Procédures modérées

Le premier des trois porcs reste sous anesthésie générale jusqu'à quatre heures, le temps que quatre opérateurs s'exercent à poser des cathéters dans une à trois veines ou artères chacun. Ces 3 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le projet se présente comme un progrès de raffinement au sens de la directive 2010/63/UE, avec une anesthésie plus courte et un risque infectieux réduit, et le porteur décrit la pose échoguidée comme "très peu invasive" et les prélèvements suivants comme "totalement indolores". Le premier porc est tué à la fin de l'intervention parce que de nombreux vaisseaux y ont été cathétérisés, que l'opération a duré et que l'asepsie n'y est pas complètement maîtrisée, les deux autres au terme de trois semaines, leurs muscles, foie et reins pouvant être récoltés.

Objectifs

Dans le cadre de la directive 2010/63/UE relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, retranscrit en droit français par le décret no 2013-118 du 1er février 2013, le raffinement des techniques utilisées en expérimentation animale est souligné. Le but de ce projet est d'améliorer la technique de pose de cathéter veineux central ainsi que d'autres voies d'accès sanguines sur 3 porcs, grâce à un appareil d'échographie, pour réaliser par la suite des études de cinétique tout en minimisant au maximum la souffrance pour les animaux. De plus ce projet permettra de former des opérateurs à cette nouvelle technique (4 opérateurs) La 2e partie de ce projet permettra de vérifier le bon maintien des cathéters et de réutiliser deux animaux pour réaliser une cinétique plasmatique comprenant une association d'antibiotiques classiquement utilisée en médecine vétérinaire, notamment dans la filière porcine, pour traiter certaines infections. Cependant les posologies actuelles ne sont pas optimales pour avoir un traitement le plus efficace possible. Cette 2e procédure permettra ainsi de compléter les données déjà obtenues lors d'une précédente saisine afin d’améliorer l’analyse des résultats. Cette 2e procédure permet donc d'optimiser l'usage de 2 de ces 3 porcs, suite à la formation sur la pose des cathéters, par la mise en place d'une cinétique de prélèvement sanguin. La répétition de ces prélèvements confirmera la fonctionnalité des cathéters et le bon maintien des bandages grâce à une évaluation à moyen et long terme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de la mise en place de cette nouvelle technique de cathéter central sont multiples : - réduction de la durée d'anesthésie des animaux (environ 30-45min contre plus de 2h avec la technique chirurgicale) - diminution du risque infectieux car il n'y a pas d'ouverture chirurgicale, le seul geste étant le passage de l'aiguille et du cathéter au niveau du cou. Celui-ci n'étant pas fixé au vaisseau comme lors de la technique précédente, il peut être retiré facilement en cas d'infection. Amélioration globale du bien-être des animaux grâce aux points précédents. Concernant les prélèvements sanguins de l'association d'antibiotique, les données récoltées permettront par la suite de proposer une posologie plus adaptée lorsque le recours à cette association d’antibiotique est nécessaire en élevage agricole.

Procédures

Pour le premier porc, une anesthésie générale sera effectuée afin d'effectuer l'ensemble des poses de cathéter sur chaque site recherché. La durée dépendra du temps d'apprentissage de chaque intervenant en fonction de leur maitrise et de leur expérience mais ne dépassera pas 4 heures. Les 2 porcs restant ayant reçu une pose de cathéter central au niveau de la veine jugulaire externe auront une anesthésie générale d'une durée moyenne de 30-45 min. Le placement du cathéter central de façon écho-guidée, permet de réduire la durée de l'anesthésie et de minimiser le risque infectieux. Cette procédure peut être source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Une fois le cathéter posé, les prélèvements de sang seront totalement indolores et sans contention particulière, et auront lieu sur une période de 56h. Puis les porcs seront gardés au maximum 2 semaines afin d'évaluer quotidiennement la fonctionnalité des cathéters. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes. Les animaux seront hébergés durant les deux semaines de prélèvement dans une salle commune avec box individuel disposant de séparation ouverte favorisant les relations sensorielles (contact visuel, contact olfactif et tactile groin à groin) entre chaque animal tout en évitant d’abimer ou détériorer les cathéters.

