Procédures modérées

458 souris pour une injection unique sous la plante de la patte chacune, suivie de tests de douleur mécanique et thermique dans les vingt-quatre heures. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis disséquées pour prélever la patte, les ganglions rachidiens et la moelle épinière. Le porteur explique que le seuil de douleur est "repéré par l'animal lui-même", le test s'arrêtant au retrait de la patte. L'objet réel est de savoir si des vésicules issues de tumeurs pancréatiques rendent les nerfs plus sensibles, question posée loin en amont de toute application pour les malades.

Objectifs

Le cancer du pancréas est de très mauvais pronostic et douloureux. Nous pensons que cette douleur est causée par des substances libérées par les cellules cancéreuses. Ces substances peuvent rendre les nerfs plus sensibles à la douleur et favoriser leur croissance dans la tumeur, mais leur nature exacte demeure inconnue. Nous proposons d’étudier le rôle potentiel des petites vésicules extracellulaires (appelées EVs) dans ce processus. Notre objectif est de caractériser l’impact des EVs produites par les cellules cancéreuses pancréatiques sur les réseaux nerveux et la douleur associée au cancer chez les souris. Pour cela, nous voulons observer si l'injection de ces EVs dans les pattes des souris provoque : 1/ Une sensibilité accrue à la douleur 2/ Des changements dans l’innervation de la patte 3/ Une activation des circuits neuronaux impliqués dans la douleur.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux régulant l’innervation tumorale et la génération de la douleur dans le cancer. A plus long terme, les résultats pourraient avoir des applications médicales concrètes dans le traitement du cancer et de la douleur afin d’améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Les animaux auront une injection intraplantaire unique avant de subir les tests de comportements pour évaluer la douleur.

Impact sur les animaux

Les injections intraplantaires peuvent causer de la douleur suite à la pénétration de la peau avec l’aiguille au moment de l’injection. Les souris peuvent donc développer un stress, pour éviter cela, elles seront anesthésiées sous isoflurane. Pour les tests de comportement, le stimulus mécanique ou thermique peut provoquer de la douleur qui sera visualisée par un retrait de la patte de l’animal. Le point limite (seuil nociceptif) est donc repéré par l’animal lui-même. Le test est arrêté au retrait de la patte de l’animal donc on ne dépassera pas le seuil. Les expériences sont arrêtées au maximum à 24h post-injection. Une grille de score servira de repère pour vérifier l’état de l’animal.

Devenir

Ces animaux ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures. Par conséquent, à la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort puis disséqués pour récupérer différents organes (patte, les ganglions de la racine dorsale et la moelle épinière) afin d’être analysés.

Remplacement

Notre recherche vise à comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de la douleur associée au cancer. Nous explorons l'idée que les petites vésicules (EVs) provenant des tumeurs pancréatiques pourraient causer une sensibilité accrue à la douleur en modifiant les nerfs dans la tumeur. Pour étudier cette question, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in-vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. Ainsi, l’observation du comportement animal est nécessaire pour comprendre comment la douleur est perçue et transmise au cerveau. Cette approche est d’autant plus pertinente que des différences comportementales entre mâles et femelles peuvent également influencer la façon dont les signaux sensoriels sont traités à différents niveaux dans le corps. En résumé, l'utilisation de souris est essentielle pour étudier les causes pathophysiologiques de la douleur cancéreuse et mener à bien notre projet de recherche.

Réduction

Nous mettrons en place des stratégies pour limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires tout en collectant suffisamment de données pour répondre à nos questions de recherche. Cela implique de définir précisément nos protocoles comportementaux et de choisir judicieusement nos contrôles. Nous utiliserons également des outils statistiques pour estimer le nombre optimal d'animaux nécessaires. En contrôlant les paramètres environnementaux et en surveillant la santé des animaux, nous réduirons la variabilité des résultats expérimentaux et, par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ces procédures sont bien établies dans notre institut et nos chercheurs sont expérimentés dans leur mise en œuvre et dans l'évaluation de l'impact sur le bien-être des animaux. En optimisant notre plan expérimental et en analysant attentivement le nombre d'animaux requis, nous minimisons ainsi l'utilisation d'animaux tout en maintenant la qualité et la validité de nos résultats scientifiques.

Raffinement

Les souris utilisées dans notre projet seront élevées en groupes sociaux et bénéficieront d'un environnement enrichi avec du coton et/ou un dôme pour assurer leur bien-être et favoriser un comportement normal, réduisant ainsi au maximum leur stress. L'élevage des souris est effectué dans notre établissement agréé par une équipe de cinq personnes dédiées à leur organisation et leur entretien. Nous contrôlons quotidiennement la santé et les conditions environnementales des animaux pour assurer leur bien-être. Les procédures expérimentales seront minutieusement planifiées, y compris la disponibilité des locaux, du matériel et la période d'acclimatation des animaux, afin de minimiser leur stress et d'assurer la fiabilité des résultats. Avant les tests comportementaux, les souris seront habituées pendant 45 minutes dans l'enceinte pour s'adapter à leur environnement. Nous établirons également des points limites les plus précoces possibles en fonction des tests comportementaux utilisés. Toutes ces mesures sont mises en place dans le but de réduire, voire d'éliminer, la souffrance des animaux et d'assurer leur bien-être tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. Travaillant sur la physiologie d’animaux adultes, nos tests comportementaux et nos analyses moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines.

