Procédures modérées

Porteuses de la même mutation du récepteur alpha de l'hormone thyroïdienne qu'un enfant diagnostiqué en 2022, 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse du foie, du cœur, du tissu adipeux et du cerveau. Les mesures in vivo se limitent à un électrocardiogramme sans pose d'électrode et à une prise de tension à la queue, vingt-cinq minutes par animal et par jour pendant trois jours, la contention se faisant dans l'obscurité à 30 degrés. Les études in vitro et in silico de cette mutation montrent un effet modéré, ce qui fait douter, de l'aveu du porteur, que les troubles du patient lui soient imputables, et il conclut pourtant que l'analyse in vivo est "irremplaçable". Quarante souris sont ainsi tuées pour éclairer le cas d'un seul patient, avec un bénéfice annoncé au conditionnel, orienter son traitement et anticiper d'éventuels troubles futurs.

Objectifs

Des cliniciens ont découvert en 2022, chez un enfant de sexe masculin montrant un fort retard de croissance, une mutation génétique altérant le récepteur alpha de l’hormone thyroïdienne. Il s’agit du cinquantième cas décrit pour cette maladie génétique rare encore mal connue. Etant donné son jeune âge, on peut anticiper la survenue future chez ce patient de troubles typiques des autres patients atteints de cette maladie : difficultés cognitives, troubles cardiovasculaires, désordres métaboliques, malformations du squelette. Toutefois, des études in silico et in vitro de cette mutation particulière montrent qu’elle a un effet modéré sur la réponse des cellules à l’hormone thyroïdienne. On peut donc douter du fait que les troubles pathologiques observés soient imputables à la mutation découverte chez ce patient. Ce projet vise à analyser les fonctions physiologiques d’une souche de souris porteuse de la même mutation génétique. L’objectif du projet est de définir en quoi les souris porteuses de la mutation diffèrent des souris témoins. En substituant à un seul patient un groupe de souris porteur de la même mutation, nous pourrons établir un lien de cause à effet entre la présence de la mutation génétique et les pathologies observées. Une grande partie de l’analyse sera effectuée post mortem et consistera à analyser l’expression des gènes dans les organes sensibles à la maladie génétique en question : foie, cœur, tissu adipeux, cerveau. Une partie de l’analyse sera consacrée à l’évaluation de possibles troubles du système cardiovasculaire chez les mêmes souris, qui ne peuvent être analysés qu’in vivo. Cette dernière partie fait l’objet de la présente demande.

Bénéfices attendus

- Si la présence de la mutation découverte chez le patient humain a des conséquences pathologiques chez la souris, on pourra en déduire que la mutation est bien à l’origine des symptomes observés chez le patient étudié. Cette information sera utile pour orienter le traitement de ce patient. - L’analyse des souris inclut une analyse post mortem approfondie des organes connus pour être sensibles à cette maladie génétique. Elle renseignera sur les mécanismes pathologiques impliqués, et permettra d’anticiper l’apparition future de troubles physiologiques chez le patient d’origine. Elle fournira éventuellement des données immédiatement transposables pour le traitement du patient, en particulier en cas d’apparition d’altérations du système cardiovasculaire. - Une fois validée en tant que modèle pertinent de la maladie génétique, la souche de souris porteuse de la mutation permettra de tester des approches thérapeutiques innovantes immédiatement transposables aux patients porteurs de mutations identiques ou similaires.

Procédures

Un électrocardiogramme non invasif (souris vigile se déplaçant librement, sans pose d'électrode) et une mesure de la tension artérielle de la queue seront effectuées à l’age adulte pendant 3 jours consécutifs (25 minutes/souris et par jour).

Impact sur les animaux

Les souris subiront un stress mineur lié à un environnement nouveau (nouvelle animalerie, placement dans le dispositif de mesure de l'électrocardiogramme). Elles subiront également un stress aigu temporaire lié à la contention, dans l'obscurité et à 30°C, nécessaire à la mesure de la tension artérielle.

Devenir

Les animaux seront tous utilisés pour des analyses post mortem, ciblées sur des organes connus pour être sensibles aux mutations du récepteur alpha de l'hormone thyroïdienne.

Remplacement

Les études in vitro déjà réalisées ne permettent pas de prédire les conséquences de la mutation sur le système cardiovasculaire, mais l’étude de la littérature sur le sujet laisse présager d’un effet modéré. D’une manière plus générale, la complexité du système cardiovasculaire n’est actuellement pas modélisée de manière satisfaisante dans des systèmes de culture cellulaire ou in silico. Par ailleurs, l’observation isolée des rares cas humains ne permet pas d'identifier la cause des symptômes observés. Pour ces raisons, l’analyse in vivo est donc irremplaçable.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé par comparaison avec des études préalables, effectuées sur des modèles proches. Le nombre de 10 animaux par groupe permet d’effectuer une analyse statistique dont la puissance est compatible avec la détection d’un effet mineur de la mutation.

