Procédures modérées

Quarante-cinq minutes de chirurgie abdominale pour implanter une sonde de température, et quarante-cinq minutes de plus, pour une partie d'entre elles, pour poser une canule sur la tête : 3 750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des structures cérébrales. Chacune reçoit ensuite jusqu'à trois injections espacées de deux semaines, par voie intrapéritonéale, intraveineuse rétro-orbitale, sous-cutanée, intranasale ou directement dans le cerveau, chaque injection étant suivie d'un prélèvement de sang inférieur à 20 % du volume sanguin total. L'objectif est de repérer, parmi plusieurs nanocorps issus de lamas, celui qui transporte le mieux un peptide jusqu'au cerveau, la baisse de température corporelle servant d'indicateur du passage. Le porteur écrit que le choix de Mus musculus est "indispensable" parce que les nanocorps testés reconnaissent des cibles murines.

Objectifs

Le cerveau est protégé par des barrières naturelles qui servent de filtres limitant le passage de molécules entre le sang et les tissus cérébraux. Elles rendent difficile le développement de solutions thérapeutiques telles que des anticorps ou des peptides, pour traiter les maladies du cerveau. Or, avec l’impact socio-économique de ces pathologies, il devient urgent de développer des stratégies pour franchir ces obstacles. Dans une étude précédente, nous avons trouvé qu’un anticorps de llamas, généralement appelé nanocorps, pouvait servir de cargo pour faire entrer un peptide – la neurotensine – dans le cerveau. Celui-ci serait un potentiel médicament pour l’addiction, la maladie de Parkinson et la douleur. Lorsqu’elle est directement injectée dans le cerveau, la neurotensine induit une baisse de la température corporelle. Cependant, elle reste incapable de franchir seule la barrière sang-cerveau. Au vu de nos résultats encourageants, nous aimerions continuer notre investigation en testant d’autres nanocorps que nous avons au laboratoire. Nous continuerons à utiliser la variation de la température corporelle comme paramètre pour évaluer le transport de la neurotensine vers le cerveau. Ces nanocorps que nous testerons présentent différentes propriétés et ciblent différentes protéines dans le cerveau. L’objectif est d’identifier au moins un nanocorps qui serait le plus intéressant en termes de rapidité à atteindre le cerveau et de temps qu’il passe dans cet organe.

Bénéfices attendus

Les potentiels médicaments biologiques tels que des anticorps thérapeutiques, rencontrent de grandes difficultés à entrer dans le cerveau. Nos études ont montré jusque-là que des nanocorps, 10 fois plus petits que les anticorps classiques, passent dans le cerveau. Ce projet vise à déterminer si ces nanocorps peuvent servir de cargo pour transporter des molécules d’intérêt thérapeutique dans le cerveau, en l’occurrence le transport de la neurotensine qui présente un potentiel dans le traitement de l’addiction, la douleur, la maladie de Parkinson et l’accident vasculaire cérébral. Grâce à ce projet, nous pourrions proposer de nouvelles stratégies pour franchir les obstacles que forment les barrières physiologiques du cerveau et accélérer le développement de médicament pour cet organe.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une opération chirurgicale. Une partie sera soumise à une simple opération de 45 minutes dans l’abdomen pour l’implantation d’une sonde de suivi de la température corporelle. Pendant 45 minutes supplémentaires, le reste des animaux sera soumis en plus à une chirurgie d’implantation de canule sur la tête pour l’administration des nanocorps par voie intracérébrale. Les animaux auront des injections périphériques (intrapéritonéale, intraveineuse en rétro-orbital, sous-cutanée, intranasale) ou directement dans le cerveau selon le groupe. Ces injections dureront 2 à 10 minutes sous anesthésie ou sur animal pris en contention. Elles seront répétées trois fois sur un même animal, avec un espacement d’au moins deux semaines. Des prélèvements sanguins inférieurs à 20% du volume sanguin total de l’animal d’une durée de 2-3 minutes seront réalisés sous anesthésie à la suite de chacune de ces injections, donc à un intervalle de deux semaines.

Impact sur les animaux

Sont attendus : - une douleur légère produite par l’introduction d’une aiguille au cours de l’administration des analgésiques et des nanocorps ; -des douleurs post-chirurgicales liées à la suture de la peau du ventre ; - une gêne liée à la chute de température (sensation de froid concomitante à baisse d’activité).

Devenir

L’ensemble de l’effectif est destiné à être euthanasié afin de pouvoir prélever les structures d’intérêt pour analyse.

Remplacement

Nous étudions l’entrée des nanocorps dans le cerveau à partir d’une administration hors de cet organe Le remplacement de l’animal n’est pas envisageable. Le cerveau est un organe complexe dont l’accès est principalement contrôlé par la barrière sang-cerveau. Mais, d’autres potentielles voies d’entrée existent et elles ne peuvent être représentées de manière exhaustive par des modèles isolés de barrière. D’ailleurs, d’après la littérature, ces modèles ne permettent pas de prédire systématiquement cette capacité d’entrée chez l’animal.

Réduction

L’étude sera réalisée sur un total de 3750 souris (3175 souris de phénotype sauvage et 575 souris génétiquement modifiées). Dans une logique de réduction, les expérimentations sur la majeure partie de l’étude (3250 souris) seront réalisées en longitudinal afin d’utiliser un seul animal pour tester plusieurs nanocorps différents. Le nombre de sujets nécessaire par groupe est proposé à partir d'un logiciel et sont cohérents avec les tests statistiques déjà publiés pour cette procédure expérimentale. Notre précédente étude ne montre aucune différence d’entrée de nanocorps entre les sexes. Par conséquent, nous utiliserons des mâles et des femelles dans nos cohortes.