Gavées jeunes et vigiles avec une bactérie isolée de patients atteints de cancer colorectal, 576 souris génétiquement prédisposées développent des tumeurs coliques jusqu'à leur mise à mort, 65 jours après le gavage. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend un amaigrissement, une anémie visible aux pattes blanches, des phases de diarrhée ou de constipation, du sang dans les selles et un prolapsus, suivis par un système de score de douleur. Il décrit les actes infligés en trois lignes, "chaque geste technique dure quelques secondes", sans préciser le nombre de prélèvements sanguins ni la dose bactérienne administrée.

Objectifs

Ce projet a pour but de poursuivre les études sur les mécanismes d’action d’une bactérie capable de sécréter une toxine,, dans la carcinogénèse colorectale. En effet, l’infection par cette bactérie isolée de patients atteints de cancer colorectal accélère le développement tumoral dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer .

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus pourraient permettre de mieux comprendre les mécanismes de l'interaction bactéries-hôtes sur la carcinogénèse et d'étudier les voies de signalisation cellulaires/moléculaires impactées. A long terme, les résultats générés par ces recherches devraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant la colonisation bactérienne

Procédures

Chaque geste technique dure quelques secondes et est réalisé par un personnel formé. Des prélèvementsde sang sont réalisés à différent temps sous anesthésie gazeuse . Un gavage est réalisé sur souris vigiles jeunes.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables liés au développement tumoral et à l'infection sont attendu L’expérimentateur contrôlera quotidiennement le comportement général de l’animal durant toute la durée de l’expérimentation (de la naissance à la mise à la mort, soit de J-36 (naissance) à J65 (mise à mort), J0 étant le jour de gavage). Une baisse d’activité, de locomotion, une perte de poil, une posture voutée, une anémie (pattes blanches) et un amaigrissement sont attendus. Au niveau digestif, l’expérimentateur pourra également observer des phases de diarrhée ou de constipation, un hyper toilettage anal ou à l’inverse un orifice souillé, du sang dans les selles et un prolapsus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort

Remplacement

L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il n'existe aucuns modèles d'infections chroniques sur cellules.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure ou cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire ont mis en évidence une forte variabilité du modèle, de la colonisation bactérienne post gavage et de son maintien au cours du temps. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance du modèle et à une formation interne du personnel à la technique de gavage, le nombre d’animaux par lot a été réduit au minimum. Le nombre de 8 souris par lot permettra donc d’analyser statistiquement les résultats de colonisation bactérienne, de perméabilité intestinale et le développement tumoral observées dans les différents lots. Toutefois, si l’analyse statistique suivant la première manipulation permet de réduire le nombre d’animaux, nous prendrons, bien entendu, ces résultats en compte pour définir l’effectif des manipulations suivantes.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être des animaux, plusieurs mesures spécifiques seront prises. Tout d’abord un suivi renforcé des animaux. L’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau / de nourriture et observera le comportement général de l’animal (activité, locomotion, état du poil, prostration, vocalise, sang, anémie…etc). Cela permettra de repérer d’éventuelle anomalies comportementales et de traiter rapidement tous signes de douleurs par des antalgiques fort, utilisés dans le traitement des douleurs cancéreuses. Enfin, si les douleurs ne sont pas soulagées par les antalgiques, une mise à mort anticipées de l'animale sera réalisée. L'évaluation de la douleur sera réalisée grâce à un système de score et le suivi des animaux sera réalisé par une personne formée en interne et désignée compétente au suivi de ce modèle murin prédisposé à développer des tumeurs.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler en modèle murin car la physiologie intestinale reste similaire à celle de l’homme. En effet, ce modèle animal présente plusieurs avantages pour l’étude du développement tumoral : -La mutation du gène est retrouvée dans 80% des cancers colorectaux chez l’homme -Les souris développent spontanément des tumeurs au niveau ducôlon -Il est représentatif des relations entre cellules tumorales et cellules de l’environnement tumoral -Il s’agit du modèle le plus proche de la physiologie humaine et le plus représentatif de l’interaction entre microbiote et tube digestif. Également, ce modèle nous a déjà permis de conclure de manière satisfaisante sur les questions scientifiques dans un contexte de cancer colorectal. De plus, nos animaleries sont adaptées à la prise en charge de ce type d’animaux. Le matériel utilisé est conforme aux règles du bien-être animal (cages, enrichissements, température, cycle jour/nuit) et le personnel a suivi une formation adaptée à la gestion et à la prise en charge de ces animaux. L’étude sera réalisée chez les souris femelles adultes. Les animaux seront gavés à l'âge de 6semaines (20-25 g). L’objectif est de réaliser l’expérience sur des animaux adultes et suffisamment jeunes puisque la durée totale de l’expérimentation est estimée à 50 jours

Départager trois candidats vaccins contre le cancer du sein triple négatif avant un développement chez l'humain : 46 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection unique dans le muscle de la patte, puis une prise de sang à l'œil sous anesthésie gazeuse avec collyre anesthésiant. Le porteur écrit qu'un produit ne peut pas passer en clinique sur la seule base de résultats obtenus in vitro et qu'il est donc "obligé" de recourir à un vertébré. Il annonce des points limites précoces et une surveillance de la motricité de la patte injectée, sans préciser ce qui déclencherait l'arrêt de la procédure.