Raffinement

Les souris seront introduites dans l’animalerie trois semaines avant l’analyse, pour leur donner le temps de s’habituer à leur environnement et réduire leur stress. Elles seront également soumises à deux séances d’habituation aux dispositifs expérimentaux, afin de réduire le niveau de stress associé aux mesures. La méthode d’analyse des fonctions cardiovasculaires prévue est non invasive et ne nécessite pas d’anesthésie. Elle est la plus pertinente par rapport à la pratique clinique humaine.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce de mammifères chez laquelle nous sommes capables de réaliser aisément des modifications génétiques. La pertinence des modèles non mammifères pour l’étude des mutations des récepteurs de l'hormone thyroïdienne est incertaine. L'étude sera réalisée sur des adultes âgés de 12-15 semaines. Le système cardiovasculaire évolue lentement au cours de la croissance post-natale. A l’âge choisi, les paramètres sont stabilisés. Les mesures publiées pour d’autres mutations du récepteur alpha de l'hormone thyroïdienne ont été effectuées à cet âge, ce qui favorisera les comparaisons.

Opérés du fémur pendant une trentaine de minutes pour qu'un trou soit percé dans le condyle puis comblé par un matériau à tester, 20 rats passent ensuite au scanner sous anesthésie à trois, quinze, trente et soixante jours, dans un établissement différent de celui de la chirurgie. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. Le porteur indique que l'opération provoque de la douleur et des difficultés à se déplacer pendant les premiers jours, avec un risque de rupture des sutures, et que les anesthésies répétées causent des désagréments. Au soixantième jour, tous sont tués pour que l'os régénéré et ses vaisseaux soient prélevés et analysés.

Objectifs

Les pertes d'os sont un problème en chirurgie dentaire et orthopédique. Souvent, on utilise des morceaux d'os du patient pour réparer ces pertes, mais cela nécessite une autre opération et peut causer des problèmes à l'endroit où on a pris l'os. C'est pourquoi il est important de développer de nouveaux matériaux (biomatériaux) pour aider à régénérer les os. Pour tester ces nouveaux matériaux, nous utilisons un modèle animal que nous maitrisons bien. On crée un petit trou dans l'os de la patte d'un rat pour voir si le matériau implanté peut aider l'os à se régénérer. Les animaux auront la chirurgie dans un premier établissement et le suivi de la régénération par imagerie sera fait dans un autre établissement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement pour la régénération osseuse) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vu d'être utilisé en clinique.

Procédures

Les rats subiront une opération chirurgicale au niveau de l'os de la patte arrière (condyle fémoral), où nous créerons un petit trou et celui-ci sera comblé avec un nouveau matériau à tester. Chaque opération prend environ 30 minutes par rat (la chirurgie sera faite dans un premier établissement). Après l'opération, nous utiliserons un scanner pour suivre la régénération de l'os à différents moments : après 3, 15, 30, et 60 jours. Pendant les scanners, les rats seront anesthésiés, pour qu'ils restent endormis et immobiles. Chaque séance de scanner dure entre 20 et 30 minutes (les imageries scanner seront fait dans un deuxième établissement).

Impact sur les animaux

Les rats auront une opération sur un os de la patte (avec un petit trou) qui ne nécessitera pas de fixer l'os avec des outils internes. Cependant, cette opération causera de la douleur et les rats auront du mal à bouger pendant les premiers jours après l'opération. Il y a aussi un risque que les points de suture se rompent. De plus, les anesthésies répétées lors des scanners peuvent causer des désagréments.

Devenir

Les rats seront euthanasiés 60 jours après l'implantation pour qu'on puisse prélever et analyser leurs os régénéré. Cela nous permettra de vérifier la qualité de la régénération osseuse, notamment la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans l'os régénéré.

Remplacement

Les produits destinés à être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche en laboratoire (in vitro) permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent être d'abord testés chez le petit animal (modèle du rat). Si les résultats obtenus sont satisfaisants, ils devront être testés sur un plus gros animal, permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi par imagerie scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur le processus de régénération osseuse, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations. Le nombre d'animaux nécessaire a été determiné en utilisant un outils statistique.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'antalgique afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite endormis. Après la chirurgie, chaque rat se réveille sur un tapis chauffant, dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur 5 jours après opération pour surveiller les points limite (vérification de la démarche de l'animal, infection du site opératoire, comportement...). Un seul des points limites terminaux suivants entrainera un euthanasie de l'animal: L'animal ne se déplace pas, présence de rougeurs et de pus au niveau du site opéré ainsi qu'une réaction violente ou très faible réaction. Les expérimentateurs maîtrisent la manipulation et les injections nécessaires. Le personnel de l'animalerie est compétent pour assurer le bien-être et le suivi des rats au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, présence de la litière en copeaux de peupliers et des jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du condyle fémoral. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. Des rats adultes de 10 semaines et d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