Impact sur les animaux

La procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale et avec des conditions d'asepsie stricte. Une fois le cathéter posé les prélèvements de sang et l'entretien des cathéters seront totalement indolores et donc non générateurs de stress. Il n'est pas attendu d'effet indésirable sauf un éventuel risque d'infection en cas d'erreur d'asepsie et/ou de mauvais entretien des cathéters (risque très faible). Pour éviter tout problèmes respiratoires durant l'anesthésie générale, un contrôle permanent sera effectué par un assistant expérimenté et complété par un monitoring respiratoire. Un tapis chauffant est associé durant l'ensemble des actes chirurgicaux afin de maintenir la température corporelle de l'animal. L'association d'antibiotique utilisée sera une spécialité vétérinaire disponible sur le marché et la dose sera conforme à ce qui est indiquée dans la notice de ce médicament, donc sans effet toxique attendu.

Devenir

Le premier porc sera mis à mort lors de la fin de l'intervention chirurgicale, car beaucoup de vaisseaux sanguins ont été cathétérisé, que l’intervention a été longue, sans une complète maitrise de l’asepsie. Les deux autres porcs seront mis à mort à l’issue des 3 semaines d’expérimentation dans des conditions éthiques, et des tissus d’intérêt (muscle, foie reins) pourront être récoltés.

Remplacement

Un entrainement et une formation avec un expérimentateur aguerri à la technique avec échographe a déjà été effectué pour 2 opérateurs, et d'autres entrainements sur des mannequins/fantômes sont prévus pour maintenir le geste de l'échographe lors de la pose de cathéter. Cependant, il est nécessaire de pratiquer cette technique in vivo sur un faible nombre d'animaux afin d'asseoir les gestes techniques et évaluer l'efficacité de cette méthode tout en maintenant et maitrisant les règles sur poste chirurgicale : asepsie, anesthésie et d'analgésie. De plus la maitrise des bandages ne peut se réaliser que sur animaux vivant. Ce contrôle nécessite une supervision des fixations du bandage sans en gêner l'ensemble de ses mouvements à court terme puis long terme par l'augmentation de la masse corporelle de l'animal. La durabilité de l'ensemble de ces gestes doit être contrôler et évaluer à moyen et long terme. La réalisation de ces contrôles servira à la réalisation d'une cinétique plasmatique d'une combinaison d'antibiotique, procédure qui ne peut pas être remplacée par des méthodes in vitro.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux (3 porcs) a été défini pour permettre une manipulation de l'ensemble des opérateurs (4 opérateurs, entre une et 3 veines et ou artères par opérateur). Concernant la cinétique plasmatique, le nombre d'animaux est faible mais complète des données déjà générées. De plus après administration intraveineuse, la variabilité inter-animale est bien moindre que par voie extravasculaire et un nombre suffisant de prélèvements dans le temps seront réalisés. Il n'y aura pas de statistiques réalisées les cinétiques étant descriptives.

Raffinement

Les animaux recevront une pré-anesthésie en intramusculaire puis anesthésie gazeuse initiée avec un masque puis relayée par intubation intratrachéale. Utilisation d'un anesthésique local au niveau du point d'insertion cutané des cathéters. La pose de cathéter sous échographie est très peu invasive et l'ensemble des anesthésiants ont un effet analgésique suffisant pour ce type de procédure. Un anti-inflammatoire sera utilisé en cas de manifestation de douleur de l'animal après la pose des cathéters. Les porcs seront hébergés ensemble lors de la phase d'acclimatation (5-7 jours) puis seront seuls par case (sur caillebotis) après la pose du cathéter afin de limiter les risques d'arrachement. Cependant, les barrières entre cases permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : jouets à mâcher en caoutchouc et jouets à mâcher suspendus (de type disque en caoutchouc, chaine) sur support amovible. Les cathéters seront protégés avec un bandage adéquat qui sera vérifié régulièrement et changé s'il est trop souillé. Un suivi-post anesthésie individuel des animaux sera effectué. Les injections et prises de sang seront indolores grâce à la pose des cathéters. Des sessions d’interactions positives sont régulièrement effectuées lors des prélèvements sanguins par des caresses et grattages, ce qui permet d’améliorer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible utilisée au laboratoire pour les études de cinétique plasmatique. Les porcs auront un stade de 60 jours correspondant à un poid de 20kg à leur arrivée. Les porcs de ce poids sont généralement utilisé dans nos projets de cinétiques. De plus à ce stade, les animaux sont plus facilement manipulables, permettant d’assurer la sécurité des animaux et des opérateurs.