Objectifs

Le développement de vaccins thérapeutiques contre le cancer, ciblant de nouvelles molécules sur les cellules tumorales (antigènes tumoraux), est indispensable afin de répondre à un besoin médical urgent pour les patients qui ne répondent pas aux traitements conventionnels. Un premier vaccin thérapeutique évalué chez la souris a donné des réponses prometteuses, mais il n’est applicable qu’à un nombre de patients restreints. L'objectif de ce projet est de développer un vaccin thérapeutique qui utilise un plus grand nombre de cibles et qui soit efficace sur une plus large population. Trois nouveaux candidats ont été conçus et nous voulons évaluer dans un modèle murin leur capacité à induire une réponse immunitaire spécifique et de comparer ces réponses à celles obtenues avec le 1er candidat vaccin. Le but de cette étude est de sélectionner le candidat le plus efficace pour poursuivre un développement clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positif, cette étude permettra La sélection d’un vaccin thérapeutique optimisé validant une nouvelle option thérapeutique pour les patients qui ont épuisé les possibilités de traitement conventionnel.

Procédures

Pour réaliser l’injection intra musculaire des candidats vaccins, la souris est maintenue environ 20 secondes. Une seule injection de 50µL est effectuée par animal. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur animaux anesthésiés , l’animal est maintenu immobile environ 50-60 secondes (15 secondes pour l’application de l’anesthésique puis 45 secondes pour le prélèvement). Une prise de température en rectal pourrait être effectuée en cas d’apparition de signes cliniques sur animaux vigiles, la souris serait maintenue en contention environ 40 secondes.

Impact sur les animaux

L’injection dans le muscle de la patte devrait entrainer une douleur temporaire légère. Le prélèvement sanguin au niveau l’œil pourrait entrainer une douleur temporaire ou une gêne pour l’animal. Il sera de ce fait effectué après anesthésie générale et application d’un collyre anesthésiant).

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever certains organes. Ces organes vont permettre d’évaluer les réponses immunitaires induites par les candidats vaccin

Remplacement

Les objectifs de ce projet étant de sélectionner le meilleur candidat d’immunothérapie pour un développement clinique d’un vaccin chez l’homme, il est donc indispensable de respecter les obligations réglementaires, à savoir qu’un produit ne peut pas passer en clinique en se basant uniquement sur des résultats générés in vitro. Ceci implique que l’évaluation de l’efficacité des candidats doit se faire dans un organisme entier. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro susceptible d’apporter le même degré d’information pour répondre à ces objectifs. L’utilisation des invertébrées ne semble pas judicieuse en raison d’un système immunitaire très différent de celui d’un vertébré. Nous sommes donc obligés de faire appel à un vertébré communément utilisé pour ce type d’étude, la souris

Réduction

L’utilisation d’un outil statistique permettant de définir le nombre d’animaux nécessaires et suffisant pour démontrer une différence entre les groupes a été utilisée. Par ailleurs, un nombre optimal d’échantillons et de données seront collectés pour chaque souris pour utiliser un nombre minimal d’animaux nécessaire pour répondre à l’ensemble des questions de l’étude.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés à minima une semaine au sein de l’animalerie avant le début de la procédure et seront gardés en groupe. Des points limites précoses ont été définis pour cette étude. La motricité des animaux sera surveillée après administration du traitement par voie intramusculaire dans la patte. Le prélèvement sanguin à l’œil se fera sur animaux anesthésiés (anesthésie gazeuse et après application d’un anesthésique local). En cas d’apparition de signes cliniques (, une prise de température sera effectuée. En cas de fièvre, une administration d’un antalgique sera effectuée.

Choix des espèces

Le modèle murin est un bon modèle pour tester les candidats vaccins car son système immunitaire est bien décrit et proche de l’homme. Des souris adultes de plus de 7 semaines seront utilisées afin de travailler sur des animaux ayant un système immunitaire mature. De plus, les réactifs nécessaires sont largement disponibles. Il n’existe donc pas de méthode alternative susceptible d’apporter le même degré d’information. En effet, l’utilisation des invertébrées ne semble pas judicieuse en raison d’un système immunitaire très différent de celui d’un vertébré. Nous sommes donc obligés de faire appel à un vertébré communément utilisé pour ce type d’étude, la souris.

