Procédures modérées

13 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue au motif qu'une exposition à la toxine les rendrait inutilisables ailleurs. Chacun reçoit la mycotoxine Enniatine B1 une fois par gavage et une à deux fois par voie intraveineuse, puis subit quatorze prélèvements sanguins à l'état vigile, répartis sur deux journées séparées par une période de récupération. Les rats arrivent déjà cathétérisés par le fournisseur, ce que le porteur compte au titre du raffinement, et leurs concentrations plasmatiques doivent alimenter un modèle mathématique censé prédire l'exposition humaine à cette toxine des céréales. Le porteur annonce vouloir "établir pour cette toxine des méthodes alternatives à l'expérimentation animale", et écrit dans le même document que l'étude chez le rat reste "indispensable" pour extrapoler des cellules à un "organisme entier".

Objectifs

L’Enniatine B1 est une mycotoxine émergente secrétée par les microchampignons du genre Fusarium. La toxicité potentielle a été étudiée mais il n’a pas été reporté de cas d’intoxication humaine cependant, du fait de son activité ionophorique, elle interagit avec plusieurs composants cellulaires avec des effets notamment au niveau du foie, estomac, intestin et reins, en cas d'exposition chronique. Elle fait partie des enniatines les plus prévalentes dans les céréales et les produits céréaliers. Ainsi, cette prévalence implique une exposition, aussi bien des humains que des animaux se nourrissant de céréales, de manière quotidienne à de faible doses. Par ailleurs, le manque de données sur la toxicologie de l’Enniatine B1 entraine l'impossibilité de fixer des seuils de sécurité pour la santé. Le projet vise à combler certaines lacunes sur ces données et à établir pour cette toxine des méthodes alternatives à l'expérimentation animale. Il s’articule autour de plusieurs axes, tout d’abord des expérimentations sur des cellules hépatiques humaines et de rats, dans le but d’étudier le devenir de la toxine. La seconde étape consiste en l’extrapolation par modélisation mathématique pour passer de l’échelle cellulaire à l’animal. Les données de cette extrapolation requièrent une validation par une étude des concentrations sanguines de l’Enniatine B1 chez le rat, sachant qu’on ne peut envisager des études chez l’humain dans un contexte toxicologique. Les données sanguines chez le rat serviront au développement d’un modèle mathématique qui reflète le fonctionnement de l’organisme chez le rat. La comparaison des concentrations toxiques pour les cellules hépatiques et les concentrations sanguines prédites par le modèle mathématique permettra de déterminer les seuils toxiques pour l’humain.

Bénéfices attendus

Le projet vise à combler les lacunes sur le devenir et la toxicité de l’Enniatine B1 pour le foie. Les données serviront au développement d’un modèle mathématique validé par l'étude chez le rat pour comparaison avec les études sur cellules. Ce modèle servira d’outil de prédiction de l’exposition humaine par estimation des concentrations plasmatiques et permettra de simuler des scenarios d’exposition. Les concentrations plasmatiques prédites par le modèle, comparées aux concentrations toxiques pour le foie permettront de déterminer le risque pour la santé humaine à long terme.

Procédures

Chaque rat, recevra l’Enniatine B1 une fois par voie orale et une ou deux fois par voie intraveineuse. Le gavage réalisé une fois pour chaque rat dure moins de 2 minutes. L’injection en intra veineuse se fait en 15 secondes. Chaque rat à l’état vigile subira au total 14 prélèvements de 0.1 mL de sang et durant moins de 30 s. Les échéances pour chaque rat seront réparties sur 2 jours séparés par une période de récupération comme suit : - 7 prélèvements à 0 min (avant l’injection), 10 min, 20 min, 45 min, 2h, 6h et 24h ou bien 5 min, 15 min, 30 min, 1h, 4h, 8h et 24h après injection intraveineuse. - 7 prélèvements à 0 h (avant gavage), 1h, 4h, 7h, 9h, 11 h et 24h ou bien 15 min, 2h, 6h, 8h, 10h, 12h et 24h après administration par voie orale. A noter que l’injection intraveineuse et les prélèvements ne sont pas invasifs, car effectués via un cathéter préalablement installé par notre fournisseur agrée avant l'arrivée des animaux au sein de nos locaux. Un contrôle quotidien préventif est toutefois nécessaire pour s'assurer de la pérénité des cathéters.