Une chirurgie de vingt minutes pour injecter un composé entre les méninges, puis jusqu'à six prélèvements de sang en vingt-quatre heures : 3 480 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, presque tous tués à l'issue pour prélever sang, liquide céphalorachidien et organes. L'objet réel est d'évaluer où se distribuent des nanoparticules lipidiques et des exosomes chargés de candidats médicaments neurologiques, dans le cadre de la recherche pharmaceutique. Seuls 174 rats, ceux qui n'auront finalement reçu aucun produit, pourront être réutilisés dans un autre projet. Le porteur retient le rat parce que la voie intrathécale employée en clinique humaine y est praticable et parce que les études réglementaires ultérieures utilisent la même espèce, et affirme qu'un modèle animal reste "nécessaire" pour juger l'interaction avec l'"organisme entier".

Objectifs

Il existe de nombreuses pathologies pour lesquelles les besoins thérapeutiques ne sont pas satisfaits. Une proportion très importante de ces pathologies atteint le système nerveux. Ces maladies neurologiques, souvent rares, sont très invalidantes voire mortelles et considérées comme la première cause de handicap dans le monde. En 2021, près de 3 milliards d’individus étaient atteints d’une maladie neurologique. L’objectif principal de la R&D Pharmaceutique est de développer de nouveaux candidats médicaments qui seront évalués durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux grandissants et d’améliorer le traitement de ces maladies neurologiques. Il est nécessaire que les candidats médicaments atteignent les cellules du système nerveux en passant la barrière hématoencéphalique Ce passage étant critique, la plupart des candidats médicaments utilisés pour le traitement des maladies neurologiques est administrée au niveau des lombaires entre les méninges par injection dans l’espace intrathécal (IT) chez l’Homme. De nouvelles formulations utilisant des nanoparticules lipidiques (LNP) ou des exosomes (vésicules protéiques naturellement excrétées par les cellules qui constituent une voie de communication intercellulaire) ont été développées pour améliorer la biodistribution dans les structures cérébrales, l’activité et/ou la tolérabilité de ces candidats médicaments. A terme, il pourrait même être possible d’administrer les candidats médicaments dans ces formulations par d’autres voies d’administration (intraveineuse ou intranasale), moins contraignantes que la voie IT utilisée en clinique pour l’administration de candidats médicaments seuls. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérabilité et la biodistribution de différents LNP et exosomes dans un premier temps seuls, puis chargés avec le candidat médicament, après administration intrathécale, intraveineuse ou intranasale chez le rat. En effet, le rat présente une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle. De plus, la voie intrathécale utilisée en clinique humaine peut être réalisée chez cette espèce. Après sélection par screening in vitro des formulations et des candidats médicaments les plus prometteurs, l’utilisation du rat est nécessaire afin d’évaluer la distribution, l’activité et la tolérabilité du candidat médicament dans la formulation sur un organisme complet et des structures cérébrales plus faciles à discerner

Bénéfices attendus

Actuellement, une grande majorité des médicaments pour le traitement de maladies neurologiques et notamment neurodégénératives sont administrés par voie intrathécale, permettant de s’affranchir du passage de la barrière hémato-encéphalique et ainsi permettre l’action du médicament sur le cerveau. Cependant, la voie intrathécale est contraignante pour le patient notamment dans le cadre d’administrations répétées Le bénéfice apporté par ce projet est ainsi d’optimiser les formulations de ces candidats médicaments pour améliorer leur activité, leur distribution et de diminuer leur toxicité. Le fait de charger ces candidats médicaments dans des nanoparticules lipidiques ou des exosomes peut aussi permettre de protéger la molécule de la dégradation (permettant de réduire le nombre d’administrations et donc la contrainte à la fois pour l’animal mais aussi pour l’Homme) et d’évaluer l’utilisation de voies d’administration autres que la voie intrathécale (moins de contraintes pour l’animal et pour l’Homme dans les études ultérieures).

