Procédures modérées
L’axe cerveau-intestin comme voie d’élimination des protéines toxiques de la maladie d’Alzheimer.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour vérifier si une voie de communication entre le cerveau et l'intestin élimine les déchets cérébraux, 485 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 115 d'entre elles sans jamais se réveiller et 370 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une neurochirurgie de quinze minutes, un prélèvement sanguin, une heure d'imagerie sous anesthésie et une injection dans l'abdomen pratiquée sur animal vigile. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer une douleur post-opératoire, une perte de poids et une accumulation de liquide dans le cerveau. Le bénéfice annoncé se limite à de nouvelles perspectives de diagnostic précoce, et le choix de l'espèce repose sur des souris transgéniques exprimant les protéines toxiques de la maladie d'Alzheimer, auxquelles s'ajoutent des souris rendues déficientes pour l'élimination des déchets du cerveau.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la principale cause de démence chez l’Homme. Elle résulte d'une dégénérescence irréversible des neurones responsable d’un déclin progressif des principales fonctions d'apprentissage et de mémorisation dû à une accumulation cérébrale de protéines toxiques. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cérébrales puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Une nouvelle voie de communication entre le cerveau et l’intestin a été identifiée, celle-ci pourrait être impliquée dans l’élimination des déchets du cerveau. Ce projet a pour but de confirmer cette hypothèse afin de développer de nouvelles méthodes de diagnostics de la maladie et donc d’augmenter l’efficacité des traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre en évidence une nouvelle voie d'élimination des protéines toxiques impliquées dans la maladie d’Alzheimer. Ce nouveau mécanisme pourrait donner de nouvelles perspectives de diagnostic précoce de la maladie.
Procédures
Les animaux subiront une neurochirurgie (15 minutes), un prélèvement sanguin (moins de 10 minutes), un examen d'imagerie médicale (1 heure) et une injection dans l'abdomen (moins de 5 minutes). Seule l'injection dans l'abdomen se déroulera sur des animaux vigiles. La neurochirurgie, le prélèvement sanguin et l'examen d'imagerie médicale se dérouleront sous anesthésie.
Impact sur les animaux
La neurochirurgie et l'injection dans l'abdomen peuvent induire une douleur légère post-opératoire ainsi qu'une perte de poids. L'effet indésirable serait l'apparition d'une accumulation de liquide dans le cerveau. L'examen d'imagerie médicale peut induire une légère hypothermie.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour des examens sur les tissus prélevés.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants permettant cette étude. Ce projet porte sur un mécanisme d’interaction indirecte entre le cerveau et l’intestin nécessitant la mise en place de réseaux qu’il n’est pas possible de reproduire par des modèles de culture cellulaire ou d’autres approches in vitro. De plus, le modèle souris permet d’avoir accès à des lignées génétiquement modifiées, modèles de la pathologie humaine.
Réduction
Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Les mises au point seront réalisées sur de petits groupes d’animaux.
Raffinement
Pour les animaux recevant des injections dans le cerveau, leur état de santé sera suivi tout au long de l’expérience. Des médicaments anti-douleur généraux et locaux seront injecté en sous-cutané en pré et post-opératoire afin de prévenir le développement de douleurs. Ces chirurgies se feront sous anesthésie. Les yeux seront protégés durant l’anesthésie avec un protecteur oculaire. Les animaux seront disposés sur une couverture chauffante à température contrôlée afin d’éviter l’hypothermie. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Aussi, des critères d'arrêt des souffrances seront clairement identifés afin de limiter les souffrances des animaux.
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles transgéniques mimant certaines pathologies humaines. Dans ce projet, l'existence de modèles transgéniques rongeurs exprimant des protéines toxiques impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie permet de mimer la maladie d’Alzheimer. De plus, des souris démontrant une déficience dans l'élimination des déchets du cerveaux seront également utilisées. La similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle de cette espèce en fait un modèle de choix pour cette étude. Les animaux seront utilisés à l’âge de 3 mois ou 9 mois afin d’étudier différents stades de la pathologie.
Évaluation du phénotype d’une lignée de souris génétiquement modifiées pour 2 gènes impliqués dans la formation et le fonctionnement de l’appareil uro-génital
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Ces souris sont créées pour vérifier si une double modification génétique les rend malades, sans que soit connue l'incidence des atteintes ni le délai de leur apparition. 232 vont être utilisées, 190 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 42 un niveau modéré. Le porteur anticipe des malformations possibles, absence d'un rein ou des deux gonades, insuffisance rénale, déshydratation, stérilité, et encadre le suivi par deux grilles d'observation et des points limites précoces. Les croisements courent sur trois générations, 190 souris reçoivent une injection, 42 sont déclarées réutilisées dans un projet ultérieur sur le développement embryonnaire, et le résumé indique par ailleurs que tous les animaux seront mis à mort.
Objectifs
Dans ce projet, nous allons créer des animaux avec des caractéristiques spéciales et vérifier s'ils présentent des problèmes de santé sur trois générations. Si nous ne remarquons aucun problème majeur qui pourrait les faire souffrir ou mettre leur vie en danger, nous continuerons à les élever et à vérifier pendant trois générations. Si encore sur la 3ème génération leur état de santé reste le même, certains de ces animaux seront utilisés pour une étude sur la prolifération des cellules. Les autres animaux seront utilisés dans un projet futur pour examiner comment un certain gène affecte le développement des embryons. Nous avons calculé que nous aurons besoin de 232 animaux au total.
