étude. Cependant, les résultats obtenus à partir de nos expériences in vivo permettront de développer un protocole in vitro qui pourrait à terme remplacer partiellement les modèles animaux.

Réduction

Nous utiliserons des statistiques prédictives pour établir la constitution des groupes, ce qui permettra de calculer le nombre d'animaux strictement nécessaires à ce projet. Par ailleurs l’utilisation de l’imagerie permettant une étude sur la durée des mêmes animaux est un élément de réduction.

Raffinement

Nous avons établi une grille d’évaluation avec des seuils de coupure précoces adaptés pour détecter le lymphome suffisamment tôt afin de réduire au maximum la souffrance animale tout en conservant la rigueur scientifique, notamment en augmentant la surveillance lors de l’observation des changements de poids, de mouvement, d’apparence physique et de comportement ; et en ajoutant de l’eau gélifiée et de la nourriture à l’intérieur de la cage lorsque des symptômes de lymphome apparaissent. D’autre part, après le transfert des cellules de lymphome et le traitement avec les composés, les animaux seront surveillés quotidiennement, permettant de détecter toute apparition de signes durables de souffrance. De plus, si les souris présentent des égratignures ou des blessures, nous utiliserons une solution d'iode pour désinfecter la zone. Concernant les souris immunodéficientes, elles seront hébergées à raison de 5 maximum par cages, sur des portoirs ventilés où les paramètres environnementaux sont contrôlés, nourries à volonté avec de l'eau stérilisée par filtration et des aliments adaptés, dans un milieu enrichi (neslets et igloo dans chaque cage). Un suivi journalier est effectué par le personnel animalier. L'ensemble des manipulations se fera en conditions stériles avec des gants et du matériel stérile pour éviter toute contamination des souris qui sont immunodéficientes.

Choix des espèces

Les souris sont les espèces les plus utilisées pour étudier la formation et le développement des lymphomes en raison de la flexibilité nécessaire pour effectuer des manipulations génétiques (souches avec des gènes désactivés) et de la possibilité de tester l'agressivité de la maladie par le transfert de cellules tumorales dans des souris réceptrices. Ils ont également un cycle de vie court et se reproduisent facilement. Les conditions optimales de réalisation des xénogreffes nécessitent d’implanter de jeunes adultes, soit des souris âgées de 6-8 semaines.

Contenus une demi-heure par semaine pendant six mois pour que des poux de corps humains se nourrissent de leur sang, quatre lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux d'entre eux reçoivent en plus de l'ivermectine par la bouche une fois par semaine, contention comprise, sur la même durée. L'objet est d'observer comment les poux développent une résistance à ce médicament, parfois prescrit contre les pédiculoses qui résistent aux traitements classiques. Le porteur ramène les nuisances à quelques minutes de stress et quelques secondes de gêne, tout en fixant comme points limites l'hépatite aiguë, le coma et la neurotoxicité, et annonce que les quatre lapins seront proposés à l'adoption en famille d'accueil sauf pathologie ou blessure grave.

Objectifs

La pédiculose, est une parasitose qui touche des millions de personnes à travers le monde. Vecteur de bactéries pathogènes pour l’Homme, ce parasite est cause de problèmes économiques et de santé publique. L’utilisation intense de pédiculicides pour le traitement de la pédiculose du cuir chevelu a entrainé une perte de leur efficacité liée au développement de résistances des poux, contribuant à l’augmentation de l’incidence des pédiculoses. Dans certains cas d’infestations massives ou d’échecs des traitements classiques, un traitement par l’ivermectine peut alors être prescrit. Bien que la pédiculose ne soit pas une indication du traitement par l’ivermectine, sa prescrition pourrait à l’avenir être plus fréquente. Compte tenu de ces données, l’étude des mécanismes de résistance des poux à l’ivermectine constitue un enjeu essentiel. L’ivermectine est connue pour agir sur les récepteurs impliqués dans les neurotransmissions. L’objectif du projet est d'étudier l'impact de l'ivermectine administrée par voie orale sur l'apparition de résistance chez les poux et d'en étudier les mécanismes moléculaires au niveau des récepteurs cibles. Les poux étant des insectes hématophages stricts, cette étude sera réalisée sur des poux de corps humains d'élevage sélectionnés il y a plusieurs décennies pour leur capacité à se nourrir exclusivement de sang de lapin. Le projet est prévu sur un an et nécessitera 4 lapins, 2 non traités et 2 traités par l'ivermectine par voie orale.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet devraient permettre d’appréhender les bases potentielles de la résistance des poux à l'ivermectine et ainsi d'adapter sa prescription dans les cas de pédiculose. Il pourra également servir de base pour appréhender les bases moléculaires de la résistance à l'ivermectine dans les pathologies pour lesquelles elle est massivement administrées (diverses parasitoses dont la gale, rosacée…).