Procédures

- A l’administration (unique) sur tous les animaux de composés par voie parentérale nécessitant une contention courte ou le passage préalable dans une enceinte thermorégulée ou par abord chirurgical sous anesthésie et couverture analgésique ; - A l’administration sous cutanée d’analgésique en pré, péri et post opératoire ou lors de l’euthanasie - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum dans l’étude - A un prélèvement unique de sang réalisés sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : • Administration intrathécale (unique dans l’étude) : la phase de chirurgie nécessaire à l’administration du composé testé (d’une durée d’environ 20 minutes) et du suivi post-opératoire peut générer du stress et de la douleur (Degré de sévérité modéré) • Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (nécessaire pour réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) peuvent générer du stress et l’injection (moins de 10sec) de la douleur (degré de sévérité modéré) • Administrations des formulations ou d’analgésique par voie intranasale intrapéritonéale, intramusculaire, ou sous-cutanée : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur. (Degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte ou à la veine caudale : La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (degré de sévérité modéré) - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et peut provoquer une nuisance pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide céphalorachidien pour analyse et d’organes pour lecture de distribution ou d’activité. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule : -du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du groupe par exemple -ou s’il s’agissait d’animaux finalement non inclus.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer de nouvelles formulations innovantes pour l’administration de composés à visée neurologique. Si les modèles in vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique sont de plus en plus prometteurs, ils restent incomplets pour juger de la distribution, de l’activité et de la tolérabilité des candidats médicaments ainsi que de l’interaction avec l’organisme entier, le système immunitaire ainsi qu’avec les éléments figurés du sang. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et le rat est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (voie intrathécale possible chez cette espèce, processus physiologiques très semblables à l’Homme). L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives de screening vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique sont utilisées pour caractériser et sélectionner les formulations à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement leur nombre.

Réduction

Une sélection des formulations les plus prometteuses est réalisée à l’aide de screening vitro et ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre habituel d’animaux (2 à 5 individus/groupe selon la procédure) est déterminé pour être un compromis efficace afin d’atteindre les objectifs des différentes procédures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint. Ces études permettent d’évaluer l’activité et la distribution du candidat médicament dans ces formulations et ainsi d’affiner le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque pour les animaux. Selon la procédure, un nombre important d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporelle, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, prélèvements d’organes…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire à chaque procédure de ce projet. Enfin, l’utilisation de la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte 40µL minimum) peu invasive, rapide, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volume sanguin (volémie) physiologiques et le bien-être animal.

Raffinement

Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la SBEA et les équipes en charge des animaux. Selon la clinique observée, et si les animaux sont en phase d’étude ou pas, une prescription de soins, un arrêt de traitement, ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique à l’espèce étudiée, mise en place avant l’apparition des points limites. L’injection par voie IT est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire. Le protocole d’analgésie sera adapté au cas par cas. L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants. Les animaux sont manipulés et peuvent être entrainés si l’étude nécessite un geste technique particulier et l’ensemble du personnel technique formé pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’isolement), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling (prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale de la patte) est mise en place. Cette technique, rapide, peu invasive, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites de volémie physiologiques du rat (recommandations SBEA disponibles en interne). Elle permet également d’éviter le placement préalable de l’animal dans une enceinte thermorégulée nécessaire à la bonne réalisation du geste Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision, une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse).

Choix des espèces

L’ensemble des procédures de ce projet est réalisé sur l’espèce rat car : - Le rat présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle - La voie intrathécale nécessaire à l’administration des formulations de ce projet peut être réalisée chez le rat. - Les structures cérébrales, dont certaines sont la cible des formulations et des futures candidats médicaments sont plus faciles à étudier chez cette espèce. - Les études réglementaires ultérieures et nécessaires au développement d’un candidat médicament utilisent ce modèle expérimental. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en amont. Jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.

Des molécules fournies par des clients, dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires possibles, sont testées ici sur un modèle de règles douloureuses. 500 souris et 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des hormones pendant dix jours et jusqu'à vingt administrations de composés, puis une injection d'ocytocine qui provoque des crampes abdominales, avant d'être placés seuls en cage pendant une heure pour que ces crampes soient comptées. Le porteur indique qu'aucun test statistique n'a servi à fixer les dix animaux par groupe et s'en remet à son expérience du modèle.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des rongeurs dans un modèle de dysménorrhée primaire.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de dysménorrhée.

Procédures

Les animaux vont avoir des administrations d’hormones et de candidats médicaments pendant 10 jours maximum. Ces gestes sont très rapides (moins d’une minute, 10 administrations pour les hormones et jusqu’à 20 administrations pour les composés médicaments) et seront réalisés par du personnel qualifié pour diminuer le stress des animaux. Une administration d’ocytocine (30 sec, 1 fois) provoquera des crampes abdominales et les animaux seront observés dans des cages individuelles pendant 1 heure pour compter ces dernières et observer le comportement de l’animal.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, les animaux vont ressentir les mêmes symptômes que la pathologie induite à savoir des crampes abdominales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et des tissus seront prélevés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des dysménorrhées. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe au début de l’expérimentation mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et dans ce modèle, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum e 10 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. A la fin de l’expérience, des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, nestlet…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure…Pour les procédures sous anesthésie, l’animal sera placé sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie. Si un animal présentait un symptôme d’un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit dans la littérature chez le rat et la souris. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 6 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