Bénéfices attendus
Les anomalies congénitales sévères représentent un enjeu majeur de santé publique. A titre d’exemple, l’incidence sur la malformation rénale concerne un nouveau-né sur 500 en Europe. Au-delà des nouvelles connaissances sur les mécanismes d’action du gène en question, nos travaux contribueront à une meilleure compréhension et prise en charge des pathologies humaines qui ont pour l’origine des malformation congénitales.
Procédures
- Accouplements naturels de mâles et de femelles provenant de 2 lignées à phénotype non dommageables (10 secondes) plusieurs fois. A partir du sevrage : - Prélèvement par earpunch pour le génotypage (30 secondes). -Pesée 2 fois par semaine (20 seconds) jusqu’à l’âge de 2 mois puis 1fois/semaine jusqu’au 3ème mois puis 1 fois/mois jusqu’au 6ème mois. - Autre intervention : 1 injection sur 190 animaux vigiles (20 secondes par injection).
Impact sur les animaux
Dans l’état actuel de nos connaissances nous ne savons pas si les animaux vont avoir des problèmes de santé. C’est la raison pour laquelle nous envisageons de faire cette évaluation. Nous ne connaissons pas l’incidence de maladie sur ce modèle de souris ni le temps que cela peut prendre à se manifester. Les animaux pourraient développer des malformations (exemple : absence d’un rein ou des 2 gonades. Si ces malformations sont moins majeures, elles peuvent engendrer des dysfonctionnements des organes uro-génitaux comme l’insuffisance rénale, la déshydratation ou la stérilité. La contention cause du stress et la piqure cause une légère douleur.
Devenir
A terme d’observation sur 3 générations, et l’analyse de prolifération cellulaire, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Nous avons les outils et l’expertise d’étudier certaines fonctions de notre gène d’intérêt dans une boîte de pétri et nous le réalisons à chaque étape que nous le pouvons. Toutefois, ce gène a un rôle important dans la formation de plusieurs organes pendant la formation de l’embryon. Par conséquent pour mieux comprendre le fonctionnement de ce gène, il est nécessaire de l’étudier dans sa globalité en occurrence dans un organisme vivant.
Réduction
En nous appuyant sur la littérature et notre propre expérience, nous prévoyons l’analyse de 4 portées issus de 4 couples indépendants au cours de 3 générations pour évaluer le phénotype de la lignée générée dans ce projet. Le nombre minimum d’animaux nécessaire a été établi en nous appuyant sur les probabilités génétiques et des schémas d’accouplement optimisés. Le nombre minimum d’animaux nécessaire pour l’analyse de la prolifération cellulaire que nous envisageons a été déterminé par des calculs statistiques basé sur un calcul de puissance associé à l’utilisation de tests de significativité statistiques.
Raffinement
L’élevage des animaux est maintenu à l’état hétérozygote pour prévenir l’apparition du phénotype dommageable. Outre de leur fournir un environnement enrichi pour satisfaire leur besoin de rongeur et leur instinct de nidification, de les héberger en permanence avec leur congénère de même portée, de les surveiller au quotidien, nous avons établis 2 grilles d’observation selon lesquels, les personnels formés et compétents noteront la moindre anomalie susceptible de compromettre leur état de santé, leur comportement et leur bien-être et prévoyant des points limites précoces et adaptés. Les accouplements seront programmés afin d’optimiser la surveillance des animaux au cours de laquelle des scores critiques pourraient être atteints (avortement spontané, risques de dystocie). Un vétérinaire dédié de manière permanente à notre animalerie est disponible à toutes nos requêtes sur l’état de santé de nos animaux et plus particulièrement de ceux sous la procédure.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme. Le modèle de souris mutante pour le gène étudié dans ce projet mime fidèlement la pathologie humaine résultant du dysfonctionnement de gènes humains homologues. Les stades du développement : Depuis la naissance jusqu’ à l’âge de 6 mois, période nécessaire et suffisante pour évaluer le bien-être de la lignée génétiquement modifiée créée dans ce projet. Les femelles âgées de 8 semaines à l’optimum de leur maturité sexuelle pour la production d’embryons objets de l’étude.
Analyse du rôle d’un gène dans la prédisposition et la progression des lésions précancéreuses pancréatiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Six injections abdominales par jour pendant deux jours, puis six par jour un jour par semaine pendant quatre semaines, après quatre premières injections quotidiennes à l'âge de cinq semaines : 160 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces injections déclenchent les modifications génétiques et favorisent des lésions précancéreuses du pancréas, dont le porteur attend une légère perte de poids le lendemain de chaque séance. Les souriceaux sont tatoués à la base des phalanges et amputés de moins de 2 mm de queue pour le génotypage. Le modèle repose sur des souris génétiquement modifiées prédisposées à ces lésions, tuées avant le stade du cancer pour analyser ce qui le précède.