Les 470 souris de ce projet, de la souche NMRI nude athymique, sont immunodéprimées et reçoivent sous anesthésie une greffe de cellules cancéreuses humaines sous la peau du flanc. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des anticorps couplés à des drogues censés éliminer les cellules tumorales sénescentes. Chacune reçoit ensuite une injection intraveineuse par semaine pendant 2 à 6 semaines, puis une ponction dans le cœur sous anesthésie, et toutes sont tuées à l'issue, une souris portant une tumeur au flanc ne pouvant entrer dans un autre protocole. Le porteur écrit que la greffe et les injections peuvent "engendrer un stress et une douleur", et annonce une surveillance pour que les souris ne subissent "aucune souffrance".

Objectifs

La sénescence est un processus biologique naturel qui intervient en protégeant les cellules contre des stress cellulaires comme le raccourcissement des télomères, les dommages à l’ADN ou encore le stress oxydatif. Durant certains processus naturels, comme par exemple l’embryogénèse, la senescence a un rôle fondamental. Cependant, l’accumulation de ces cellules sénescentes dans l’organisme au cours du temps conduit à l’émergence de pathologies que l’on retrouve majoritairement chez les personnes âgées. Par exemple, les fibroses comme celle du foie, des poumons, des reins ou du coeur, le cancer, les maladies neurodégénératives ou l'arthrose sont des ptahologies directement liées à l’accumulation de ces cellules sénescentes. L'objectif de ce projet est la mise au point de thérapies innovantes capable d'éliminer les cellules senecentes dans les tumeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de valider l'efficacité de nouveaux composés dans le traitement du cancer. Ces thérapies ciblées permettent d'éliminer spécifiquement les cellules senescentes tumorales responsables des mécanismes de résistance aux drogues et de la formation des métastases. De plus, le ciblage des cellules senescentes cancéreuses permettra de limiter les effets secondaires associés aux traitements classiques comme la radiothérapie comme par exemple la formation de tissus fibrotique.

Procédures

Les animaux seront greffés en sous-cutané avec des modèles de lignées cellulaire humaines tumorales. Au début du protocole, les souris seront anesthésiés puis des cellules cancéreuses seront implantées sous la peau au niveau du flanc droit. Puis, les animaux se verront injecter différents produits par intraveineuse, une par semaine, durant 2 à 6 semaines consécutives en fonction de la progression des tumeurs. En fin de protocole, les souris seront anesthésiées afin de permettre une ponction intracardiaque puis euthanasiées.

Impact sur les animaux

Plusieurs éléments peuvent nuire au bien être des animaux et engendrer un stress et une douleur notamment lors des greffes sous cutanées des cellules tumorales et lors des injections intraveineuses.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le protocole expérimental seront mis à mort soit en fin de procédure. En effet, les animaux présentant une tumeur dans le flanc ne pourront être réutilisés ou inclus dans un autre protocole.

Remplacement

Ce projet a pour but le développement de potentielles thérapies ciblées pour la traitement du cancer. Ces études in vivo font suite à de nombreux résultats in vitro qui nous permettent d'affirmer que nos nouveaux ADC présentent un réel intérêt thérapeutique. Cependant, à ce stade du développement de nos recherches, l'utilisation de modèles complexes, comme des modèles de xénogreffes, est requise pour pouvoir prouver l'efficacité thérapeutique de nos candidats. De plus, pour le développement préclinique de nos ADC, nous devons apporté la preuve d'une efficacité sur des modèles complexes en plus d'étude de pharmacocinétique précise des molécules en développement.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum tout en maintenant la possibilité d'une analyse statistique des résultats. Etand donné que l'originalité de nos ADC, ces expériences n'ont jamais été faites précédemment dans la littérature.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (administration d'un antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné.

Choix des espèces

La souche NMRI nude athymique sera utilisée dans l'étude de modèles de xénogreffes de cellules humaines cancéreuses en greffées en sous-cutanée. Il s'agit d'un modèle immunodéprimé avec une courbe de poids homogène et couramment utilisée dans la littérature associée à la recherche en oncologie. Ce souche permettra l'évaluation de l'effiacité anti-tumorale de nos candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes exprimant les cibles d'intérêts thérapeutiques. Les souris NMRI athymique nude seront âgées de 6-7 semaines lors de la greffe sous-cutanée pour garantir une prise tumorale homogène.

Piégées au sol, transportées dans un sac, puis anesthésiées de dix à trente minutes, 650 marmottes alpines subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À la première capture de leur vie, elles reçoivent un transpondeur et des marques auriculaires et subissent un prélèvement de peau, puis chaque année des prélèvements de poils, de sang et, pour les mâles matures, de sperme obtenu par électrostimulation en dix à vingt minutes. Le porteur signale un risque d'hyperthermie potentiellement fatale quand un animal reste piégé trop longtemps par forte chaleur, sur un site où aucun arbre ne fait de l'ombre, et le compense par des ombrelles posées sur les cages et de l'eau versée sur l'animal. Toutes sont relâchées près de leur terrier après environ deux heures, avec le risque, pour une marmotte dominante trop longtemps absente, qu'un rival ait pris son territoire et tué les marmottons.