Raffinement

Cette étude impliquera l’utilisation d’une lignée de souris génétiquement modifiées. Elles présentent une déficience pour le récepteur d’un neurotransmetteur cérébral, sans impacter sur leur comportement et leur bien-être. Cependant, tous les animaux de cette étude seront placés dans un milieu enrichi (bâtonnets de coton et abri en carton) avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum, sous surveillance régulière. La procédure ne débutera que sept jours après réception des animaux pour diminuer le stress lié au changement d’environnement. Tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront suivis quotidiennement après l’opération. Les injections ainsi que les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Les nanocorps à tester reconnaissent des cibles murines. Afin que leur passage à travers les différentes voies possibles d’entrée soit évalué, le choix de l’espèce Mus musculus est indispensable. Les souris seront traitées à partir de 5 semaines d’âge correspondant à l’âge adulte où la formation de la barrière sang-cerveau est complétement achevée.

Une chirurgie de trente à quarante minutes déclenche l'accumulation d'alpha-synucléine dans le cerveau de 60 souris adultes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent des injections sous la peau cinq jours par semaine pendant deux à quatre semaines selon les groupes, et une pesée hebdomadaire. Le peptide testé doit franchir la barrière hémato-encéphalique et bloquer l'agrégation de la protéine, et le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternatives" à l'expérimentation animale pour en démontrer l'efficacité et l'innocuité. Toutes sont tuées à la fin, par thoracotomie et perfusion intracardiaque destinées à fixer les tissus avant analyse.

Objectifs

La plupart des molécules destinées à la thérapie de maladies neurodégénératives qui ont une efficacité in vivo n'atteignent pas leurs cibles parce qu'elles sont incapables de traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui protège le cerveau chez les vertébrés et même les invertébrés. L'une des stratégies non invasives les plus prometteuses pour l'administration de médicaments au système nerveux central (SNC) est l'utilisation de peptides qui traversent la BHE. Ces peptides sont capables d'améliorer le passage des composés à travers la BHE sans en altérer l'intégrité. Ils sont économiques, chimiquement polyvalents et non immunogènes selon des résultats déjà obtenus chez la souris saine. De plus, ces peptides combinent un ciblage sélectif et spécifique. Ils sont mieux adaptés que les petites molécules, ils présentent une faible toxicité et sont moins enclins à générer des mécanismes de résistance aux médicaments administrés de façon quotidienne à long terme. La maladie de Parkinson est reconnue comme la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente. Cette pathologie touche environ 1% de la population de plus de 60 ans. La prévalence de la maladie augmente avec l'âge. Le coût économique direct et indirect estimé par patient tourne autour de 100.000 euros. Les traitements existants ne sont pas curatifs et ont des effets secondaires importants. Il s'agit donc d'une pathologie qui nécessite de développer des nouvelles approches thérapeutiques. La thérapie ici proposée utilise les dernières avancées en termes d’ingénierie peptidique pour permettre une pénétrance de la BHE optimisée, et combine cela à une stratégie d’arrêt d’accumulation de la protéine alpha-synucléine qui est clé dans le développement de la maladie de Parkinson. On testera ainsi l’effet protecteur de peptides anti-agrégation d’alpha-synucléine embarqués dans une navette qui les aide à traverser le BHE et arriver au cerveau de la souris parkinsonienne après avoir été injectés sous la peau.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour soigner la maladie de Parkinson, les traitements non-invasifs actuels ne traitent que les symptômes et ont, à terme, des effets secondaires assez importants, menant certains patients à arrêter le traitement. C’est pour cette raison que des nouvelles thérapies non-invasives sont toujours nécessaires. Le traitement que nous proposons est un peptide thérapeutique qui bloque l’interaction entre deux protéines dérégulées dans cette pathologie, une phosphatase et une kinase, et empêche ainsi l’accumulation pathologique d’alpha-synucléine. Ceci devrait conduire à une modification significative de la progression de la maladie de Parkinson si le traitement est administré précocement après le diagnostic.

Procédures

Les souris adultes seront sujettes à une seule procédure chirurgicale (30-40min) pour induire l’accumulation d’alpha-synucléine dans le cerveau, puis à un traitement par administration du médicament 5 jours par semaine (5min/jour) pendant 2 ou 4 semaines selon les groupes expérimentaux. Les souris seront pesées toutes les semaines. Lors de d’euthanasie les animaux subiront une thoracotomie pour permettre une perfusion intracardiaque et fixation des tissus.

Impact sur les animaux

Délivrer l’alpha-synucléine dans le cerveau nécessite une chirurgie ce qui peut entrainer une douleur modérée et transitoire péri-opératoire. Le traitement par injection sous la peau journalière pendant 2 à 4 semaines peut entrainer également un stress de manipulation/contention de l’animal. Une pesée hebdomadaire sera effectuée pour contrôler la normalité de la courbe de poids tout au long de l’expérience.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour d’alternatives à l’expérimentation animale pour faire la preuve de concept d’efficacité et sécurité de notre thérapie/peptide. Il est nécessaire de prouver une efficacité de passage de la BHE en conditions physiologiques chez le modèle animal rongeur puis une bonne distribution dans les régions ciblées dans le cerveau. De même, la démonstration de l’innocuité du traitement impose la présence d’un système immunitaire fonctionnel ce qui est absente dans les cultures cellulaires. Cela justifie donc l’utilisation des modèles murins.