Impact sur les animaux

Le cathéter posé pour réduire la douleur et l’inconfort des prélèvements peut être sujet à une infection ou une inflammation induisant une douleur ou une souffrance chez le rat. Par ailleurs, le gavage qui pourrait constituer une source de stress pour les animaux, sera réalisé par un opérateur expérimenté, afin de s’assurer de la sécurité des animaux et de réduire l’inconfort lors de la contention.

Devenir

Tous les animaux impliqués dans ce projet, seront mis à mort après le dernier prélèvement de la dernière séquence de chacune des procédures (pilote et principale). Ayant été exposés à une toxine, les rats pourraient développer une toxicité retardée ou des effets pouvant changer le fonctionnement de leur organisme, notamment au niveau du foie ou la toxine est métabolisée. De ce fait, ils ne peuvent être réutilisés dans d'autres projets.

Remplacement

Cette étude est indispensable pour valider les résultats des expérimentations de la cinétique de l'Enniatine B1 obtenus sur des modèles cellulaires. Les études sur des cellules isolées ne reflètent pas le fonctionnement d’un organe ou d’un organisme entier, qui ne peut s’apprécier que par des études chez l’animal. Ces études restent indispensables pour pouvoir extrapoler les données sur cellules à un organisme entier. Les méthodes alternatives comme les expérimentations in vitro ou la modélisation permettent de réduire le recours à l’expérimentation animale ou le nombre d’animaux utilisés mais aucun modèle expérimental ne permet dans l’état actuel d’avancement de la science de s’affranchir complètement des études sur animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux par procédure, un design expérimental spécifique sera appliqué, permettant d’utiliser les mêmes animaux pour deux administrations avec une période de récupération suffisante à l’excrétion totale de l’Enniatine B1 avant la seconde administration. Ce design permet de couvrir un nombre suffisant de prélèvements sanguins, tout en respectant le volume sanguin maximal à prélever par rat. De plus, en réutilisant les rats dans une seconde séquence, le nombre d’animaux par temps de prélèvement garantira des données pouvant être exploitées dans un modèle mathématiques avec ses variations (grâce à l'augmentation du nombre d'animaux par temps de prélèvement en réutilisant les animaux dans une seconde séquence).

Raffinement

Dans le respect des normes du bien-être animal, les rats seront hébergés dans des cages en polypropylène, aux bonnes dimensions, sur litière. Les rats seront au minimum deux par cages. Par ailleurs, les cages seront équipées d’enrichissements comme : briquettes, balles, billes…etc, et seront en étroite proximité pour favoriser le contact visuel et sonore entre les rats des autres cages. De même, les cages à métabolisme seront également équipées d’enrichissements comme les balles. Le design expérimental est conçu pour réduire autant que possible l’inconfort des animaux en limitant au strict nécessaire leur manipulation. Ainsi, l’utilisation d’animaux cathétérisés, permet de réduire l’inconfort et la douleur lors des prélèvements sanguins et de faciliter l’administration par voie intraveineuse. De plus, Les cathéters seront nettoyés à chaque utilisation avec une solution de chlorhexidine avant fermeture, et surveillés régulièrement pour détecter d’éventuels signes d’infection. L’expérimentation sera effectuée par des opérateurs formés, maitrisant les gestes de contention afin de limiter l’inconfort et la souffrance des rats. De même, la surveillance des signes limites déterminés au préalable permet d'intervenir rapidement sur les animaux. Des méthodes et des médications appropriées sont prévues pour réduire le stress, l’inconfort ou la douleur. L’administration d’analgésiques (Anti-Inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ou bien des dérivés morphiniques) est prévue si nécessaire.

Choix des espèces

Les rats ont été choisis pour l’expérimentation animale car le laboratoire dispose déjà de données sur des cellules isolées de foie de rats Sprague-Dawley. Les rats utilisés pour cette étude sont au stade de développement entre 6-8 semaines, pour permettre la pose chirurgicale des cathéters. Ce choix est également justifié par le fait de réduire la quantité de toxine (Enniatine B1) utilisée, et pour répondre aux besoins en terme de prélèvements sanguins.