Objectifs

Les suivis à long-termes de populations d’animaux sauvages constituent aujourd’hui une ressource scientifique précieuse pour répondre à de nombreuses questions concernant l’écologie et la biologie évolutive. L’objectif du présent programme de recherche est la perpétuation d’un suivi démographique, phénotypique, génétique, physiologique d’une population de marmotte Alpine (Marmota marmota). La marmotte Alpine est une espèce sociale, à reproduction despotique (seul le couple dominant se reproduit) et hibernante. Ces caractéristiques biologiques en font une espèce modèle originale pour les mammifères et, de manière plus générale, pour les espèces qui vivent en groupes structurés et stables. Nous souhaitons mieux comprendre le rôle de la vie en groupe et de la socialité sur l’écologie des populations et de mettre en évidence la manière dont la variabilité environnementale (par exemple les changements globaux) affecte le rapport coût – bénéfice de la vie en groupe. Nous étudierons également les variations de la sex-ratio des jeunes en réponses aux changements globaux. Cela passe notamment par une quantification de la variabilité inter- et intra-individuelle de la proportion relative de spermatozoïdes avec un chromosome Y versus X.

Bénéfices attendus

Nous testerons l’hypothèse que les changements climatiques ont des répercussions majeures sur la socialité des individus, qui deviennent en quelque sorte plus égoïstes, en préférant quitter le groupe de naissance que de rester et aider à l’élevage des marmottons frères et sœurs. Les résultats attendus auront des implications pour les autres espèces sociales, y compris l’homme face aux changements globaux. Enfin, déjà fragilisée par le changement climatique, la marmotte Alpine est chassée à l’automne dans certains départements du sud-est de la France. La chasse à la marmotte semble assez marginale, mais les effets négatifs du changement climatique pourraient pousser nos décideurs politiques à en interdire la pratique. Notre projet apportera une meilleure compréhension du rôle des pères dans l’allocation selon les sexes en comparant la proportion de spermatozoïdes avec un chromosome X versus Y. La recherche sur l’allocation selon les sexes s'est concentrée jusqu’ici presque exclusivement sur le rôle de la mère alors que les parents peuvent avoir des intérêts divergents. Quelques études récentes ont montré une proportion déséquilibrée des chromosomes sexuels X et Y dans les échantillons de sperme de bovins domestiques et dans les populations humaines affectées par des polluants, ce qui rend difficile l’extrapolation des résultats à des populations sauvages comme la marmotte alpine. L’importance du rôle des pères reste à démontrer, mais ses multiples implications potentielles pour l’évolution de l’allocation selon les sexes et les conflits parentaux invitent à un surcroît d’attention.

Procédures

L’ensemble de ces prélèvements est réalisé après induction d’une anesthésie générale (~ de10 à 30 minutes): - Prélèvements de tissu cutané, injection d’un transpondeur et pose de marques auriculaires lors de la première capture dans la vie de l’animal (10 minutes) ; - Prélèvements de poils à chaque première capture de l’année (1 minute) ; - Prélèvements sanguins à chaque première capture de l’année (de 1 à 5 minutes) ; - Prélèvement de sperme chez les mâles sexuellement matures à chaque première capture de l’année (de 10 à 20 minutes) ;

Impact sur les animaux

Les principales sources de nuisance identifiées pour les marmottes sont (i) les risques de blessures superficielles, de traumatologie et le stress thermique causé par la capture (phase d’attente dans le piège puis transfert dans le sac de transport) ; La marmotte étant une espèce thermosensible avec une thermorégulation comportementale marquée (refuge dans le terrier), il existe un risque d’hyperthermie potentiellement fatal lorsqu’un animal reste piégé pendant trop longtemps lors des épisodes de forte chaleur (note : il n’y a aucun arbre sur le site d’étude). (ii) douleur et stress lors des mesures biométriques et lors des prélèvements biologiques ; (iii) le risque de déstructuration sociale par la prise de pouvoir sur un territoire par des rivaux lors de la capture d’un individu dominant. Un changement de dominance par un animal transient ou d’un territoire voisin, change la composition du groupe et induit souvent un infanticide des marmottons.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie et relâchés dans leur milieu de vie après la procédure à proximité immédiate du terrier où ils ont été capturés.

Remplacement

Notre programme de recherche sur la marmotte Alpine repose en grande partie sur l’étude des réponses individuelles et populationnelles aux variations des conditions environnementales d’origine diverse (ex : climat, phénologie de la végétation, socialité). Ces réponses sont étudiées aux niveaux comportemental, physiologique et démographique. Notre étude s’inscrit dans la lignée des suivis à long termes en écologie évolutive qui repose sur le suivi le plus long et plus exhaustif des individus au cours de leur vie en milieu naturel. Les populations de marmottes en captivité (par exemple en zoo) ne constituent pas une alternative pertinente à l’utilisation de populations sauvages lorsqu’il s’agit d’étudier le rôle de l’environnement sur la démographie et les processus évolutifs. Il n’existe donc, par essence, aucune méthode substitutive à notre protocole de recherche. Notre protocole a été réfléchi de sorte que toutes les quantités de tissus prélevées soient utilisées pour répondre à nos problématiques de recherche. Toutefois, si certains échantillons s’avéraient non utilisés (en particulier les échantillons de sperme pour lesquels nous ne pouvons pas anticiper de manière précise la quantité que nous allons collecter), les échantillons supplémentaires seront mis à disposition de notre réseau de collaboration et participent ainsi à du “remplacement” pour des projets futurs.