Objectifs
Les cellules acineuses du pancréas sécrètent des enzymes digestives transportées dans les canaux pancréatiques jusqu’au tube digestif pour la digestion des aliments. La grande majorité des cancers du pancréas sont initiés par la transformation de ces cellules, notamment via l’activation du gène KRAS connu pour favoriser les cancers. Une inflammation progressive du pancréas associée à une perte des cellules acineuses constituent la pancréatite chronique. Elle peut être causée par des calculs biliaires, l’alcool, le tabagisme et des facteurs génétiques, mais environ 20 % des cas de pancréatite chronique ont une cause inconnue. Ces modifications du tissu pancréatique sont des facteurs de risque de cancer du pancréas. Ce cancer, en constante augmentation, est un des plus agressifs (taux de survie à 5 ans inférieur à 8%), notamment parce qu’il est dans la majorité des cas diagnostiqué trop tardivement. Il est crucial de mieux comprendre les causes de la pancréatite chronique et les facteurs qui favorisent les étapes précoces du cancer du pancréas. Notre objectif est d’étudier le rôle d’un gène de prédisposition au développement du cancer du pancréas. Pour ce faire, nous utilisons des souris génétiquement modifiées pour étudier le rôle des gènes et l’impact de leur inactivation sur le développement des lésions précancéreuses. Ceci a un intérêt pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ces modèles de souris sont nécessaires pour comprendre les causes de prédisposition et de progression des lésions pré-cancéreuses pancréatiques, ce qui a un intérêt pour le développement de stratégie de dépistage et de stratégie thérapeutique du cancer du pancréas.
Procédures
Les souriceaux sont marqués par tatouage à la base des phalanges et un prélèvement d’un petit bout de queue (moins de 2 mm) est effectué pour le génotypage, c'est à dire l'identification des modifications génétiques induites chez chaque animal. La manipulation est très rapide et n’induit pas de modification du comportement du souriceau, et la queue cicatrise très rapidement à ce stade. Les souris sont traitées par injections au niveau de l’abdomen (1 fois par jour pendant 4 jours consécutifs à l’âge de 5 semaines, puis 4 semaines après elles sont injectées 6 fois par jour pendant 2 jours consécutifs, puis 6 fois par jour 1 jour par semaine pendant les 4 semaines suivantes. La nécessité de ce nombre d'injection a été établie par des travaux de mise au point validés dans différents laboratoires dans le monde). Ces injections servent à induire les modifications génétiques et à favoriser le développement des lésions pré-cancéreuses pour étudier les causes de leur initiation et de leur progression.
Impact sur les animaux
Les souris sont traitées par un certain nombre d’injections, au niveau de l’abdomen. Cela peut entrainer une légère perte de poids le jour suivant l’injection. Les souris vont développer des lésions microscopiques pré-cancéreuses au niveau du pancréas. Les souris seront euthanasiées précocement pour l’analyse de ces lésions avant le stade de cancer.
Devenir
Les animaux de la procédure sont euthanasiés pour des analyses effectuées sur le pancréas (visualisation et études de molécules) afin d’étudier les lésions précancéreuses.
Remplacement
Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être actuellement obtenues par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique du développement des lésions précancéreuses, nous obligeant à travailler à l'échelle d'un organisme. Des études in vitro sur des cellules et des "mini-organes" en culture ou issus de prélèvements de lésions humaines sont également possibles en complément mais ne peuvent pas remplacer cette étude avec ce modèle physiologique. Les retombées de ce travail sont utiles du point de vue des implications thérapeutiques à terme chez l'homme.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal de souris, determiné par des résultats obtenus précédemment et dans les publications scientifiques pour ce type d’analyse, et qui permet d'obtenir des résultats statistiques permettant la validation de l'étude.
Raffinement
Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des conditions optimales d'élevage, en portoirs ventilés. Les souris sont 5 individus par cage au maximum pour avoir assez de place dans la cage sans pour autant être isolés car ce sont des animaux grégaires. La température, l'hygrométrie, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec des cotons et des petits abris. Une surveillance quotidienne du personnel de l'animalerie et un suivi régulier de l'expérimentateur (au moins 1 fois par semaine) avec la prise en compte de différents éléments bien définis tels que l'aspect du pelage et des yeux, le poids et le comportement des souris permet d'éviter toute souffrance des animaux. Nos analyses sont précoces et concernent les phases de lésions pré-cancéreuses. Les souris sont euthanasiées pour analyse avant de développer un cancer.
Choix des espèces
Les souris modifiées génétiquement sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques de pathologie humaine. L’objectif du projet est d’étudier le développement et l’évolutivité de lésions pré-cancéreuses pancréatiques grâce au modèle de souris et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les souris seront utilisées à l’âge de 5 semaines car au tout début de l’âge adulte. On laisse les lésions pré-cancéreuses se développer dans ce modèle de souris jusqu’à l’âge de 4 mois (ce qui correspond à environ 1/4 de la durée de vie de la souris). Cela permet d’étudier l’impact de notre gène d’intérêt dans l’initiation et la progression de ces lésions précancéreuses.
Etude de la stéatose hépatique non alcoolique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
2 130 souris pour une seule maladie provoquée par l'alimentation, 1 380 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 750 un niveau léger, toutes tuées. Chacune peut recevoir une injection intrapéritonéale par semaine pendant 24 semaines, subir trois microcoupures de la queue, une biopsie de la pointe de la queue à dix jours, un gavage et deux jeûnes de six et quinze heures. Le régime riche en graisse les fait grossir jusqu'à 45 grammes et les rend moins actives, effet recherché puisque le projet reproduit la stéatose hépatique liée à l'obésité et au diabète de type 2. Les souris dont le génotype ne convient pas sont tuées à trois ou quatre semaines de vie, et le porteur justifie l'ensemble en une phrase, les modèles in vivo étant "indispensables" pour analyser la signalisation entre organes.