896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement prédisposées à développer des tumeurs du tube digestif, elles reçoivent à six semaines un gavage de bactéries Escherichia coli productrices de colibactine, puis deux prélèvements sanguins, et vivent avec leurs tumeurs jusqu'à la mise à mort au 65e jour. Le porteur attend une baisse d'activité, une perte de poils, une posture voûtée, une anémie visible aux pattes blanches, un amaigrissement, des diarrhées, du sang dans les selles et un prolapsus. À court terme il s'agit de savoir si un acide aminé, la sérine, conditionne l'effet pro-cancérogène de ces bactéries, les régimes appauvris en sérine administrés en prévention à des personnes à risque restant renvoyés au long terme.

Objectifs

Ce projet a pour but de poursuivre les études sur les mécanismes d’action d’une bactérie capable de sécréter une toxine, nommée : « Escherichia coli producteurs de colibactine (CoPEC) », dans la carcinogénèse colorectale. En effet, l’infection par cette bactérie isolée de patients atteints de cancer colorectaux accélère le développement tumoral dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer. Les résultats préliminaires semblent démontrer le rôle essentiel d’un acide aminé (sérine) dans l’activité pro-carcinogène des souches CoPEC. Ainsi, nous proposons premièrement d’évaluer l’effet d’une alimentation déplétée en sérine sur l’effet pro-carcinogène de la souche CoPEC. Ensuite, nous souhaitons également vérifier la spécificité des besoins en sérine de cette souche, en étudiant une souche incapable d’utiliser la sérine. Pour cela, nous évaluerons l’effet de la toxine, la colonisation bactérienne, la perméabilité intestinale et le développement tumoral à un stade précoce et/ou tardif dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus pourraient permettre de conclure sur l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène des CoPEC et de mieux comprendre les mécanismes de l’interaction bactéries/hôte/nutrition sur la carcinogénèse colique. A long terme, les résultats générés par ces recherches devraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant les personnes les plus colonisées par ces bactéries. Ce projet permettra de mettre au point des traitements curatifs afin d’empêcher la bactérie d’utiliser la sérine et ainsi diminuer le développement tumoral. Également, des alimentations déplétées en sérine pourront être administrées en prévention chez les personnes susceptibles de développer un cancer colorectal, ou en curatif chez les patients opérés afin de limiter la réimplantation des CoPEC.

Procédures

Une injection (gavage) sera réalisée à J0, soit lorsque la souris a 6 semaines. Des prélèvements sanguins seront réalisés à J9 et en pré-mortem sous anesthésie gazeuse. Les gestes techniques seront réalisés rapidement en quelques secondes.

Impact sur les animaux

L’expérimentateur contrôlera quotidiennement le comportement général de l’animal durant toute la durée de l’expérimentation (de la naissance à la mise à la mort, soit de J-36 (naissance) à J65 (mise à mort), J0 étant le jour de gavage). Une baisse d’activité, de locomotion, une perte de poil, une posture voutée, une anémie (pattes blanches) et un amaigrissement sont attendus. Au niveau digestif, l’expérimentateur pourra également observer des phases de diarrhée ou de constipation, un hyper toilettage anal ou à l’inverse un orifice souillé, du sang dans les selles et un prolapsus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après la reproduction ou à la fin de l'expérience. A la fin de l'expérience, les animaux sont sacrifiés afin de réaliser des prélèvements tissulaires. Lors des reproductions, seul les animaux d'intérêt sont conservés.

