Procédures modérées
Développement d’un modèle murin de maladie de Sjögren pour tester un nouveau traitement ciblant les cellules B auto-immunes
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit cinq injections de protéine SSA avec adjuvant complet de Freund pour déclencher une maladie auto-immune, sept prélèvements de sang à la joue sous anesthésie générale, et cinq recueils de salive provoqués par la pilocarpine, au rythme d'une série par mois. Le traitement testé, un anticorps bispécifique censé détruire les seuls lymphocytes B auto-immuns, est injecté jusqu'à trois fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur justifie la mise à mort de toutes les souris par l'analyse histologique de leurs glandes salivaires, et ajoute que les exposer à vie à la sécheresse buccale provoquerait des pathologies dentaires rendant leur adoption inenvisageable.
Objectifs
Le syndrome de Sjögren (SS) est une maladie auto-immune chronique caractérisée par une inflammation des glandes salivaires et lacrymales, entraînant une sécheresse de la bouche et des yeux. Cette pathologie se complique de manifestation graves comme des atteintes d’organes sévères (poumon, muscle, nerfs). La maladie de Sjögren augmente de 20 fois le risque de faire un lymphome lié à la maladie. Il n’existe à ce jour aucun traitement approuvé pour cette maladie. Cette pathologie est caractérisée par la présence d’auto-anticorps dirigés contre la protéine SSA aussi appelée Ro60 qui sont produits par des lymphocytes B spécifiques. Les modèles murins utilisant la vaccination contre la protéine SSA reproduisent les caractéristiques de la pathologie humaine. Notre objectif est de développer un nouveau traitement de cette pathologie avec un anticorps bispécifique qui détruit spécifiquement les cellules B auto-immunes qui sont à l’origine des auto-anticorps anti-SSA. Cet anticorps bispécifique portera sur un bras l’antigène SSA et sur l’autre un anti-CD3 qui dirigera une réponse des lymphocytes T qui détruiront spécifiquement les cellules B autoimmunes dirigées contre SSA sans détruire les autres lymphocytes B qui sont utiles pour portéger des infections. Pour cela nous avons besoin du modèle animal préclinique de vaccination anti-SSA pour tester l’efficacité du traitement.
Bénéfices attendus
La maladie de Sjögren est due à une petite fraction de globules blancs( les lymphocytes B) qui détruisent les glandes produisant de la salive. Cependant les traitements actuellement disponibles pour détruire les lymphocytes B les détruisent en totalité. La destruction de tous les lymphocytes B entraine un risque important d’infection. L’objectif est d’aboutir à une guérison des patients grâce a une destruction ciblée des lymphocytes B qui détruisent les glandes salivaires. Ceci ne peut être obtenu qu’après démonstration de l’efficacité de cet anticorps bispécifique dans un modèle murin de la maladie. Après d’autres études chez l’animal le traitement pourra faire l’objet d’essais cliniques chez l’homme.
Procédures
-Injection : 5 fois. durée
Impact sur les animaux
1)Douleur liées aux injections de vaccination, de médicaments: légère de courte durée 2)Douleur et stress de courte durée liée aux prélèvements sanguins sur la joue 3) Stress lié à la contention pour le recueil de salive limitation par l’anesthésie générale. 4) L'adjuvant complet de Freund sera injecté en sous-cutané pour limiter les lésions cutanées au point d'injection. En cas de lésions nous appliquons un antiseptique et un antibiotique en crème si besoin.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés car pour démontrer à la fois l’existence de la maladie de Sjögren et l’efficacité des traitements il est nécessaire de réaliser des analyses histologiques des tissus cibles de la maladie comme les glandes salivaires qui sont le siège de la maladie. Par ailleurs exposer tout le reste de leur vie de les animaux à la sècheresse buccale peut entrainer à long terme des pathologies dentaires qui pourraient entrainer des difficultés d’alimentation des animaux. Il n’est donc pas envisageable d’adopter ses animaux.
Remplacement
Le développement d’un nouveau médicament utilisant un système immunitaire complet et des organes cibles comme les glandes salivaires et reproduisant la pathologie ne peuvent être effectués que sur un modèle animal. En effet la réalisation sur des cellules humaines humains est rendu impossible par le fait qu'il nous faudrait reproduire plusieurs organes (rate, glandes salivaires, ganglions) reliées entre eux par des vaisseaux dans lesquels circulerait des cellules immunitaires. Ceci n'est pas réalisable à ce jour par les outils à notre disposition.
Réduction
Le calcul du nombre d'animaux par groupe a été calculé précisément à l'aide d'outils statistiques qui permettent d'être surs que le nombre d'animaux par groups (ici 15) est suffisant pour être sur de voir une différence significative d'augmentation du flux salivaire si le traitement fonctionne. Pour cela nous avons analysé les données disponibles de variations de la production de salive entre différentes souris malades et non malades.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'un milieu enrichi avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Les animaux seront suivis quotidiennement et des points limites sont prévus pour veiller à ce bien-être . Les injections et les prelèvements seront faits sous anesthésie génrale et/ou locale.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris car nous avons besoin d'un organisme entier avec un système immunitaire proche de celui de l'homme. Par ailleurs le modèle de maladie de Sjögren avec immunisation avec le peptide SSA a été developpé par une équipe américaine sur la souris il est donc logique pour le reproduire d'utiliser la même espèce. Nous utiliserons des animaux adultes entre 10 à 12 semaines ce qui est l’âge habituel auquel les protocoles d’immunisation commencent dans les protocoles de vaccination.
Etude de l’effet d’une infection bactérienne sur une voie de l’immunité innée chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une sonde de température est implantée sous la peau de chaque souris, qui reçoit ensuite dans la veine de la queue une injection de bactéries pathogènes. 176 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les quatorze jours d'infection sont résumés à une "variation de température", alors que le raffinement prévoit d'administrer des analgésiques en cas de baisse trop forte de la température corporelle. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur donnant pour seule raison qu'elles auront été infectées par des bactéries pathogènes.
Objectifs
La pyrine est un composant de l'immunité. La pyrine est activée lors de certaines infections bactériennes et déclenche une réaction inflammatoire (variation de température) qui permet de lutter contre ces infections. A ce jour, les mécanismes d'activation et de régulation de la pyrine lors d'infections est peu compris. Le but de ce projet est de mieux décrire les mécanismes d'activation et de régulation de pyrine lors d'infections bactériennes dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Nous attendons des bénéfices scientifiques de ce projet : progrès des connaissances sur l’activation et la régulation de pyrine et sur l’utilisation d’un modèle murin pour modéliser l’activation de pyrine lors d’une infection. L'inflammasome pyrine étant associé à des maladies génétiques chez l'homme (la fièvre méditerranéenne familiale entre autres), l'utilisation d'un modèle murin humanisé pourra nous permettre de développer de nouveaux traitements pour ces maladies génétiques.
Procédures
Tous les animaux du projet subiront une injection intraveineuse qui durera 30secondes dans la veine de la queue et une injection sous-cutanée qui durera 30 secondes d'une sonde de température, certains animaux pourront recevoir une injection sous cutanée de qui durera 30secondes d'analgésique.
Impact sur les animaux
Les gestes techniques prévus dans les procédures (injections intraveineuses ponctuelles, mesure de poids, pose de sonde de température) sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. Pendant les 14 jours d’infection, les souris pourront ressentir les effets de l’infection (variation de température).
Devenir
Les animaux auront été infectés par des bactéries pathogènes, ils seront donc euthanasiés
Remplacement
L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests préliminaire déjà réalisés in vitro) et pour s’assurer d’une potentielle relevance clinique. Les modèles in vitro étudient la réplication de bactéries dans un seul type cellulaire dans un contexte non-inflammatoire et ne peuvent pas mimer la complexité des interactions hôtes-pathogènes rencontrées lors d’une infection.
Réduction
De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus, l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des « essais pilotes » déterminants. Nous prévoyons 5 animaux par lot de génotype et de souche d’infection, 3 animaux par lot contrôle pour les analyses post-mortem. Les nombres d’animaux sont calculés au minimum en fonction des résultats attendus et des tests statistiques qui seront appliqués.
Raffinement
Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Habituation à la contention (une fois par jour, une semaine avant le début de l’expérience) pour minimiser angoisse et biais secondaire. 2) Utilisation d’implants pour prendre la température (la pose de l’implant est plus invasive mais cela permettra de rendre les prises de température moins intrusive) 3) Anesthésie gazeuse lors de la pose de l'implant de température 4) Minimisation de la fréquence de manipulation (observation et privilège aux mesures les moins intrusives). 5) L'utilisation d'analgésiques en cas de trop forte baisse de température corporelle des animaux suite à l'infection. Les points limites sont définis spécifiquement pour le projet afin de limiter au maximum la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Il est nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo, vertébré Mammifère), avec un fonctionnement immunitaire reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain. La souris en est un modèle idéal, permettant aussi un accès aux lignées humanisées, KO (délétion de gènes) et phénotypes issus de mutations, indispensables pour l’analyse de maladies génétiques comme ici. Par ailleurs, les animaux portant un gène humanisé nous permettront de savoir si les réponses observées in vitro sont transposable à l’échelle de l’organisme. Les expériences débuteront à l’âge de 6 semaines ce qui correspond à des souris avec un système immunitaire mature.
Circuits à deux cellules stroma-macrophage
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Six mois d'antibactérien dans l'eau de boisson pour les souris mises à la reproduction, et de la conception jusqu'à six semaines d'âge pour leur descendance : 945 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit sous anesthésie une injection de cellules tumorales, et la tumeur est laissée croître jusqu'à 12 mm avant la mise à mort, avec un risque d'ulcération que le porteur reconnaît douloureux. Toutes finissent tuées pour le prélèvement d'organes ou de tumeurs, les reproducteurs étant retirés de l'élevage à six mois d'âge pour une "raison éthique" invoquée sans autre précision. L'ensemble sert à cartographier les niches de macrophages dans les tissus, et le porteur indique que le projet repose exclusivement sur des souris génétiquement modifiées.