Des administrations répétées, jusqu'à deux par jour pendant quatre semaines, précèdent des tests de douleur sur 3 600 souris et 2 400 rats. Ces 6 000 animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 5 500 sont tués et 500 pourront être réutilisés dans d'autres projets s'ils n'ont reçu que les traitements contrôles. Les voies d'administration vont de l'orale à l'intradermique, et chaque animal est isolé de ses congénères jusqu'à soixante minutes pour les phases de test, d'habituation ou de récupération. Le porteur annonce des modèles comportementaux censés reproduire chez le rongeur le symptôme de la douleur humaine, et des tests provoquant des douleurs de moins de trente secondes, sans nommer un seul de ces tests.

Objectifs

La douleur est une expérience complexe, sensorielle et émotionnelle, aigue ou chronique, mettant en jeu des récepteurs et nerfs présents dans tout l’organisme ainsi que des régions cérébrale spécifiques. Indépendamment de la cause, la douleur doit être prise en charge afin de soulager le patient avec des traitements qui reposent essentiellement sur les médicaments antalgiques (3 niveaux en fonction de l’intensité de la douleur incluant le paracétamol, la codéine, la morphine). D’autres substances peuvent aussi être utilisées telles que les anesthésiques locaux, des antispasmodiques, des antidépresseurs ou encore des relaxants musculaires. Mais ces traitements symptomatiques peuvent entrainer des effets indésirables selon les substances utilisées : nausées, somnolence, dépendance… Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de nouvelles entités pharmacologiques synthétisées ou acquises au sein du laboratoire dans des modèles comportementaux chez le rongeur permettant de mimer le symptôme la douleur chez l’homme. Ce projet implique l’obtention de données comportementales chez l'animal nécessaires pour envisager la poursuite du développement de produits pharmacologiques chez l’humain.

Bénéfices attendus

A court terme, il s’agira de démontrer à l’aide de données chez l'animal l’efficacité potentielle de nouvelles entités pharmacologiques : les procédures mises en œuvre permettront de mesurer la capacité de nouvelles molécules à moduler les symptômes de la douleur chez le rongeur, de les comparer et ainsi de choisir la meilleure selon des critères de sélection pour l’application thérapeutique choisie. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques robustes indispensables au processus de développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests chez l'Homme.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des administrations dont la voie (orale, intrapéritonéale, intra-veineuse, intra-musculaire, sous-cutanée ou intra dermique ) , la fréquence d’administration (aigüe ou chronique, dans ce cas pas plus de 2 administrations/jour) ainsi que la durée (période maximale de 4 semaines) seront adaptées en fonction des objectifs de recherches. Les délais d'administration avant les phase de test seront de 0 à 4h. Pour chaque administration, une courte contention (

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux recevront des administrations de composés/inducteurs avant les évaluations comportementales. Il est possible que la courte contention alors nécessaire (

Devenir

Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort. Certains animaux, les animaux contrôles de la procédure 1, pourront cependant être réutilisés pour d’autres projets en fonction des objectifs de recherche si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée. La décision sera prise par le responsable projet (une personne compétente désignée par lui) ou le vétérinaire.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur le symptôme de la douleur dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. Il n’existe à ce jour pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet c’est pourquoi l’utilisation de modèles in vivo est indispensable avant toute administration à l’homme, la souris et le rat étant ici les espèces les plus adaptées.

Réduction

Un effectif minimum et suffisant de 12 animaux par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques. En fin de procédure, les animaux (en particulier les contrôles) seront au maximum réutilisés dans d’autres projets comportementaux ou bien pour des analyses histologiques faisant l’objet d’autres projets.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie centrale et restent 5 jours en acclimatation avant toute expérimentation. Tout au long des études, les animaux sont hébergés en groupe (nombre maximal défini par la règlementation en cours) dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, Sizzle pad pour nidification…) ou isolés de leurs congénères pour les tests lors de périodes les plus courtes possibles (moins de 60 min) selon les besoins de la procédure. Le change des cages se fait 1 à 2 fois par semaine. Les animaux sont observés chaque jour, et font l’objet d’un suivi par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-être Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. En cas d’atteinte d’un des points limites définis plus loin, l’animal est écarté de l'étude pour subir les soins essentiels ou être euthanasié si nécessaire. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et dispositif expérimental, phase de familiarisation aux manipulations, administrations…).

Choix des espèces

Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques du comportement humain. Ce sont les espèces animales les plus pertinentes et couramment utilisées pour évaluer les effets de substances sur la douleur. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l’animal à d’autres stades de développement. De plus, les tests de douleur décrits dans ce projet sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités motrices et cognitives fonctionnelles.  