Réduction

Une simulation statistique précise a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu de la variabilité de la technique d’analyse prévue (histologie). Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les résultats que nous avons observés dans le passé lors d’expériences similaires menées dans le laboratoire.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi, fournissant une palette de stimulations cognitives et motrices pour les animaux, et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés qui vont du soutien nutritionnel adapté à l’administration de médicaments. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Le protocole d’anesthésie et d’analgésie de la procédure chirurgicale a été défini et validé par une équipe vétérinaire et est implémenté en routine dans le laboratoire avec des résultats satisfaisants. Les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation à l’arrivée dans l’animalerie, de récupération après chirurgie et d’adaptation à la manipulation pour traitement quotidien qui ont pour objectif de garantir des conditions physiologiques et d’assurer un minimum de souffrance et stress pendant le protocole. La surveillance rapprochée et la mise en place de points limites (et de points d’alerte en amont des points limites) permettent d’évaluer une perte de poids, une infection, un changement de comportement en lien avec une douleur/ nuisance liée aux interventions.

Choix des espèces

Les régions les plus touchées du cerveau des patients atteints de la maladie de Parkinson sont la substance noire, où résident les noyaux des neurones dopaminergiques, et le striatum où se trouvent leurs terminaisons. Les modèles invertébrés ne possèdent pas de striatum. Les souris envisagées dans ce projet permettent d’étudier les neurones ciblés dans leur environnement cérébral complexe. De la même façon, les peptides utilisés dans ce projet doivent traverser une BHE, ce qui est difficilement atteignable sur des cultures cellulaires. La maladie de Parkinson est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Pour cette raison, les animaux utilisés dans le protocole seront des animaux adultes avant le début de l’induction de l’agrégation d’alpha-synucléine et du traitement pour réduire ou empêcher son agrégation. De plus, l’innocuité du traitement et l’efficacité de passage à travers la BHE nécessite une physiopathologie adulte pour augmenter la fiabilité de la prédiction des résultats chez l’homme.

Toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de quinze à vingt minutes leur greffe des cellules cancéreuses directement dans le pancréas, puis viennent des injections intrapéritonéales et intraveineuses trois fois par semaine, des pesées et un suivi hebdomadaire de la tumeur. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner une douleur modérée mais prolongée, que le développement tumoral peut provoquer des troubles métaboliques et une perte de poids au-delà de trois semaines, et que la chimiothérapie peut causer une cachexie. Il décrit une étude pilote de six souris par groupe destinée à calibrer les effectifs des expériences suivantes, et affirme ne pas pouvoir remplacer le modèle murin par des approches in vitro.

Objectifs

On estime à environ 10.000 le nombre de nouveaux cas de cancer du pancréas en France. L'incidence dans le monde, varie entre 1 et 10 cas pour 100 000 personnes et reste globalement stable dans le temps mais en croissance dans les pays développés. D’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Notre projet consiste à évaluer l’efficacité d’une thérapie dans un modèle tumoral murin du pancréas. L’objectif secondaire sera, si une efficacité est constatée, d’étudier les mécanismes d’action de notre candidat médicament. Cette étude pilote permettra de valider la maitrise du modèle de chirurgie expérimentale et de mesurer la variabilité des paramètres observer en réponse au différents traitements.

Bénéfices attendus

Le cancer du pancréas est difficile à diagnostiquer et particulièrement compliqué à traiter. Il résiste en effet à plusieurs traitements antitumoraux. Notre hypothèse est que notre cible thérapeutique joue un rôle dans le développement des tumeurs du pancréas. Nous nous basons pour cela sur des éléments d'évaluation de son expression dans une cohorte de patients atteints de ces tumeurs. Dans le cadre de notre société, nous évaluons l’effet anti-tumoral d’une thérapie ciblée seule ou en combinaison avec une chimiothérapie ou immunothérapie. Un essai clinique portant en partie sur le traitement de ces tumeurs avec notre thérapie ciblée a été initié début 2023. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement du candidat médicament et de son fonctionnement en association avec des chimiothérapie et immunothérapies. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéales et intra-veineuses 3x/semaine lors des administrations thérapeutiques ainsi qu'une procédure chirurgicale permettant d’accéder au pancréas. Chaque souris sera soumise à des injections sous-cutanées pour l'administration d'analgésique. Chacune des injection dure moins d' 1 minute. La durée de la chirurgie est estimée à 15 et 20 minutes par animal. Les souris subiront différentes manipulations chaque semaine pour des pesées, le suivi de la croissance tumorale mais également une procédure de chirurgie de greffe de cellules cancéreuse en orthotopique dans le pancréas. Ces manipulations peuvent entrainer du stress durant le temps des contentions ainsi que pour l'anesthésie (endormissement et réveil) lors de la chirurgie.

Impact sur les animaux

L'anesthésie des animaux peut entrainer une détresse légère et une hypothermie de moins d'une 1h. La chirurgie peut entrainer une douleur modérée mais prolongée. Les piqures et contentions peuvent entrainer un stress physique et une douleur légère inférieure à 1 minute. Le développement tumoral peut à des tades tardifs (>3sem post induction) entrainer des troubles métaboliques conduisant à une perte de poids. La chimiothérapie peut entrainer une cachexiedes animaux. Aucune activité métastatique n'est décrite dans le modèle.

Devenir

L’ensemble des animaux étant soumis à la chirurgie seront mis à mort car notre projet nécessite le prélèvement d’organes pour analyse.

Remplacement

En raison de la nature complexe de nos recherches, qui visent à comprendre les interactions cellulaires au sein du pancréas et de différents organes affectés par sa dysfonction, nous ne pouvons pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro. Le modèle de greffe de lignées cellulaires sera utilisé en remplacement des modèles génétiquement modifiés d’origine ayant servis à l’établissement ces lignées. Cette démarche permettra une réduction du nombre de souris nécessaire à cette problématique scientifique et un raffinement avec une réduction des nuisances induites chez les animaux, liées aux troubles métaboliques retrouvés dans ces modèles.