Procédures

Ll'administration d'ivermectine par voie orale et la contention nécessaire durent moins de 10 minutes. Elles seront réalisées une fois par semaine, pendant 6 mois maximum (24 fois), sur les animaux concernés. Le nourrissage des poux et la contention nécessaire durent environ 30 minutes une fois par semaine, pendant 6 mois maximum (24 fois).

Impact sur les animaux

La contention du lapin nécessaire à l'administration orale d'ivermectine peut engendre du stress pendant quelques minutes. L'administration d'ivermectine par voie orale peut entrainer une gêne pendant quelques secondes. L’ivermectine est largement utilisée en médecines humaine et vétérinaire et des effets indésirables variables peuvent survenir suite à son administration. Par exemple chez l'humain, des atteintes cutanées (prurit, urticaire...), oculaires (conjonctivite, kératite...), digestives (vomissement, diarrhée...), respiratoires (toux, asthme...) ou du système nerveux (somnolence, tremblement...) ont été rapportées à des fréquences inconnues. Les points limites sont l'apparition d'atteintes graves telles que hépatite aiguë, coma ou neurotoxicité. Le nourrissage des poux peut entraîner une irritation cutanée qui disparaît après une dizaine de minutes.

Devenir

A l'issue de la procédure "traitement oral de lapins par l'ivermectine suivi du nourrissage des poux", tous les animaux seront proposés à l'adoption en famille d'accueil. Les animaux ne seront mis à mort qu'en cas de pathologie grave dépendante ou non du traitement, de blessure grave accidentelle ou d'impossibilité de les placer en fin de projet. La décision de mise à mort sera préalablement soumise aux responsables du projet initial et au vétérinaire référent.

Remplacement

Aucun mode de nourrissage in vitro permettant l'obtention d'une colonie conséquente et viable sur plusieurs générations n'est actuellement possible pour les poux humains. Le cycle de vie des poux d'élevage, insectes hématophages, est assuré par des repas sanguins sur le lapin, seul animal sur lequel ils ont été adaptés il y a plusieurs décennies.

Réduction

Le nombre d'animaux est le minimum requis pour un nourrissage des poux en alternance, 2 fois par semaine chacun sur une période de 6 mois maximum.

Raffinement

Les lapins seront hébergés en accord avec les directives européennes à 2 par cage double comportant une tablette leur permettant de grimper ou de se cacher. De plus, leur environnement sera enrichi d’une balle en plastique pour jouer et régulièrement d'un bouchon de fibres pour se faire les dents. Une habituation à la contention se déroulera sur plusieurs jours avant de procéder au premier traitement par ivermectine et avant de procéder au premier nourrissage des poux. A chaque étape d'habituation et après chaque nourrissage des poux, le lapin recevra de la carotte de culture biologique en renforcement positif. A la fin du projet, les lapins seront proposés à l’adoption en famille d’accueil. Des points limites liés au traitement par l'ivermectine sont mis en place.

Choix des espèces

Le lapin est la seule espèce sur laquelle les poux de corps humains d’élevage peuvent se nourrir et assurer leur survie sur plusieurs générations. Le projet ne nécessite pas un stade de développement particulier mais des animaux adultes sont préférables pour le nourrissage d’un grand nombre de poux en une seule fois.