Objectifs
La stéatose hépatique non-alcoolique est une maladie chronique caractérisée par une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation. Elle est plus fréquente chez les personnes atteintes d’obésité et/ou du diabète de type 2. Nous allons soumettre des modèles de souris à différents régimes induisant des dommages au foie pour comprendre le développement et les facteurs contribuant à cette maladie et proposer des solutions thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de définir une nouvelle approche thérapeutique dans la stéatose hépatique non-alcoolique et ses complications. Il apportera des connaissances fondamentales nécessaires au développement de thérapies ciblées sur les macrophages hépatiques. Des médicaments pourraient être developpés pour inhiber/activer spécifiquement les voies métaboliques spécifiques des macrophages révélées par ce projet. Considérant que la stéatose hépatique touche environ 1 être humain sur 4, les bénéfices de ce projet sont importants.
Procédures
-Microcoupure à la queue : 3X,5 seconds. -Biopsie de l'extrême pointe de la queue à l’âge de 10 jours: 1X, 5 seconds. Injection intrapéritonéale, 10s, 1X par semaine, pendant 24 semaine et 7X pendant une semaine. - Mise à jeun, 15h, 1X par animal. - Mise à jeun, 6h, 1X par animal. - Gavage, 10s, 1X par animal.
Impact sur les animaux
Régime riche en graisse: les souris vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines (jusqu’à 45 grammes) et devenir un peu moins actifs. - Injection intrapéritonéale (IP) : douleur légère due à la piqure et possible nécrose ou irritation. - Microcoupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. - Mise à jeun : Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. - Gavage : stress dû à la contention et à la sonde de gavage. - Biopsie de l'extrême poite de la queue à l'age de 10 jours pour génotypage: douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les différentes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet. Les animaux dont le génotype n'est pas conforme seront également mis à mort à l'issue du génotypage (3-4 semaines de vie).
Remplacement
Pour réaliser les tests de métabolisme systémique et d’analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.
Réduction
Le nombre de souris est reduit a son minimum. De nombreux tissus seront collectes apres mise a mort, afin d'approfondir les etudes moleculaires et cellulaires. Chaque souris generera donc de nombreuses informations. De plus nous avons determine un nombre de souris par groupe en fonction de donnees de la litterature et grâce à l’utilisation d’un outil statistique adapté.
Raffinement
Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Pour limiter les nuisances/effets indésirables par exemple Injection intrapéritonéale, nous utiliserons d’une aiguille fine pour gavage un sonde souple. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et lorsque cela est nécessaire une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les personnel seront formé à ces techniques.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. Dans la littérature, les modèles murins sont largement utilisés dans les études sur l’obésité. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales seront adultes uniquement.
Déchiffrer le code de compatibilité entérofécal après transplantation de microbiote fécal pour contourner la resistance aux inhibiteurs des points de contrôle immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 136 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et, selon les protocoles, chacune peut recevoir une tumeur, deux administrations orales de matières fécales de souris, jusqu'à quatre traitements d'immunothérapie et une prise de sang par semaine. Certaines procédures ajoutent une chirurgie de cinq minutes sous anesthésie générale pour injecter un traceur qui suit la migration des cellules. Toutes les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour l'analyse de leurs organes. L'équipe cherche à comprendre pourquoi une transplantation de microbiote fécal réussit ou échoue à lever la résistance des patients aux immunothérapies contre le cancer, avec un bénéfice renvoyé à plus tard, mieux choisir donneurs et patients, quand la douleur liée à la tumeur et une possible perte de poids sont prévues pour les souris.
Objectifs
Des précédentes études ont montré l'impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse immunitaire et la réponse aux traitements par immunothérapies contre le cancer. Il a d’abord été montré que la prise d’antibiotiques (ATB), en créant une dysbiose intestinale, est associée à une diminution de l’efficacité de ces immunothérapies dans de nombreux types de cancers. Puis, des compositions spécifiques du microbiote intestinale ont été mises en évidence comme étant associées à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies. Ensuite, des travaux sur des modèles de souris ont permis de démontrer que la transplantation de microbiote fécal (TMF) à partir de selles de patients répondeurs ou résistants aux immunothérapies conduisait à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies chez ces souris, respectivement. Finalement, la transplantation de microbiote fécal chez les patients parait être une approche efficace pour contourner la résistance aux immunothérapies induite par une dysbiose intestinale. Malgré des résultats prometteurs en clinique, il est nécessaire de comprendre les mécanismes qui expliquent la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. L'objectif principal de ce projet est de décrire les effets de la transplantation de microbiote fécal sur le système immunitaire et son implication dans la réponse antitumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes expliquant la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. Cela permettra par la suite de mieux sélectionner les donneurs pour la transplantation, ainsi que de mieux sélectionner les patients pouvant recevoir la transplantation de microbiote fécal. De plus, ce projet apportera plus de compréhension sur les liens existants entre le microbiote intestinale, le cancer et la réponse aux immunothérapies. Enfin, par la compréhension des ces mécanismes, les patients ayant une dysbiose intestinale et résistants aux immunothérapies pourront bénéficier d'une tranplantation de microbiote fécal afin de contourner cette résistance.
Procédures
Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation d'une tumeur (une fois, d'une durée d'1 minute), l'administration orale de matières fécales murines (2 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie (4 fois maximum, durée 1 minute), l'injection au niveau de la queue (une fois, durée 1 minute, anesthésie locale). De plus, il est prévu pour certaines procédures d'utiliser un traceur pour suivre la migration cellulaire, nécessitant une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale, d'une durée de 5 minutes (une fois). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, au maximum 1 fois par semaine (durée 5 minutes). Les injections seront réalisées sous anesthésie locale.