Deux heures d'anesthésie générale par séance d'imagerie TEP, et jusqu'à deux transports de quarante-cinq minutes entre deux établissements : 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vecteur de thérapie génique par injection intraveineuse rétro-orbitale, geste auquel le porteur associe un risque rare d'hémorragie, d'atteinte oculaire ou d'infection, puis un radiotraceur en perfusion, puis un prélèvement de sang. Toutes sont tuées à la fin, les analyses histologiques et biochimiques d'efficacité se faisant post mortem. Le porteur utilise deux lignées génétiquement modifiées à partir de douze mois, âge auquel leur cerveau présente les lésions de la maladie d'Alzheimer, et les suit sept semaines.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer l’effet thérapeutique d’une approche de thérapie génique et valider un biomarqueur d’imagerie nucléaire chez deux lignées de souris génétiquement modifiées, modèles de la maladie d’Alzheimer. Ce projet se déroulera sur 2 sites (EU 1/2 et 2/2) pour l'accès au système d'imagerie spécifique et les competences liées à cette imagerie qui ne sont disponible que dans le second établissement utilisateur.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera d’établir la preuve de concept de l’efficacité d’une nouvelle thérapie génique pour la maladie d’Alzheimer et de valider un biomarqueur d’imagerie pour le suivi de cette pathologie chez deux modèles souris de cette pathologie. Si le projet permet de confirmer la pertinence de ce biomarqueur, celui-ci pourrait potentiellement être utilisé en clinique Humaine pour le diagnostic ou le suivi de plusieurs maladies neurodégénératives. De plus, si l’efficacité de l’une des thérapies testées est avérée cela pourrait permettre de proposer des essais cliniques chez l’Homme, et donc à long terme d’améliorer la prise en charge des patients atteints de maladie d’Alzheimer, pathologie pour laquelle il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif et qui touche près de 900 000 personnes rien qu’en France.

Procédures

Une partie des animaux recevront une injection intraveineuse (durée 5 min) sous anesthésie générale (EU1/2). Ils seront ensuite transportés entre deux établissements utilisateurs par un transporteur agréé (45 minutes maximum, 2 fois maximum). Ils réaliseront une procédure d’imagerie par tomographie par émission de positrons (EU2/2) sous anesthésie générale, (durée 2 heures) durant laquelle une injection intraveineuse d’un produit nécessaire à l’imagerie (radiotraceur) sera réalisée en perfusion pendant 2 minutes (EU2/2). Cet examen pourrait être réalisé une 2ème fois (maximum) si l’on rencontrait un problème avec le radiotraceur lors de la première imagerie. Un prélèvement de sang sera réalisé sur les animaux sous anesthésie générale (EU1/2, 1 fois, durée 2 minutes). Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure (EU1/2).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont (dans l’EU1 sur 2) : un risque modéré cardio-respiratoire et hypothermique durant les anesthésies; un léger stress lors des anesthésies générales; une légère douleur liée à la piqure de l’aiguille suite aux Injections intrapéritonéales, une légère douleur liée à la piqure de l’aiguille suite aux Injections intraveineuses rétro-orbitale du vecteur viral (durée 5 mn, sous anesthésie générale). Il existe un risque rare d’hémorragie, d’atteinte oculaire ou d’infection suite à cette injection intraveineuse. enfin, une légère douleur au point de prélèvements lors de la prise de sang (durée 5mn, sous anesthésie générale) et un stress lié au transport entre les 2 établissements utilisateurs et au changement d’environnement. Dans l’EU 2 sur 2, les effets indésirables sont une légère douleur liée à l’injection intraveineuse du ligand radioactif; un risque modéré cardio-respiratoire et hypothermique durant les anesthésies. De plus, lors du réveil les animaux peuvent être désorientés et stressés. Et enfin, un stress faible de l’animal lors des contentions tout au long de nos expériences.

Devenir

Tous les animaux injectés avec la thérapie génique à évaluer et leurs contrôles seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données d’efficacité.