Remplacement

L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il n’est pas possible d’étudier le rôle de la sérine sur les effets pro-carcinogènes des bactéries suite à une infection chronique sur des cellules en culture.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure ou cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire ont mis en évidence une forte variabilité du modèle, de la colonisation bactérienne post gavage et de son maintien au cours du temps. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance du modèle et à une formation interne du personnel à la technique de gavage, le nombre d’animaux par lot a été réduit au minimum. Le nombre de 8 souris par lot permettra donc d’analyser statistiquement les résultats de colonisation bactérienne, de perméabilité intestinale et le développement tumoral observées dans les différents lots. Toutefois, si l’analyse statistique suivant la première manipulation permet de réduire le nombre d’animaux, nous prendrons, bien entendu, ces résultats en compte pour définir l’effectif des manipulations suivantes.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être des animaux, plusieurs mesures spécifiques seront prises. Tout d’abord un suivi renforcé des animaux. L’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau / de nourriture et observera le comportement général de l’animal (activité, locomotion, état du poil, prostration, vocalise, sang, anémie…etc). Cela permettra de repérer d’éventuelle anomalies comportementales et de traiter rapidement tous signes de douleurs par des antalgiques fort, utilisés dans le traitement des douleurs cancéreuses. Enfin, si les douleurs ne sont pas soulagées par les antalgiques, une mise à mort anticipées de l'animale sera réalisée. L'évaluation de la douleur sera réalisée grâce à un système de scooring et le suivi des animaux sera réalisé par une personne formée en interne et désignée compétente au suivi de ce modèle murin prédisposé à développer des tumeurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de superficie adaptée, avec des cabanes pour se cachées et des enrichissements à ronger. Des croquettes seront également mis à disposition dans le fond de la cage et les tétines des biberons allongées si les douleurs empêchent l'animale de grimper sur la grille. Enfin certains animaux pourront être isolés si leur état général le nécessite.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler en modèle murin car la physiologie intestinale reste similaire à celle de l’homme. En effet, le modèle animal APC présente plusieurs avantages pour l’étude du développement tumoral : -La mutation du gène APC est retrouvée dans 80% des cancers colorectaux chez l’homme -Les souris développent spontanément des tumeurs au niveau du tube digestif -Il est représentatif des relations entre cellules tumorales et cellules de l’environnement tumoral -Il s’agit du modèle le plus proche de la physiologie humaine et le plus représentatif de l’interaction entre microbiote et tube digestif. Ainsi, ce modèle nous a déjà permis de conclure de manière satisfaisante sur les questions scientifiques dans un contexte de cancer colorectal. De plus nos animaleries sont adaptées à la prise en charge de ce type d’animaux. Le matériel utilisé est conforme aux règles du bien être animale (cages, enrichissements, température, cycle jour/nuit) et le personnel a suivi une formation adaptée à la gestion et à la prise en charge de ces animaux. L’étude sera réalisée chez les femelles adultes âgées de 6 semaines (20g au gavage). L’objectif est de réaliser l’expérience sur des animaux adultes et suffisamment jeunes puisque la durée totale de l’expérience est estimée à 65 jours post-gavage.

Quatre injections dans le sinus rétro-orbitaire et cinq prélèvements sanguins à la queue par animal, à raison d'une séance par semaine pendant quatre semaines : 165 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque intervention se déroule sous anesthésie profonde, et le porteur indique qu'une réaction pseudo-allergique peut suivre l'injection de l'enzyme, un antihistaminique étant administré 48 heures avant en cas de réaction lors de la première expérience. Le projet compare des formulations d'encapsulation d'une enzyme utilisée contre la maladie de Pompe, dont la majorité des patients traités développent des anticorps qui la dégradent. Le porteur annonce une meilleure prise en charge de ces patients, quand l'étape réellement engagée ici mesure l'immunisation de souris et la distribution du produit dans leur rate et leur foie, prélevés après mise à mort.

Objectifs

L’alpha-glucosidase, une enzyme, est responsable de la dégradation du glycogène en glucose, en particulier au niveau des muscles. Dans le cas de la maladie de Pompe, un déficit de l’enzyme alpha-glucosidase (GAA), entraîne une accumulation de glycogène dans les lysosomes. L'accumulation de glycogène entraîne des conséquences graves dans de nombreux organes, en particulier les muscles et le système nerveux avec l’apparition d’une faiblesse musculaire et des troubles respiratoires. Le principal traitement de la maladie de Pompe se base sur l'administration en intra-veineux de l’alpha-glucosidase, permettant alors la dégradation du glycogène en glucose. Pour autant, ce traitement n’est pas sans complications étant donné que la majorité des patients traités développent des anticorps contre cette enzyme, ce qui entrainent sa dégradation et donc une diminution de l’efficacité de la thérapie. Il existe aujourd’hui des systèmes d’administration de médicaments basés sur l’encapsulation dans une paroi de phospholipides permettant la protection d’un médicament encapsulé contre le système immunitaire, l'amélioration de sa persistance chez l’Homme et la réduction des effets indésirables. Il serait intéressant de développer un tel système d’administration dans le cadre de la maladie de Pompe afin de réduire la résistance au traitement des patients. Ce projet vise donc à évaluer l’activation du système immunitaire par l’enzyme encapsulée ainsi que sa persistance chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les patients qui nécessitent une thérapie basée sur l’injection de l’enzyme alpha-glucosidase dans le traitement de la maladie de Pompe, sont susceptibles de développer une réaction immunitaire face à ce traitement, ce qui le rend à terme moins efficace. Les bénéfices attendus de ce projet sont ; une diminution de l’activation du système immunitaire par le médicament encapsulé et une amélioration de la persistance et de la distribution du médicament chez l’Homme. In fine, ce projet permettra une meilleure prise en charge des patients atteints de la maladie de Pompe.

