Procédures modérées

Pour déterminer la dose d'un médicament vétérinaire, la spironolactone, 15 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une hormone en intramusculaire puis le produit par voie orale, subit deux ponctions de vessie à l'aiguille sur animal éveillé à six heures d'intervalle, reste à jeun douze heures et passe vingt-quatre heures seul dans un box divisé en deux. Le porteur reconnaît que la contention et les ponctions peuvent provoquer du stress et de la douleur, et indique que les chats ont été entraînés deux semaines à s'y soumettre. Aucun n'est tué à l'issue, tous restant disponibles, après un temps de repos, pour une autre procédure expérimentale.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de la spironolactone à trois doses différentes 0.6-3-et 6 mg/kg et de mesurer l'effet de ces doses sur le modèle d'excés de minéralocorticoïdes chez le chat. Ce modèle se traduit par un désordre dans les électrolytes sodium /potassium présents dans des échantillons d'urines aprés une administration d'aldostérone. Ce désordre d'électrolytes dans les échantillons d'urine sont également présents dans les pathologies cardiaques comme les cardiomyopathies. L'objectif est donc de montrer quelle est la dose de spironolactone qui convient le mieux pour retrouver le niveau basal au niveau des électrolytes sodium/ potassium avant l'administration d'aldostérone chez le chat.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de pouvoir démontrer quelle est la meilleure dose de spironolactone à administrer (faible, moyenne ou forte dose) pour pouvoir retourner au niveau basal sur le modèle d'excès en minéralocorticoïdes chez le chat. Cela permettra de conduire des études de pharmacocinétique et de pharmacodynamie dans le traitement de certaines maladies cardiaques chez le chat.

Procédures

Les nuisances ou effets indésirables attendus: - Les animaux seront hébergés en conditions individuelles pendant une durée d'environ 24 heures. Alimentation et recueils d'urine par miction spontanée en condition individuelle. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. - Les animaux auront 2 prélèvements d'urine par cystocentèse espacés de 6h. Ces prélèvements se feront sur animal vigile, par un vétérinaire expert. Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute. Les animaux auront un entraînement à la contention pendant au moins deux semaines avant le début de ce projet. - Les animaux seront mis à jeun 12h avant la première cystocentèse. Distribution d'1/3 de la ration alimentaire 1h avant et le restant distribué 6h aprés. Les animaux auront également un entraînement de 2 semaines avant le début de ce projet. Administrations intramusculaire et orale : Soit 2 administrations au maximum par animal et par période. Durée d'une administration de l'ordre de la minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus : - Les animaux seront hébergés en conditions individuelles pendant une durée de 24 heures au maximum. Cela peut engendrer un stress pour l'animal. - Deux recueils d'urine par cystocentèse échoguidée seront réalisés par animal : cela peut engendrer du stress pour l'animal liée à la contention, peut être aussi de la douleur. Les animaux seront soumis à l'administration d'une hormone, il s'agit d'une administration intramusculaire. La contention manuelle de l'animal peut engendrer un stress et peut être une gène au niveau du site d'injection. La solution à trois concentrations différentes sera administrée par voie orale, la contention pourra également engendrée un stress pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure. A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de déterminer la meilleure dose de spironolactone qui permettra de revenir au niveau basal aprés un excés de minéralocorticoïdes chez le chat. Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de mimer les désordres d'électrolytes dans l'excrétion urinaire il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble.

Réduction

D'un point de vue statistique et pour avoir des résultats scientifiques interprétables , 3 animaux par groupe est le nombre d'animaux minimal pour conduire des analyses statistiques. D'un point de vue scientifique et réglementaire il est necessaire d'avoir 5 groupes d'animaux, un groupe animaux contrôle négatif, un groupe contôle positif, puis une faible, moyenne et forte dose pour la spironolactone. Pas de test statistique réalisé au préalable

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe de 2 ou 3 pendant la periode d'acclimatation de 14 jours. Puis les animaux seront en condition d'hébergement individuel aprés chaque administration pour chaque période pour une durée maximale de 24h. L'herbergement en individuel se fait dans le même box, seule une séparation est placée pour séparer le box en 2. Durant cette période les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin, corde) sera présent dans chaque box autant que possible. Les animaux devront manger 1/3 de la ration alimentaire journalière dans l'heure qui précède la cystocyntèse. Les animaux auront un entraînement durant les 2 semaines précédentes. Un entraînement des animaux est également prévu pour la contention, pour faire les prélèvements d'urine par cystocentèse. L'entraînement se fera durant les 2 semaines précédentes. Les prélèvements d'urine par cystocentèse seront échoguidés et réalisés via l'utilisation d'un doggy relax (gouttière en mousse). Si un animal présente une douleur au moment du recueil d’urine par cystocentèse, une douleur abdominale, ou un signe d’inconfort alors l’animal sera pris en charge par les vétérinaires du site. Les animaux seront observés a minima quotidiennement. Les analgésiques, anesthésiques, anti inflammatoires, antibiotiques sont à disposition des vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Le chat est l’espèce cible pour ce produit vétérinaire Pour ce projet il est nécessaire d'avoir des chats adultes pour avoir des reins matures et fonctionnels.