Impact sur les animaux
Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures une douleur et une gêne modérée liée à l'implantation d'une tumeur, un inconfort lié à l'administration de matières fécales par voie orale au moment de l'administration, ainsi qu'une potentielle perte de poids liée à la tumeur, aux traitements et à l'administration des matières fécales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes pour analyser les tissus, les cellules, doser des protéines ou de l'ADN.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles, dont certaines dites "GO-NO-GO", et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. Notre critère de jugement principal est le suivi de la croissance tumorale. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière quotidienne permettra le suivi clinique de la souris ainsi que de son comportement, permettant l’éventuelle mise en place de mesures d'analgésie. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale. Les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières. Les points limites précoces seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique et l'immunotlogie sont proches de celle de l’Homme et bien connues. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des bactéries et de la transplantation de microbiote fécal sur l’immunité et la réponse antitumorale. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cette âge là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.
Etablissement du phénotypage de modèles de phase maniaque du trouble bipolaire chez la souris par injections répétées de stimulants 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
400 souris sont utilisées dans ce second établissement du projet, 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré, toutes tuées et leur cerveau prélevé pour des études ultérieures. Injections répétées d'amphétamine ou d'un bloqueur du transporteur de la dopamine, contentions, isolement, six à huit tests comportementaux passés une fois chacun. Le projet vise l'acquisition par le laboratoire de méthodes d'étude de la phase maniaque du trouble bipolaire, aucun traitement n'étant évalué à ce stade. Le porteur écrit que le stress chez l'animal "comme modèle de pathologie psychiatrique humaine" repose sur l'observation du comportement, et qu'aucune méthode in vitro n'y répond.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. Le but de ce projet est à court terme d’établir des méthodes d’étude de la phase maniaque du trouble bipolaire au niveau comportemental. En effet, notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, mais pas des phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir des tests comportementaux pertinents pour des études ultérieures avec un modèle simple à mettre en œuvre avec administration d’un stimulant mimant certains aspects de la manie chez des souris des deux sexes. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude participera à établir de nouveaux tests comportementaux dans notre laboratoire pertinents pour développer de nouveaux modèles murins de trouble bipolaire, mais qui pourront aussi servir pour étudier d’autres pathologies étudiées dans notre équipe de recherche.
Procédures
Selon le groupe traité, 5 à 7 injections intrapéritonéales sont réalisées respectivement 1 jour sur 2 (GBR, un stimulant spécifique du transporteur de la dopamine) ou tous les jours (amphétamine). Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test n'a lieu qu'une seule fois (6 à 8 tests selon le groupe). Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris, en-dehors du test de préférence au sucrose (qui a lieu sur 5 jours) et du test du nid (qui a lieu sur 24h). Les deux premier groupes (80 animaux au total) seront réalisés dans l'EU1, le reste dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales (5 à 7 fois), sont espacées de 24h au moins, et les doses de GPR et AMPH sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. Les stimulants eux-même peuvent générer de l’anxiété en lien avec leurs effets aigus et des phénotypes anxio-dépressifs en lien avec le sevrage.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). Notre stratégie des 8 groupes suit une analyse statistique de puissance a priori : avec deux groupes (contrôles et stressés), un effet attendu modéré, on utilisera un test utilisé de manière standard dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. Dans ce cas, une euthanasie (injection létale) sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. Aucun transport d'animaux ne sera réalisé entre les deux sites.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 8 semaines ou plus. Les modèles stimulants ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.
Etablissement du phénotypage de modèles de phase maniaque du trouble bipolaire chez la souris par injections répétées de stimulants 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Mettre au point des tests comportementaux dont le laboratoire déclare ne pas disposer mobilise 400 souris, 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Cinq à sept injections intrapéritonéales d'amphétamine ou d'un stimulant du transporteur de la dopamine précèdent six à huit tests comportementaux, dont le test de préférence au sucrose sur cinq jours et le test du nid sur vingt-quatre heures. Le porteur indique que les stimulants peuvent provoquer de l'anxiété par leurs effets aigus, et des phénotypes anxio-dépressifs au sevrage. La mise à mort intervient en l'absence d'amélioration au bout d'une semaine, seule limite temporelle que le résumé oppose à la souffrance sévère déclarée pour 320 souris.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. Le but de ce projet est à court terme d’établir des méthodes d’étude de la phase maniaque du trouble bipolaire au niveau comportemental. En effet, notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, mais pas des phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir des tests comportementaux pertinents pour des études ultérieures avec un modèle simple à mettre en œuvre avec administration d’un stimulant mimant certains aspects de la manie chez des souris des deux sexes. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude participera à établir de nouveaux tests comportementaux dans notre laboratoire pertinents pour développer de nouveaux modèles murins de trouble bipolaire, mais qui pourront aussi servir pour étudier d’autres pathologies étudiées dans notre équipe de recherche.
Procédures
Selon le groupe traité, 5 à 7 injections intrapéritonéales sont réalisées respectivement 1 jour sur 2 (GBR, un stimulant spécifique du transporteur de la dopamine) ou tous les jours (amphétamine). Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test n'a lieu qu'une seule fois (6 à 8 tests selon le groupe). Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris, en-dehors du test de préférence au sucrose (qui a lieu sur 5 jours) et du test du nid (qui a lieu sur 24h). Les deux premier groupes (80 animaux au total) seront réalisés dans l'EU1, le reste dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales (5 à 7 fois), sont espacées de 24h au moins, et les doses de GPR et AMPH sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. Les stimulants eux-même peuvent générer de l’anxiété en lien avec leurs effets aigus et des phénotypes anxio-dépressifs en lien avec le sevrage.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). Notre stratégie des 8 groupes suit une analyse statistique de puissance a priori : avec deux groupes (contrôles et stressés), un effet attendu modéré, on utilisera un test utilisé de manière standard dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. Dans ce cas, une euthanasie (injection létale) sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. Aucun transport d'animaux ne sera réalisé entre les deux sites.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 8 semaines ou plus. Les modèles stimulants ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.