Procédures

Les animaux seront soumis au total à quatre injections par voie rétro-orbitale ainsi qu'à quatre prélèvements sanguins au niveau de la queue. Ces interventions seront réalisées une fois par semaine sur quatre semaines sur des animaux profondément anesthésiés. Le prélèvement à la queue suivi directement de l'injection en rétro-orbitale ne dépassera pas les 15 minutes. Un prélèvement de sang final sera également réalisé à la fin de la procédure sur animaux profondément anesthésiés. Le prélèvement final n'excédera pas les 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets prévus sur les animaux sont une immunisation des souris à l'enzyme alpha-glucosidase injectée et une diminution de cette immunisation ainsi qu'une meilleur absorption grâce à la nouvelle formulation de l'enzyme. Les effets indésirables attendus pour les deux procédures expérimentales sont : un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire, un saignement au niveau du point de prélèvement ou d’injection. Il peut également survenir un possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement à la queue (durée de 30 secondes avant endormissement). Une réaction pseudo-allergique peut également être attendue suite à l’injection de l’enzyme.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort, car le prélèvement sanguin est terminal et car les organes (rate et foie) doivent être récupérés afin d'analyser la distribution de la nouvelle formulation de l'enzyme.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’activation du système immunitaire par les différentes formulations d’encapsulation de l’enzyme alpha-glucosidase afin de diminuer la réponse immunitaire et d’améliorer l’efficacité du traitement. Ce processus fait intervenir de multiples types cellulaires et tissulaires (cellules immunitaires, cellules musculaires…) il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par de l’in vitro du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus complet.

Réduction

Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 15 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison de moyennes des résultats obtenus pour chaque groupe d’animaux.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Par l’application d’une goutte de collyre sur l’œil après les injections retro-orbitale pour réduire la douleur au réveil • Par traitement des animaux avec un antihistaminique, 48h avant l’injection de l’enzyme en cas de réaction allergique lors de la première expérimentation • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

Puisque nous souhaitons observer les différences de réactions immunitaires en fonction de la formulation de l’enzyme alpha-glucosidase, le recours à l’animal est nécessaire, car l’activation du système immunitaire est un phénomène complexe qui implique plusieurs types cellulaires et tissulaires et faisant intervenir des intercommunications complexes entre les cellules circulantes, les cellules immunitaires, les cellules musculaires et les cellules résidantes des tissus environnants, qui ne peuvent pas être reproduites de façon complète in vitro. Les similarités connues entre le système immunitaire de la souris et de l’homme, et en particulier les cellules impliquées dans les procédés d’immunisation font de la souris un modèle de choix. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères présentant un système immunitaire mature et ne présentant pas encore de vieillissement.

Huit disques de péricarde bovin sont implantés dans les muscles de chaque jeune lapin de huit semaines, et y séjournent deux à trois mois. 144 lapins vont être utilisés sur trois ans, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués par injection intracardiaque pour récupérer les disques. Le porteur signale des douleurs postopératoires dans la zone lombaire et un hébergement individuel qu'il reconnaît comme source de stress. Multiplier les implants par animal est présenté comme une mesure de réduction des effectifs, ce qui revient à concentrer sur chaque lapin ce qui aurait été réparti sur plusieurs.