Rendus migraineux par une injection quotidienne pendant quatre jours, puis soumis au test de Von Frey qui mesure leur réaction à une stimulation, une minute toutes les quinze minutes pendant deux heures, 400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le cinquième jour, une injection locale et deux injections sous-cutanées leur sont administrées sous anesthésie générale. L'objectif tient en peu de choses, le porteur indiquant que l'activité antimigraineuse de la molécule est déjà établie et cherchant seulement à comparer les voies d'administration et une dose plus faible. Tous les rats sont tués à l'issue, le RNT justifiant leur mort par une "impossibilité de récupérer les animaux du fait des procédures réalisées", sans dire lesquelles.

Objectifs

Nous savons que la molécule d'intérêt a bien une activité dite antimigraineuse. Le but de ce projet est d'étudier l'amélioration de la douleur dans un modèle de migraine, selon différentes voies d’administration de la molécule d'intérêt et de tester l’effet de cette molécule à une dose plus faible.

Bénéfices attendus

A moyen terme, selon les résultats obtenus, ce projet nous permettra de mieux connaitre le mécanisme d'action de la molécule d'intérêt et proposer des cibles thérapeutiques avec des effets secondaires limités. Dans le contexte de ce projet, une diminution de l'effet antimigraineux après l'administration centrale indiquera que la majorité de l'effet antimigraineux de ces agonistes est dûe à une action sur les récepteurs delta opioïdes localisés en périphérie, notamment dans le ganglion trigéminale. Il serait donc accessible à des molécules qui ne passent pas la barrière hémato-encéphalique ce que permettrait d'avoir la même efficacité et moins d'effets secondaires.

Procédures

Les interventions dans ce projet sont prévues sur une durée maximale de 5 jours. Ce sont des injections (intrapéritonéales i.p.) sur des animaux vigiles (maximum 5 injections). Les premiers 4 jours de l'induction du modèle de migraine chronique, chaque animal reçoit au maximum une injection i.p. par jour (durée d’intervention : 1min). Au 5ème jour de l'induction de la migraine chronique ou le premier jour de l'induction de la migraine aigue, une injection locale et/ou deux injections sous-cutanées seront réalisées sous anesthésie générale. Dans le cas du test comportemental de Von Frey, nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum conformément aux règles éthiques éditées par l'International Association for the Study of Pain (IASP). L’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements (intervention de 1 minute par rat, toutes les 15 minutes pendant 120 min, maximum).

Impact sur les animaux

Le modèle de migraine, que ce soit en aigu ou en chronique, ne montre pas d'effets indésirables sur les animaux autre que le développement d'une douleur modérée majoritairement faciale. L'injection centrale (intra-cisternale) ou systémique (sous-cutanée ou intra-veineuse) de la molécule d'intérêt est réalisée sous anesthésie. L'administration de cette molécule peut produire une augmentation transitoire de la mobilité.

Devenir

Impossibilité de récupérer les animaux du fait des procédures réalisées.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet, il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Il n'existe dans la littérature aucune méthode alternative (in vitro ou in silico) pouvant répondre à l'efficacité d'un produit à potentiel thérapeutique anti-migraineux. Un animal entier avec un système nerveux intégré est un préalable à une étude pertinente dans le domaine de la douleur. Une méthode in vitro ne pourrait rendre compte de la douleur car elle supprimerait de nombreux paramètres (régulations...) et rendrait le résultat réducteur voir inadapté. Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l'effet d'une molécule sur le seuil nociceptif. Les études in silico constituent dans le domaine de la migraine une étape encore trop primaire aujourd'hui.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum (n=10/groupe/sexe). Les animaux seront hébergés collectivement (au moins 2 par cage), avec de l'enrichissement, afin d'éviter le stress. Pas de groupe témoin pour le modèle de migraine (réutilisation des données précèdentes) ni de groupe véhicule pour l'administration sous-cutanée car il a déja été réalisé dans l'étude précèdente. Le nombre d'animaux par groupe est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. D’après les données du laboratoire nous prévoyons une perte maximum 15 à 20% (complexité de la technique d'admnistration, exclusion après la phase d'habituation, rats non-répondeurs à l'ISDN). L’ensemble des données sera analysé par une analyse de variance à 2 ou 3 voies (effet douleur et/ou traitement et/ou sexe) en mesures répétées (ou non) et suivi d'un test post-hoc.

Raffinement

Pendant sept jours, les rats seront acclimatés à l’animalerie. Les conditions d'hébergement sont standard et enrichies à l'aide de rouleaux en carton permettant aux animaux de se cacher. Les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les expériences peuvent être interrompues si un point limite est atteint (mise à mort).

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Adultes (6-8 semaines) pour comparaison avec les autres données de la littérature.