Réduction

Chaque année, 30 familles de marmottes Alpines sont suivies, correspondant ainsi à environ à 250 individus capturés. Ce nombre de 30 est le nombre minimal permettant d’approximer la distribution réelle de traits quantifiés dans la population par la loi normale et ainsi utiliser les outils statistiques appropriés. D’autre part, étant donnée les forts effets structurant de l’âge dans les paramètres démographiques des espèces à longue durée de vie, la description de la dynamique des populations nécessite des tailles d’échantillon substantielles d’animaux d’âge connu (donc suivis de la naissance à la mort) afin d’estimer les paramètres démographiques (survie, reproduction, dispersion). Le suivi longitudinal des animaux nous permet d’avoir des mesures répétées pour les individus et contribue ainsi à limiter le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats interprétables et fiables.

Raffinement

Nous réduisons les risques d’hyperthermie en plaçant des « ombrelles » sur le dessus des cages à pièges qui recouvrent environ la moitié de leur longueur, offrant une zone ombragée pour l’animal le temps qu’un membre de l’équipe arrive sur place. Des bouteilles d’eau sont prévues pour arroser légèrement l’animal pendant le transport quand la température de l’air est 27°C, et une vérification des pièges est faite systématiquement toutes les 30 minutes de 07:00 à 21:30, une plage horaire qui couvre l’activité journalière des marmottes. Le stress lié à la manipulation et à la contention est atténué car les animaux sont anesthésiés avant que les prises de mesures, d’échantillonnage des tissus et le marquage débutent. Les manipulations sous anesthésie sont effectuées dans un local réservé à cet effet par du personnel qualifié et le plus silencieusement possible. La durée totale entre la capture et le relâcher est en moyenne de 2 heures incluant 20 minutes de contention et de manipulation en dehors du sac de capture, mais il existe une forte variabilité individuelle dans le temps de réveil. Un temps de réveil long est risqué pour un dominant car pendant son absence un animal transient ou voisin peut tenter de prendre le contrôle de son territoire en tuant notamment les marmottons. Bien que nous limitions ce risque en plaçant un effaroucheur ou une personne sur le territoire le temps de la manipulation, cela n’est pas optimal en termes de dérangement. Ainsi en 2024, nous prévoyons d’expérimenter un nouveau protocole d’anesthésie dans le but de réduire le temps de réveil des individus et d’induire une analgésie plus puissante. Une analgésie plus puissante est mise en place pour les mâles sexuellement matures afin de limiter les possibles douleurs associées à l’électrostimulation dont la mise en place est prévue en 2024. Les protocoles d’anesthésie et d’électrostimulation seront optimisés en fonction des réponses des marmottes aux protocoles initialement définis. Nous envisageons aussi des protocoles alternatifs, comme la collecte de sperme par pharmo-induction si l’électrostimulation s’avérait trop inconfortable pour les animaux.

Choix des espèces

La marmotte Alpine (Marmota marmota) est une espèce particulièrement pertinente pour l’étude de la socialité (élevage coopératif, groupes sociaux hiérarchiques et stables), et représente un modèle biologique pour nombre d’espèces de mammifères sociaux. Sa structure sociale est bien décrite, et son comportement de territorialité et sa longévité (jusqu’à 16 ans) facilitent grandement le suivi des compositions de groupe et de leur dynamique temporelle. Ces caractéristiques biologiques permettent donc d’appréhender en détails la façon dont la vie en groupes sociaux affecte les traits d’histoire de vie et comment la socialité contraint les stratégies biodémographiques des espèces. Grâce à ce projet, nous disposons d’un jeu de données biodémographiques conséquent à l’échelle individuelle (30 ans de suivis) ainsi qu’une connaissance de nombreux facteurs environnementaux (météorologie, pathogènes…). Le recours à des populations captives ne permettrait pas de répondre aux objectifs de nos projets. Tous les stades de développement sont concernés par l’étude. La marmotte Alpine étant particulièrement longévive (longévité maximale observée sur le site de 16 ans), il est impératif de prendre en compte la structure d’âge de la population, et donc de connaître l’âge exact des animaux. A notre connaissance, la seule méthode fiable à disposition est de marquer les individus au stade juvénile (marmottons c’est-à-dire les jeunes de l’année), seule classe d’âge pouvant être déterminée à l’année près avec certitude. Ensuite, le statut social des marmottes est une variable capitale structurante les traits d’histoire de vie (conditionnant l’accès à la reproduction, la dispersion, et le taux de mortalité des individus) mais qui changent rapidement au cours d’une saison et d’une année à l’autre – ce n’est pas une variable fixe propre à chacun. Nous devons alors capturer les animaux tout au cours de leur vie pour être en mesure de décrire leur histoire de vie correctement.