Objectifs
Cellules immunitaires vitales présentes dans tout le corps, les macrophages contribuent à la santé et au fonctionnement de nos tissus. Leur absence entraîne des changements biologiques significatifs, soulignant leur importance. Les macrophages remplissent divers rôles dans différents organes, de la promotion de la croissance des neurones dans le cerveau à la régulation du développement osseux. Ils sont également impliqués dans différentes pathologies telles que le cancer. Ils peuvent donc être considérés comme des régulateurs fonctionnels de nombreux processus clé de notre organisme. Malgré leur importance, nous ne savons que peu de choses sur la façon dont ces régulateurs biologiques sont eux-mêmes régulés. Le concept de « niche des macrophages » suggère qu'un environnement local spécifique appelé « niche » régule le développement, l’instruction et le comportement de ces cellules immunitaires. Les cellules de soutien dites « stromales », connues pour agir comme des niches pour les cellules immunitaires dans les organes lymphoïdes, jouent probablement un rôle similaire dans le soutien des macrophages dans divers tissus. Ce projet de recherche propose d’étudier les relations complexes existant entre les cellules immunitaires et leurs environnements, offrant ainsi des perspectives sur leurs échanges qui assurent l'harmonie et la stabilité des tissus, et sur les traitements potentiels pour les maladies impliquant une dysfonction des macrophages (des maladies infectieuses au cancer). Il vise à accomplir deux objectifs cruciaux : (1) construire un atlas complet détaillant la distribution des niches de macrophages à travers différents tissus, (2) élucider les mécanismes moléculaires régissant la communication réciproque entre les cellules niches et les macrophages.
Bénéfices attendus
Les macrophages jouent un rôle vital dans le maintien de l'équilibre physiologique et la réparation des tissus. Cependant, dans de nombreux contextes pathologiques tels que cancers et maladies infectieuses, la diversité des macrophages et leur capacité d'adaptation peuvent avoir des effets bénéfiques et/ou néfastes. Par exemple, une présence accrue de macrophages dans les tumeurs est souvent associée à des résultats défavorables dans différents types de cancer. Étant donné les rôles doubles des macrophages dans divers tissus, les approches thérapeutiques efficaces devraient idéalement cibler les macrophages "défavorables" tout en préservant les "bénéfiques". Pour y parvenir, il est nécessaire de manipuler individuellement les différents sous-ensembles de macrophages in vivo. Ce projet vise à cibler les macrophages via la manipulation de l'environnement nutritif qui les entoure pour à terme en comprendre leurs fonctions. Cette approche innovante permettra non seulement de révéler de nouvelles fonctions de ces cellules immunitairess, mais aussi d’infirmer ou confirmer les rôles qui leur ont été précédemment attribués. Elle nous permettra également d'identifier les niches des macrophages à travers les tissus, d'explorer la réponse fonctionnelle fournie par les macrophages à leurs niches, et de découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents. En résumé, ce projet éclairera de nouveaux aspects des fonctions des macrophages tout en fournissant un niveau de détail sans précédent de la compréhension du concept de la niche de ces cellules immunitaires. Les résultats de notre recherche pourraient servir de cadre pour comprendre les rôles polyvalents des macrophages, guidant ainsi potentiellement les stratégies thérapeutiques futures pour diverses maladies où ils sont impliqués.
Procédures
Notre demande de projet comporte 2 types d’interventions : nos animaux recevront soit un antibactérien à large spectre, soit une injection en sous-cutanée de cellules tumorales. Les animaux vigiles recevront un antibactérien à large spectre administré dans l'eau de boisson : depuis la saillie jusqu'à la fin de l'accouplement pour les animaux en accouplement soit durant 6 mois ; de la conception (embryon) jusqu'à l'âge adulte pour les individus issus de ces accouplements soit durant 6 semaines. Les animaux anesthésiés recevront une injection de cellules tumorales en sous cutanée, et seront mis à mort dès que la tumeur atteindra la taille de 12mm (longueur ou largeur) soit avant la semaine 4 post-injection tumorale.
Impact sur les animaux
Les systèmes de régulation dépendants d’antibactériens sont couramment utilisés chez les souris génétiquement modifiées depuis le milieu des années 1990, et cette procédure ne devrait engendrer aucune douleur, souffrance ou angoisse. La pousse de la tumeur peut induire une perte de poids, et interférer avec les besoins / comportements normaux de la souris. La tumeur peut évoluer en ulcération et causer une souffrance à l’animal.
Devenir
Les animaux de nos groupes d'étude seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem de multiples organes. Les animaux reproducteurs seront gardés en vie jusqu'à l'âge limite de mise en reproduction (= 6 mois d'âge) pour raison éthique. Les animaux seront mis à mort pour prélèvement post-mortem de tumeur.
Remplacement
La complexité et la dynamique des interactions entre les macrophages et leur microenvironnement ne peuvent être étudiées efficacement à l'aide de modèles in vitro : les macrophages présentent en effet une plasticité remarquable, et peuvent modifier leur physiologie en réponse à des stimuli environnementaux. Pour obtenir une compréhension de leurs fonctions ils doivent donc être considérés dans leur environnement et, à ce titre, seuls les modèles in vivo permettront de décrypter les contacts cellulaires authentiques sous-jacents aux interactions macrophage-niche. Enfin, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés et de garantir des résultats exploitables, le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé à l’aide d’un logiciel statistique. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour les analyses des données.
Raffinement
Le statut EOPS (= Exempt d'Organisme Pathogène Spécifique) de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les animaux utilisés dans cette étude sont traités conformément aux règles éthiques édictées par la directive 2010/63/UE, ainsi que par le décret n°2013-118 et ses 5 arrêtés : - Les cages utilisées dans les zones d’hébergement ont une surface de 530 cm2. Il est possible d'y héberger 5 souris adultes d'un poids >= à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Les souris sont donc élevées en groupes sociaux afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et de limiter l’agressivité. - Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi : du matériel de nidification ainsi que des dômes seront introduits dans chaque cage pour confectionner des nids. - Les animaleries bénéficient d'une température régulée, d'un taux d'humidité dans l'air contrôlé, ainsi que d'une exposition à la lumière contrôlée. - Les animaleries sont calmes. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur/souffrance. Tout au long de la vie de l’animal, nous mettrons en place des points limites prédictifs et adaptés à chaque procédure afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress. Bien que nous ne nous attendions pas à des nuisances liées au traitement ou à l’arrêt du traitement antibactérien, nous effectuerons des surveillances quotidiennes pendant la première semaine de traitement et la première semaine d’arrêt du traitement afin de garantir le bien-être de nos animaux. Si l’ajout d’antibactérien dans l’eau de boisson impacte la quantité d’eau bue par les souris, nous rajouterons du sucrose pour augmenter son appétence. Si l’ajout / l’arrêt du traitement antibactérien ou la pousse de tumeur entraine une perte de poids, les animaux recevrons de la nourriture sous forme de gelée. Si une posture anormale ou une blessure est détectée l'animal sera isolé, et un médicament pour soulager la douleur sera mélangé à du nutella et ajouté dans la cage pendant 5 jours maximum. Sans amélioration de la condition de l’animal pour l’ensemble des points limites décrits, celui sera mis à mort par inhalation progressive de CO2.
Choix des espèces
L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés et ce projet est entièrement basé sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Les souris mises en accouplement recevront un traitement antibactérien de la saillie jusqu’au retrait de la mise en reproduction (6 mois d’âge). Les souris issues des accouplements recevront un traitement antibactérien de la gestation à 6 semaines d’âge. Elles seront euthanasiées et prélevées à partir de 10 semaines d’âge puisque nous nous intéressons au rôle des macrophages à l’âge adulte et non au cours du développement. Des animaux âgés de 6 semaines seront utilisés, puisque nous nous intéressons au rôle des macrophages à l’âge adulte et non au cours du développement.
Modèles de migraine pour évaluation de traitements
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2415
Pour évaluer des candidats anti-migraineux, 1 623 souris et 2 415 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des crises de migraine leur sont provoquées par injection d'un réactif ou par stimulation optogénétique, une fois par jour ou tous les deux jours pendant deux à quatre semaines, après une chirurgie de trente minutes à deux heures pour implanter des électrodes crâniennes chez une partie d'entre eux. Le porteur décrit des tests de réaction à des stimuli tactiles ou thermiques provoquant une douleur aiguë, arrêtée dès le retrait de la patte, et un hébergement en cage individuelle jusqu'à quatorze jours pour les rats blessés par leurs congénères. Les animaux porteurs d'implants crâniens et ceux soumis à des inductions répétées sont tués, le porteur estimant qu'un maintien en vie les exposerait à des céphalées récurrentes, tandis que 50 souris et 50 rats sont réutilisés.
Objectifs
La migraine est un trouble neurologique courant et potentiellement invalidant, caractérisé par des crises récurrentes de maux de tête modérés à sévères, souvent accompagnés d'autres symptômes tels que la sensibilité à la lumière, au son et/ou aux odeurs, ainsi que des nausées et des vomissements. Les migraines peuvent être classées en deux principaux sous-types : les migraines avec aura et les migraines sans aura. Les migraines avec aura représentent environ un quart de tous les cas de migraines. L'aura se réfère à une série de symptômes neurologiques qui précèdent habituellement le mal de tête, pouvant inclure des phénomènes visuels tels que des éclairs de lumière, des taches aveugles ou des zigzags lumineux, ou des sensations sensorielles telles que des engourdissements ou des picotements dans les membres. L'aura dure généralement moins d'une heure et précède souvent le mal de tête, bien que parfois elle puisse se produire simultanément avec le mal de tête ou même après. Les migraines sans aura sont beaucoup plus courantes, représentant environ 75 à 85 % de tous les cas de migraines. Contrairement aux migraines avec aura, celles-ci surviennent sans les symptômes neurologiques précurseurs. Les migraines constituent un fardeau significatif pour les individus qui en souffrent, ainsi que pour la société dans son ensemble, en raison de leur prévalence élevée, de leur impact sur la qualité de vie et de leurs coûts économiques associés. Malgré les progrès dans la compréhension de la physiopathologie de la migraine, le développement de thérapies efficaces reste un défi majeur. Dans ce contexte, l'évaluation préclinique d'agents pharmacologiques potentiels est essentielle pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques. Le présent projet vise ainsi à évaluer l'efficacité voire potentiellement la sécurité d'anti-migraineux chez le rongeur, en utilisant des modèles animaux présentant des symptômes typiques de la migraine.