Objectifs

Un cœur sain bat environ 100 000 fois par jour pour alimenter l’organisme avec un sang riche en oxygène. Le cœur se compose de quatre cavités : 2 oreillettes (droite et gauche) ; deux ventricules (droit et gauche) et de quatre valves. Lorsque les valves cardiaques fonctionnent normalement, elles assurent un écoulement efficace du sang entre les cavités du cœur. En revanche, les valves malades ne peuvent pas s’ouvrir ou se fermer correctement, et finissent par se rigidifier et se calcifier progressivement. Le traitement de choix pour les patients est le remplacement de la valve cardiaque par une valve artificielle mécanique ou par une bioprothèse valvulaire d’origine animale. Les bioprothèses valvulaires d’origine animale sont composées de péricarde bovin ou porcin. La mise au point des techniques pour leur préservation a révolutionné les indications de remplacement valvulaire en clinique humaine. De nombreuses études ont démontré les avantages significatifs des bioprothèses valvulaires par rapport aux prothèses mécaniques, en particulier la diminution du risque de maladie thromboembolique et donc l’absence d’utilisation d’anticoagulants avec une morbidité et une mortalité per-opératoire et post-opératoire moindres. Néanmoins, l’une des limitations principales à l’utilisation des bioprothèses valvulaires, est la survenue plus ou moins tardive de calcifications, c’est l’inconvénient majeur nécessitant un nouveau remplacement valvulaire. L’objectif de ce projet est de modifier les traitements de la bioprothèse valvulaire, afin de diminuer les calcifications qui apparaissent après implantation chez l’homme et de prolonger la durée de leur fonctionnement. Ces nouveaux traitements seront testés et analysés après implantation intramusculaire de péricarde bovin chez les jeunes lapins âgés de 8 semaines. Pour ce projet, 144 jeunes lapins seront nécessaires pour une durée de 3 ans. A l'issue de ce projet, il sera possible de définir le traitement optimal contre la calcification et la dégénérescence des bioprothèses valvulaires.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce travail vont nous permettre d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes de calcification et une meilleure sélection parmi les différents traitements chimiques proposés. A l'issue de ce projet, il sera possible de définir le traitement optimal contre la calcification et la dégénérescence des bioprothèses valvulaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie. Il s'agit d'une implantation intramusculaire de disques de péricarde bovin pendant 2 à 3 mois. La durée de l'intervention est de 10 minutes par lapin. 2) Deux injections intramusculaires pour l'anesthésie et l'analgésie avant la chirurgie d’implantation. 3) Une injection intramusculaire pour l'anesthésie et une injection intracardiaque pour la mise à mort avant la chirurgie d’explantation.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont le stress et les douleurs associés aux injections des anesthésies et potentielles douleurs post-opératoire dans la zone lombaire après la chirurgie. L'hébergement individuel est une source de stress.

Devenir

La mise à mort des lapins avant l’explantation de péricarde est nécessaire pour récupérer les disques afin d'effectuer des tests, dosages et immunohistochimie.

Remplacement

L’étude de la prévention de la calcification des bioprothèses valvulaire nécessite le recours aux animaux. Il n’existe pas de modèle in vitro capable de réunir tous les facteurs biologiques, immunologiques ou mécaniques responsables de la calcification des bioprothèses.

Réduction

La diversité des traitements et des tests nécessite un grand nombre de groupes tests et chaque groupe doit contenir un grand nombre d’échantillons nécessaires pour nos études statistiques. Dans l’intention de réduire le nombre d'animaux au maximum, chaque jeune lapin recevra 8 disques de tissu péricardique. Le nombre des jeunes lapins par groupe a été déterminé afin de pouvoir réaliser une analyse statistique adaptée. Cela permet de comparer les moyennes de calcification de chaque groupe, tout en prenant en compte le fait qu'un même animal puisse avoir plusieurs groupes.

Raffinement

Pour réduire la douleur, souffrance ou angoisse ressenties par les jeunes lapins : notre étude sera effectuée sous anesthésie générale profonde et l’injection intra musculaire d'un analgésique. Les lapins sont hébergés dans des cages (portoirs de 3 cages), avec un accès à l’eau et à la nourriture en granulé sans restriction et dans un milieu d'enrichissement adapté. Durant toute la procédure nous surveillerons les animaux. La surveillance sera quotidienne durant toute la période d’implantation plus la visite hebdomadaire d’un vétérinaire. Des points limites ont été définis et leur atteinte entrainera la mise mort du lapin.

Choix des espèces

Les calcifications observées chez le lapin correspondent à celle observées chez l’homme, ainsi le lapin est le modèle préférentiel pour cette étude. Pour l’implantation en intramusculaires chez le jeune lapin, nous utiliserons de jeunes lapins de 8 semaines ± 1 semaine, à cet âge les processus de calcification sont plus rapides que chez l’animal adulte, ce qui permet d’écourter l’expérimentation

4 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des cellules tumorales injectées dans le poumon après incision de la peau, sous anesthésie générale, les autres portent des tumeurs sous-cutanées, et toutes passent par une irradiation localisée de cinq minutes, réalisée sur animal vigile maintenu en contention un quart d'heure. Le porteur décrit l'irradiation comme indolore et annonce une perte de poids inférieure à 5 % liée au passage des rayons sur l'intestin ou l'œsophage. Le bénéfice avancé, réduire les doses de radiothérapie chez des patients, est renvoyé à un transfert clinique lointain, quand les tumeurs greffées et les mini-chirurgies pulmonaires, elles, sont immédiates.