Remplacement

Le projet vise à valider une thérapie génique pour la maladie d’Alzheimer, incurable à l’heure actuelle chez l’Homme, mais aussi à valider in vivo un biomarqueur permettant de suivre ou diagnostiquer la maladie. Les modèles in vitro (modèles de cellules de neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de notre approche de thérapie génique ; elle nécessite à présent d’être validée dans un contexte physiologique de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez l’animal. La souris représente un modèle pertinent dans notre cas puisque des modèles de la maladie d’Alzheimer associés à la mutation génétique que nous voulons cibler ont été créés chez cette espèce.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe en maintenant des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 20 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Nous utiliserons deux lignées de souris génétiquement modifiées mais dans un souci de réduction nous utiliserons un seul groupe contrôle de souris non génétiquement modifiées pour ces deux lignées pour l’évaluation de la thérapie génique d’intérêt. Nous prévoyons au cours du projet un nombre total maximal de 120 souris. De façon générale nos résultats seront analysés statistiquement avec les tests statistiques appropriés.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, la procédure a été mise en œuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture (adaptée à leur stade physiologie) à volonté et ils bénéficieront d’un enrichissement réglementaire. En cours de procédure une attention particulière est portée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne, la mise en place de points limites et de soins adaptés Les animaux seront hébergés en groupe, en cas d’agressivité les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge), dans ce cas, on lui rajoute une maisonnette dans sa cage en plus des enrichissements habituels. Nous incluons dans notre étape d’injection uniquement des animaux qui font plus de 20g pour une meilleure récupération des animaux à l'anesthésie et à l'intervention, avec la mise en place de gel ophtalmique et la prévention de l’hypothermie en plaçant les souris sur un tapis chauffant. Un suivi rapproché est effectué au réveil. Les transports entre les 2 établissements seront réalisés par un transporteur agrée et dans des conditions contrôlées. Une phase d'acclimatation sera respectée avant toute manipulation dans le deuxième établissement. Les injections intraveineuses et la prise de sang seront réalisées sous anesthésie pour éviter le stress des animaux. Nous injectons un sédatif avant l’euthanasie pour éviter la douleur de l’injection et obtenir une pré-sédation. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Pour notre projet, nous avons besoin d’un modèle de la pathologie afin d’étudier les effets de notre thérapie génique sur la cible d’intérêt, et pouvoir évaluer notre biomarqueur d’imagerie dans le cadre de la maladie d’Alzheimer. De nombreux modèles de souris génétiquement modifiés ont déjà été mis au point, et deux modèles d’intérêts ont été sélectionnés pour notre projet. Les animaux utilisés pour l’évaluation de notre thérapie génique et de notre biomarqueur seront utilisés à partir de l’âge de 12 mois car il s’agit de l’âge où ils présentent des signes de la pathologie (au niveau du tissus du cerveau). Ils seront ensuite suivis 7 semaines pour l’évaluation de notre approche thérapeutique.

616 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de tissus destinés à la microscopie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Adultes comme nouveau-nées, elles subissent une chirurgie d'injection intracérébrale de quinze minutes, des injections intrapéritonéales, sept jours de restriction alimentaire destinée à les motiver pendant les tâches comportementales et sept jours d'hébergement individuel. Les tests annoncés portent sur la mémoire et l'anxiété, sans que soit précisé lesquels seront employés. Le porteur affirme que la souris est "l'espèce de choix" pour étudier le système nerveux des vertébrés et que les résultats en sont "très facilement transposables à l'homme", après avoir formé son hypothèse en culture de neurones.

Objectifs

Dans ce projet, nous cherchons à comprendre le rôle de certaines protéines qui interviennent dans les mécanismes de liaison cellulaire dans le cerveau. Nous voulons comprendre comment ces protéines connectent les cellules du cerveau les unes aux autres et leur permettent de communiquer. Plus précisément, nous nous concentrons sur des protéines appelées neuroligines, ainsi que sur d'autres protéines avec lesquelles elles interagissent, tels que les récepteurs impliqués dans la communication neuronale. Des études ont montré que la modification genetique sur ces protéines sont liées à des troubles neurologiques comme l'autisme ou la schizophrénie, qui impliquent des anomalies de connexions entre cellules cérébrales. A ce jour, nous ne savons pas exactement où sont localisées ces protéines de point de vue anatomique. Dans ce projet, nous avons deux objectifs principaux : (1) Visualiser ces protéines à différents moments du développement et dans des situations où les connectivités cérébrales changent. (2) Modifier l'expression ou la fonction de ces protéines dans le cerveau de souris, soit pendant leur développement, soit à l'âge adulte, pour mieux comprendre leur rôle dans la formation et le maintien des connexions cérébrales. Pour atteindre ces objectifs, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui nous permettent de marquer ou de supprimer ces protéines dans des types spécifiques de cellules cérébrales

Bénéfices attendus

Visualisation et compréhension des mécanismes des protéines qui interviennent dans la liaison cellulaire dans le cerveau. Comprendre le rôle des proteines de liaisons impliquées dans des pathologies comme l'autisme ou la schizophrénie à différents stades de développement du cerveau.