Bénéfices attendus
L'objectif principal est de déterminer si les candidats médicaments sont capables de réduire l'intensité, la fréquence et/ou la durée des crises migraineuses chez le rongeur afin de potentiellement développer de nouveaux traitements plus efficaces contre les différents types de migraine. De plus, cette évaluation permettra de recenser de potentiels effets secondaires de ces traitements, tels que la toxicité et les altérations comportementales. Cette approche préclinique revêt une importance cruciale puisqu'elle permet une évaluation initiale de l'efficacité des anti-migraineux potentiels avant de les tester chez l'homme, réduisant ainsi les risques et dans une moindre mesure les coûts associés au développement clinique. De plus, elle offre la possibilité d'identifier de nouveaux mécanismes thérapeutiques et de comprendre les bases biologiques de la migraine, ce qui pourrait conduire au développement de thérapies plus ciblées et plus efficaces à l'avenir. En résumé, ce projet s'inscrit dans une démarche visant à améliorer la prise en charge de la migraine en identifiant de nouveaux traitements potentiels et en comprenant mieux les mécanismes sous-jacents à cette pathologie. Les résultats obtenus contribueront au développement de nouvelles options thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (principalement 1 fois (2 fois max) par jour; pendant 1 à 4 semaines en fonction de la spécificité du traitement), sous anesthésie (quelques minutes) si nécessaire. L'induction de crises migraineuses sera réalisée par administration d'un réactif (environ 1 minute, sous contention ou quelques minutes sous anesthésie) ou par stimulation optogénétique (quelques minutes, sous anesthésie), de manière unique ou répétée (en général, 1 fois/jour ou tous les 2 jours pendant 2 semaines, max 4). Cette induction et éventuellement le placement d'électrodes pour enregistrement d'ondes cérébrales pourra nécessiter une phase chirurgicale (de 30 minutes à 2h si électrodes) sous anesthésie. Dans certains cas, les signaux électriques au niveau cérébral seront mesurés après l'induction de la migraine (en général pendant 1h). Le comportement général des animaux sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes à 30 minutes pour les tests d'exploration/activité locomotrice) et des tests comportementaux (réaction à des stimuli tactiles ou thermiques, de l'ordre de quelques secondes à 5 minutes). Des prélèvements sanguins (en général 2 maximum par animal) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non).
Impact sur les animaux
Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress le temps de l'administration de réactif, de substance, ou lors du test (e.g. stimulation tactile au niveau d'une patte, ou placement dans un dispositif nouveau comportant une zone ouverte ou fortement éclairée) ou du prélèvement sanguin, notamment du fait de la contention. Dans les modèles impliquant une chirurgie, il est possible que celle-ci entraîne une douleur post-opératoire au niveau de la peau du crâne (un analgésique est toutefois administré en péri-opératoire). Pour les cas avec implantations d'électrodes chez le rat, ceux-ci seront potentiellement hébergés en cage individuelle en cas de blessure causée par le congénère, ce qui peut entraîner un stress le temps de l'étude (1 à 14 jour en général). Les tests comportementaux basés sur la stimulation tactile ou thermique d'une zone cutanée peuvent entraîner une douleur aigue au moment du test (la stimulation est arrêtée dès la réaction de retrait de l'animal). L'induction de crises migraineuses est supposé entraîner une douleur de type céphalées pour les animaux le jour de test (il n'est pas attendu de crises spontanées).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude dans les modèles sévères, impliquant à la fois une chirurgie avec placement d'implants crâniens qui ne permettent pas un maintien en vie dans de bonnes conditions. Ils seront également euthanasiés en cas d'induction répétée de crises de migraine et de tests de douleurs, afin déviter tout risque de développement de céphalées récurrentes ou de pathologies associées à un stress chronique. Les animaux ayant reçu un traitement aux effets potentiellement néfastes ou soumis à un prélèvement de sang ou d'organes terminal seront euthanasiés car cela ne permet pas leur maintien en vie dans de bonnes conditions. Les animaux ayant reçu une seule induction de crise migraineuse, ou les animaux Sham (pas d'induction de la migraine), pourront être maintenus en vie, s'ils n'ont pas reçus un traitement induisant des effets néfastes.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction au sein du corps entier. Les migraines sont des affections complexes impliquant des interactions entre différents systèmes biologiques incluant notamment le système nerveux central et le système vasculaire. Les modèles animaux permettent d'étudier ces interactions multisystémiques dans un contexte physiologique plus réaliste. Les modèles animaux permettent d'évaluer à la fois l'efficacité et, si pertinent, la sécurité des anti-migraineux potentiels à différents niveaux, notamment l'absorption et la distribution du médicament, ainsi que ses effets sur les organes et les systèmes biologiques. Cependant, dans certains cas les traitements médicamenteux étudiés dans le cadre de ce projet ont été sélectionnés au cours d'études in vitro et/ou in silico avant leur évaluation chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques (test t de Student, ANOVA one-way) ou non paramétriques (tests de Mann-whitney, Kruskal-Wallis) pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Ce projet est en développement dans notre établissement utilisateur, et une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal sera demandée afin de permettre de réévaluer et d’adapter a posteriori la catégorie éthique et les méthodes de raffinement, si pertinent. Le cas échéant, pendant la phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
Les rats et les souris partagent de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec les humains, ce qui en fait des modèles animaux pertinents pour évaluer l'efficacité des traitements anti-migraineux potentiels. Des modèles de migraine chez le rat et la souris ont été développés pour reproduire certains aspects de la pathophysiologie de la migraine, tels que l'hypersensibilité à la lumière et au son. Ces modèles permettent d'étudier les mécanismes de la migraine et d'évaluer l'efficacité des traitements anti-migraineux potentiels. Majoritairement à l'âge adulte (au moins 6 semaines après la naissance), mais la migraine pouvant survenir chez des patients jeunes, potentiellement dans certains cas spécifiques des rongeurs plus jeunes (stade post-natal - adolescence) pourraient être utilisés.
Évaluation d’innocuité et de l’efficacité des ultrasons focalisés non thermiques pour l’occlusion veineuse de la veine saphène chez ovins.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Traitées sous anesthésie générale par des ultrasons focalisés de haute intensité pour obstruer leurs deux veines saphènes, puis suivies par échographie à quatre ou six reprises, parfois sous sédation, 10 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin de chaque étude pour le prélèvement de leurs veines saphènes. Une étude de dose puis une étude réglementaire doivent démontrer la sécurité et la faisabilité de cette technique contre les varices, après des essais préalables sur des veines d'oreille de lapin et sur trois brebis. Le porteur parle d'ultrasons "non thermiques", rapporte des brûlures aux sites traités lors d'essais précédents, problème qu'il dit résolu par un refroidissement de la peau, et signale qu'"un léger échauffement peut être observé".
Objectifs
L'insuffisance veineuse superficielle est l'une des maladies majeures dans le monde, actuellement traitée par ablation thermique ou sclérothérapie. La technologie d'ultrasons focalisés de haute intensité utilisant une modalité thermique peut être utilisée pour obtenir l'oblitération des varices, avec certaines limitations : un temps de traitement long et douloureux. La méthode utilisant des ultrasons de haute intensité traite les varices de manière plus rapide et indolore. Jusqu'à présent, les études montrent que pour le traitement, il est nécessaire d'injecter un agent de contraste. Cette étude préclinique sur des animaux vise à démontrer la sécurité et la faisabilité de cette nouvelle approche thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les varices sont présentes chez 25% de la population des pays industrialisés et représentent un coût sociétal de ressources médicales pour ces pays. Les techniques mini-invasives développées ces dernières années permettent de traiter avec efficacité et peu de récidives cette maladie. La technique nouvellement développée et étudiée dans ce projet pourrait permettre d'obtenir d'aussi bons résultats que les autres techniques tout en diminuant les risques associés. Elle permettrait donc de continuer à améliorer le traitement de cette maladie.
Procédures
Les animaux seront traitées sous anesthésie générale. Un suivi échographique aura lieu à temps différents (procédure n° 1 – 4 temps et procédure n°2 – 6 temps). Si nécessaire, les animaux seront sédatés pour cet examen. De plus, un suivi post-traitement de la zone traitée sera réalisé à temps différents (procédure n° 1 – 4 temps et procédure n°2 – 6 temps) afin de détecter d’éventuelles lésions dues au traitement.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue chez les animaux est le léger stress et la douleur modérée lors de réalisation des tranquillisations des animaux. De plus, dans les essais précédents, des brûlures ont pu être observées au niveau des sites traités. Ce problème a été résolu par l'ajout d'un système déjà validé de refroidissement de la peau au niveau de la sonde. Ce risque est donc très faible, mais nous devons mentionner qu'un léger échauffement peut être observé.
Devenir
Les dix brebis du projet seront mises à mort à la fin de chaque étude afin de prélever leurs veines saphènes pour les analyser.
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter les points finaux de ce projet. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant. Le modèle ovin est recommandé dans la norme ISO 10993, partie 6 (2016) comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires.
Réduction
Une étude de preuve de concept sur des veines d'oreilles de lapin, ainsi qu'une étude de faisabilité sur trois brebis a déjà été réalisée. Elles ont permis de déterminer les meilleures conditions d'utilisation des ultrasons focalisés de haute intensité ce qui permet de réduire à 10 (deux études : validation de la dose puis une étude réglementaire) le nombre d'animaux utilisés dans la présente étude. De plus, le traitement est appliqué sur les deux veines saphènes des animaux, ce qui permet d'utiliser deux fois moins d'animaux pour obtenir le même nombre d'échantillons. Les résultats seront analysés par les tests statistiques.