Objectifs

Le cancer du poumon est l'un des cancers les plus répandus. La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. De nombreuses études précliniques et cliniques montrent que l’efficacité antitumorale de la radiothérapie dépend du système immunitaire et du microenvironnement tumoral de l’hôte. Nous voulons évaluer un nouveau traitement.Nous pensons que la combinaison radiothérapie + traitement spécifique peut s’avérer être très efficace. Par ailleurs, de nombreuses données précliniques et cliniques suggèrent que la combinaison de radiothérapie + traitement classique est prometteuse. Toutefois, les données cliniques en faveur sont encore parcellaires et de nombreux modèles murins restent résistants à ce traitement. Nous évaluerons donc la triple combinaison radiothérapie + traitement classique+ traitement spécifique pour voir si l’ajout ce traitement spécifique peut sensibiliser les tumeurs au traitement radiothérapie + traitement classique. Il a été observé que la radiothérapie pouvait induire des effets antitumoraux « abscopaux », c’est-à-dire en dehors du champ d’irradiation. Ainsi, l’irradiation d’une tumeur primaire peut entraîner un effet antitumoral sur une tumeur secondaire ou une métastase placée hors du champ d’irradiation. Cet effet « abscopal » est augmenté par les modulateurs de l'immunité. Nous testerons la triple combinaison thérapeutique dans un contexte de tumeurs multisites (plusieurs tumeurs portées par le même hôte) pour évaluer si le traitement spécifique peut augmenter l’effet abscopal.

Bénéfices attendus

50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de minimiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. L’amélioration de la réponse tumorale à l’irradiation pourrait permettre de réduire les doses d’irradiation et ainsi les effets secondaires sans affecter l’efficacité du traitement anti tumoral. Les progrès en immunologie ont révolutionné le pronostic de maladies métastatiques autrefois incurables et de nombreuses études montrent des combinaisons prometteuses entre radiothérapie et immunothérapie chez l’humain. L’effet à distance induit par l’irradiation qui provient du système immunitaire est également un thème de recherche actif en radiothérapie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender les interactions radiothérapie/immunité mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de cette combinaison lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.

Procédures

Les souris pourront avoir des injections (1 à 4) sous anesthésie locale, durée 1 minute maximum. Injection de cellules tumorales dans le poumon après incision de la peau, sous anesthésie générale, n=1, durée 1 minute. Irradiation localisée sur souris vigiles, durée 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée. Elle a lieu sans anesthésie pour les tumeurs sous-cutanées. Les souris sont placées dans un système de contention pendant une quinzaine de minutes ce qui peut générer du stress et de l’anxiété légers et transitoires. Elle a lieu sous anesthésie gazeuse pour l’irradiation du thorax dans le cas des tumeurs pulmonaires. L’irradiation en elle-même est indolore et, comme elle est localisée et à dose raisonnable, elle n’induit pas une perte de poids conséquente (perte de poids de moins de 5% due à l’irradiation d’une partie des intestins ou de l’œsophage qui sont proches de la tumeur). L’administration traitements peut engendrer un stress transitoire léger. Les tumeurs peuvent gêner la souris modérement. L Pour les prélèvements de sang, les souris seront d’abord anesthésiées ce qui peut générer un stress léger et transitoire. La principale nuisance réside dans l’implantation en orthotopique des cellules cancéreuses pulmonaires qui se fait au cours d’une mini-chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de sang et tumeurs pour analyses ultérieures, ou pour respecter les points limites dans le cadre des études d'efficacité.

Remplacement

Le recours à des modèles animaux nous permettra d’étudier les effets d’une nouvelle combinaison thérapeutique dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et le système immunitaire. Ceci permet donc l’interaction des cellules tumorales avec leur environnement naturel. Ces interactions jouant un grand rôle dans les effets de la radiothérapie, il apparaît donc indispensable d’avoir une évaluation sur un modèle animal pour déterminer exactement les effets de ces immunomodulateurs avant d’envisager un passage en thérapie humaine. Aucun modèle in vitro ne permet actuellement d’obtenir la complexité présente dans un animal vivant (immunité, vascularisation, organo-dépendance,…).

Réduction

Uune analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives de croissance tumorale. L’analyse de la croissance tumorale se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité des différences obtenues pour les différents groupes, suivie d’un test de comparaisons multiples pour tester la significativité du traitement triple combinaison par rapport aux doubles combinaisons. La dernière procédure ne sera menée que si les résultats des procédures précédentes sont prometteurs.