1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une greffe de cellules tumorales, des injections de vecteurs viraux dans la tumeur et deux prélèvements de sang sous anesthésie, la taille de la tumeur étant mesurée au pied à coulisse sur animal éveillé. Le porteur reconnaît que les cellules injectées peuvent former des métastases, entraîner une perte de poids importante et dégrader l'état général, et que les vecteurs peuvent déclencher une inflammation générale. Sur le remplacement, il affirme que seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration entre cellules immunitaires et cellules tumorales, et qu'une nouvelle approche thérapeutique "ne peut se faire que chez l'animal".

Objectifs

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, en témoigne le succès des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients ayant ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie beaucoup selon les cancers. Alors que les mécanismes de résistance primaires et secondaires ont été identifiés au cours des dernières années, il apparait que pour les tumeurs faiblement immunogènes et/ou avec un faible infiltrat immunitaire, de nouvelles stratégies doivent être développées afin de stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. On sait que l’efficacité d’une réponse inflammatoire dépend de la qualité et de la quantité de médiateurs inflammatoires tels que cytokines et chimiokines produites dans le microenvironnement tumoral (MET). Dans ce contexte, les vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ciblant les cellules tumorales et/ou immunitaires semblent un outil idéalement adapté à des approches de vaccination/immunothérapie. L'objectif du projet est d’utiliser de nouveaux AAV codant pour des cytokines d’intérêt afin de stimuler les réponses immunitaires dirigées contre la tumeur. Nous avons développé des AAV codant pour l’une des 4 cytokines murines suivantes : IL-12sc (protéine de fusion entre les sous-unités IL-12p40 et IL-12p35) qui module l’activité des lymphocytes T et cellules NK, IFN-α ayant des activités anti-tumorales, GM-CSF (facteur stimulant granulocytes et macrophages) et IL-15sushi (protéine de fusion entre le domaine sushi de la chaine α du récepteur à l’IL-15 avec la cytokine IL-15) dont le rôle anti-tumoral est établi. Nous pensons que l’injection intra-tumorale des AAV codant pour une cytokine donnée ou plusieurs (combinaison d’AAV codant pour des cytokines différentes ou un AAV codant pour plusieurs cytokines à la fois) entrainera une production locale et aiguë de ces cytokines favorisant le recrutement et l’activation des cellules immunitaires dans le MET, ce qui permettra de générer une réponse immunitaire anti-tumorale efficace permettant une diminution de la croissance tumorale, voire un rejet de la tumeur. Nous envisageons également de combiner cette stratégie thérapeutique avec 1) les immunothérapies utilisant des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (CTLA-4 et PD-1/PDL1) et 2) avec des AAV codant pour des protéines capables d’induire une mort cellulaire immunogénique (ou mort cellulaire inflammatoire capable d'induire la stimulation du système immunitaire).

Bénéfices attendus

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, comme en témoigne le succès des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients bénéficiant de ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie considérablement entre les différents cancers. De nouvelles thérapies innovantes ont donc besoin d'être mise en place. Pour ce faire, nous attendons que l'injection intra-tumorale des AAV codant pour les différentes cytokines (IL-12sc, IFN-α, GM-CSF et IL-15sushi), induise une réponse immunitaire permettant un rejet de la croissance tumorale et l'augmentation de la survie des animaux traités. De plus, l'utilisation de nos vecteurs codant pour ces différentes cytokines seule, mais aussi en combinaison avec d’autres immunothérapies déjà bien connues (tels qu’un anti-PD1, anti PD-L1 ou anti-CTLA-4) et/ou en cours de développement dans le laboratoire (l’utilisation d’AAV codant pour des protéines capables d’induire une mort cellulaire immunogénique et de permettre l’initiation d’une réponse immunitaire antitumorale), aura pour but : (1) d’apporter des effets à long terme chez nos animaux avec la mise en place d'une réponse immunitaire amplifiée et (2) de permettre le contrôle voire le rejet à long terme des différents modèles tumoraux. Les vecteurs AAVs possèdent de nombreux avantages et ont déjà été approuvés en clinique en Europe et aux Etats-Unis. Il est donc envisageable de produire ces vecteurs pour une utilisation chez l'homme, si nos stratégies se montrent convaincantes.

Procédures

- Prélevements de sang sur souris anesthésiées : 2 prélevements par souris à 10 jours d'intervalle, 15 secondes - Injections de cellules tumorales et de vecteurs AAV sur souris anesthésiées, 10 secondes - Mesures de la taille de la tumeur au pied à coulisse sur souris vigile, 45 secondes

Impact sur les animaux

Une fois injectées, les cellules tumorales peuvent former des tumeurs secondaires (métastases) dans différents tissus causant de la souffrance animale. Pour limiter cet écueil, le nombre des cellules tumorales à injecter est bien documenté dans la littérature, minimisant de ce fait ce phénomène. Les modèles tumoraux peuvent aussi induire une perte de poids importante et un mauvais état global de l'animal. De plus, l'injection d'AAV pourrait induire une inflammation systémique si les différents AAV vont transduire différents organes ou tissus de l'animal. Cependant, nous limitons cet effet secondaire par une injection intra-tumorale avec un volume d'injection limité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever le sang et des organes pour analyse. Aucun animal ne peut donc être replacé, adopté ou réutilisé.