Réduction

Nous réaliserons ici une étude pilote permettant d'évaluer la variabilité des différents modèles utilisés sur les différents paramètres observés en fonction des traitements. Ainsi un effectif de 6 souris par groupe sera retenu. Ces expériences permettront par la suite de calculer les effectifs nécessaires et suffisants à l'évaluation thérapeutique sur ces modèles. Les conditions ne montrant pas de résultats préliminaires encourageants ne seront pas refaites avec des effectifs statistiques.

Raffinement

Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux à l'aide d'une grille d'évaluation portant sur le poids, l'état général et le comportement. Celle-ci sera mise en place 2x/semaine les 2 semaines suivant la greffe et 3x/semaine la dernière semaine avant sacrifice. Des mesures sont mises en oeuvre en fonction des scores obtenus. La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie et analgésie adaptée. Tous les gestes techniques et le suivi des animaux sont réalisées par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux. Une perte de poids et des signes de prostration sont également possibles en lien avec la pathologie induite ou après l’administration de chimiothérapie. Des mesures d'enrichissement du milieu (éléments de nidification supplémentaires) permettant un réchauffement des individus seront mises en place afin de limiter l’apparition d’hypothermies. De la nourriture semi-liquide sera mise dans la cage en cas de perte de poids >10%.

Choix des espèces

Le modèle de sourisutilisé est capable de générer des tumeurs pancréatiques dans 100 % des animaux. Il récapitule les aspects génétiques, moléculaires et micro-environnementaux liés à l’évolution de la maladie humaine. La souris immunocompétente est le modèle le plus approprié pour faire des suivis de pharmacocinétique dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux et de chimiothérapie. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres espèces. Par conséquent, les modèles de souris immunocompétentes sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les souris adultes de 6 semaines ayant un système immunitaire compétent et un pancréas développé et fonctionnel seront utilisées.

Un tube enfoncé par l'œsophage jusqu'au rumen, la tête immobilisée dans un lève-tête, quarante-huit prélèvements par animal sur six semaines : six vaches laitières taries subissent ces procédures, déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacune donne trois prélèvements de jus de rumen et six prises de sang par journée d'expérience, en alternant tubage gastro-œsophagien et prélèvement par la canule ruminale dont elles sont déjà équipées, une endoscopie de l'œsophage devant ensuite rechercher d'éventuelles lésions. L'objet déclaré est d'évaluer leur bien-être pendant ces prélèvements, et le porteur renonce pourtant au spray anesthésiant local pour rester "le plus représentatif possible des conditions de prélèvement utilisées dans ce type de recherche". Aucune vache n'est tuée, toutes rejoignent leur troupeau à la fin de l'étude.

Objectifs

Le recours à des bovins fistulés au niveau du rumen permet de réaliser des prélèvements de contenu ruminaux d’intérêt pour la recherche. L’utilisation des vaches fistulées est aujourd’hui remis en cause et des alternatives doivent être recherchées. Parmi elles, le prélèvement par tubages gastro-œsophagien est à évaluer. A ce jour, les seules études ayant comparé le prélèvement par tubages gastro-œsophagien vs. par canule se sont concentré sur la qualité des prélèvements (Boudon et al., en cours de soumission). Il s’agissait de déterminer si la qualité de ces prélèvements était suffisante pour i) être utilisés pour inoculer des fermenteurs de type batch et pour ii) étudier leur microbiote. A notre connaissance, aucune étude ne s’est intéressée au ressenti du bovin pendant et après ces prélèvements. L’objectif de cet essai est donc de comparer le bien-être de bovins pendant et après des prélèvements de contenu ruminal par tubage gastro-oesophagien vs. par canule ruminale. Pour répondre à ces objectifs, six vaches laitières taries équipées de canules ruminales (vaches fistulées), seront soumises successivement à des prélèvements du contenu ruminal par prélèvement gastro-oesophagien (PGO) et par canule (PC). Pour prendre en compte la variabilité individuelle et de réduire le nombre d’animaux soumis aux prélèvements, chaque vache sera son propre témoin. Les prélèvements se dérouleront en 2 périodes expérimentales de 3 semaines chacune, les animaux seront répartis en deux lots, : - Le lot 1 sera prélevé par PGO, puis par PC – Le lot 2 sera prélevé par PC, puis par PGO. Chaque semaine, chaque vache sera prélevée un jour par semaine, avec trois prélèvements par jour. La veille du premier prélèvement de la période, la procédure sera mimée trois fois (aux mêmes horaires que le lendemain) : le bovin sera contenu, le manipulateur mimera le geste sans réaliser le tubage ni l’ouverture de la canule. Au total, chaque vache sera prélevée pendant 6 semaines, et aura subi 9 PGO (3 prélèvements x 3 semaines) et 9 PC (3 prélèvements x 3 semaines), ainsi que 3 prélèvements mimés pour le PGO et pour le PC. Les réponses des bovins seront suivies via des mesures comportementales et physiologiques pendant et après le prélèvement. Pour caractériser la possible présence d’atteintes tissulaires liées à la procédure PGO, une endoscopie œsophagienne sera réalisée sur chaque vache par un vétérinaire: au début, entre les deux périodes expérimentales et en fin d’expérimentation.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude permettront d’avoir une vue d’ensemble sur la manière dont les prélèvements par PGO et PC impactent le bien-être des bovins. Cela permettra d’adapter, dans de futurs projets, les méthodes de prélèvements pour raffiner les expériences nécessitant de collecter du contenu ruminal.