Ces injections intrathécales servent à caler les doses et le calendrier des études réglementaires obligatoires qui suivront. 116 macaques à longue queue y sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 tués pour l'analyse post-mortem des tissus et 66 gardés en vie pour d'autres études. Chacun peut recevoir jusqu'à six injections dans le liquide céphalo-rachidien sous anesthésie générale, avec ponction du même liquide, jusqu'à dix prélèvements sanguins par semaine sur animal vigile, six IRM de trois heures maximum et vingt-quatre heures en module de collecte d'urine. Le porteur anticipe une baisse transitoire des réponses des membres inférieurs, des contractions musculaires et de rares fuites urinaires, et présente ces essais comme un moyen de réduire les contraintes des études réglementaires à venir.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer très précocement l’efficacité et la toxicité éventuelle de candidats-médicaments administrés par voie intrathécale afin de pouvoir proposer le meilleur traitement aux patients atteints de troubles neurologiques graves tels que par exemple les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson…) ou des atteintes neuropsychiatriques (épilepsie, …). Les études dans ce projet permettront d’ajuster au mieux les doses et le schéma expérimental des études réglementaires (diminution des contraintes pour l’animal).

Bénéfices attendus

Détecter le plus précocement possible des effets potentiellement toxiques des candidats-médicaments en développement permettra en plus d’assurer la réduction du nombre d'animaux qui seront utilisés à des fins de recherche pour sécuriser in fine l’utilisation chez les patients. Ce projet nous permettra également de comprendre l’impact du geste de l’administration spinale (voie intrathécale) répétée d’un traitement et à terme d’identifier des biomarqueurs d’intérêt pour rendre plus sûre l’administration du traitement chez les patients et améliorer ainsi leur prise en charge.

Procédures

•Injections intrathécales réalisées sous anesthésie générale : jusqu’à 6 injections maximum avec un délai minimum de 7 jours entre les 2 injections (durée acte : 15min maximum) •Prélèvements de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie générale juste avant les injections intrathécales et plus rarement entre 2 injections intrathécales. (durée : 2 à 3 min en fonction de la vitesse d’écoulement) •Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (au maximum 10 par semaine ou dans la limite de 7,5% du volume total circulant ; quelques secondes •Prélèvements urinaires en hébergeant l’animal dans un module d’hébergement adapté pendant 24 heures maximum pour collecter les urines. •Examen des yeux sous anesthésie générale (utilisation d’une lampe à fente) : 30 à 40 min • Examen du système cardiovasculaire (port gilet pour monitoring sur 12h) par électroencéphalogramme et prise de la tension artérielle (brassard pour les mesures : 10min max). • Imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie générale : 6 sessions au maximum, espacées de 15 jours minimum, seront réalisées par animal (durée acte : 3h maximum)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les effets indésirables anticipés concernent ceux inhérents à la voie d’administration intrathécale et pourrait inclure : une diminution transitoire (jusqu’à 24-48 heures après injection) des réponses des membres inférieurs pouvant induire ou non une perturbation de la démarche et la posture de 30 minutes à 4 heures après le réveil, contractions musculaires durant la procédure ou juste après injection, de rare troubles neurologiques tel que des fuites urinaires (jusque 4 heures après injection). Ces effets potentiels seront gérés par l’utilisation de points limites adaptés afin de limiter au maximum l’apparition et la durée des effets décrits ci-dessus. La douleur et la souffrance potentiellement présentes sont liées aux administrations et aux prélèvements de sang et de liquide cérébrospinal. Ces désagréments sont gérés sous anesthésie générale excepté dans le cas des prélèvements de sang où l’anesthésie provoquerait plus de souffrance et de stress que l’acte en lui-même pour lesquels les animaux sont habitué par renforcement positif. Concernant l’IRM, il s’agit d’un examen de nature non-invasive mais des nuisances liées à l’anesthésie et son caractère répétitif (troubles respiratoires/embolie pulmonaire, fausse déglutition) ou une perte de poids peuvent subvenir. Un inconfort des voies aériennes suite à l’intubation endotrachéale (max 3h) peut être attendu

Devenir

66 animaux seront gardés en vie et pourront être réutilisés dans d’autres études, après accord vétérinaire. 50 animaux seront euthanasiés pour procéder à l’analyse post-mortem des tissus (immunohistochimie/biochimie).

Remplacement

Les progrès scientifiques ont permis de diminuer le nombre d’animaux utilisés en privilégiant les tests in silico et in vitro pour la sélection précoce des molécules. Cependant, les progrès réalisés n’ont pas permis la substitution complète des tests in vivo qui demeurent un requis réglementaire. Comme les études envisagées dans le cadre de ce projet permettent de choisir les doses des études réglementaires obligatoires et d’identifier les organes cibles potentiels pour ajuster au mieux les examens à réaliser dans les études réglementaires, elles doivent être réalisées sur le même modèle animal que celui des études réglementaires.Cependant, des études préliminaires réalisées en amont chez le rongeur (rat/souris) auront déjà permis de bien définir les doses à administrer et à limiter le nombre de produits à tester chez le primate non humain..