Raffinement

Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections, un anesthésique local sera utilisé. La mise en contention pour l’irradiation sera réalisée par une personne entraînée qui effectue déjà geste depuis des années au sein du laboratoire pour réduire le temps de la contention et le stress induit. La chirurgie pour l’implantation du tumeur dans le poumon se fera sous anesthésie gazeuse, également par une personne très entraînée et un analgésique sera administré avant et après le geste opératoire pour limiter au maximum la douleur induite. Les prélèvements de sang se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids, même si elle est non attendue dans ce projet. Un complément alimentaire énergétique sera donné en cas de perte de poids. De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris C57BL/6 ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines. Souris après sevrage.

Après une période d'acclimatation, chacun des six macaques à longue queue reçoit par voie intraveineuse, à quatre reprises espacées d'une semaine, des doses croissantes de molécules destinées à activer les récepteurs Toll-like. Des prélèvements de sang jalonnent le protocole, complétés par des prélèvements de nœuds lymphatiques sous anesthésie, après une mise à jeun pouvant atteindre seize heures. Le porteur mentionne des hématomes, des œdèmes, des douleurs au site de prélèvement et, plus rarement, une réouverture de plaie ou une infection, le tout classé d'un niveau de souffrance modéré. Les six animaux sont tués à la fin pour récolter leurs organes et mesurer la distribution et la toxicité des trois candidats-médicaments.

Objectifs

Cette étude permettra d’évaluer la toxicité aigue de trois molécules capables d’activer les récepteurs « Toll-like » (TLR) des cellules immunitaires administrés par voie intraveineuse à dose croissante chez le singe cynomolgus. Ce projet s'incrit dans le cadre du développement de plusieurs candidats médicaments novateurs capables d’imiter les acides nucléiques d'un rétrovirus afin d’activer la stimulation des cellules immunitaires du patients. Cette activation va permettre d’obtenir une réponse systémique des cellules anti-tumorales. À terme, l’objectif est de combiner l'immunothérapie utilisée contre les cancers avec une ou plusieurs de ce molécules améliorant ainsi la réponse des patient contre le cancer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché de nouveaux médicaments humain pour des indications tels que les cancers de la peau, de l'estomac, du colon etc… De plus, ces études génèrent des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles de futures études règlementaires sur le macaque. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux macaques.

Procédures

Avant tout acte et dans le but de diminuer leur stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation. Ils recevront à quatre reprises un candidat médicament à doses croissante par voie intra veineuse avec un temps de repos d’une semaine entre chaque administration. Des prélèvements de sang, et un suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) seront réalisés à intervalles de temps définis afin d'étudier l’effet du candidat médicament aux différentes doses. Les volumes prélevés et administrés aux animaux tout au long du projet ainsi que les temps de repos accordés entre ces différents actes respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Les prélèvements de nœuds lymphatiques seront réalisés sous anesthésie et courverture analgésique après une période de mise à jeun. Les administrations des candidats médicaments et les prélèvements de sang sont moins traumatisants pour les animaux qu'une anesthésie et seront donc réalisés sur animal vigile. Une sédation pourra être envisagée en cas de besoin.

Impact sur les animaux

Des réactions locales au niveau des sites d'administration peuvent éventuellement apparaître les jours suivant les administrations répétées (hématome, œdème léger, etc). La réalisation de prélèvements sanguins pourra également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction. Les prélèvements de nœuds lymphatiques peuvent provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (maximum 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la distribution et la toxicité des candicats médicaments.

Remplacement

Les études de toxicité in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la toxicité de la molécule en fonction de la dose administrée et affine la connaissance des caractéristiques de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les modèles animaux permettent dans ce cas d'objectiver l'apparition des signes cliniques et donc de mettre en évidence une éventuelle toxicité de la molécule en test. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex: in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux inclut dans cette étude sera réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. 3 lots de 2 animaux seront utilisés. Ce nombre permettra d’obtenir des résultats fiables, interprétables et transposables.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe dans des volières respectant les recommandations de la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l'espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend: 1) Des enrichissements structuraux (perchoirs, barres transversales, grillages...) ; 2) De la litière pour leur permettre de fourrager ; 3) Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine ; 4) Des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; 5) De la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de plusieurs semaines sera mise en place avant le début de l'étude pour permettre aux animaux de se familiariser avec leur environnement. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associées à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, de température rectale...). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou que son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le macaque cynomolgus (macaca fascicularis) a été retenu dans le cadre de ce projet. De plus, ces médicaments ont pour objectif de stimuler des cellules agonistes des récepteurs TLR. Or, contrairement aux rongeurs, les primates partagent de nombreuses similitudes avec l’Homme en termes d’expression de ces récepteurs, de cinétique de réponse, de voie de signalisation en aval ainsi que d’activation du complément. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de ces candidats médicaments. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.