Procédures

Durant les 6 semaines de l'expérimentation, nous réaliserons chaque semaine les prélèvements suivants : – 3 prélèvements de jus de rumen par vache sur une journée (8h30, 13h30, 16h30) pour nous permettre d’étudier la réponse de l’animal en fonction du remplissage du rumen : avant le repas ; 3h après le repas et 6h après le repas. Le volume prélevé sera à chaque fois de 100mL. – 6 prélèvements de sang à la queue sur une journée (un au moment de la contention, i.e. mise au cornadis, et un 20 minutes après la fin du prélèvement PGO ou PC pour avoir le pic de cortisol plasmatique), soit 2 prélèvements de sang/PGO ou PC = 6 prélèvements de sang par jour. Le volume prélevé lors de chaque prise de sang sera de 3 x 5 mL, soit 75 mL au total par jour. Sur la totalité de l’étude, chaque vache sera prélevée 48 fois : – P1 : 1 jour sham et 3 jours de manip = 24 prélèvements au total – P2 : 1 jour sham et 3 jours de manip = 24 prélèvements au total. Nous avons déjà réalisé une telle fréquence de prélèvement par jour sur des vaches adultes femelles à la veine coccygienne, sans jamais avoir été confronté à des complications.

Impact sur les animaux

Les effets du prélèvement de contenu ruminal par la canule (PC) et par tubage gastro–oesophagien (PGO) sur les bovins est à ce jour inconnu. Au regard de ce qui est observé chez le mouton lors de vidage total de rumen, nous pouvons nous attendre à un effet limité pour le PC. En effet le vidage total de rumen n’avait entraîné qu’un effet très limité sur la fréquence cardiaque des animaux expérimentaux, ce qui laisse suggérer qu’un simple prélèvement par la canule aura des effets similaires ou inférieurs que ceux observés dans le cadre d’un vidage total de rumen. En revanche, nous pouvons nous attendre à ce que le PGO déclenche une réaction aiguë plus intense (stress, agitation, comportement de défense) mais de courte durée, à l’instar de ce qui est observé lors d’autres prélèvements comme la ruminocentèse. La mise à mort des animaux en fin d’expérimentation n’est pas envisagée.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie et réintègreront le troupeau à la fin des procédures.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer l’espèce car cette étude de comportement et de bien-être animal sera effectuée sur l’espèce cible (bovin). Nous allons étudier le comportement et les réponses physiologiques des animaux. Il n’est pas possible de remplacer cette étude sur animaux car l’évaluation des méthodes de prélèvement sur le bien-être des animaux ne peut être réalisé que sur des animaux vivants.

Réduction

Afin de répondre aux objectifs du projet, 6 vaches seront mobilisées selon un schéma randomisé et longitudinal dans lequel chaque animal constituera son propre témoin. Elles seront soumises successivement à des prélèvements du contenu ruminal par tubage gastro-oesophagien (PGO) et par canule (PC). Afin de prendre en compte la variabilité individuelle, chaque vache sera son propre témoin. Les prélèvements se dérouleront en 2 périodes expérimentales de 3 semaines chacune, les animaux seront répartis en deux lots : – le lot 1 (n=3) sera prélevé par PGO trois semaines de suite, puis par PC trois semaines de suite – le lot 2 (n=3) sera prélevé par PC trois semaines de suite, puis par PGO trois semaines de suite Chaque semaine, chaque vache sera prélevée un jour par semaine, avec trois prélèvements par jour. L’effectif est le minimum nécessaire à une interprétation statistique. Ces types de prélèvements sont classiquement réalisés dans des études qui s’intéressent à la digestion ou à l’étude du microbiote ruminal. L’effet d’un anesthésique sur ces métabolites ou sur les populations microbiennes d’intérêt n’étant pas connu, ces sprays ne seront pas utilisés dans des études mettant en jeu ce type de prélèvement. Aussi, souhaitant être le plus représentatif possible des conditions de prélèvement utilisées dans ce type de recherche, nous ne prévoyons pas d’utiliser un spray anesthésiant.

Raffinement

Les animaux seront logés en stabulation libre respectant leur bien-être : ils seront maintenus en groupe social stable, auront accès à des zones de couchage avec matelas, d’alimentation et d’abreuvement conformes aux besoins de leur espèce, ainsi qu’à des brosses. A la fin de l’étude, ces bovins rejoindront leur troupeau d’origine. Pour tous les prélèvements, les vaches seront placées (contenues) au cornadis. Pour le PGO, nous immobiliserons la tête des vaches à l’aide d’un dispositif de lève-tête, placé devant le cornadis.

Choix des espèces

Il n'existe à ce jour aucun moyen alternatif d'obtenir les données attendues dans ce projet sans avoir recours à l'expérimentation in vivo sur vache laitière. Il s’agit de vaches laitières de race Prim’Holstein (race la plus fréquente en France). Les animaux utilisés dans cette expérimentation sont des animaux déjà appareillés d’une fistule ruminale, et disponibles dans l’unité expérimentale. Aucun animal ne sera nouvellement opéré pour cette étude expérimentale. Les vaches seront des vaches adultes, sélectionnées parmi le troupeau de vaches fistulées du troupeau de l’établissement utilisateur.