Etude de la fonction des cellules endothéliales en contexte physiologique, de régénération du thymus et de dissémination leucémique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées a 12 ou 18 mois, choisies pour leur involution thymique avancée, d'autres reçoivent une injection de cellules leucémiques. 295 souris vont être utilisées, 175 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau sévère, toutes tuées pour analyse. Deux séries de quatre injections quotidiennes éliminent un récepteur dans les cellules des vaisseaux sanguins, avant trois injections du ligand testé et des prises de sang sur animaux vigiles. Le porteur décrit une leucémie qui génère un inconfort et une douleur prolongée, précise que ce modèle est létal au-delà de 21 jours, et fixe la mise à mort au dixième jour au plus tard.
Objectifs
Notre projet de recherche porte sur la régulation du développement des lymphocytes T (LT). Les LT se développent au sein du thymus, hébergeant leur production et leur sélection. Or, le thymus est un organe extrêmement sensible aux perturbations de la physiologie tel que le vieillissement. En effet, avec l’âge, le thymus subit une réduction drastique en taille et en fonctionnalité. Ce processus résulte en une forte altération de la production de nouveaux LT, réduisant ainsi fortement leur renouvellement dans l’organisme. Ceci résulte en une susceptibilité accrue de l’organisme aux infections, aux pathologies auto-immunes et aux cancers. De manière intéressante, notre équipe a identifié que l’administration d’une protéine ligand-X capable de se fixer sur un récepteur-Y spécifique présent sur les cellules du thymus promeut la régénération de cet organe et la production des LT au cours de l'involution associée à l'âge. Nos résultats montrent que l’action de cette molécule est médiée par une amélioration du nombre et de la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins. Ce projet s’intéresse à comprendre comment ce Ligand-X agit sur la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins du thymus. Ainsi, le premier objectif de notre projet est de caractériser le rôle de l’axe ligand-X/ récepteur-Y dans la physiologie des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques ainsi que de déterminer le rôle de ces cellules dans la régénération du thymus. De plus, puisque le ligand-X est important pour la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques et que nos résultats démontrent que les cellules leucémiques produisent fortement cette protéine ligand-X, nous émettons l’hypothèse que l’axe ligand-X/récepteur-Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins est impliqué dans la dissémination des cellules leucémiques. Ainsi, le deuxième objectif vise à démontrer et caractériser le rôle de cet axe dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques au cours de la leucémie. Ce projet permettra d’évaluer le rôle de l’axe ligand-X/récepteur-Y dans la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques en contexte physiologique, de régénération du thymus, de dissémination leucémique et de réponse vaccinale.
Bénéfices attendus
Du fait du vieillissement progressif de la population et de l’amélioration de l’espérance de vie, l’immunodéficience liée à l’âge, étroitement corrélée avec le processus d’involution thymique, devient une préoccupation de santé publique majeure. Notamment, de nombreuses études révèlent un lien étroit entre le vieillissement et l’incidence des cancers. Ainsi, notre projet est susceptible d’avoir des retombées majeures dans la compréhension et la lutte contre le vieillissement immunitaire. A moyen terme, notre étude évaluera le rôle des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques et de l’axe ligand-X/récepteur-Y dans la régénération thymique. Par ailleurs, notre étude du rôle de l’axe ligand-X /récepteur-Y dans la dissémination leucémique permettra de mettre en avant une nouvelle cible thérapeutique, particulièrement en ciblant cet axe afin de limiter l’invasion dans les tissus. A plus long terme, nos études devraient participer au développement des thérapies promouvant le vieillissement en bonne santé en corrigeant les défauts de développement thymique liés à l’âge et pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients atteints de leucémies.
Procédures
Pour l’étude du rôle du ligand-X dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques, des souris âgées de 8 semaines, 12 mois (involution thymique avancée) ou 18 mois (involution thymique très avancée) vigiles recevront 2 séries d’injections (1 injection quotidienne par série de 4 jours, espacée de 3 jours de la suivante) permettant d’éliminer le récepteur Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins. Trois jours après la dernière injection, les souris âgées de 12 et 18 mois seront traitées avec le ligand-X ou un contrôle par injection sous anesthésie gazeuse légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. Une partie des animaux recevront des progéniteurs de lymphocytes T par injection sous anesthésie gazeuse légère. La fonctionnalité des cellules sera ensuite analysée. Pour le modèle de leucémie, les souris âgées de 8 semaines recevront 2 séries d’injections (1 injection quotidienne par série de 4 jours, espacée de 3 jours de la suivante) permettant d’éliminer le récepteur Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins. Trois jours après la dernière injection, les animaux recevront une injection de cellules leucémiques sous anesthésie gazeuse légère durant 2 minutes par animal. Aux jours 3 et 6 après l’injection des cellules leucémiques, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang sur animaux vigiles. Finalement, pour les tests de réponse vaccinale, des souris de 12 mois seront traitées avec le ligand-X ou un contrôle sous anesthésie gazeuse légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. 28 jours après la première injection, les animaux recevront par voie sous-cutanée une protéine A en tant que modèle de vaccination sous anesthésie gazeuse légère.