Tués à l'issue au motif du risque lié à un agent pathogène de groupe III, 1 000 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit le SARS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie gazeuse, puis des traitements ou des vaccins administrés sur animal vigile, et jusqu'à trois prélèvements de sang au sinus rétro-orbital. Le porteur décrit l'infection comme une perte de poids transitoire d'environ 10 %, que l'animal contrôle au bout d'une semaine, et présente le hamster doré comme un modèle des formes non sévères de la COVID-19. La mise à mort de la totalité des animaux est acquise dès le départ, quelle que soit leur récupération.

Objectifs

Depuis fin 2020, la COVID-19 évolue par vagues épidémiques et l’émergence de variants préoccupants de SARS-CoV-2 requiert dans l’urgence de nouvelles données scientifiques. Dans ce contexte, l’apport de la recherche utilisant des espèces animales modèles est essentiel à la gestion de la crise sanitaire. De nouveaux besoins urgents de recherche sont apparus en lien avec l’apparition de formes symptomatiques longues de la maladie et l’émergence des variants préoccupants du SARS-CoV-2. Le présent projet a pour objectifs (i) l’étude de la physiopathologie des infections à SARS-CoV-2 et ses variants et ce, principalement, au niveau de l’épithélium respiratoire du hamster Syrien modèle de la COVID-19, (ii) une meilleure compréhension de la diffusion et de la multiplication du SARS-CoV-2 et ses variants dans les tissus (immunité croisée, transmissibilité, réinfection) et (iii) l’évaluation de vaccins, et d’approches thérapeutiques adaptés à l’évolution épidémiologique des infections à SARS-CoV-2.

Bénéfices attendus

L’étude chez le hamster des infections à SARS-CoV-2 et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la pandémie de COVID-19. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche.

Procédures

L’inoculation de la souche virale est réalisée par voie nasale sous anesthésie gazeuse. Les traitements (thérapeutiques ou vaccinaux) sont administrés par différentes voies à l’animal vigile par des manipulateurs expérimentés. Ces manipulations durent quelques secondes. Le traitement par voie nasale est administré sous anesthésie. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Les prélèvements sanguins nécessaires pour ces analyses seront réalisés au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié avec ajout d’un collyre anesthésique. Ces prélèvements effectués par un manipulateur expérimenté durent quelques secondes. Un maximum de 3 prélèvements sanguins sont prévus sur les animaux sur toute la durée du protocole.

Impact sur les animaux

Dans les conditions expérimentales les plus défavorables, l’infection du hamster doré par le SARS-CoV-2 se traduit par une perte de poids transitoire d’environ 10%. L’animal infecté contrôle l’expression pulmonaire de la maladie au bout du septième jour de l’infection et retrouve son poids d’origine vers le 10ème jour.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure.

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection et de l’efficacité vaccinale ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. En revanche, les stratégies thérapeutiques sont validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées. L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SARS-CoV-2 ainsi que son innocuité sont ainsi entérinés par des analyses in vitro. Les essais vaccinaux et thérapeutiques sont ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l’efficacité du traitement.

Réduction

Les modèles d’infection à SARS-CoV-2 chez le hamster sont maîtrisés depuis 2020 au laboratoire. Nous disposons d’un protocole d’administration de souches virales présentant des conditions de répétabilité et reproductibilité satisfaisantes qui nous permettent de réduire nos études à des groupes de 6 animaux pour atteindre une significativité statistique.

Raffinement

Nous nous sommes employés à définir les conditions optimales d’hébergement des hamsters dorés. L’observation du comportement du hamster, d’une part, et l’adaptation des méthodes d’anesthésie, de contention et des gestes techniques à l’animal, d’autre part, garantissent une bonne prise en compte du principe de raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation une semaine avant les expérimentations. Les hamsters sont hébergés par deux dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger. Une grille de points limites est établie afin de limiter la douleur des animaux.

Choix des espèces

Le hamster doré est naturellement sensible aux infections à SARS-CoV-2, quel que soit le variant, et représente un modèle de choix pour étudier les formes non sévères de la COVID-19. Ce modèle restitue naturellement la physiopathologie humaine de la COVID-19. Les signes cliniques sont transitoires (perte de poids modérée et hyposmie/anosmie), l’animal contrôlant naturellement l’infection au bout d’une semaine. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes mâles ou femelles. Ils sont sensibles à l’infection SARS-CoV-2 et ne développent pas de symptômes graves.

Une trentaine d'études d'efficacité sur des candidats médicaments contre l'eczéma : 1 150 souris et 1 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le dos rasé, ils reçoivent un extrait d'acariens appliqué ou injecté dans la peau jusqu'à neuf fois en trois semaines, puis le produit à tester tous les jours. Pour mesurer le grattage, chaque animal est isolé jusqu'à cinq heures dans une enceinte, et jusqu'à sept prises de sang sont pratiquées en trois semaines, la dernière suivie d'une mise à mort sans réveil. Le porteur justifie le recours aux rongeurs par l'impossibilité de faire apparaître un comportement de grattage in vitro, et annonce des traitements "sans effets secondaires majeurs" pour les patients.