Neuf vomissements en moyenne par séance, survenant entre quatre et trente-cinq minutes après l'injection, et une léthargie qui dure jusqu'à cinquante-cinq minutes : 30 chiens sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun n'étant tué dans ce projet, tous restant disponibles pour une autre expérience après une période de repos. L'apomorphine leur est injectée sous la peau jusqu'à cinq semaines de suite pour provoquer nausées et vomissements, puis un antiémétique vétérinaire en développement est testé, avec douze à quatorze prélèvements sanguins en cinq jours pour ceux qui le reçoivent. Le porteur écrit que le chien est "l'espèce cible" et qu'il n'existe "pas de méthode de remplacement", le modèle devant aussi servir au développement de médicaments humains. Le point limite ne se déclenche qu'au-delà de dix vomissements en trente minutes ou de trois heures de symptômes.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : de développer et valider un modèle de nausées/vomissements induit par l’apomorphine chez le chien provoquant des signes cliniques mesurables, répétables, homogènes entre les animaux et pouvant être inhibés par l’utilisation d’antiémétiques; et d’évaluer l’efficacité d’un antiémétique vétérinaire en cours de développement sur ce modèle induit.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un modèle de nausées/vomissements chez le chien contribuera au développement de nouveaux médicaments vétérinaires antiémétiques. Ce modèle pourra également être utilisé pour le développement de médicaments à visée humaine car le chien a une sensibilité aux vomissements proche de celle de l’homme. Le développement de ces nouveaux médicaments permettra de prévenir les nausées et vomissements et de pallier aux effets secondaires de certains médicaments. Le vomissement est en effet l’effet secondaire le plus fréquent des différents médicaments en pratique vétérinaire ou en chimiothérapie. Ce signe clinique peut limiter l’efficacité des doses administrées et cause une gêne considérable qui diminue le confort et la qualité de vie des patients. De plus, une première étude pilote sur un nouveau médicament avec un faible nombre de chiens permettra de valider la poursuite de son développement ou non avant de passer aux études réglementaires de sa mise sur le marché. Le développement de nouveaux produits permettra également la mise sur le marché de médicaments pouvant être moins douloureux à l’administration ou encore permettant de palier à de potentielles ruptures de stock de médicaments déjà sur le marché.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées : 1) Administration d’apomorphine en sous-cutanée sur animaux vigiles (quelques secondes) : au maximum une fois par semaine sur un maximum de 5 séances consécutives, puis un repos de minimum 4 semaines sera appliqué avant de nouvelles administrations si besoin. 2) Administration de maropitant en sous-cutanée sur animaux vigiles (quelques secondes) : au maximum une fois par semaine sur 2 séances. 3) Administration d’un anti-émétique en cours de développement en sous cutanée sur animaux vigiles (quelques secondes) : au maximum une fois par semaine sur 2 séances. 4) Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (quelques secondes), uniquement sur les animaux traités avec le produit en développement : 12 à 14 prélèvements sanguins espacés de façon croissante et régulières durant les 5 jours suivant l’administration de produit d’essai.

Impact sur les animaux

L‘objectif de ce projet est d’induire des nausées/vomissements chez le chien. De nombreuses publications sur ce sujet montrent que la durée moyenne de ces symptômes est d’environ 30 minutes après l’administration d’Apomorphine avec une durée maximum de 2,5h. A la suite de la réalisation des 2 premières phase, nous savons aujourd’hui que ces données sont confirmée avec une administration de 0.05 mg/kg d’apomorphine . Le nombre moyen de vomissement observé sur les 12 chiens inclus dans ces deux premières phases est de 9, tous survenus entre 4 et 35 minutes après induction. Des signes de nausées (léchage des babines chez tous les chiens et plus occasionnellement une accélération de la respiration, une hypersalivation et des vocalisations) ont été observés rapidement après l’induction. Une léthargie a été observée chez tous les chiens, durant jusqu'à 55 minutes avant une récupération complète. Des autres signes incluant des évènements de prurit, de léchage corporel ou des tremblements passager ont également été observés de façon occasionnelle. L’apomorphine est un émétique commercialisé (EMEDOG) dont les effets secondaires fréquents sont une somnolence, diminution ou perte de l’appétit, augmentation de la salivation, déshydratation légère, troubles du rythme cardiaque transitoire et une douleur légère à modérée au point d’injection. Le Maropitant est également une substance active présente dans un produit vétérinaire ayant une AMM (ex. CERENIA). L’effet indésirable fréquent est une douleur au point d’injection. Il n’est pas attendu d’effets majeurs indésirables avec le nouveau produit en développement car les premiers tests de toxicité auront déjà été réalisés par le donneur d’ordre. En revanche, quelques effets secondaires liés à ce produit peuvent éventuellement ne pas avoir encore pu être anticipés. Les nuisances attendues liées aux prélèvements des animaux (12 à 14 prélèvements en 5 jours) durant la phase 4 sont celles liées au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

Le recours aux chiens pour mettre en place ce modèle de vomissement est justifié car il n’existe pas de méthode alternative pour vérifier l’efficacité d’un traitement antiémétique. L’utilisation d’un modèle in vivo permettra d’utiliser un nombre restreint d’animaux tout en testant des candidats médicaments dans un environnement contrôlé et standardisé.