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit à son minimum afin d’atteindre l’objectif du projet. Pour ces études, en tenant compte de la disponibilité de la bibliographie existante et des données générées en interne,, on utilise 1 à 3 animaux/sexe/dose. Le choix du nombre d’animaux dépend de la variabilité des paramètres étudiés. Ces études préliminaires permettront de limiter le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques dans les études réglementaires.

Raffinement

Une procédure d’analgésie et d’anesthésie sera appliquée au moment des administrations intrathécales. Une anesthésie sera également effectuée pour l’examen IRM. Un délai d’au moins 48h sera respecté entre les IT et IRM. Une observation accrue et adaptée du comportement de l’animal sera faite suite à l’administration afin de s’assurer qu’il ne présente pas de signe défavorable ou que l’apparition d’éventuels signes liés à la procédure ne soit que transitoire (ex : démarche anormale). Concernant le reste des examens pratiqués, afin de ne pas interférer sur les paramètres étudiés, les animaux ne seront pas anesthésiés mais ils seront habitués par renforcement positif. Une grille de point limite adaptée est mise en place pour prise de décision rapide. En cas de nécessité, le vétérinaire pourra intervenir et décider de la mise en place de soin spécifique. Tous les animaux sont mis en groupes, sauf cas occasionnel justifié scientifiquement (enregistrement télémétrie , prélèvements sanguins ou signes nécessitant l’hébergement individuel) ou éthologiquement (incompatibilités), avec de l’enrichissement adapté aux besoins des primates.

Choix des espèces

Les études de ce projet ont pour but de prédire au mieux les effets indésirables secondaires liés aux candidats médicaments chez l’Homme ainsi que son efficacité sur l’engagement de la cible associée à la distribution du médicament dans l’organisme humain. Dans ce contexte, le modèle primate non-humain peut être sélectionné à la place d’une autre espèce non-rongeur parce qu’ils sont plus proches de l’humain notamment sur la totalité des paramètres suivants : • Sur le plan pharmacologique et toxicocinétique : exposition au médicament, élimination, fraction libre du médicament… • D’un point de vue du métabolisme : le type et la quantité relative de métabolites produits suite à l’administration d’un médicament en se basant sur des études préliminaires • D’un point de vue physiologique : réactions physiologiques similaires (exemple : engagement de la cible) et pertinentes pour évaluer la sécurité chez l’Homme • Sur le plan expérimental : évaluation des formulations et excipients tolérés, voies d’administration possibles • Données historiques : expérience avec des médicaments compétiteurs de la même catégorie Ces études étant préliminaires aux études réglementaires qui utilisent principalement des adultes et de jeunes adultes, il est donc prévu d’utiliser des animaux du même stade de développement.

3 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales destinées à déclencher des tumeurs de la prostate, puis, trois, cinq ou neuf mois plus tard, une ouverture de l'abdomen avec ou sans retrait des testicules, et enfin des injections de traitements stimulant ou bloquant les cellules natural killer jusqu'à quatre fois par semaine. Le porteur qualifie les suites opératoires de "douleurs mineures facilement prévenues" et écrit que l'étude pourra ouvrir de "nouvelles pistes thérapeutiques" contre les cancers résistants à la castration. Il affirme que la complexité des lésions précancéreuses "rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo", tout en indiquant que l'équipe étudie déjà une partie des paramètres sur des organoïdes dérivés des tumeurs.