Remplacement

Seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration qui existe entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique ne peut se faire que chez l’animal. Dans ce cadre la souris est utilisée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée pour optimiser les protocoles expérimentaux et s’assurer de la non-obtention de résultats déjà publiés. Le nombre d’animaux utilisés sera déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée qui peut être limitée en se basant sur une grille d’observation visant à définir des points limites à partir desquels l’expérience sera arrêtée immédiatement. Si les animaux présentent des signes de douleur, de la buprénorphine sera administrée (0,05 mg/kg). Un enrichissement est également apporté par des abris de cellulose et des carrés de coton vierge.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris permet aussi l’utilisation de modèle transgénique, des modèles de Knock-Out qui peuvent être intéressants dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le cancer. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (animaux âgés entre 6 et 8 semaines au début du protocole) afin que le système immunitaire soit mature au moment de l’inoculation de la tumeur et de l’injection intra-tumorale des différents AAV.

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune enchaînant plusieurs protocoles métaboliques pour limiter les effectifs. Le régime riche en graisses démarre à cinq semaines et dure douze semaines, avec deux prises de sang, un test de tolérance au glucose de deux heures ponctué de sept mesures de glycémie, un test d'insuline d'une heure, quatre jours d'injections quotidiennes d'habituation avant l'administration de l'hormone de la faim, puis une injection de leptine. Un jeûne de vingt-quatre heures précède le test de réalimentation, jeûne que le porteur déclare sans danger, et les souris isolées en cage individuelle disposent de parois transparentes pour voir leurs congénères. Le cerveau est prélevé après une perfusion intracardiaque, au bénéfice d'une hypothèse sur le rôle d'une protéine kinase dans la régulation de l'appétit, dont les retombées annoncées contre l'obésité et le diabète restent au conditionnel.

Objectifs

Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel autour d'une constante. Une dérégulation du système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont fortement associées comme le diabète. Au laboratoire, nous étudions le développement de l'obésité et ses altérations métaboliques induits par le stress cellulaire. Nous avons ainsi mis en évidence une protéine qui compromet la fonction des cellules pancréatiques mais qui induit également l'obésité et la résistance à l'insuline. Cet effet est très probablement dû à une diminution de la prise de poids dans des conditions hypercaloriques. De manière intéressante, cette protéine n'est pas induite dans les tissus périphériques (foie, pancréas, tissue adipeux) mais elle est fortement exprimée dans le cerveau, y compris dans l'hypothalamus, le centre de régulation de l'appétit. Ainsi, notre objectif est de déterminer le rôle particulier de de cette protéine dans la régulation de la balance énergétique par le système nerveux central. Dans le cadre de ce projet, nous étudierons un modèle de souris dans lequel le gène codant pour cette protéine est invalidé dans tous les tissus de l'animal. Si nous observons un rôle de cette protéine dans le contrôle de la balance énergétique nous affinerons alors notre étude en invalidant cette protéine spécifiquement dans les neurones responsables de la régulation de l'appétit et de la satiété.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de type 2 en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés ne cesse d'augmenter et la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète est déjà présent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du Diabète de type 2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'une protéine kinase dans la régulation neuronale de la prise alimentaire. Cette étude est pertinente et innovante pour plusieurs raisons. Cette protéine joue un rôle essentiel dans la sécrétion d'insuline et mais sa fonction dans l'homéostasie énergétique reste inconnue. Comme le contrôle de la prise alimentaire est très complexe, les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage sa fonction dans la prise alimentaire et le gain de poids. Cette étude nous permettra de déterminer si cette protéine kinase est une nouvelle cible thérapeutique dans l’obésité.

Procédures

2 prélèvements sanguins (2 minutes) au début et à la fin du régime standard ou riche en gras (aux âges de 5,17 semaines) seront réalisés. Pour le test de tolérance au glucose, la durée de la procédure est de 2 heures. Un bolus de glucose est injecté par voie intrapéritonale (15 secondes). La glycémie sera évaluée (10 secondes) aux temps 0', 15', 30', 45', 60', 90', 120'. Pour le test de sensibilité à l'insuline, la durée de la procédure est de 1 heure. Une injection intrapéritonéale (15 secondes) d'insuline est effectuée. La glycémie sera évaluée (10 secondes) aux temps 0', 15', 30', 45', 60'. Concernant le test de sensibilité à l'hormone de la faim, les animaux reçoivent une injection intrapéritonéale (15 secondes) de liquide physiologique chaque jour pendant 4 jours (habituation). La prise alimentaire est mesurée en réponse à un bolus d'hormone de la faim (15 secondes). Pour le test de sensibilité à l'hormone de la satiété, les animaux reçoivent une première injection de liquide physiologique (15 secondes) puis le 2ème jour les souris reçoivent un bolus de leptine (15 secondes) afin de mesurer la réponse alimentaire. À la fin du phénotypage métabolique, les animaux préalablement anesthésiés sont perfusés en intracardiaque.