Réduction

Aucune approche statistique ne sera réalisée pour cette étude. Des recherches bibliographiques ont permis d’établir le protocole pour mettre en place un modèle de vomissement avec un nombre restreint d’animaux et de périodes dans chaque phase du projet. La molécule choisie (Apomorphine), la dose à administrer, la voie d’administration, les effets attendus seront ainsi déjà estimés. Le nombre d’animaux utilisés correspondra au minimum pour obtenir des résultats interprétables. Le nombre d’animaux sera réduit avec leur réutilisation sur plusieurs phases si possible et une dernière phase en cross-over. L’étude pilote de preuve de concept sur le médicament en développement permettra de valider la poursuite de son développement avec un nombre restreint d’animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets suspendus, tunnel/plateforme). Avant l’inclusion dans une nouvelle phase, l’état de bonne santé des chiens sera confirmé par un examen clinique et un bilan hémato-biochimique. Pour limiter les quantités de vomissement en volume, les animaux auront été mis à jeun environ 4 heures avant l’administration d’apomorphine. Les phases 1 et 2 ont montré que ces conditions d’alimentation sont adaptées pour le bien-être de l’animal qui vomit de nombreuses fois en très petites quantités. Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués maximum quatre heures après l’administration du traitement pour le suivi des observations. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Les animaux seront observés pendant deux heures après l’induction du vomissement afin de caractériser les signes apparus. Puis toutes les 30 minutes jusqu’à au moins 4 heures post-traitement et jusqu’à disparition des signes (durée maximale des signes est de 2.5h selon le résumé des caractéristiques du produit). Lors de la phase 3 et 4, l’administration du Maropitant (Cerenia) sera faite à température réfrigérée pour diminuer la douleur au site d’injection comme indiqué dans la notice du produit. Lors de la phase 4 un suivi au point d’administration du produit d’essai sera réalisé pour vérifier les éventuelles réaction locale. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique sévère chez l’animal les points limites suivants ont été définis : vomissements très intenses à répétition (plus de 10 en 30 minutes ou qui durent plus de trois heures et sur appréciation vétérinaire), prostration de l’animal, difficultés respiratoires. Dès l'apparition de ces symptômes, l'animal sera pris en charge par le vétérinaire désigné et un traitement adapté sera prescrit pour le soulager.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible pour la mise en place du modèle de nausées/vomissements qui sera utilisé pour le développement d’un traitement antiémétique. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Ce modèle pourra également être utilisé pour le développement de médicaments à visée humaine car le chien a une sensibilité aux vomissements proche de celle de l’homme Chiens adultes correspondant à l’âge cible des traitements administrés.

Tous tués en fin de protocole pour prélever leur sang, leur liquide alvéolo-pulmonaire et leurs tissus pulmonaires, 1 680 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun inhale, vigile, des substances tussigènes pendant vingt à trente minutes pour déclencher des épisodes de toux, isolé dans une boîte en plexiglas. Le porteur décrit une bronchoconstriction, une gêne respiratoire, des épisodes de toux sévères et un écoulement de mucus par le museau, et prévoit en plus des chirurgies de pose de cathéter de vingt à trente minutes et des ponctions veineuses répétées sous anesthésie. Il écrit limiter le nombre d'animaux "tout en prenant en compte les besoins de nos clients", et fixe le sexe et le poids des cobayes "selon la demande client".

Objectifs

La toux est un réflexe primordial pour la protection des voies respiratoires et pulmonaires contre la production de substances internes (sécrétions) ou externes (inhalées). La toux chronique (durée dépassant les 8 semaines) affecte environs 10% des adultes de la population mondiale et représente un des symptômes les plus courant pour lequel les individus consultent les centres de soins primaires. La toux représente également la manifestation clinique dont les patients atteints de pathologies respiratoires se plaignent le plus. De nombreux facteurs de risques sont associés à la toux dont l’âges et le genre, les pathologies pulmonaires et extra-pulmonaires (e.g. infections respiratoires, asthme, reflux gastroœsophagiens…), les facteurs environnementaux (e.g. polluants), les produits chimiques irritants ou les allergènes. Le plus souvent, les patients souffrant de toux chroniques présentent également une hypersensibilisation des voies nerveuses impliquées dans le réflexe de toux amplifiant la fréquence et le nombres d’épisodes de toux. Malgré l’existence de nombreux traitements permettant de lutter contre ces épisodes de toux, l’efficacité de ces derniers peut être limitée et présentent un effet interindividuel très variable. De plus, chez 40% des patients, les mécanismes physiopathologiques à l’origines de la toux chronique ne sont pas toujours bien identifiés diminuant ainsi l’efficacité de la prise en charge du patient avec un traitement adapté. Le projet a donc pour objectif de tester l’efficacité de candidats médicaments sur un modèle de toux in vivo chez le cobaye vigile. De plus, il est essentiel de pouvoir connaitre la dose efficace d’un candidat médicament en déterminant sa concentration permettant d’assurer son effet thérapeutique optimal tout en minimisant le risque d’effets indésirables. Pour cela, il pourra être établi une analyse du devenir du candidat médicament dans l'organisme après son administration, et testé en parallèle de l’étude de son efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter des arguments scientifiques sur l’efficacité de nouveaux candidats médicaments chez le cobaye soumis à l’inhalation d’agent irritants des voies respiratoires. Les effets de ces molécules pourront être évalués sur une analyse solide de la réponse comportementale des épisodes de toux mais pourront également être confortés par une analyse approfondie de la réponse moléculaire et/ou immunohistochimique. En parallèle, l’établissement du profil pharmacocinétique des candidats médicaments pourra permettre de déterminer leur dose thérapeutique optimale pour, à terme, proposer une posologie adaptée de la molécule d’intérêt.