Objectifs

Afin de mieux comprendre la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate (CaP), ce projet vise à étudier les effets de la castration chirurgicale dans plusieurs modèles murins de cancers prostatiques. En effet, le traitement du cancer de la prostate chez l'homme repose sur la chirurgie et l'utilisation de traitement anti androgénique appelé castration chimique. Malheureusement, après un temps limité de sensibilité aux traitements, 20% des patients développent des résistances à ces traitements et les cancers "résistants à la castration" sont de très mauvais pronostic. Il est donc primordial de mieux comprendre la résistance à la castration. Les études récentes menées au laboratoire mettent en évidence une implication forte du facteur de transcription Hif1a induit par l'hypoxie dans le développement de la résistance à la castration. Ainsi nous voulons étudier le mécanisme moléculaire sous-jacent pour mieux comprendre par quel biais l'inactivation de Hif1a rend ces tumeurs sensibles à la castration. Nos données préliminaires montrent un infiltrat de cellules natural killer majeur dans les souris sensibles à la castration comparé à celles qui présentent des tumeurs résistantes à la castration. L'objectif est donc de conduire une étude dans laquelle les cellules natural killer sont bloqués ou stimulés afin de voir la réponse sur la croissance des tumeurs après castration.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si les cellules natural killer permettent de rendre les tumeurs de prostate sensibles à la castration dans le cancer de la prostate et par quels mécanismes. Si cela s'avère être le cas, cette étude pourra ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate résistant à la castration.

Procédures

Les souris subiront 5 injections intra-péritonéales sur 5 jours pour induire l'apparition des tumeurs (5 minutes par souris), puis une intervention chirurgicale (castration/sham) 3, 5 ou 9 mois plus tard (30 min par souris) et les injections intra-péritonéales de traitement stimulant ou bloquant les cellules natural killer 1 à 4 fois par semaine pendant au plus 4 semaines (jusqu'à 12 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets secondaires post chirurgicaux sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas. En cas de mauvaise ligature des artères, une hémorragie peut avoir lieu. Cette complication est très rare et facilement visible du fait du gonflement important de la zone et d'effets secondaires généraux sur l'animal. Le blocage des cellules natural killer a été déjà éffectué dans de nombreuses études chez la souris et sont administrés en routine par un laboratoire collaborateur sans observation d'effets secondaires. L'activation des cellules natural killer peut engendrer une perte de poids transitoire des souris traitées dans les 48h suivant l'administration, les souris reprennent habituellement leur poids de départ dans la semaine qui suit l'injection. La croissance des tumeurs de prostate est lente et donc les variations de poids liée à leur croissance ou régression sur 2 semaines est négligeable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les organes et de les analyser.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.Par ailleurs, nous utilisons des organoïdes dérivés des tumeurs pour étudier un certain nombre de paramètres, cependant l'étude du microenvironnement nécessite de se placer en condition in vivo stricte.

Réduction

Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Afin d’obtenir des résultats significatifs avec une bonne puissance, nous aurons besoin de 20 animaux par groupe. Le nombre d’animaux sera de 3860 souris maximum.

Raffinement

On procèdera à l'anesthésie générale des souris par inhalation, et après l'induction, une analgésie en injection intrapéritonéale sera faite. En post-opératoire, une injection en sous cutannée d'ant- inflamamtoire sera faite. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, une analgésie supplémentaire sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Par ailleurs, les animaux castrés (ouverture abdominale avec retrait des tesitcules) et les animaux sham (ouverture abdominale sans retrait des tesitcules) seront séparés: une cage sham versus une cage castré par exemple pour éviter tout risque de domination. En cas de signe de douleur (dos voute, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation), l'animal sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Après les injection-intrapéritonéales, les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter une éventuelle infection sur les sites d'injection, et en cas d'observation de rougeur, de voussure ou de signe de douleur, les animaux seront retirés de l'étude et un avis vétérinaire sera pris. Par ailleurs, pour prévenir une éventuelle perte de poids liée aux traitements, le poids sera pris 1 fois par semaine pendant la durée de l'étude et en fonction de la différence de perte de poids observée, soit de la nourriture enrichie sera administrée aux souris, soit les animaux seront mis à mort et retirés des études.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le CaP humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes. A l'âge de 8 semaines, nous administrons le Tamoxifène pour induire le développement de tumeurs. Puis, 3, 5 ou 9 mois plus tard, nous débutons les expériences (castration et neutralisation des cellules NK, stimulation de ces cellules) avec les différents groupes expérimentaux et nous euthanasierons les animaux à un temps court et un temps long après les traitements.

Vingt ouistitis seront tués pour vérifier par histologie la localisation de protéines dans leur cerveau, les quarante autres étant rendus au centre d'élevage. Ces 60 ouistitis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec trois à quatre chirurgies crâniennes par animal de trois à six heures, une à deux IRM sous anesthésie, puis des séances d'entraînement oculomoteur d'une à deux heures par jour pendant vingt-quatre semaines au plus. Le porteur décrit l'isolement temporaire du groupe social, la douleur liée aux vis et à la craniotomie, et le rasage de la tête qui peut perturber les interactions sociales après l'opération. Il indique que l'effectif tient à des aspects pratiques plutôt qu'à un calcul statistique, et affirme que les primates non-humains sont "le seul modèle approprié".