Raffinement
Afin de permettre aux animaux de s’adapter à leur environnement et de s’assurer de leur bon état de santé, une période d’acclimatation adaptée à l’espèce et au stade physiologique sera dispensée avant début de traitement. Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d'hébergement adaptées et optimales. Les paramètres d'ambiance, l'aliment, l'abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les animaux seront hébergés collectivement en groupes harmonieux. Un programme spécifique d’habituation à la manipulation par l’homme est en place. Les ovins disposeront d'un environnement enrichi (exemples : objets à manipuler de type ballon) permettant à l'animal de jouer. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement par un personnel habilité et habitué à travailler avec des brebis. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s'il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d'un traitement thérapeutique. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. Un renforcement positif sera également réalisé pour obtenir leur coopération lors des opérations courantes ou de soins. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes. De plus, les points limites généraux suffisamment prédictifs sont définis dans ce projet.
Choix des espèces
La brebis est recommandée dans la norme ISO 10993-6 comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. En effet, la morphologie et la taille des veines saphènes du mouton sont similaires à celles de l'homme et ce modèle a été décrit dans la littérature comme un modèle approprié pour évaluer l'occlusion veineuse. Une fois rasés, ces animaux possèdent également une peau proche de celle de l'Homme ce qui permettra aux ultrasons d'atteindre la veine sans une trop forte absorption de ceux-ci. En outre, la faisabilité a été évaluée par le promoteur qui a pris les mesures des veines saphènes de l’animal. Les animaux sont adultes afin d'avoir une structure comparable à l'homme.
Etude des conséquences du diabète sur la réactivité vasculaire chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris engagées dans la procédure sont gavées et pesées chaque jour pendant 42 jours, après une biopsie de la queue et un transfert entre deux établissements. 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le modèle repose sur des animaux rendus diabétiques et obèses, qui peuvent développer une cardiopathie et des irritations cutanées, et qui urinent assez pour imposer de limiter les cages à deux individus et de les changer plus souvent. Quarante souris seulement entrent dans la procédure et voient leurs organes prélevés, les autres, dépourvues de la mutation recherchée, étant tuées sans y avoir été soumises.
Objectifs
Le diabète est la quatrième cause de décès dans la majorité des pays développés, notamment par suite de maladies cardiaques et d'accident vasculaire cérébral. Dans ces pays, le diabète est aussi la principale cause de cécité, d'amputation des membres inférieurs et d'insuffisance rénale. La dysfonction endothéliale est un marqueur précoce du développement de la pathologie métabolique et du risque cardiovasculaire. Cette dysfonction doit par conséquent être évaluée tôt dans l’histoire naturelle du diabète. Les stimuli à l’origine des lésions des vaisseaux sanguins induites au cours du diabète ne sont pas complètement connus. L'objectif principal est d'identifier si la modulation pharmacologique de certains mécanismes d'atteinte délétère des vaisseaux sanguins permettrait de limiter les lésions des vaisseaux sanguins au cours du diabète. Le projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs, EU1 qui élèvera les animaux et EU2 qui fera les analyses fonctionnelles sur les vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la progression de la dysfonction endothéliale dans le diabète et pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des complications vasculaires du diabète.
Procédures
Biopsie à la queue (EU1, 1 fois 10 secondes), préhensions quotidiennes et gavage (EU1 et EU2, 42 fois 1 minute), pesées quotidiennes (EU1 et EU2, 42 fois 30 secondes).
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, inconfort lié au gavage. Effet indésirable lié au modèle de diabète et d'obésité: cardiopathie, irritation cutanée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort. Les 40 utilisés dans la procédure verront leurs organes prélevés pour analyse. Les animaux qui n'ont pas la mutation d'intérêt seront également mis à mort.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte vasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires (in vitro). Ici nous étudions les propriétés de vasoconstriction et vasodilatation des artères en réponse à différents signaux moléculaires et mécaniques. Ces propriétés des vaisseaux sont essentielles pour assurer le bon fonctionnement des organes. Elles dépendent des différents types cellulaires qui composent les artères et également des molécules sécrétées par différets organes de l'organisme. La culture cellulaire ne peut pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. Il n'existe pas de modèle de remplacement in vitro ou in silico à l'heure actuelle pour ces raisons.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur un logiciel en ligne et donnait 8 animaux par groupe requis. 2 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental et des analyses post-mortem. Le schéma d'accouplement est optimisé pour permettre d'obtenir le meilleur rendemeent possible d'animaux d'intérêt.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux diabétique par cage est limité à 2 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, le modèle de diabète utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. animaux utilisés du sevrage (identification) à l'âge adulte. Les reproducteurs pourront être utilisés jusqu'à 1 an de vie. Les souris d'intérêt sont gavés de 6 à 12 semaines de vie.
Evaluation de candidats médicaments dans le modèle d’asthme chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Sensibilisés par injection une fois par semaine pendant trois semaines, puis enfermés dans des chambres de plexiglas pour respirer le même réactif en aérosol trente minutes, trois fois par semaine pendant trois semaines, 1 200 rats développent un asthme expérimental. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère et tous les rats sont tués à l'issue, soumis à un prélèvement terminal de sang, d'organes ou de liquide bronchoalvéolaire. Le porteur décrit des crises de gêne respiratoire, une respiration sifflante et une hyperréactivité bronchique pouvant aller jusqu'à la détresse respiratoire, et prévoit jusqu'à douze heures d'affilée en chambre de pléthysmographie. Les bénéfices annoncés, des médicaments qui amélioreraient la qualité de vie des patients asthmatiques, restent au stade de l'évaluation préclinique, quand l'atteinte respiratoire infligée aux rats, elle, est immédiate.
Objectifs
Affectant des millions de personnes à travers le monde, l'asthme est une affection pulmonaire chronique qui touche les personnes de tous les âges. Elle se manifeste par des crises, caractérisées par des épisodes de gêne respiratoire (essoufflement), de respiration sifflante, de toux sèche ou de sensation d’oppression dans la poitrine. Les crises d'asthme peuvent durer de plusieurs minutes à quelques heures. Entre deux crises, la respiration redevient normale. L’asthme est caractérisé par trois composantes : l’inflammation des bronches, leur hyperréactivité et leur remodelage. Ces trois phénomènes sont intimement liés et s’influencent entre eux. L’inflammation bronchique est liée à l’activité anormale de différentes cellules de l’immunité au niveau du tissu bronchique. Lorsqu’elles sont agressées par une substance chimique ou microbiologique, les cellules de la paroi des bronches (cellules épithéliales bronchiques) déclenchent une réaction de défense qui fait intervenir plusieurs molécules pro-inflammatoires de la famille des cytokines qui vont déclencher différentes cascades réactionnelles locales. L’hyperréactivité bronchique se traduit par la contraction exagérée du muscle lisse des bronches et au rétrécissement des voies respiratoires au contact d’une substance déclenchante. Le remodelage bronchique correspond à l’accumulation d’anomalies au niveau des cellules qui structurent les voies aériennes (hypertrophie, hyperplasie, fibrose). Ce phénomène aboutit à l’épaississement de la paroi des bronches. L’asthme altère considérablement la qualité de vie des patients. Il entraîne des insomnies, une baisse d’activité et un absentéisme à l’école ou au travail. Un asthme mal contrôlé peut conduire à une altération de la fonction respiratoire. En effet, certains patients répondent mal ou pas du tout aux thérapies ciblées et il est donc nécessaire de développer de nouveaux traitements ou des associations médicamenteuses. Dans ce contexte, le présent projet consiste à évaluer l’efficacité de candidats médicaments dans un modèle d’asthme chez le rat.
Bénéfices attendus
Les bénéfices recherchés sont le développement de médicaments destinés à améliorer la qualité de vie des patients asthmatiques. Les modèles précliniques appropriés à l'évaluation de l’asthme sont nécessaires pour comprendre les mécanismes sous-jacents entraînant le développement de la réaction asthmatique chez l’homme. Ces modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter les problématiques de la réaction asthmatique (diminution des symptômes, de la réaction inflammatoire,…) quels qu'en soient l'origine et/ou le mécanisme d'action.
Procédures
Les rats sont sensibilisés une fois par semaine pendant 3 semaines minimum par injection d'un réactif (durée d'environ quelques secondes). Quelques jours après la phase de sensibilisation, les animaux sont placés dans des chambres en plexiglas et reçoivent par aérosol le même réactif (durée : 30 minutes, 3 fois/semaine, pendant 3 semaines). Le traitement avec les candidats médicaments est initié en parallèle des aérosols (administration pendant quelques secondes) de manière chronique (durée maximum de 3 semaines selon le composé, soit 21 administrations). Quelques jours après les challenges, la fonction respiratoire des animaux est évaluée dans des chambres de plethysmographie (maximum 12 heures, incluant la période de stabilisation). A la fin de la procédure, ces animaux seront soumis à des prélèvements de sang, ou de liquide bronchoalvéolaire sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, l’induction de la pathologie entraine une atteinte de la fonction respiratoire, une réaction inflammatoire et un remodelage pulmonaire. Parmi les symptômes les plus couramment observés dans ce modèle d’asthme, nous retrouvons des crises caractérisées par des épisodes de gêne respiratoire (essoufflement), de respiration sifflante, d’hyperactivité bronchique pouvant aller jusqu’à la détresse respiratoire (dans des cas extrêmes). De plus, un stress lié aux prélèvements et aux administrations répétés peut être ressenti par les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car ils sont soumis à un prélèvement terminal (sang, organes ou liquide bronchoalvéolaire).
Remplacement
De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant à la fois de sélectionner uniquement les molécules présentant une certaine efficacité, innocuité et d’explorer les détails relatifs au mécanisme d’action de ces dernières. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester in vivo (et donc du nombre d’animaux), il ne représente pas la complexité du système immunitaire. Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la réaction inflammatoire (respiration sifflante, hyperactivité bronchique, sécrétion de mucus, mesure des taux de cytokines, immunoglobulines...).