Impact sur les animaux

La procédure pour tester la sensibilité à l'hormone de la faim et l'hormone de la satiété nécessitent l'injection quotidienne de liquide physiologique afin d'habituer les souris avant le jour du test. Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Cette durée de jeûne ne met pas en danger l'animal. Une diète riche en gras pour créer un environnement obésogène sera mise en place, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire et la mesure de la dépense énergétique nécessitent que les souris soient individualisées dans les cages. Ces cages individuelles sont transparentes afin que les animaux puissent se voir entre eux, mais aussi se sentir et s'entendre mutuellement. Le test de sensibilité à l'hormone hypoglycémiante peut provoquer une hypoglycémie chez la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

Toutes nos données publiées convergent vers une fonction de cette protéine kinase dans l'homéostasie énergétique. Pour tester nos hypothèses, nous avons maintenant besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 380 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées avec les mêmes cohortes de souris. Les différences de paramètres métaboliques attendues peuvent être modérées. Pour toutes cette raisons, le nombre d'animaux a éte déterminé en prenant en compte ces difficultés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement de certains animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. L’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifées dans lesquelle le gène codant pour la protéine d'intérêt est invalidé. Les animaux seront soumis à une diète riche graisse dès l'âge de 5 semaines et pour une durée de 12 semaines, âge auquel les strucutres cérébrales sont développées et fonctionnelles mais surtout âge auquel le régime riche en graisse est le plus efficace. Le phénotypage métabolique se terminera à l'âge de 23 semaines.

Trente à quarante-cinq minutes de chirurgie crânienne par animal, pour une injection dans le cerveau doublée d'une injection dans un vaisseau : 200 souris vont être utilisées, toutes tuées trois semaines plus tard, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que l'injection intracérébrale provoque une douleur et une perte de poids pouvant durer sept jours. Il s'agit de caractériser les astrocytes du subiculum, une région du cerveau liée à la mémoire, dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Les souris utilisées sont transgéniques, examinées à trois ou quatre mois avant les symptômes puis à sept ou huit mois, le porteur écartant les organismes plus simples au motif que leurs cellules gliales ressemblent aux astrocytes sans leur être identiques.

Objectifs

Notre cerveau encode, stocke et récupère nos souvenirs. Non seulement l'apprentissage et la mémoire sont indispensables pour l'interaction d'un individu avec l’environnement, mais ce sont aussi des processus cérébraux fondamentaux susceptibles d’être modifiés dans un grand nombre de maladies du cerveau, et donc d’altérer fortement la qualité de vie des personnes qui en souffrent. C’est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre les neurones et différentes cellulaire partenaires, dont les astrocytes. Nous faisons le constat que la contribution des astrocytes dans une région du cerveau impliquée dans la mémoire reste aujourd’hui totalement inexplorée que ce soit en conditions physiologiques mais également dans la maladie d’Alzheimer (MA). Nous proposons de caractériser les astrocytes de cette région et leur implication dans un modèle murin de la MA. Notre objectif à terme est de dégager de nouvelles pistes thérapeutiques pour la maladie d’Alzheimer et les démences en général.

Bénéfices attendus

Le projet a pour ambition de fournir de nouvelles connaissances sur la maladie d’Alzheimer et en particulier sur l’importance des interactions entre les neurones et les astrocytes. En identifiant ces mécanismes dans une région encore peu étudiée du cerveau, ce projet permettra d’avancer sur la compréhension de ces cellules en particulier sur l’idée qu’elles constituent une population hétérogène. Ces nouvelles connaissances collectées au cours de ce projet seront directement exploitées dans le domaine des pathologies cérébrales comme la maladie d’Alzheimer. Manipuler ces cellules pour les rendre plus efficaces à soutenir l’activité des neurones apparaît ainsi comme une stratégie thérapeutique alternative potentielle.

Procédures

Chaque souris recevra une injection intracérébrale ainsi qu’une injection intravasculaire sous anesthésie et analgésie (30-45 min de chirurgie par souris). Trois semaines après, ces souris seront mises à mort pour analyse.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les souris utilisées dans ce protocole sont le stress lié à la contention lors de l’injection d’analgésique ainsi que la douleur et la perte de poids qui durent maximum 7 jours, induite par l’injection intra-cérébrale.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyse des tissus.