Objectifs

Orienter son regard vers les stimuli d’intérêt régit nos interactions avec notre environnement. Il existe deux types de comportements oculomoteurs, les saccades—mouvements rapides, précis et balistiques—et les mouvements de poursuites de cibles en mouvement. Les poursuites sont sous le contrôle direct de neurones situés dans différents noyaux du tronc cérébral et les saccades sous le contrôle du colliculus supérieur. Ces zones intègrent directement des informations en provenance de différentes aires corticales qui sous-tendent également les interactions entre systèmes sensoriels, cognitifs/volontaires et moteur. Par exemple, les neurones d'une aire frontale appelée champ oculomoteur frontal répondent spécifiquement durant les mouvements de poursuites ou de saccades mais également lors de tâches impliquant des processus cognitifs (attention visuelle, mémoire de travail). Cette aire est ainsi dans une situation anatomique idéale pour combiner les commandes oculomotrices et les informations contextuelles. L’influence contextuelle sur les comportements oculomoteurs peut être étudiée ainsi : dans une tâche simple consistant à suivre un point se déplaçant vers la droite ou la gauche, la latence de poursuite vers la droite (début du mouvement des yeux) est inversement proportionnelle à la fréquence de mouvements vers la droite. Autrement dit, plus la probabilité que la cible se déplace vers la droite est élevée, plus les sujets anticipent le mouvement vers la droite. Mécanistiquement, nous proposons que l'intégration de telles informations dans les comportements oculomoteurs s'effectue au niveau des réseaux pariéto-frontaux. Ce projet s’organise autour de 3 buts principaux : 1. Caractériser les influences du contexte comportemental sur les comportements oculomoteurs des ouistitis. 2. Définir les propriétés anatomo-fonctionnelles des neurones des cortex pariétaux et frontaux des ouistitis, notemment tester l’hypothèse d’une analogie avec les réseaux décrits chez d'autres espèces de primates. 3. Tester comment les neurones des réseaux pariéto-frontaux intègrent les informations spécifiques au contexte comportemental pour influencer les comportements visuo-moteurs.

Bénéfices attendus

Les troubles oculomoteurs sont des marqueurs fiables des pathologies touchant les cortex pré-frontaux et pariétaux comme la schizophrénie, les deficits attentionnels et l’hyperactivité. Mieux comprendre les mécanismes régissant ces comportements permettra de mieux appréhender ces maladies. Ce projet nous donnera accès à des données nouvelles et permettra de mieux comprendre le fonctionnement du système oculomoteur. Les bénéfices sont liés à des apports de connaissance fondamentale. Nous aurons ainsi une meilleure connaissance des mécanismes mis en jeux lors des modulations contextuelles des mouvements oculomoteurs.

Procédures

-manipulations et captures par expérimentateurs -IRM anatomique (anesthésie) (1 à 2 par animal, 2 heures) -procédures chirurgicales d'implantation et de désimplentation de dispositifs crâniens (3 à 4 par animal-3 à 6 heures). -séances d'entrainements à des tâches comportementales permettant de manipuler et de caractériser les comportements oculomoteurs (1 à 2 heures par jour par animal pendant plusieurs semaines-max 24 semaines). - séances d'acquisition des données (2 à 3 heures par jour par animal pendant plusieurs semaines).

Impact sur les animaux

Stress lié à la manipulation quasi-quotidienne et proximité avec humains. Stress lié à l'isolement temporaire du groupe social. Stress lié aux anesthésies et aux piqures. Chirurgies nécessitent de raser la tête (notemment les toupets), entrainant un potentiel problème d'interaction sociale après la chirurgie. Douleurs liées à l'implantation de plot de tête (incisions et vis) et craniotomie pour la chambre. Impatience liée aux temps d'attente lors des acquisitions.

Devenir

Il est nécessaire, pour 20 des animaux de ce projet, d’effectuer des études histologiques anatomiques pour vérifier la localisation de l’expression de protéines spécifiques. Ces études histologiques ne sont pas nécessaires pour les 40 animaux restant, qui seront remis sous la responsabilité du centre d’élevage à la fin des expériences.