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Dans le contexte d’études cherchant à réverser/diminuer la réaction inflammatoire, nous pouvons observer une variabilité inter-individuelle de réponse pouvant être liée à l’agent allergisant utilisé et à la substance d’essai évaluée. Compte-tenu de la variabilité de réponse connue d'un individu à un autre, 8 rats minimum sont généralement nécessaires pour atteindre une sensibilité correcte du test. De nombreux critères d’évaluation (scores ou valeurs quantitatives telles que suivi du poids corporel, mesure des paramètres respiratoires, dosages des immunoglobulines, cytokines,…) sont intégrés dans ces études. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire et adapté à la condition des animaux (troubles respiratoires), afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce est basé sur la bibliographie scientifique. Les rats répondent bien à une variété d'allergènes couramment utilisés pour induire des modèles d'asthme, tel que l'ovalbumine..., permettant l'étude de différents aspects de la maladie. Il existe une vaste base de publications chez le rat dans la recherche sur l'asthme. Cela permet de comparer les résultats de nouvelles études avec des données antérieures, offrant ainsi une continuité et une cohérence dans la recherche. Principalement rongeurs sevrés, après 4 semaines de développement, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.
Evaluation d’un élément d’essai dans une étude pré-clinique de pharmacocinétique, de pharmacodynamie ou de toxicité
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1800
Cochons d'Inde : 120
Lapins : 120
Chiens : 240
Furets : 180
Cochons : 120
Les protocoles suivent ici la commande d'un donneur d'ordre, chaque étude fixant l'espèce, les doses et la durée selon le candidat médicament à enregistrer. 1 800 souris, 1 800 rats, 240 chiens, 180 furets, 120 cobayes, 120 lapins et 120 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des administrations une à trois fois par jour pendant un à 91 jours, subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins le premier jour pour les non-rongeurs, et parfois une chirurgie de quinze à soixante minutes pour implanter un cathéter ou une micro-pompe. Les animaux ayant reçu une substance toxique ou atteint les points limites sont tués, les autres réutilisés, et c'est le vétérinaire qui décide si un chien ou un furet peut être replacé, selon le nombre et la sévérité des procédures qu'il a déjà subies.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier la pharmacocinétique, la bio-distribution ou la toxicité de candidat médicaments. Les résultats de ces études sont indispensables pour la mise sur le marché de nouveaux médicaments et pour la réalisation des autres études précliniques dans de bonnes conditions. En maitrisant la pharmacocinétique, il est possible de choisir des doses efficaces qui ne présentent pas ou le moins possible d’effets délétères sur l’animal. L’intérêt sociétale est majeur puisqu’il s’agit de prérequis réglementaires pour l’enregistrement de nouveaux médicaments.
Bénéfices attendus
Les études de pharmacocinétique et de toxicité permettent de cibler les doses du candidat médicament appliquées dans les études de pharmacologie préclinique, de manière à déterminer les temps de pré-traitement, la durée de vie, les doses présentant le plus d'efficacité et le moins d'effets secondaires... Mais aussi à évaluer leur distribution dans, et/ou leur potentielle toxicité sur différents organes. Ils sont donc nécessaires pour 1/réduire le nombre d'animaux utilisés en expérimentation animale en ciblant au mieux les doses et temps de pré-traitement pour les études d'efficacité par exemple dans des modèles de pathologie, et 2/apporter des données pré-cliniques préalables aux études cliniques et à la mise sur le marché des médicaments.
Procédures
Les animaux sont soumis à des administrations d'éléments d'essai par diverses voies, de manière unique (de l'ordre de 1 à 60 secondes) ou répétée à diverses fréquences (1 à 3 fois par jour, pendant 1 à 91 jours), à l'état vigile ou sous anesthésie générale. A l'administration d'un élément d'essai peuvent s'ajouter des prélèvements de fluides biologiques, de manière unique (de l'ordre de quelques secondes à plusieurs minutes par prélèvement) ou répétée à diverses fréquences (1 à 8 fois par jour, sur une durée de 1 jour à plusieurs mois). Ces prélèvements sont réalisés sur animal vigile ou anesthésié. Chez le rongeur, un maximum de 7 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 1 ou 2 les jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines ou mois. Chez le non-rongeur, un maximum de 8 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 2 les quatre jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines ou mois. Dans le cas d'administrations répétées ou par perfusion, ou de prélèvements sanguins répétés, d'une chirurgie (implantation de cathéter veineux ou autre dispositif de type micro-pompe ou système d'accès vasculaire, ou prélèvement de tissus d'intérêt) peut être pratiquée sur les animaux, quelques jours avant le début des administrations ou des prélèvements, ou en fin d'étude. Ce type de procédure chirugicale dure entre 15 et 60 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Quelques nuisances peuvent être causées par certaines procédures: par exemple, un stress provoqué par les administrations, des prélèvements divers ou à l'isolement (le cas échéant), une potentielle douleur post-opératoire (après chirurgie d'implantation de cathéter veineux ou autre dispositif) ou une gêne causée par le volume occupé par un dispositif implanté en sous-cutané.
Devenir
Pour les 7 procédures décrites dans ce projet, tous les animaux, de toute espèce, soumis à un prélèvement terminal et/ou ayant reçu un élément d'essai toxique (atteinte des points limites) ou une substance dont les effets à long terme sont potentiellement néfastes, sont euthanasiés. Les animaux gardés en vie, et potentiellement réutilisés, sont ceux qui ont reçu un traitement dont les effets à long terme sont connus pour être non-néfastes. La réutilisation des animaux (toute espèce) est soumise à l’approbation du vétérinaire, celle-ci est privilégiée pour contribuer à la réduction du nombre d'animaux utilisés en expérimentation animale. La décision de replacer un chien ou un furet est prise par le vétérinaire, en fonction du nombre et de la sévérité des procédures subies par l'animal, et éventuellement de son age.
Remplacement
Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, la biologie clinique, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes, ou l'étude vise à évaluer la distribution d'une substance pharmacologique dans l'organisme vivant, dans son intégralité. Selon les espèces, le métabolisme est différent. Selon le stade d’avancement du projet ou selon le type de composé, il peut être nécessaire d’effectuer ces études sur les espèces suivantes : rats, souris, cobayes, lapins, chiens, furets, porcs. Ces techniques nécessitent l’utilisation d'animaux de laboratoire et ne peuvent être efficacement remplacées par des méthodes alternatives.
Réduction
Ce projet s'intègre dans un objectif de Réduction du nombre d'animaux utilisé en expérimentation animale. En effet, il permet de sélectionner dans des groupes réduits, les doses et les temps de pré-traitement les plus efficaces (et d'éliminer les doses sub-efficaces et/ou présentant trop d'effets délétères) avant les études pré-cliniques d'efficacité ou de sécurité, permettant, ainsi, de réduire de manière importante le nombre d'animaux utilisé dans d'autres modèles d'études précliniques (modèle de pathologie, tests comportementaux et/ou physiologiques...). Dans le but de réduire le nombre d’animaux, certains animaux peuvent être réutilisés après accord du vétérinaire. Le nombre d'animaux utilisé pour chaque étude est réduit au strict minimum, de manière à permettre une interprétation correcte et objective des résultats, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux sera déterminé en fonction des procédures secondaires qui seront ensuite réalisées sur les animaux ou selon les lignes directrices de l’OCDE dans le cas des études de toxicité. Ce projet, d’une durée de 3 ans, couvrirait un maximum de 36 études chez le rat, 18 chez la souris, 6 chez le cobaye, 9 chez le furet, 6 chez le lapin, 12 chez le chien et 6 chez le porc, en considérant qu’une étude correspond à une procédure expérimentale. De plus, la formation du personnel technique permettra de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisé (limitation du nombre d’animaux surnuméraires et de l'euthanasie prématurée des animaux).
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, l'état d'hydratation, les tremblements, la respiration, etc...), ainsi qu'en une limitation de l'effectif au strict nécessaire. De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, en mettant à disposition des animaux, de l’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, des tapis chauffants, des lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. Enfin, lorsque nécessaire (e.g. en cas de prélèvements sanguins importants), une réhydratation des animaux est prévue.
Choix des espèces
La distribution d'une substance ou ses effets sur la biologie clinique chez l'animal de laboratoire sont prédictifs de ce qui peut se produire en clinique. Par ailleurs, l'innocuité d'une substance ainsi que sa cinétique doivent être évaluées chez une espèce rongeur et une espèce non-rongeur (Réf. ICH M3(R2)). Le choix de l’espèce est propre à chaque étude et justifié par le donneur d’ordre, en fonction de la substance à tester, de son mécanisme d’action, de l’éventuelle disponibilité de données préliminaires issues de tests de pharmacocinétique ou d’innocuité, préalablement réalisés, ce peut être aussi en fonction des similitudes avec l’homme concernant des voies métaboliques précises ou un système physiologique cible. Principalement rongeurs (rats, souris, cobayes) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique (par exemple, lignes directrices OCDE 420). Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis l'âge de sevrage jusqu'à l'âge adulte. Lapins, furets, chiens et cochons adultes conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique (par exemple, lignes directrices OCDE 409).
Identité moléculaire des synapses des cellules de Purkinje en développement et adultes
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Anesthésiés puis injectés dans le crâne entre zéro et sept jours de vie, les souriceaux sont remis auprès de leur mère roulés dans la sciure souillée, pour limiter le risque qu'elle les rejette. 1 696 souris, souriceaux et adultes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'injection intracérébrale durant vingt à trente minutes selon l'âge. Le porteur indique que la manipulation des souriceaux amène parfois les femelles à rejeter leurs petits, qui sont en général mangés par leur mère sans qu'aucune intervention soit possible. Toutes les souris injectées sont tuées en fin de procédure pour l'électrophysiologie, la biochimie ou l'histologie, et 70 mères sont gardées vivantes pour de nouveaux accouplements.
Objectifs
Dans le système olivo-cérébelleux, la cellule de Purkinje du cervelet reçoit deux types différents de connexions excitatrices. L’activité neuronale régule la formation et le maintien d'un seul de ces deux types de connexions, ce qui fait du réseau olivo-cérébelleux un système d’étude idéal pour analyser les mécanismes moléculaires dépendants de l’activité menant à l’établissement de réseaux neuronaux fonctionnels. Nous proposons d’étudier le rôle de l’activité neuronale dans l’établissement de ce réseau ainsi que dans la régulation des facteurs moléculaires contrôlant sa mise en place.