Procédures

Les animaux seront soumis à l'inhalation de substances tussigènes afin d'induire des épisodes de toux. La durée de cette étape est d'environ 20 à 30 min et s'effectue sur animaux vigiles. Ces derniers seront également traités avec des candidats médicaments ou des analgésiques par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou orale de manière aigue ou répétée (pour les analgésiques si besoin). Ces types d'administrations prennent 1 minute pour être effectuées. Les cobayes pourront également être traités avec les candidats médicaments par voie intraveineuse directement dans la veine jugulaire lorsqu'une seule administration sera nécessaire. Cette procédure se déroule sous anesthésie gazeuse et dure environs 10 min. Les administrations intraveineuses peuvent également être effectuées à travers un cathéter veineux sur animaux vigiles pour réaliser des traitements répétés et l'acte prend 1 minute. Il sera cependant nécessaire de réaliser une chirurgie unique sous anesthésie gazeuse pour implanter le cathérer dont la durée de l'intervention est de 20 à 30 min. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux veineux à l’aide d’une aiguille. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée pour une durée de 10 min par prélèvement.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. De plus, pour l’analyse de la toux, l’animal doit être placé et isolé dans une boite en plexiglass pendant plusieurs minutes ce qui peut engendrer de l’anxiété. L’induction des épisodes de toux via l’inhalation de substances tussigènes est une source d’inconfort pour le cobaye car ce sont des agents irritants pour les voies respiratoires et peuvent également causer une bronchoconstriction entrainant une gêne respiratoire, des épisodes de toux sévères et un écoulement de muscus par le museau. Pour les administrations de composés par voie sous-cutanée, intrapéritonéale ou orale, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut générer du stress. Une ou plusieurs administration par voie orale des composés pourront être réalisées, ou des injections de composés impliquant l’introduction d’une aiguille pouvant être source de douleur. Certaines modalités d’administration, telles que les injections intraveineuses directement dans les vaisseaux veineux nécessiteront d’avoir recours à l’anesthésie des animaux tout comme lors des chirurgies d’implantation de cathéters. Cette dernière modalité peut entrainer un risque d’infection et être l’origine de douleur et de perte de poids en post-opératoire. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée, générant potentiellement du stress et de l’inconfort.

Devenir

A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir collecter le sang, le liquide alvéo-pulmonaire, les tissus pulmonaires et les voies aériennes pour quantifier les effets du candidat médicament sur l’aspect moléculaire et/ou immunohistochimique. De même, certains animaux seront mis à mort pour les analyses de pharmacocinétique permettant de quantifier la biodistribution par organes du candidat médicament étudié.

Remplacement

L’objectif principal du projet étant de tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments sur les caractéristiques comportementales de la toux (i.e., fréquence et/ou intensité des épisodes de toux), il n’est pas possible de substituer les cobayes par des modèles in vitro. Par ailleurs, si des méthodes d’extrapolation in vitro-in vivo sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.

Réduction

Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (nombre de voies d’administrations et de doses à tester et nécessité de collecter les organes en fin de protocole). Selon l’objectif des projets, chaque animal pourra être son propre contrôle au cours des inductions des épisode de toux. Un même animal inclus dans un des groupes d’efficacité subira les tests d’induction de la toux, les prélèvements sanguins et la collectes des organes permettant de faire un suivi longitudinal. Le nombre d'animaux choisi par groupe doit permettre de mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre le groupe contrôle négatif et le(s) groupe(s) traité(s) avec un composé de référence. Par ailleurs, suite à la phase de pré-sélection des animaux répondeurs ou non-répondeurs aux agents tussigènes, les animaux non-répondeurs pourront être utilisés dans les groupes d’analyse de pharmacocinétique du même projet. Pour ces analyses pharmacocinétiques, chaque animal pourra être son propre contrôle en fonction du volumes de sang nécessaire (

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont familiarisés avec l'ensemble des outils de mesures, les nouveaux environnements ainsi qu’aux expérimentateurs. Avant de rentrer dans la salle d’hébergement, il est demandé aux expérimentateurs de toquer 2 fois à la porte pour diminuer le stress lié à la surprise. Pour l'induction de la toux par inhalation d’agents tussigènes : - les inductions sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. - les animaux sont habitués à être placés dans la boite de plexiglass. - l’induction de la toux se fait sur animaux vigiles évitant l’expositions à des agents anesthésiques et aux méthodes d’administrations de ces agents qui peuvent être source de stress. - pour limiter la bronchoconstriction, un bronchodilatateur est administré à la fin après la nébulisation facilitant la ventilation. Les actes pouvant générer de la douleur telles que les implantations de cathéter et les administration/prélèvements dans la veine jugulaire nécessitant une incision cutanée seront réalisés sous anesthésie chimique ou gazeuse et analgésie pré-opératoire et/ou locale et/ou post-opératoire selon le score sur la grille d’observation. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention. Les prélèvements sanguins et les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent) pour compenser la perte de volémie. Lorsque qu’une chirurgie sera nécessaire pour l’implantation de cathéter, elle sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (min 2x/jour) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie.

Choix des espèces

L’espèce animale la plus appropriée pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments antitussifs et la physiologie du réflexe de toux est le cobaye. Cette espèce exprime une réaction comportementale proche de celle de l’Homme en présence de 3 agent tussigènes communément utilisés pour induire des épisodes de toux chez l’Homme. En effet, les cobayes sont capables de tousser contrairement aux rats et aux souris ne permettant pas, chez ces espèces, de modéliser la toux d’un point de vue comportemental. De plus, les mécanismes nerveux sous-tendant le réflexe de la toux impliquent les fibres sensorielles composant le nerf vague, dont la neurophysiologie et l’aspect histologique sont très similaires à ceux de l’Hommes. Suite à l’activation de ces fibres, l’intégration des influx nerveux au niveau supraspinal se fait dans le bulbe rachidien dans le noyau du tractus solitaire tout comme chez l’Homme. Selon la demande client, les animaux utilisés dans le cadre de ces études seront des cobayes : -Femelles : > 200g correspondant à un âge > 4-8 semaines -Mâles : > 350g correspondant à un âge > 9-10 semaines Ces âges correspondent, en fonction du genre, à l’atteinte de la maturité sexuelle indiquant un ralentissement du développement, limitant ainsi la variabilité des résultats.