Remplacement

Il est très compliqué d'avoir accès à l'activité des neurones du système nerveux central (le cerveau étant protégé par la boite cranienne). Les méthodes disponibles chez l'humain n'ont pas la résolution nécessaire pour comprendre les mécanismes décris ici et ne permettent de toute façon pas les manipulations causales que nous proposons. Par exemple, l'IRM fonctionnel ne possède pas la résolution temporelle (plusieurs secondes) pour accéder à des mécanismes intervenant dans des durées de quelques millisecondes. De plus, il n'existe pas de modèle artificiel des comportements étudiés et des mécanismes les sous tendant, empêchant l'expérimentation in silico ou ex vivo. De plus, étudier ces mécanismes nécessite un modèle proche de l'humain pour assurer la conservation phylogénétique, anatomique et comportementale. En raison de la proximité anatomique et fonctionnelle des structures étudiées avec celles de l'humain, les primates non humains sont le seul modèle approprié. Le cerveau lissencéphalique du marmouset ainsi que sa susceptibilité aux méthodes d'optogénétiques en font un modèle de choix pour étudier ces phénomènes.

Réduction

Nous réduirons le nombre d'animaux utilisés au minimum accepté par la communauté scientifique. Les études électrophysiologiques sur le primate non-humain sont généralement réalisées sur 2 à 4 animaux. Compte tenu du faible nombre d'essais des tâches comportementales réalisés par chaque individu, nous avons besoin de multiplier les expériences chez plusieurs animaux pour tester un panel de tâches suffisament large. De plus tous les animaux ne présentent pas la motivation nécessaire pour réaliser ces tâches. Il faut donc tenir compte qu'un certain nombre d'animaux (dans des proportions difficiles à quantifier) seront sortis du projet à des phases précoces et ne subiront que des procédures légères. Nous considérons qu'acquérir des données électrophysiologiques sur 3 animaux par tâche suffira. Nous comptons tester environ 5 tâches par animal. Nous utiliserons au maximum 20 animaux (moins si les résultats permettent de n'utiliser que 2 ou 3 animaux par tâche comportementale) dans 3 procédures différentes (total de 60 animaux). Il est important de noter que ce nombre d'animaux par étude n'est pas lié à des données statistiques mais à des aspects pratiques (dont la durée de réalisation complète d'une expérience).

Raffinement

Nous mettrons en place des points limites préalablement définis. Les procédures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale et une médication appropriée (analgésie) sera fournie dans le but d'éviter toute souffrance liée aux chirurgies. Les animaux sont hébergés en groupe social (2 individus minimum par groupe), dans des espaces enrichis dont les dimensions dépassent la règlementation actuelle. Le transport vers le centre IRM sont effectués dans une boite de transport sous sédation, dans une couverture pour éviter toute déperdition thermique. Les phases d'apprentissage seront incrémentielles pour réduire au maximum le stress. De plus, l’enregistrement simultané de grandes populations de neurones à l'aide d'électrodes à haute densité permet d’acquérir des données nouvelles rapidement, nous permettant donc de raffiner la qualité des données obtenues par rapport aux standards antérieurs et de réduire la durée des expériences. Tester la validité de nos modèles en condition tête libre ouvrira le champ à des expériences futures moins contraignantes pour les animaux.

Choix des espèces

Ce projet requiert l'enregistrement et la manipulation de l'activité cérébrale à l'échelle neuronale, c'est à dire au sein d'une aire corticale avec une grande précision spatiale et temporelle. Les méthodes non-invasives ne permettent pas cette finesse. Nous avons donc besoin d'utiliser un modèle animal pour réaliser ces enregistrements. Les comportements oculomoteurs humains sont seulement partagés par les primates. Les ouistitis sont un modèle en développement mais approprié à l'étude de ces comportements. Les circuits neuronaux sous-jacents sont bien connus anatomiquement et homologues des circuits chez l’Homme. Le modèle marmouset nous permettra de travailler sur une espèce qui possède plusieurs avantages significatifs pour notre projet. Premièrement l’organisation du système visuel et oculomotrice reste très proche de celui de l’homme tout comme son comportement oculomoteur. Deuxièmement, c’est une espèce lissencéphale, ce qui permet d'accéder facilement aux aires d'intérêts contrairement à d’autres espèces primates. Animaux matures plus de 18 mois. Avant 18 mois, les individus sont juvéniles, leur système nerveux est encore en développement.