Bénéfices attendus
Les maladies mentales et neurologiques constituent un réel problème de santé publique puisqu’elles sont la première cause d’invalidité dans le monde. Parmi ces maladies, la schizophrénie et l'autisme touchent chacune environ 1% de la population. Les symptômes associés à ces maladies sont très variés et apparaissent dans l'enfance pour l'autisme, et à la fin de l’adolescence ou chez le jeune adulte pour la schizophrénie. Les patients présentent par exemple des déficits cognitifs (concentration, attention, mémoire de travail…) qui apparaissent dans l’enfance et auraient pour origine des défauts neurodéveloppementaux. Les traitements, qui restent pour l’heure purement symptomatiques, sont la plupart du temps peu efficaces. Il est donc crucial de comprendre l’origine de ces maladies, pour pouvoir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Les synapses, connexions permettant aux neurones de communiquer entre eux, sont indispensables au bon fonctionnement du cerveau. Aujourd’hui, il est très bien établi que des déficits de connectivité neuronale sont présents dans le cortex chez des patients atteints d'autisme ou de schizophrénie. En revanche, en dépit de la présence évidente de déficits cérébelleux chez certains patients, l’implication du cervelet dans ces pathologies reste très peu étudiée. La présente étude nous permettra d’identifier des déficits synaptiques dans le réseau olivo-cérébelleux, suite à la modulation de l’activité neuronale au cours du développement du cervelet et nous aidera à mettre en évidence les protéines synaptiques potentiellement modulées par l’activité neuronale qui pourraient provoquer l’apparition de certaines maladies du cerveau lorsqu’elles sont dérégulées.
Procédures
Injection transcranienne de 0 à 2 jours ou intracérébrale de 3 à 7 jours sur souriceau anesthésié. La durée totale de l'injection est de 20 min. Injection intracérébrale sur souris adulte anesthésiée. La durée totale de l'injection est d'environ 30 min.
Impact sur les animaux
La manipulation des souriceaux peut parfois amener les femelles à rejeter leurs petits qui sont en général mangés par leur mère sans qu'aucune intervention ne soit possible. D'éventuelles douleurs post-opératoires peuvent apparaitre au niveau de la petite incision de la peau réalisée au niveau du crâne. Aucun autre effet indésirable n’a été observé sur ces animaux dans notre précédent projet.
Devenir
Pour les études d’électrophysiologie, de biochimie ou d'histologie, les 1696 animaux injectés (souriceaux et adultes) seront euthanasiés en fin de procédures.
Remplacement
Il est important d’étudier le réseau olivo-cérébelleux dans le contexte du cerveau puisque le cervelet est connecté à d’autres régions du cerveau dont notamment le tronc cérébral mais aussi le cortex qui est déjà connu pour son implication, par exemple, dans l'autisme ou la schizophrénie. Une telle étude nécessite donc d’avoir recourt à des animaux vivants. En effet, il ne serait pas possible d'étudier la connectivité entre différentes régions du cerveau in vitro en culture cellulaire ni même dans des « assembloïdes » associant des organoïdes simulant différentes régions cérébrales grâce à la diversité des cellules qui les composent, les activités cellulaires observées dans ces cultures ou organoïdes cérébraux ne pouvant être assimilées aux processus cognitifs, sensoriels ou moteurs propres au cerveau. Des études in silico sont possibles lorsque l'on étudie des molécules dont les propriétés sont bien décrites dans la littérature scientifique mais ne sont pas possibles dans notre étude qui concerne de nouvelles molécules dont les rôles et mécanismes d'action sont pour l'heure inconnus.
Réduction
Le projet est conçu pour limiter le nombre de souris au minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats statistiquement et scientifiquement valides en prenant en compte la nécessité d’avoir plusieurs échantillons et de reproduire les résultats de manière indépendante pour éviter les différences dues à la variabilité biologique (sexe, caractéristiques génétiques…), à la variabilité environnementale (différence liée à la vie avec la mère). Après sevrage des souriceaux, les mères peuvent continuer à être utilisées pour de nouveaux accouplements dans notre animalerie.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Notamment, des compléments environnementaux (dômes en carton, cotons, baguettes en bois) sont ajoutés afin de permettre à la femelle de créer un meilleur nid, de diminuer tout stress éventuel et d'user ses dents. Lors des injections, les souriceaux sont séparés de la mère pendant maximum 1 heure afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux et les souriceaux sont réchauffés sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère afin d’éviter le rejet des souriceaux par la mère. Les animaux sont surveillés quotidiennement jusqu’à leur euthanasie. Lorsque les souris sont en âge de se nourrir seules, de la poudre de croquette humidifiée est ajoutée dans la cage pour favoriser le nourrissage après l'injection. Les souris reçoivent également une injection intrapéritonéale d'analgésique au début de l'anesthésie pour prévenir toute douleur post-opératoire. Nous utilisons une grille de suivi des animaux, les points limites sont mis en place pour éviter toute douleurs ou mal être des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. En effet, elles permettent l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elles permettent également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. De plus, le court cycle de reproduction chez la souris et sa petite taille permettent de maintenir ces animaux relativement facilement, tout en gardant une espèce assez proche de l’homme en terme de développement. Notre projet concerne non seulement l’étude du développement du système olivo-cérébelleux, qui se déroule principalement après la naissance et nécessite donc de travailler chez le nouveau-né, mais aussi l’étude de son maintien chez l’adulte. Nous réaliserons les injections stéréotaxiques chez le souriceau agé de 0 à 7 jours, moment de la formation des synapses d‘intérêt, ou chez l’adulte de 2 mois, moment où le réseau est mature. Les souris seront ensuite euthanasiées environ 3 semaines après injection, soit environ 30 jours après leur naissance pour les souriceaux (stades auquels la connectivité du réseau est finalisée) et avant leur 3 mois pour les adultes. En effet, 3 semaines sont nécessaires et suffisantes au bon fonctionnement de nos outils moléculaires et à la production d’effets morphologiques ou fonctionnels quantifiables sur les synapses.
Etude de l’interaction entre P53 et Hif1a dans le développement de lésions précancéreuses prostatiques.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
220 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent pendant cinq jours des injections abdominales destinées à faire apparaître des lésions précancéreuses de la prostate, 40 d'entre elles subissent ensuite deux semaines d'injections quotidiennes d'une molécule, et 120 sont castrées chirurgicalement sous anesthésie, une opération de vingt minutes suivie d'un mois de surveillance. Les prostates sont prélevées après la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique de la transition cancéreuse ni la complexité cellulaire en jeu, ce qui rend selon lui "nécessaire" le recours à l'animal.
Objectifs
Le cancer de la prostate est la 3ème cause de mortalité par cancer chez l'homme. Dès lors qu'il est invasif, il conduit inévitablément au décès du patient par échappement aux traitements. Notre laboratoire s'intéresse aux mécanismes de progréssion des lésions précancéreuses indolores et benignes vers les tumeurs invasives et agressives. Nous avons auparavant identifié un facteur moléculaire qui promeut la plasticité de cellules épithéliales de lésions précancéreuses prostatiques en les protégeant contre la mort cellulaire. En parallèle, nous avons démontré le rôle protecteur d'une autre protéine contre la plasticité de ces cellules. Par ailleurs, les intéractions entre ces deux facteurs ont été décrites dans les systèmes cellulaires dans la littérature et indiquent que les deux facteurs pourraient intéragir pour contrôler l'agressivité des cellules cancéreuses, mais aucune étude in vivo n'a été conduite dans le cas du cancer de la prostate. Dans ce projet, nous voudrions évaluer l'impact de l'inhibition simultanée de ces deux facteurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les intéractions entre les facteurs clefs contrôlant la survie, la sénescence et éventuellement l'agressivité des cellules précancéreuses prostatiques, ainsi que leur résistance aux traitements actuels par hormonothérapie. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la tumorigénèse ouvre des perspectives thérapeutiques et diagnostiques et ainsi, une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Tous les animaux de ce projet (220) seront sujets à des traitements par des injections au niveau de l'abdomen pendant 5 jours pour induire l'apparition de lésions précancéreuses prostatiques. Cette procédure prend 10 secondes comprenant la préhension de la souris et l'injection en elle-même. Une partie d'animaux sera soumise à un traitement pharmacologique (40) soit avec la molécule active, soit avec son adjuvant. Ces solutions seront également administrées par des injections au niveau de l'abdomen, le traitement durera deux semaines avec les injections quotidiennes. La procédure prendra 10 secondes. Une partie d'animaux subira une intervention chirurgicale (120) - castration, sous une anesthésie accompagnée d'une analgésie efficace. La durée de la chirurgie est estimée à environ 20 minutes par animal, et sera surveillée pendant un mois après chirurgie.
Impact sur les animaux
Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Les lésions précancéreuses restent indolores jusqu'à 5 mois après injection du premier composé, nous ne nous attendons donc pas à une agressivité et donc une douleur. Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables suite au second traitement, car le composé a été décrit comme bien toléré dans la littérature et a été utilisé pour des traitements plus longs que ceux prévus dans notre étude. Des effets indésirables liés à l'intervention chirurgicalex sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas.
Devenir
Une fois les procédures terminées, les prostates des animaux seront prélevées pour les analyses ultérieures.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique de la transition cancéreuse ni la complexité cellulaire impliquée dans l'évolution des lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences dans les modèles animaux pour comprendre ce phénomène et en disséquer les méchanismes moléculaires.
Réduction
Etant donné la variablité inter-individuelle observée dans nos études précédentes, nous avons estimé par une approche statistique que 10 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement. Ainsi, nous avons prévu les groupes de souris de sorte à avoir 10 souris par analyse effectué pour le groupe expérimental donné. Nous allons profiter des données obtenues précédemment dans le laboratoire sur d'autres modèles murins pour effectuer les comparaisons et reduire le nombre de nouvelles souris utilisées. Amendement: Pour le groupe d'animaux qui subiront une chirurgie, cette intervention peut générer plus de variabilité entre les animaux, nous avons donc estimé que 15 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet entre les groupes comparés.