Impact sur les animaux
Les injections intraveineuses (sous anesthésie gazeuse légère) et intrapéritonéales peuvent générer un stress, un inconfort et une douleur légère de courte durée. Concernant le modèle de leucémies, la maladie peut générer des nuisances caractérisées par un inconfort et une douleur prolongée. Bien que ce modèle puisse être léthal au-delà de 21 jours, les souris seront mises à mort et analysées à un temps court (maximum 10 jours) dans le cadre de ce projet. Les nuisances possibles sont : un stress, une perte de poids et une potentielle douleur prolongée. Concernant le modèle de réponse vaccinale, les injections sous-cutanées (sous anesthésie gazeuse légère) peuvent générer un stress et une douleur légère de courte durée et peuvent éventuellement générer une inflammation locale, qui sera surveillée quotidiennement attentivement. Les nuisances possibles sont : un stress, une perte de poids et une potentielle douleur modérée et prolongée.
Devenir
Les animaux utilisés seront mis à mort pour l'analyse à la fin des procédures.
Remplacement
A ce jour, aucune alternative non animale permet d’étudier l’effet de la régénération de la production du thymus par le traitement ligand-X. De plus, l’étude de la dissémination leucémique au sein des tissus nécessite l’utilisation du modèle in vivo. Notre projet nécessite donc une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes tissulaires et cellulaires impliquées dans la réponse étudiée.
Réduction
Le choix du nombre d’animaux est réalisé afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Il prend en considération la variabilité inter-individuelle, la variabilité de réponse au traitement et la variabilité de charge leucémique. Après la première expérience, le nombre d'animaux à utiliser sera ajusté après estimation du nombre d'animaux nécessaires pour garantir un résultat fiable. D’après nos analyses de la littérature et notre expérience passée, un nombre de 9 à 15 animaux par groupe devraient fournir des résultats suffisamment robustes et interprétables. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront répartis en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience, e.g. l'étude de la dissémination leucémique chez les animaux et l’étude de l’effet d’une neutralisation du ligand-X chez ces animaux.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Concernant le stress de manipulation, les animaux seront manipulés par un seul expérimentateur sauf pour l’étape de répartition dans les groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésiés gazeuse légère par inhalation gazeuse avant chaque injection intraveineuse. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance quotidienne ou tous les deux jours selon la procédure, afin d’identifier tout signe de gêne ou de douleur, à l’aide d’une grille d’évaluation dans le cas de la leucémie. Entre autres, les animaux seront pesés tous les jours avec une balance de précision, et seront soumis à une surveillance accrue dès l’identification d’une perte de poids. En cas de faiblesse pouvant générer un défaut d’alimentation ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Les signes de douleurs seront monitorés avec précision selon la grille d’évaluation, et des analgésiques seront administrés à l’apparition de signes de douleurs.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix des divers projets de l’équipe, adapté à l’analyse du système immunitaire, et en particulier du thymus, ainsi qu’à l’oncologie. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons ont un fond génétique stable et après traitement, le récepteur Y sera spécifiquement mutée dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques . Trois âges sont prévus : -stade jeune : souris de 8 semaines. -stade avancé d’involution thymique : souris âgées de 12 mois. -stade très avancé d’involution thymique : souris âgées de 18 mois.
Investigation du rôle des systèmes neuromodulateurs dans l’alignement de l’axe vertébral du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
2 012 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, 1 824 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 188 un niveau sévère. Une partie est exposée vingt heures par jour pendant quatre jours à un composé pharmacologique qui déforme la colonne vertébrale, avec une mortalité attendue jusqu'à 40 % chez les larves traitées. D'autres subissent une biopsie de la nageoire caudale, une immobilisation en gel d'agarose, une injection intramusculaire paralysante, puis jusqu'à quarante-cinq minutes d'illumination laser des tissus. Le porteur écrit que cette étude "ne peut donc être soumise au principe de remplacement", au motif que seules des espèces pourvues d'une colonne vertébrale permettraient d'étudier la scoliose.
Objectifs
Les déformations de la colonne vertébrale regroupent des pathologies de l’alignement du rachis qui surviennent autour de la période de forte croissance chez l’adolescent. Parmi elles, la scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est la plus fréquente : elle consiste en des désalignements des vertèbres qui touchent 1 à 4% de la population. La correction de ces déformations spontanées, détectées principalement chez les filles, se base sur le port prolongé de corsets et sur des chirurgies invasives de fusions vertébrales dont le but est de recouvrer une posture correcte et d’atténuer les douleurs thoraciques associées. A ce jour, aucun traitement non invasif n’existe pour traiter la SIA, faisant de la compréhension de ses causes un enjeu majeur pour son traitement mais aussi pour sa détection précoce. L’étiologie de la SIA est restée longtemps peu comprise, principalement à cause de l’absence de modèles intégrant la complexité spatiale, temporelle et moléculaire, impliquée dans le développement et la consolidation du squelette vertébral. Récemment, le poisson zèbre a émergé comme un modèle puissant pour cette pathologie. Des travaux récents ont montré que le système nerveux est à l’origine de voies importantes, mais encore mal comprises, dans l’établissement de l’alignement de la colonne vertébrale au cours du développement post-embryonnaire. La finalité de ce projet est donc de comprendre, en utilisant le poisson zèbre comme modèle animal, par quels mécanismes le système nerveux influence l’alignement de la colonne vertébrale au cours du développement post-embryonnaire.