Remplacement

Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones et différentes cellules partenaires, dont les astrocytes. Ces cellules peuvent être étudiées in vitro à partir de cellules embryonnaires mais pour avancer sur le fonctionnement du cerveau adulte et sur l’importance des interactions métaboliques entre les neurones et les astrocytes, il est indispensable de passer à un modèle animal car ces interactions cellulaires, vasculaires et métaboliques ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico. Ces modèles animaux, en particulier souris, permettent ainsi d’étudier les neurones et les astrocytes dans leur environnement natif, en interaction avec le système vasculaire. De plus, il existe des souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA) qui possèdent des mutations génétiques impliquées dans les formes familiales de la MA et reproduisent de nombreux symptômes de la MA. Ces souris modèles ont l’avantage de reproduire certains symptômes cliniques caractéristiques de la MA (ex. déficits mnésiques, anxiété). Au final, seule une approche sur un mammifère modèle possédant un cerveau complexe et exprimant des comportements sophistiqués peut nous permettre d’identifier le rôle des interactions métaboliques entre les astrocytes et les neurones, avec l’objectif à moyen terme de les cibler par des stratégies thérapeutiques adaptées.

Réduction

Le projet prévoit au maximum 200 souris nées dans notre élevage ou achetées chez un fournisseur agréé. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux est réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liés aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. En particulier le maintien des souris sur une couverture thermostatée jusqu’à leurs premiers mouvements puis en chambre thermostatée jusqu’à leur réveil complet post-chirurgie permet de réduire la mortalité péri-opératoire des souris.

Choix des espèces

Ce projet vise à étudier les interactions entre neurones et astrocytes ; les organismes modèles simples possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau des mammifères. Les souris transgéniques permettent d’étudier les interactions neurones-astrocytes dans le contexte génétique de la maladie d’Alzheimer. Le présent projet a pour but d'étudier les cellules gliales chez l’animal adulte et son altération au cours du vieillissement pathologique. Les animaux étudiés seront donc des animaux au stade pré-symptomatique (3-4 mois), et des animaux plus âgés (7-8 mois) correspondant aux phases symptomatiques de la maladie d’Alzheimer.

Irradiées sur tout le corps à 2 Gy, 166 souris au système immunitaire déficient reçoivent des cellules leucémiques humaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent sans anesthésie une ou deux injections dans la veine, une injection dans l'abdomen chaque semaine et, pour 130 d'entre elles, trois prises de sang, puis sont toutes tuées au plus tard 80 jours après les injections, plus tôt si un point limite est atteint. L'équipe compare deux types de lymphocytes équipés d'un récepteur qui cible la tumeur, les CAR-iNKT et les CAR-T, contre la leucémie aiguë myéloïde. Les effets néfastes déclarés se limitent à la piqûre, présentée comme une douleur légère de courte durée, et à la leucémie, qui réduit l'activité des souris, les fait maigrir et peut former de petites tumeurs dans l'abdomen. L'irradiation n'y figure pas.

Objectifs

Ce projet porte sur l'utilisation des lymphocytes T natural killer invariant (iNKT), des cellules immunitaires capables de cibler et de détruire naturellement les cellules cancéreuses associées à la leucémie. En ajoutant une molécule ciblant la tumeur (le CAR) aux iNKT, on leur confère une meilleure capacité à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses et à s'activer plus efficacement après le contact avec celles-ci. Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde, où la greffe de moelle est le seul traitement curatif, mais malheureusement inaccessible à tous les patients, les approches de thérapie génique impliquant des cellules CAR sont en développement. Les premières études chez l'homme ont montré des réponses prometteuses mais de courte durée, nécessitant une optimisation. Une alternative envisagée est l'utilisation de cellules immunitaires moins susceptibles de s'épuiser dans le temps. Les lymphocytes iNKT se présentent comme des candidats potentiels dans ce contexte, offrant ainsi une piste intéressante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie.

Bénéfices attendus

Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), les thérapies génétiques sont toujours en développement. Cependant dans la leucémie aiguë lymphoïde (LAL) elles sont déjà utilisées en clinique avec des résultats très probants. Il est possible d'explorer de nombreuses voies d’optimisation de ces thérapies, notamment en changeant leur base cellulaire. L’utilisation d'un sous-type de lymphocytes rare et naturellement anti-tumoral, les iNKT, permettrait une meilleure action directe contre les cellules tumorales avec une double action : la modification génétique et l'efficacité naturelle de la cellule. De plus, les iNKT ont aussi un effet contre les cellules empêchant l'action du système immunitaire. Ils peuvent aussi activer ce dernier, par leur production importante de molécules d’activation. Le développement de CAR-iNKT serait une très bonne opportunité d’amélioration des approches par cellules CAR.

Procédures

-Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 166 souris -Une injection intra-veineux (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 18 souris, deux injections pour 148 souris. -Une injection intra-péritonéal (IP) sur animal vigile, une fois par semaines pour toutes les souris soit 166. -Un prélèvement de sang sur animal vigile, pour les animaux des tâches 2 et 3 soit 130 animaux à J21, J42 et J63 après injection des cellules leucémiques.

Impact sur les animaux

La piqure d'aiguille pour l’injection et le prélèvement entraîne une douleur légère de courte durée. L'administration de cellules tumorales entrainera une diminution de l’activité, une perte de poids, et possiblement le développement de petites tumeurs en intra-abdominal dans les trois premières semaines sans traitement.