Raffinement
Tout le long des traitements par injections intra-péritonéales, la souris sera surveillée afin de détecter les irritations ou l'inflammation du site d'injection. De plus, les injections seront réalisées en altérnant les côtés d'injection. Les souris seront surveillées quotidiennement, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Elles seront également pésées quotidiennement pendant les traitements. Tout animal en souffrance sans possibilité de soulagement sera sorti de l'étude. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l'animalerie et/ou les chercheurs. Un enrichissement sera ajouté systématiquement dans les cages. Amendement: Les souris subiront une anesthésie générale et recevront des médicaments antalgiques afin de prévenir l'apparition de douleurs. Elles seront surveillées de manière très rapprochée durant les jours qui suivront la chirurgie. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables.
Choix des espèces
Nos modèles de souris récapitulent de manière fidèle l'apparition et l'évolution des lésions précancéreuses prostatiques chez l'homme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'effet d'un traitement et que le microenvironnement tumoral joue le rôle clé dans l'évolution des lésions, nous sommes dans l'impossibilité d'utiliser les systèmes cellulaires qui ne récapitulent pas la complexité d'un tissu. Seuls les souris mâles adultes seront utilisés pour ce projet car l'induction de lésions précancéreuses doit se faire sur des prostates matures et donc après la puberté.
Etude de la toxicité et efficacité de la radiothérapie et de la radiorésistance dans les tumeurs cérébrales pédiatriques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à quinze séances de tests comportementaux par semaine et cinq irradiations du crâne par expérience : 9 143 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des cellules ou des fragments de tumeurs cérébrales pédiatriques leur sont greffés sous la peau ou injectés directement dans le cerveau sous anesthésie, avec un suivi par imagerie chaque semaine et des mesures de tumeur au pied à coulisse. Le porteur décrit des tests portant sur la capacité d'apprentissage et la mémoire spatiale, sans préciser lesquels sont employés. Il justifie l'emploi de souriceaux de dix jours par le fait que leur cerveau est alors en plein développement, comme celui des jeunes enfants atteints des cancers étudiés.
Objectifs
Les cancers sont la seconde cause de mortalité chez les enfants âgés de 1 à 15 ans dans les pays industrialisés. Parmi eux, les cancers cérébraux sont la deuxième cause de cancers pédiatriques et la cause majeure de mortalité liée au cancer. La radiothérapie est nécessaire et souvent curative pour traiter les tumeurs cérébrales pédiatriques. Cependant, elle est associée à une forte toxicité sur le cerveau en développement entraînant des effets secondaires dramatiques chez les enfants (défauts neurocognitifs sévères, etc). Chez certains patients, la radiothérapie échoue et des récidives tumorales apparaissent suggérant une forme de radiorésistance de ces tumeurs. Chez les très jeunes enfants, le médulloblastome (MB) et les tumeurs rhabdoïdes et tératoïdes atypiques (AT/RT) sont parmi les cancers cérébraux les plus agressifs. En outre, ils sont souvent associés à une rechute et ce malgré d’intensifs traitements classiques associant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. Ce projet a pour but d’améliorer les connaissances scientifiques en permettant de mieux comprendre les mécanismes de radiorésistance et de toxicité sur le tissu normal. L’objectif est d’identifier de nouvelles cibles ou modalités thérapeutiques afin d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie et de diminuer ses effets secondaires indésirables. De plus, l’étude de l’infiltrat des cellules immunitaire c’est-à-dire l’accumulation de cellules du système immunitaire dans les tumeurs permettra d’identifier les meilleurs traitements d’immunothérapie à combiner à la radiothérapie pour améliorer le contrôle de la tumeur.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact de l’irradiation sur la réponse tumorale dans 2 types de cancer pédiatrique permettra de mieux comprendre les mécanismes associés à la rechute et de diminuer les effets secondaires indésirables. Ce projet a pour but d’identifier de nouvelles modalités thérapeutiques telles que la combinaison de traitements d’irradiation avec de l’immunothérapie ou un traitement par thérapie ciblée. La finalité est donc d’améliorer le traitement de ces cancers tout en diminuant les effets délétères. Les bénéfices directs attendus sont de deux ordres, l'un cognitif pour une meilleure compréhension des mécanismes de résistance et de toxicité et le second, d’ordre sociétal en santé humaine avec le potentiel développement de nouvelles thérapies plus efficaces pour soigner des patients atteints de cancers pédiatriques. Les effets indirects attendus en réduisant les effets secondaires indésirables pourront également avoir un effet sociétal en diminuant les handicaps associés et permettant une meilleure intégration des patients dans la société, mais aussi avoir un impact économique en réduisant la nécessité de soins liés aux effets secondaires. La bonne connaissance de nos modèles nous garantira une qualité au niveau de nos expériences ce qui contribuera à l’enrichissement des connaissances à travers la publication de nos résultats dans des journaux scientifiques.
Procédures
Des fragments de tumeurs seront placés soit en sous-cutanée soit en interscapulaire sous anesthésie gazeuse (1 fois par expérience/ 10 minutes/ souris), Des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience/ 2 minutes/souris) ou des fragments de tumeurs seront greffés aux animaux sous anesthésie (1 fois par expérience/ 10 minutes/souris), Les tumeurs de ces animaux seront ensuite irradiées (soit 3 fois/expérience soit 5 fois/expérience, compter entre 2 et 10 minutes/irradiation/animal). Les animaux seront ensuite suivis, et les tumeurs mesurées à l’aide d’un pied à coulisse (1 à 2 fois par semaine/ 1 minutes/souris). Les animaux vigiles recevront un ou plusieurs traitements soit par injection intrapéritonéale, soit par voie orale. (Environ 1 minutes/souris). Des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau sous anesthésie gazeuse (1 fois au cours de l’expérience/ 10 minutes/souris) puis suivi à l’imagerie sous anesthésie (1 fois par semaine/ environ 20 minutes/souris). Le cerveau de ces animaux sera ensuite irradié en préservant les bulbes olfoactifs et la gorge (soit 3 fois/expérience soit 5 fois/expérience, compter entre 2 et 10 minutes/irradiation/animal) – acte réalisé sous anesthésie). Afin d'évaluer la capacité d'apprentissage et la mémoire spatiale de ces animaux, des tests de comportement seront réalisés avec au maximum 15 séances/semaines (chaque séance ayant une durée de moins de 10 minutes par animal). Enfin, des animaux anesthésiés seront irradiés au niveau du cerveau en veillant à préserver les bulbes olfactifs (1 irradiation - durée de l'anesthésie environ 10 minutes). Puis pour évaluer la capacité d'apprentissage et la mémoire spatiale de ces animaux, des tests de comportement seront réalisés avec au maximum 15 séances/semaines (chaque séance ayant une durée de 10 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Des cellules ou des fragments de tumeurs seront implantées chez des souris. Ces souris développeront des tumeurs et pourront recevoir des traitements tel qu’un protocole d’irradiation, un traitement ciblé et/ou une immunothérapie. Suite à la greffe des cellules ou de fragments de tumeurs, une perte de poids peut être observée jusqu’à environ 4 jours post-greffe. Suite à l’irradiation d’une partie du corps de l’animal, une perte de poids pourrait être observée durant 15 jours post-irradiation. Les nuisances attendues lors des administrations d’agents pharmacologiques sont liées à l’administration en elle-même (douleur légère de courte durée suite aux injections, stress de courte durée lié à la contention de l’animal lors des administrations orales) ainsi qu’à la composition du solvant utilisé . Les nuisances attendues lors des tests comportementaux sont liés au stress provoqué par les modifications apportées à l’environnement des animaux : conditions du test, type d’hébergement, expérimentateur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Concernant l’étude sur le médulloblastome, nous disposons au laboratoire de nombreux modèles : des progéniteurs neuronaux (= progéniteurs des cellules granulaires (GCP)) dissociés et purifiées à partir de cervelet de souriceaux âgées de 3 à 8 jours, des lignées cellulaires sur lesquelles de nombreux résultats prometteurs in vitro ont déjà pu être obtenus. Des expériences préliminaires in vitro sur cellules tumorales sont toujours réalisées en amont de l’approche in vivo chez la souris afin de ne poursuivre qu’avec les axes de recherche les plus solides. De la même façon, tous les composés de thérapies ciblés seront testés in vitro, seul ou en combinaison à l’irradiation et ne seront testés in vivo que ceux pour lesquels les résultats seront prometteurs. Des travaux sont également en cours en ce moment dans notre laboratoire sur l’obtention d’organoïdes de cervelet à partir de cellules humaines souches induites pluripotentes (iPS) ce qui nous permettra dans l’avenir d’augmenter nos approches in vitro et de remplacer une partie des animaux utilisés à des fins expérimentales . Concernant les traitements d’immunothérapie, ils ne peuvent être testés qu’in vivo du fait de la nécessité d’avoir un système immunitaire complet au sein d’un organisme. Enfin, l’étude de la toxicité des nouveaux traitements ou modalités ne peut s’envisager que sur animal. Nous chercherons en particulier à évaluer l’effet de ces traitements sur le tissu sain par des tests de comportement à plus ou moins long terme qui permettent d’étudier les déficits moteurs ou cognitifs semblables à ceux observés chez les patients après radiothérapie. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (cultures in vitro) l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
1-Pour minimiser le nombre d’animaux tout en cherchant à répondre aux objectifs scientifiques, nous aurons recours à des études longitudinales avec l’utilisation de l’imagerie du petit animal (suivi du même animal au cours du temps). Des études pilotes pourront être réalisés pour l’administration d’agent pharmacologique en fonction des données déjà publiées ou non. L’utilisation des patient derived xenograft qui sont des fragments de tumeurs obtenus chez des patients fraichement opérés (PDX) et qui sont maintenues sur animaux vivants est mutualisée avec les autres projets au sein de l’équipe ce qui contribue également à la réduction du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux estimé dans ce présent projet est un nombre maximum, mais il sera sans doute réduit. 2- Le nombre d’animaux à utiliser a été défini à l’aide d’outils statistiques
Raffinement
Dès que cela n’implique pas de stress ou de l’angoisse supplémentaire, une méthode d’anesthésie sera utilisée pour réaliser le geste technique nécessaire à l’expérimentation. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux ou généraux pendant l’opération et si besoin post-opératoire. Le réveil de l’animal se fera sous lampe chauffante et sera surveillé par l’expérimentateur. Des méthodes sont mises en place durant la chirurgie pour le bien-être de l’animal avec par exemple l’utilisation d’un coussin chauffant, l’utilisation de vaseline pour éviter le dessèchement des yeux, et en post-opératoire en favorisant l’accès à la nourriture molle en déposant au fond de la cage des cupules d’aliment gélifié. Nous habituerons les animaux quelques jours avant la chirurgie à se nourrir à base de ces cupules d’aliments gélifiés pour diminuer encore le stress et l’angoisse. Lorsque cela est possible scientifiquement, nous choisissons la méthode la moins invasive comme par exemple le choix du site d’implantation en sous cutané pour le maintien des PDX contrairement à un maintien qui aurait également pu être fait en orthotopique. L’injection de cellules dans le cerveau exprimant un marqueur permettra de suivre la croissance tumorale par une méthode non invasive d’imagerie. L’imagerie sera réalisée de 1 à 3 fois par semaine et sous anesthésie. Une procédure d’entrainement du personnel permettra de transmettre les gestes techniques de manière sûre aux nouveaux personnels en diminuant ainsi le stress et l’angoisse chez la souris. Les animaux greffés seront observés régulièrement par l’expérimentateur pour le suivi de la croissance tumorale soit par mesure à l’aide d’un pied à coulisse soit par imagerie en fonction du site d’implantation et pour vérifier leur état général de santé. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Dès atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté physiologique avec l’Homme. Ce modèle est utilisé dans de nombreuses études en cancérologie, notamment pour des expériences de greffes ainsi que l’utilisation de lignées murines génétiquement modifiées. De plus, le modèle murin est un modèle de choix puisque les tumeurs spontanées sont rares et la croissance tumorale induite par greffe est relativement rapide. La majorité des animaux seront utilisés au stade adulte soit à 7 semaines Greffées à l’âge adulte, ce modèle de génération de tumeur est communément utilisé et bien maîtrisé (reproductible). La bonne connaissance de nos modèles sur les souris adultes nous ont conduit à réaliser ces expériences sur adultes pour garantir une bonne reproductibilité et donc une réduction du nombre d’animaux à utiliser. Concernant les greffes en sous-cutanés, les tumeurs seraient rapidement trop volumineuses par rapport à la taille de l’animal si nous la réalisions chez le souriceau. Nous utiliserons également des jeunes souriceaux non sevrés à 2 jours et 9 jours pour comparer l’infiltrat immun en fonction du stade de développement. Pour les tests comportementaux, des jeunes souris de 10 jours seront utilisés car à cette période, le cerveau est en plein développement (prolifération des progéniteurs neuronaux) tout comme l’est celui des jeunes enfants atteints des cancers pédiatriques étudiés.