Objectifs

La dermatite atopique, ou eczéma atopique, est une maladie inflammatoire chronique de la peau, fréquente chez les nourrissons et les enfants, qui se caractérise par des démangeaisons, une sécheresse de la peau, un érythème et une peau épaisse causés par une perturbation immunitaire, des défauts génétiques et des facteurs environnementaux. En médecine humaine, on estime jusqu'à 20 % des personnes souffrant de dermatite atopique . La sècheresse de la peau, son irritabilité et son hyperréactivité s'expliquent par une diminution des graisses à la surface cutanée. Les patients dits atopiques sont génétiquement prédisposés (terrain familial). Leur système immunitaire est très réactif et leur peau présente une anomalie de perméabilité. Les allergènes environnementaux (poussières, pollens…), normalement bien tolérés, vont alors pouvoir pénétrer plus profondément dans l'épiderme et stimuler de façon excessive le système de défense immunitaire. En particulier, une altération de la barrière cutanée entraîne une sensibilité élevée aux allergènes aériens atopiques, y compris les acariens . Les acariens constituent un vecteur non seulement de protéines allergènes, mais aussi d'adjuvants microbiens qui peuvent tous deux conduire à l'allergie. Dans la dermatite atopique, les lésions liées au grattage (conséquences des démangeaisons), peuvent être responsables de surinfection bactérienne (ex : staphylocoque doré) ou virale (ex : virus de l'herpès) dont les conséquences sur l’état général peuvent être plus ou moins importantes. Le projet concerne des tests d'évaluation de réactions cutanées, de comportements de grattage chez le rongeur. Le modèle de dermatite atopique (induit par des extraits d’acarien) décrit dans ce projet cible l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Le modèle est mis en place et utilisé afin de tester l'efficacité de médicaments à lutter contre les conséquences directes ou aggravantes (comportement de grattage) de l’allergie aux acariens.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l'évaluation de nouveaux traitements nécessaires pour améliorer la prise en charge et la qualité de vie des patients, car les traitements actuels présentent des effets secondaires qui peuvent être importants. Par exemple, même si les corticoïdes, appliqués par voie topique ou orale, sont fréquemment utilisés pour traiter de nombreuses affections cutanées, ces derniers ne restaurent pas la barrière que constitue l’épiderme. Leur utilisation est de plus fréquemment accompagnée d’une immunosuppression, ce qui a pour conséquence de prolonger leur utilisation à des doses fortes entrainant ainsi de nombreux effets secondaires (atrophie de la peau, augmentation du risque d’infection). Pour ces raisons, de nouveaux traitements, sans effets secondaires majeurs, sont en développement.

Procédures

Les animaux seront rasés au niveau du dos. 2-3 fois par semaines et pendant environ 3 semaines (soit en 9 occasions maximum), un extrait d’acariens est appliqué ou injecté au niveau de la peau. Cette procédure ne dure que quelques minutes et est réalisée sous anesthésie gazeuse si nécessaire. Les administrations d’éléments d’essai pourront être réalisées tous les jours pendant la durée de l’étude (environ 1 minute par administration). Avant la première application de l’extrait d’acariens, puis à différents jours jusqu'au lendemain de la dernière application, l’épaisseur des oreilles est mesurée et la peau est observée. Cette procédure ne dure que quelques minutes et est réalisée sous anesthésie gazeuse si nécessaire. Les animaux sont placés individuellement dans une enceinte pour évaluer le comportement de grattage, généralement en une occasion et pendant 5 heures maximum. Les jours qui précédent cette évaluation, une ou plusieurs phases d’habituation à l’enceinte d’environ 1 heure sont mises en place. Des prélèvements de sang pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse, procédure d’une durée de quelques minutes (7 prélèvements maximum en 3 semaines). Si le prélèvement est effectué en fin d’étude, les animaux sont immédiatement euthanasiés (sans retour à l’état conscient).

Impact sur les animaux

Les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil (nécessaires pour la réalisation des administrations, des prélèvements sanguins et des évaluations le cas échéant), tout comme les phases de contentions nécessaires aux administrations substances (produit test) ou d’isolement (évaluation du comportement de grattage, généralement 2 à 5 heures) peuvent être source de stress ou d’inconfort pour l’animal. Des démangeaisons pourraient apparaitre au niveau du site d'application des extraits d'acariens.

Devenir

Dans la procédure, les animaux sont euthanasiés, les prélèvements de peau/oreilles et de sang (pour analyses) ne permettant pas le réveil et le maintien en vie.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments testés, des tests in vitro, ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique, du système endocrinien et immunologique chez l’Homme, ou l’apparition d’un comportement de grattage. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Selon les données de la littérature, il est estimé qu’un effectif de 8-10 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) sera nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Une étude comprendra en général 4 groupes et une trentaine d'études sont anticipées. L'analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques adaptés aux objectifs de l'étude. Par ailleurs, des prélèvements terminaux (tissus, organes, sang) peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères.... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou attendus ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation faite par du personnel formé inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration, l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie si nécessaire. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données.

Choix des espèces

Aujourd’hui encore, les rongeurs (souris et rats) demeurent essentiels pour étudier la dermatite atopique, comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse de cette affection cutanée et étudier l'efficacité de nouveaux traitements. Tous les animaux seront utilisés après 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris conformément à la bibliographie scientifique.