Devenir

Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ni en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences en laboratoire sur des modèles cellulaires pour valider la fonctionnalité des cellules humaines, et de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé sur cellules, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques, en se basant sur des expérimentations antérieurs ainsi que sur la littérature, et en calculant le nombre nécessaire sur la base de logiciel adequats. Nous avons aussi réuni des expérimentations afin de mutualiser les contrôles. Ainsi, au maximum 166 souris seront utilisées. L'utilisation de l'imagerie par bioluminescence avec anesthésie permet d'obtenir des données sur la progression tumoral sans sacrifice de l'animal. Suite à la mise à mort certains organes seront récupérer ainsi que du sang pour des analyses complémentaires.

Raffinement

Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage dans un secteur spécifiquement adapté pour leur état immunitaire déficient. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Des points limites sont mise en place.

Choix des espèces

La souris permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines, car cette souris dépourvu de système immunitaire ne rejete pas les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire humaine. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur le contrôle anti-leucémique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe des cellules humaine est meilleure dans cette période de vie.

350 grands requins pélagiques vont être capturés dans les eaux françaises de l'Atlantique Nord-est et soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être relâchés un par un. Chaque animal lutte vingt à trente minutes au bout d'une ligne, reste ensuite vingt minutes hors de l'eau sur une plateforme hydraulique, subit deux prises de sang, une biopsie musculaire et la pose d'un maximum de trois balises. Requin blanc, taupe commun, peau bleue, mako, renard, griset et hâ sont visés sans distinction, la pêche ne permettant pas de choisir l'espèce capturée. Le porteur écrit qu'"un seul individu est suffisant" au regard des lacunes de connaissance, retient tout de même 50 individus par espèce, et présente ces captures comme "valorisées" par l'application systématique du protocole.

Objectifs

Le projet présenté a pour objectifs une meilleure compréhension des mouvements et des histoires de vie des espèces de grands requins pélagiques présentes dans les eaux françaises de l'Atlantique Nord. Ce projet cible différentes espèces de requins et vise à raffiner l'expérimentation par la mutualisation des procédures expérimentales. En effet, le nombre de gestes techniques réalisés sur un animal est optimisé afin de contribuer à la collecte d’un maximum de données tout en tenant compte de la condition des animaux capturés. Ces données seront exploitées au sein de plusieurs projets de recherche et limitent le nombre total d’animaux qui serait nécessaire à la réalisation de ces projets indépendamment les uns des autres. De plus, la pêche ne permet pas de sélectionner les espèces de grands requins pélagiques capturées pour lesquelles les lacunes de connaissance sont identifiées au niveau national et international. Ainsi, les captures sont valorisées par l’application de la procédure expérimentale de façon systématique quelles que soient les espèces. Les espèces d’intérêt présentes dans la zone de pêche sont : le grand requin blanc, le requin taupe commun, le requin peau bleue, le requin mako, le requin renard commun, le requin griset et le requin hâ. Ces espèces seront capturées afin de répondre à deux objectifs principaux : (1) avoir des informations moléculaires sur l'écologie trophique des individus à travers les biomarqueurs naturels de l'alimentation et sur les contaminations associées grâce à des prélèvements de tissus, et (2) d'identifier les mouvements des individus grâce à la pose de balises. Ces données contribueront à une meilleure prise en compte de l'écologie des requins pélagiques dans les mesures de gestions des activités humaines en mer.

Bénéfices attendus

Il s'agit d'un projet relié à un effort de recherche international afin de contribuer à des avancées significatives dans l'évaluation des populations des espèces de grands requins pélagiques, leur physiologie, leur écologie trophique ainsi que les menaces environnementales auxquelles elles sont confrontées. Ces données seront exploitées au sein de plusieurs projets de recherche et limitent le nombre total d’animaux qui serait nécessaire à la réalisation de ces projets indépendamment les uns des autres. Les espèces ciblées dans ce projet sont identifiées comme des espèces à enjeu pour lesquelles les lacunes de connaissances limitent la mise en place de mesures de gestion pertinentes et efficaces par les organisations régionales des pêches ainsi que les conventions de mer régionales et l'Union Européenne. A court terme, ce projet apportera des bases de connaissance sur les requins pélagiques dans les eaux de l'Atlantique Nord-est sous juridiction française. A long terme, ce projet s'inscrit dans une démarche collaborative internationale qui vise à appréhender les enjeux liés aux requins pélagiques dans l'ensemble des eaux de l'Atlantique Nord.