Etude de l’efficacité de molécules pharmaceutiques dans un modèle d’induction de lésion pulmonaire aiguë par injection intranasale de lipopolysaccharides chez la souris et le rat.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Rats : 513
847 souris et 513 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une endotoxine bactérienne leur est instillée dans le nez sous anesthésie gazeuse pour provoquer une lésion pulmonaire aiguë avec œdème, puis ils reçoivent par voie orale, une à deux fois par jour, les composés d'une société pharmaceutique, avant un prélèvement sanguin terminal et la mise à mort pour analyse histologique des poumons. Le porteur annonce vingt-cinq études sur ce modèle. Il présente le choix de la voie nasale plutôt que trachéale comme "un raffinement important pour les études sur l'inflammation pulmonaire", la dégradation de la fonction respiratoire provoquée restant selon lui "limitée" parce que ces études durent 24 heures.
Objectifs
La lésion pulmonaire aiguë (ou ALI pour acute lung injury) est une forme d'insuffisance respiratoire, caractérisée par une atteinte pulmonaire inflammatoire diffuse aiguë qui entraîne une augmentation de la perméabilité des capillaires alvéolaires et un œdème pulmonaire non hydrostatique. Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), forme la plus invalidante d’insuffisance respiratoire, représente encore une cause importante de mortalité chez les patients. Nous souhaitons développer un modèle in vivo d’inflammation pulmonaire aigue pour une évaluation de l’efficacité de composés pharmacologiques développés par notre société. Les modèles murins d’infection intranasale par le LPS (une endotoxine) constituent des modèles de choix pour cette pathologie. Cette endotoxine d’origine bactérienne provoque une réponse inflammatoire importante chez les animaux et chez l’Homme. L'administration intranasale du LPS provoque une réponse inflammatoire pulmonaire rapide et locale à court terme. Ce modèle aigu nous permettra de relier l’efficacité à l’exposition pulmonaire de nos composés (pharmacodynamique). La voie d’administration intranasale est également moins invasive que l’injection par voie intratrachéale (avec ou sans chirurgie). Selon la littérature scientifique, la reproductibilité et l’impact sur l’inflammation et les lésions du tissu pulmonaire semblent être comparables entre les deux voies d’administration. Ainsi, le modèle LPS intranasal offre un raffinement important pour les études sur l'inflammation pulmonaire. Ce modèle de lésion pulmonaire aigue se rapproche fortement du phénomène inflammatoire observé chez l’Homme lors d’atteintes pulmonaires aiguës. En termes de mécanisme d’action, la production excessive de molécules du stress oxydatif, induite par l’administration de LPS, joue un rôle déterminant dans le déclenchement et le maintien de la réponse inflammatoire aigüe. Ce modèle constitue donc un modèle de choix pour évaluer nos composés pharmacologiques ciblant le stress oxydatif.
Bénéfices attendus
La lésion pulmonaire aiguë, par son stade aggravé (le syndrome de détresse respiratoire aiguë - SDRA), est un syndrome clinique sévère courant en unité de soins intensifs, qui conduit à une forme d'insuffisance respiratoire, entraînant une mortalité jusqu’à 30 à 40 %. Les résultats attendus dans ce modèle nous permettront d’identifier rapidement les molécules avec le meilleur potentiel thérapeutique. Par ailleurs, les mécanismes inflammatoires impliqués correspondent parfaitement au mode d’action de nos molécules. Cela nous permettra de valider leur action dans ces processus inflammatoires. Ces molécules pourront par la suite être incluses dans le processus de développement pour la mise en place d’essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
L’administration intranasale de LPS se fera sous anesthésie gazeuse en moins d'une minute. Une contention légère permettra le traitement par voie orale en 20 secondes, 1 ou 2 fois par jour selon la molécule testée et sa pharmacologie. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous anesthésie gazeuse (moins de 1 minute) avant euthanasie (sans réveil entre les 2 actes).
Impact sur les animaux
Le LPS a pour effet une dégradation de la fonction pulmonaire, malgré tout limitée pour ces études de 24h. La légère contention nécessaire pour le traitement par voie orale, ainsi que l'anesthésie pour le prélèvement sanguin, pourront engendrer un stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prelever les tissus pulmonaires afin d'analyser l'évolution de la maladie en histologie.
Remplacement
En amont des tests chez l’animal, les composés sélectionnés sont évalués sur des tests in vitro, permettant d’identifier les composés les plus prometteurs, de comprendre leur mécanisme d’action et d’éliminer les molécules inactives ou pouvant entrainer des nuisances ou effets indésirables chez les animaux (via les tests de toxicologie cellulaire). Pour évaluer l’activité des composés in vivo, il est indispensable de recourir ensuite à l’utilisation de modèles animaux intégrant au mieux la physiopathologie humaine (interactions intercellulaires, inter-organes, inflammation…). Malheureusement, ce genre d’interaction ne peut pas encore être reproduite in vitro et c’est pour cela que ce modèle in vivo est nécessaire. De plus, ce modèle vivo est décrit dans la littérature scientifique et a été validé avec des composés qui ont montré leur efficacité chez l’homme dans des études cliniques.
Réduction
La sélection des composés est faite en utilisant des tests cellulaires ou non cellulaires in vitro. Seules les molécules présentant une activité sur les tests in vitro et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront étudiées avec les animaux. Ce modèle a déjà été utilisé par le passé pour développer des molécules au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux maximum nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Des tests statistiques seront utilisés. Nous optimiserons les études pour utiliser le moins de groupes contrôle possible. Ainsi, 25 études seront réalisées dans ce porjet.
Raffinement
Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. La Structure Chargée du Bien-Être Animal (SBEA) émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. La voie d’administration intranasale est privilégiée par rapport à l’infection intratrachéale pour éviter une contention forte (injection par otoscope et sonde) ou de la chirurgie. Afin de limiter le stress causé aux animaux, les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique, rapide et nécessitant une contention courte, est bien tolérée par les animaux. La formation du personnel, la taille de la sonde et l’adaptation des volumes administrés permettront de limiter le stress ressentit par l’animal lors du traitement. Après réception, un programme d’enrichissement permet de varier les éléments de la cage afin d’encourager le comportement de rongeur : coton pour la construction de nid, dôme rouge pour se cacher, bois à ronger… La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. Les animaux seront monitorés à chaque traitement pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces dont les manifestations inflammatoires sont les plus connues et se rapprochent le plus de celles de l’Homme dans ce modèle. Comme décrit dans la littérature, la souris est le modèle animal le plus utilisé pour ce modèle de lésion pulmonaire aiguë induit par le LPS. Il est approprié car plusieurs signes physiopathologiques caractéristiques de cette atteinte inflammatoire ont été rapportés dans la littérature scientifique. Nous établirons également le modèle chez le rat si nécessaire, dans le cas de composés ayant une pharmacocinétique plus favorable chez le rat par rapport à la souris. L’implication du stress oxydatif dans ce type de pathologie a été rapporté dans la littérature scientifique via des études in vivo. Basé sur la littérature scientifique et sur notre expérience antérieure sur le modèle, les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 8 à 12 semaines d’âge à l’induction de l’inflammation.