Une perte de poids supérieure à 20 % vaut le score maximal sur la grille de suivi et retire la souris de l'expérimentation. 112 souris, dont le récepteur CAR a été rendu non fonctionnel, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées après un prélèvement de sang aux veines porte et cave. Elles mangent pendant soixante semaines une nourriture additionnée de glyphosate ou d'un mélange de boscalid et de lambda-cyhalothrine, subissent une glycémie à jeun tous les deux mois, deux prélèvements de sang à la joue, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec sept mesures sur deux heures chacun, un gavage qui peut irriter l'œsophage et 23 heures seules en cage à métabolisme. Le porteur revendique des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde, sur des paramètres que les études toxicologiques réglementaires explorent peu.

Objectifs

La maladie du foie associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) et les maladies chroniques inflammatoires de l’intestin (MICI) sont en constante augmentation. Outre les facteurs génétiques et le mode de vie (sédentarité, alimentation), l’exposition aux pesticides peut être un facteur de risque au développement de ces pathologies. Des études montrent que le microbiote intestinal est aussi impliqué. Le glyphosate est l’herbicide le plus utilisé dans le monde et on le retrouve dans les aliments. Il agit sur une enzyme présente chez les champignons, les végétaux et certaines bactéries du microbiote intestinal avec comme conséquence un blocage de la synthèse des protéines. L’exposition au glyphosate change la composition du microbiote et modifie l’expression de gènes du foie parmi lesquels le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor). Le boscalid (fongicide) et le λ-cyhalothrine (insecticide) sont également retrouvés dans l’alimentation. Des résultats préliminaires obtenus sur une lignée de cellules de foie montrent qu’un mélange de boscalid et de λ-cyhalothrine agit sur le récepteur CAR. Par ailleurs, ce récepteur CAR est impliqué dans le développement des MASLD, associées à des perturbations du microbiote intestinal et à une inflammation intestinale. Dans ce projet nous voulons tester l’hypothèse que ces pesticides seuls ou en mélange, dans un contexte où les capacités de détoxification de l’organisme sont altérées via l’inactivation du récepteur CAR, favorisent le développement de la MASLD et des MICI. Nous étudierons donc l’impact d’une exposition alimentaire chronique au glyphosate et à un mélange boscalid/ lambda-cyhalothrine en utilisant des souris mâles et femelles dont le gène CAR a été inactivé.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire au glyphosate et à un mélange de pesticides dans un contexte de prédisposition génétique à la maladie du foie associée à un dysfonctionnement métabolique et à l’inflammation intestinale. Le projet fournira des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde mais également sur l’effet d’un mélange de pesticides retrouvés dans l’alimentation. Il permettra d’étudier aussi certains paramètres peu explorés dans les études toxicologiques réglementaires, à savoir les effets sur le microbiote intestinal et l'inflammation intestinale.

Procédures

Ces souris seront nourries pendant 60 semaines (14 mois) avec un régime standard, et exposées via l’alimentation au glyphosate ou au mélange du Boscalid/Lambda-Cyhalothrine à des doses toxicologiques de référence (dose journalière admissible ou dose sans effet nocif observable). Tous les 2 mois, la glycémie à jeun sera réalisée par dosage du glucose dans une goutte de sang prélevée à la veine de la queue, ainsi qu’un dosage de lipocaline (marqueur de l’inflammation intestinale) en récupérant les fécès des animaux. Durant les 60 semaines, du sang sera prélevé à la joue (maximum 100 μl/prélèvement), à deux moments, afin de doser des marqueurs de dommages hépatiques. Les souris subiront également : - un test de tolérance au glucose, qui sera administré par gavage (moins d'1 minute par animal) et à la suite duquel la glycémie sera mesurée à intervalle régulier sur 2h (7 fois) comme décrit précédemment. - un test de tolérance à l’insuline par une injection intrapéritonéale avec une seringue adaptée (insuline), suivi d’une mesure de glycémie à intervalle régulier sur 2h (7fois), comme décrit précédemment. - un test de perméabilité intestinale qui nécessitera un gavage oral avec une sonde de gavage adaptée (moins d'1 minute par animal), suivi de deux prélèvement d’1 goutte de sang (10µl) à la queue - enfin, afin de récupérer les urines et fèces, les animaux seront placés en cages à métabolisme 1 fois au cours de l’expérimentation durant 23 h maximum. Selon les résultats obtenus, les animaux recevront un régime enrichi en gras et en sucre (Western Diet) pendant les 8 dernières semaines ou seront exposés au Dextran Sulfate Sodium dans l’eau de boisson destiné à provoquer une inflammation intestinale. A la fin de l’essai, un prélèvement de sang à la veine porte et la veine cave sous analgésie et anesthésie générale sera réalisé.