Procédures

Les animaux seront soumis à un stress lié à la capture par des engins de pêche. Puis, les animaux vigiles seront soumis à 2 prélèvements de sang d'une durée de 2 minutes maximum, 1 biopsie d'une durée max de 2 minutes et la pose de, au maximum, 3 balises d'une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lié à la pêche permettant leur capture en milieu naturel pendant 20 à 30 minutes, puis lors de leur maintien sur la plateforme, durant 20 minutes, hors de l'eau. Une douleur légère voir négligeable sera généré par la présence de l’hameçon à la commissure des mâchoires. Une douleur légère d’une durée de 20 minutes maximum pourra être générée par l’ensemble des prélèvements qui seront réalisés : prises de sang (légère/2 fois 2 minutes maximum) et biopsie musculaire (légère/2 minutes maximum) ; ainsi que lors de la pose des balises pour l’identification et le suivi télémétrique de l’animal (légère/10 minutes maximum au total).

Devenir

L'ensemble des individus seront relâchés individuellement à l'issu de la procédure.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d'étudier l'écologie et la biologie du grand requin blanc, du requin taupe commun, du requin peau bleue, du requin taupe commun, du requin mako, du requin renard commun, du requin griset et du requin hâ en milieu naturel, de ce fait il n'est pas possible de remplacer les animaux dans les procédures.

Réduction

Dans un objectif de réduction, le nombre maximum d'individus impactés par les procédures a été limité à 50 par espèce. Les enjeux de connaissance sur ces espèces sont tels qu’un seul individu est suffisant et l’on considère qu’à partir de 10 individus la variabilité interindividuelle peut être explorée et à partir de 50 une extrapolation peut être faite sur les individus issus d’une même zone de pêche. Ainsi le choix de 50 représente le nombre maximum d’animaux suffisants par espèce pour les analyses Par ailleurs, la mutualisation de la procédure expérimentale sur les animaux permet de réduire le nombre total d'animaux qui seraient impactés par une réalisation de projets de recherche indépendamment les uns des autres dans divers champs de l’écologie : écologie trophique, écotoxicologie, génétique et dynamiques spatio-temporelles. Cette collecte simultanée d'échantillons sur des animaux issus du milieu naturel est un point central de cette expérimentation, de même la collaboration internationale associée à ce projet garantit la minimisation de l'impact de cette recherche sur la faune sauvage.

Raffinement

Les détresses associées à la procédure expérimentales sont essentiellement liées à la pêche en elle-même puis au contentionnement des individus et enfin à l'exécution des gestes techniques. Afin de minimiser la souffrance liée à la pêche les individus sont pêchés un à un afin de diminuer le temps de capture. De plus, les hameçons et le montage des lignes de pêche minimisent les risques de blessures des animaux en favorisant l'ancrage des hameçons au niveau de la mâchoire de l'animal tout en réduisant les risques d'ingestion. Le contentionnement des individus est assuré sur une plateforme hydraulique le long du bateau. Cette plateforme permet à l'équipe technique d'opérer en sécurité pendant une période limitée à 20 minutes sur un animal. Par ailleurs, une manche à eau qui pompe en continue de l’eau de mer est insérée dans la gueule du requin afin de maintenir les échanges respiratoires durant la procédure et diminuer le stress ventilatoire. De même, une serviette humide est déployée sur la tête de l'animal afin de maintenir les branchies et les yeux en milieux humide car ces derniers ne sont pas équipés de paupières et cela diminue le stress visuel. Additionnellement, l'ensemble du corps est maintenu en conditions humides par arrosage à l'eau de mer afin de prévenir l'augmentation de la température corporelle, la dessiccation du derme et le risque de lésions associé. Lors de la remise en liberté l’hameçon est retiré à l’aide d’une pince à poisson dédiée qui assure la sécurité du manipulateur et permet d’éviter de blesser l’animal. L’ensemble de la procédure est conditionné par l’application d’une grille de points limites présentée dans la procédure. Aucune anesthésie ou analgésie générale n’est prévue. En effet cela représente un risque de ralentissement de la récupération suite à la pêche voir de décès des individus. Ces méthodes risquent d’impacter leur nage qui est un mouvement critique assurant la ventilation, le maintien de leur température corporelle optimale et le fonctionnement métabolique général.

Choix des espèces

Le requin blanc, le requin taupe commun, le requin peau bleue, le requin mako, le requin renard commun, le requin griset et le requin hâ ont été choisis du fait des lacunes de connaissances sur la biologie et l'écologie de ces espèces. Les espèces ciblées sont susceptibles d’être capturées par les mêmes engins de pêche, il n’est pas possible de faire une sélection par espèce lors des opérations. Les stades de développement des animaux utilisés seront des juvéniles, subadultes et adultes de plus de 150 cm. A titre d’information, les individus à la naissance sont autonomes, seule leur taille, leur maturité et leur régime alimentaire varie au cours de la croissance. Pour chaque espèce, les ordres de grandeur des tailles à la naissance et maximale observée sont indiquées en centimètres, dans l'ordre, ci-dessous : Grand requin blanc : 135-600 cm Requin taupe commun : 90-350 cm Requin mako : 80-450 cm Requin peau bleue : 50-400 cm Requin renard commun : 100-580 cm Requin griset : 70-550 cm Requin hâ : 30-155 cm