Trois cents rats sont réutilisés pour entraîner du personnel à des gestes techniques, les autres tués dès la fin de la phase expérimentale parce que les composés testés ont pu modifier leurs structures et leur immunité. 2 750 rats juvéniles à adolescents vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour tester des candidats médicaments contre la douleur. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter intrathécal ou intraveineux, jusqu'à six stimulations mécaniques ou thermiques par jour répétées sur plusieurs jours, des administrations par une dizaine de voies différentes, des prélèvements sanguins et jusqu'à vingt-quatre heures de mise à jeun. Le porteur affirme que la douleur, "expérience sensorielle et émotionnelle", ne peut pas être étudiée in vitro et que l'évaluation chez l'animal vigile "reste la seule option" avant le passage chez l'être humain.

Objectifs

La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. D’une part, le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur et tests comportementaux et pour différents types de douleur (mécanique, thermique). D’autre part, certains tests visent à évaluer les effets secondaires de composés pharmacologiques issus de différentes classes. En effet, une utilisation abusive s’est développée ces dernières années dans l’utilisation des opiacés mettant à jour une crise appelée « crise des opioïdes ». De plus, les Gabapentinoides provoquent généralement une forte sédation, une somnolence et ont donc un impact sur la démarche et la coordination motrice. C’est pourquoi il est nécessaire de développer de nouvelles molécules antalgiques de référence tout en limitant les effets secondaires. L’implantation de cathéter permettra l’évaluation de composés administrés en perfusion ou de manière répétée. Ces tests sont couramment décrit dans la littérature et sont réalisés dans le laboratoire depuis plusieurs années.

Bénéfices attendus

Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des tests de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients mais aussi à destination du domaine de la santé animale. A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie pour l’implantation de cathéters. Lors des tests ils pourront être exposés à une stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limite de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Les animaux seront également soumis à la contention ou isolés dans des compartiments le temps des tests. Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. Les animaux seront soumis à un anesthésiant gazeux durant quelques minutes pour l'implantation du cathéter qui nécessite une micro-chirurgie (10minutes). De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.

Impact sur les animaux

Les nuisances liées aux tests sont dues à l’application d’un stimulus douloureux ou non (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal (nuisance légère < 1 min). Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (légère < 1 min) ou dans une boîte en plexiglass avec une mobilité possible mais réduite (nuisance légère, 4h maximum). Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle :, nuisance légère < 1 min, administration répétée : nuisance modérée). Le port d'un adaptateur au système de de perfusion dans la nuque peut etre une nuisance légère (légère gène,) Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites (posture anormale, sédation). Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance légère < 3 min). Certains animaux subiront les nuisances liées à la mise à jeun (modérée maximum 24h). Les nuisances liées à la pose du cathéter et du système de perfusion sont : le risque d’infection, l’apparition de tissu cicatriciel et l’anesthésie. La nuisance liée aux perfusions est l’anesthésie gazeuse qui peut-être répétée.

Devenir

Le test de composé pharmacologique en développement ne permet pas la réutilisation des animaux pour tester de nouveaux composés car un impact des composés pharmacologique sur les structures, l’immunité, etc… n’est pas exclu. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité. Néanmoins, dans le cas des procédures n'impliquant pas la mise à mort immédiate des animaux, les animaux ne présentant pas de signe de souffrance pourront être réutilisés pour de la formation à des gestes techniques (traitements, tests par exemple).

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Ces tests sont couramment mis en place au sein du laboratoire. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place au laboratoire.Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes. Elle comporte différent groupe d’animaux contrôles positif et négatif qui peuvent être exclus ou limités à un seul en fonction des tests. Ici nous avons pris en compte l’ensemble des contrôles mais dans le cadre de ce projet ils pourront être revus à la baisse si certains groupes contrôles ne sont pas nécessaires. En fonction du design de chaque étude de tests statistiques appropriés seront effectués.

Raffinement

Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre de certains tests, le choix des températures ou de la gamme de filaments est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (c’est-à-dire la réponse à un stimulus non douloureux chez l’animal sain). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, injection sous cutanée de solution hydratante en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre. La pose d’un système de perfusion est un raffinement en soi car il permet d’éviter les injections répétées en intraveineux et réduit les temps d’anesthésie pour injection.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles à adolescents (4-7semaines). Ce stade a été choisi car ilpermet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.