Impact sur les animaux

Le prélèvement sanguin à la veine maxillaire et le gavage oral de glucose et l’injection intrapéritonéale d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention, une douleur possible au point d’injection. De plus, le prélèvement à la joue peut induire un épanchement au niveau de la joue chez les individus et le gavage oral au glucose peut induire une irritation de l’œsophage. L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des récoltes d’urine en cages métaboliques peut entraîner un stress de l’animal. Le challenge au Dextran Sulfate Sodium, visant à provoquer une inflammation intestinale de faible intensité pourrait entraîner une baisse de poids et une colite plus importante chez les animaux exposés aux pesticides comparés aux animaux contrôles. Le régime Western Diet induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité : intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation suite aux prélèvements de sang à la veine porte et cave (entrée et sortie du sang dans le foie), et différents organes seront récupérés pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.

Remplacement

L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. De plus, afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies métaboliques impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec notamment la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires).

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur nos résultats préliminaires. Le nombre idéal d’animaux par lots est donc de 12.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages de 4 animaux dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 4 aspects de l'état de l'animal : (i) variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; (ii) apparence physique externe ; (iii) changement dans les comportements non provoqués et (iv) réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacun de ces aspects indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 ou plus après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint, l'animal sera retiré de l'expérimentation. Par exemple, une perte de poids supérieure à 20% entrainera un score de 3 pour cet aspect de l’état de l’animal, et constituera un critère d’arrêt. Ce score sera calculé sur chaque animal, de façon hebdomadaire. Lors du séjour en cage à métabolisme, les animaux bénéficieront d'un abri inox et les contacst olfactif et visuel avec leurs congénères seront maintenus.

Choix des espèces

Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. De plus, nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la toxicité des pesticides grâce à un modèle murin dont le gène CAR est non fonctionnel. Ce modèle existe uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 4 semaines (au sevrage). En effet, c’est au moment du sevrage que le microbiote intestinal de l’animal se met en place avec le changement d’alimentation. Les animaux recevront donc les régimes expérimentaux dès le sevrage et jusqu’à l’âge de 64 semaines. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme des différences entre sexes dans le développement des maladies hépatiques mais également dans l'expression du récepteur CAR.

Tous tués à l'issue pour prélever leur aorte et d'autres tissus, 270 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils courent sur un tapis motorisé quarante-cinq minutes par séance, une fois pour le protocole aigu, cinq fois par semaine pendant cinq semaines pour le protocole chronique, et reçoivent une à cinq injections dans le ventre. Le porteur mentionne des lésions aux pattes liées à la course, qu'il dit peu fréquentes et concentrées sur la phase d'apprentissage, ainsi qu'une augmentation de la fréquence des urines liée à la hausse du sucre dans le sang. Des expériences sur cellules portent déjà sur les mêmes mécanismes vasculaires, mais le porteur conclut que l'évaluation de l'effet de l'exercice rend l'expérimentation animale "nécessaire".