Procédures

Les interventions sont: chirurgie d’injection Intra-cérébrale chez les souris adultes et souriceaux(15min), injection intra-péritonéal(2min), restricition caorique pour motiver l'animal durant les tâches comportementales(7 jours), comportement pour tester la memoire et le phenotype d'anxiété(10minutes par session), hebrgement indivuduel de souris adultes pendant des périodes determinées avec contact visuel et olfactif avec ces congénéres à chaque session de comportement (7 jours)

Impact sur les animaux

Les procédures post-opératoires et l'analgésie se feront en minimisant la douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/Un risque de perte de poids durant la restriction calorique, en cas de perte de poids trop importante l'animal est nourrit à volonté pendant 48H. 3/Le risque de rejet des animaux non sevrés et le stress de la séparation peuvent également entrainer une nuisance ou un effet indésirable.

Devenir

Mise à mort pour collecter les tissus pour les études histologiques et la microscopie

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Le concept du projet a été identifié par notre équipe avec des approches in vitro de culture de neurones de souris de type sauvage comme de neurones de nos lignées transgéniques. Pour vérifier ce concept dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production: en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 1 jour d'age jusqu'à 60 jours d'age

Des ultrasons focalisés ouvrent temporairement la barrière qui protège le cerveau de 36 souris, le temps d'y faire entrer une molécule radioactive. Ces souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées à l'issue, pour que soient recherchées les conséquences des ultrasons et la distribution du produit dans leur cerveau. Chacune fait l'aller-retour entre deux animaleries, subit une IRM de contrôle, reçoit le traceur par voie intraveineuse et enchaîne jusqu'à huit séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie. Le porteur signale que l'ouverture par ultrasons peut provoquer des microhémorragies cérébrales ou un œdème, écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu sur les animaux, et limite le projet aux expériences qu'il juge "absolument indispensables".

Objectifs

L’objectif global du projet est de développer une nouvelle molécule radioactive pour identifier en scintigraphie une protéine dans la maladie d’Alzheimer chez l’humain. Evaluer l’entrée de la molécule radioactive dans le cerveau d’une souris après application d’ultrasons. Evaluer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau de ces souris. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents mais voisins.

Bénéfices attendus

Confirmer que la molécule radioactive reconnait sa cible dans le cerveau des souris. Cette étape permettra de poursuivre le développement de la molécule radioactive, le but étant de pouvoir l’utiliser chez l’humain pour le diagnostic précoce et le suivi des traitements de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les souris seront transportées depuis leur animalerie d’hébergement jusqu’à une plateforme d’imagerie (10 min) dans laquelle elles seront anesthésiées afin d’effectuer une ouverture temporaire de la barrière protégeant le cerveau pour faire entrer la molécule radioactive (durée quelques minutes), et toujours sous anesthésie des images IRM pour confirmer cette ouverture. Les animaux réveillés retournent dans leur établissement utilisateur principal pour injection intraveineuse de la molécule radioactive, à la suite de laquelle des images seront réalisées à différents temps, sous anesthésie (durée maximum d’une heure par image, jusqu’à 8 temps d’imagerie).

Impact sur les animaux

La procédure d’ouverture de la barrière du cerveau par ultrasons peut entrainer de possibles microhémorragies cérébrales ou un œdème identifiable en imagerie. Aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux qui sont sous anesthésie gazeuse pendant les sessions d’imagerie. Le transport et le changement d’animalerie peuvent induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que l‘injection intraveineuse de la molécule radioactive peuvent également causer un stress léger.

Devenir

A la fin de la dernière session d’imagerie, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées pour détecter d’éventuelles conséquences de la procédure d’ultrasons et pour déterminer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau.

Remplacement

Des modèles in vitro de la membrane protégeant le cerveau ont été développés à partir de cellules animales ou humaines. Malheureusement, les techniques in vitro démontrent une perte rapide de leurs propriétés. Leur utilisation est donc limitée. Néanmoins, ces modèles nous ont permis de réaliser des études préliminaires de sélection, mais seuls les modèles in vivo nous permettront l’étude du passage des molécules radioactives définitives et la reconnaissance de la cible, en raison de la combinaison de tous les aspects complexes du cerveau.

Réduction

Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 36 souris seront utilisées. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. L’imagerie permet également de réduire le nombre d’animaux puisqu’une même souris peut être imagée à plusieurs reprises si elle n’est pas mise à mort en fin de procédure.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec ajout d’objets récréatifs , un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites adaptés aux modèles permettront de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit avec couverture chauffante le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire, un médicament contre la douleur pourra également être administré. Le transport et changement d’animalerie se fera avec soin en isolant les animaux des stimuli extérieurs. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min.

Choix des espèces

Il existe des modèles de souris génétiquement modifiées présentant la cible pathologique étudiée. Le protocole concernera uniquement des souris adultes car la maladie se développe progressivement dans le temps et n’est donc détectable qu’à l’âge adulte.