Objectifs

Ce projet vise à investiguer l'influence de l'exercice sur les mécanismes de régulation au niveau des vaisseaux dans un contexte d'augmentation du taux de sucre dans le sang. Un postulat de ce travail est que cette hausse du sucre dans le sang, telle qu’observer dans le cadre du diabète, perturbe l'équilibre entre différentes mécanismes favorisant ainsi une altération de la fonction des vaisseaux. L’objectif principal sera de déterminer si l’exercice, via une action directe sur ces mécanismes permet de contrer les effets néfastes de l’augmentation du sucre dans le sang. Pour cela nous étudierons donc les effets de l’exercice aigu (réalisé une seule fois) ou chronique (réalisé plusieurs fois) dans des modèles ne présentant pas de pathologies mais soumis à une augmentation du sucre dan sle sang ou induisant une hausse de certains mécanismes spécifiques ou dans un modèle pathologique de type diabétique.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche s'avère crucial pour comprendre comment l'exercice, à la fois aigu et chronique, peut influencer les mécanismes régulant la fonction des vaisseaux sanguins, particulièrement sous l'effet de l'augmentation du sucre dans le sang, souvent rencontrée dans le diabète. Ce projet est d'autant plus pertinent qu'il explore ces effets dans différents contextes, y compris des modèles sans pathologies mais exposés à une augmentation du sucre dans le sang, ainsi que dans un modèle pathologique de diabète. Les implications de cette recherche sont significatives, offrant des perspectives pour de nouvelles stratégies thérapeutiques en vue de traiter les troubles vasculaires liés au diabète et d'améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'exercice sur tapis (1 exercice unique pour les animaux du protocole aigu et 5 fois par semaine pendant 5 semaines pour les animaux du groupe chronique) de course ainsi qu' à une ou plusieurs injections (1 injection intrapéritonéale durant approximativement 3 secondes pour une partie des animaux et 5 injections intrapéritonéales durant approximativement 3 secondes/injection pour l'autre partie). Concernant l'exercice, chaque session durera 45 minutes et se déroulera sur un tapis motorisé adapté aux animaux.

Impact sur les animaux

Les injections intra-péritonéales peuvent entraîner des douleurs faibles au site d'injection. L'augmentation de la glycémie peut entraîner une augmentation de la fréquence des urines. La course sur tapis peut engendrer des légères lésions aux pattes des animaux, néanmoins ces dernières restent peu fréquentes et arrivent généralement en début de protocole pendant la phase d'apprentissage. Pour éviter ce problème une phase d'apprentissage avec augmentation progressive de la vitesse de course est systématiquement prévue.

Devenir

Le prélèvement des tissus pour les différentes analyses nécessite la mise à mort de 270 rats à l'issu de la procédure.

Remplacement

Des expérimentations sur cellules sont actuellement conduites pour évaluer les différents mécanismes qui impactent la fonction des vaisseaux. Cependant la question posée ici est complexe et l’évaluation de l’effet de l’exercice nécessite l’utilisation de modèle animaux vivants afin d’évaluer l’influence de ces différentes conditions. L’intégration d’expérimentations animales apparait donc comme nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.

Réduction

Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables. Ceci en se basant sur des résultats de la littérature scientifique et une analyse statistique permettant de déterminer le nombre minimum d'animaux à inclure pour démontrer une différence entre nos groupes. Pour la partie réactivité vasculaire, plusieurs morceaux d'aorte sont récupérés sur chaque animaux ce qui permet d'augmenter notre nombre de mesure et ainsi de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés 7 jours après leur arrivé à n’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélèvements seront réalisés post mortem suite à une anesthésie et une euthanasie. Durant toute la procédure expérimentale (injections et exercice physique), les animaux seront suivis et en cas de douleur une injection d'analgésique est prévue.

Choix des espèces

Le rat est un modèle pertinent pour l’étude du système cardiovasculaire. En effet, la description anatomique de cette espèce réalisée par le passé a pu démontrer une similitude forte notamment au niveau du coeur et des vaisseaux. De plus son utilisation permet d’obtenir des quantités de tissu suffisantes pour la réalisation de plusieurs dosages biochimiques permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux nécessaires. En effet, l'aorte du rat permet de récupérer une quantité importante qui permet de réaliser plusieurs expérimentations sur organes isolés mais aussi une plus grande quantité de tissu pour les analyses biochimiques ce qui permet d'utiliser un nombre minimal d'animaux. Les animaux seront des animaux de quelques semaines pour éviter de confondre les effets de l'exercice et des traitements avec ceux de la maturation et du vieillissement).