Bénéfices attendus
Ce projet offre deux bénéfices principaux. Du point de vue scientifique, il permettra à court terme (pendant la durée du projet) de faire progresser les connaissances liées à l’influence du système nerveux sur l’alignement de la colonne vertébrale ainsi que sur les mécanismes sous-jacents qui se mettent en place au cours du développement post-embryonnaire et de la croissance de l’organisme. Du point de vue sociétal, il permettra à plus long terme d’identifier de nouveaux marqueurs de progression ou de nouvelles cibles pharmacologiques potentielles permettant d’infléchir l’évolution de la scoliose idiopathique de l’adolescent.
Procédures
Les signes cliniques attendus dans nos modèles de scoliose consistent en des déformations de la colonne vertébrale, sans troubles visibles attendus en termes de douleur, de nage, de comportement, ou d’alimentation (durée attendue des signes cliniques allant de 2 à 32 semaines en fonction des lots). Des animaux seront exposés à des traitements pharmacologiques délivrés directement dans l’eau permettant de mettre en place un de nos modèles de scoliose (un traitement par animal 20h par jour avec 4h de récupération, pendant 4 jours ; durée attendue des signes cliniques de 8 jours). Les animaux, sous anesthésie profonde, seront soumis soit à une biopsie de la nageoire caudale (biopsie de 1-2 mm, une fois par animal, 30 secondes), soit à des immobilisations en gel d’agarose (indolore, 1 fois par animal, durée : 10 à 15 minutes) suivies d’injections intramusculaires (une fois par animal, 2 secondes) suivies de d’enregistrements non invasifs d’images en fluorescence à des stades du développement où ils sont transparents et optiquement accessibles (une fois par animal, 30 à 45 minutes). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure.
Impact sur les animaux
La première catégorie d’effets indésirables attendus est liée à l’apparition de déformations de l’axe du corps chez des animaux mutants et chez des animaux exposés à des traitements pharmacologiques permettant établir notre modèle. Ce signe clinique apparait spontanément chez les mutants étudiés (à environ 2 semaines d’âge) et sera effectif jusqu’à la fin des procédures expérimentales associées. Il sera induit pharmacologiquement chez les animaux traités pendant une durée de 7 jours. Les observations reportées dans la littérature et nos observations préliminaires n’indiquent aucun impact détectable de ce signe clinique sur l’alimentation des animaux, leur comportement de nage en milieu aquatique, et leurs interactions en groupe social, suggérant des conséquences modérées en termes de stress, de douleur ou de mobilité. La deuxième catégorie d’effets indésirables attendus est liée aux actes expérimentaux nécessaires pour effectuer des expériences d’imagerie. Elle comprend le prélèvement des animaux de leur aquarium avec une épuisette, l’anesthésie, l’immobilisation d’animaux profondément sédatés, la paralysie par injection intramusculaire, et l’illumination des tissus avec un laser. Les effets indésirables prévus pour ces animaux couvrent donc le stress induit par la manipulation jusqu’à la sédation, leur immobilisation après une sédation profonde, la douleur causée par une aiguille permettant de procéder à une injection intramusculaire et l’illumination des tissus sous un microscope à fluorescence, couvrant une durée ne dépassant pas 60 minutes par animal. La troisième catégorie d’effets indésirables concerne la toxicité du composé pharmacologique délivré dans l’eau permettant de mettre en place un de nos modèles de scoliose, auquel les animaux seront exposés et qui nécessitera une modification des conditions d’hébergement (modification du cycle jour-nuit), pouvant générer un stress, et diminuera leur taux de survie pendant la période d’exposition. Enfin l’acte de biopsie consistant à prélever un échantillon de nageoire caudale chez des adultes sous anesthésie générale afin d’identifier leur statut génétique constitue la dernière catégorie de nuisance pour les animaux étudiés.
Devenir
Pour toutes les procédures de ce projet, les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de nous permettre de réaliser les analyses prévues post-mortem. Elles comprennent des analyses de l’alignement vertébral, d’histologie, d’anatomie, et de prélèvement de tissus post-mortem qui seront utilisés pour des analyses de biologie moléculaire nous permettant de caractériser génétiquement chaque animal.
Remplacement
La scoliose idiopathique est une déformation de la colonne vertébrale qui apparaît spontanément chez l’adolescent au cours de la puberté. L’étude des origines génétiques ainsi que des mécanismes biologiques qui la sous-tendent ne peut donc être réalisée que chez espèces pourvues de colonnes vertébrales. Aucune alternative non animale n’existe à ce jour permettant d’étudier ces questions, notamment le rôle du système nerveux dans l’alignement vertébral, ni de sonder les conséquences induites par la manipulation de ce système sur leurs cibles en aval. Cette étude ne peut donc être soumise au principe de remplacement.
Réduction
2012 animaux seront utilisés dans ce projet. Afin de limiter le plus possible le nombre d’animaux prévus dans notre étude, nous avons évalué le nombre d’individus nécessaires pour chaque procédure en se basant sur : (i) l’identification de lots déterminés par les stades développementaux clés pour mener nos investigations et tester nos hypothèses de travail, (ii) une estimation de l’échantillonnage nécessaire pour détecter les effets biologiques testés, basée sur une comparaison statistique, (iii) la prise en compte d’une comparaison de groupes expérimentaux liée à l’identité génétique de frères et sœurs dont la distribution est connue, (iv) un taux de survie estimé à 80 pour cent pour les alevins mis élevage, (v) une mortalité maximale estimée à 40 pour cent pour les larves exposées au traitement pharmacologique permettant de mettre en place notre modèle, (vi) la prise en compte d’un échantillonnage équivalent de mâles et de femelles. Pour chaque quantification effectuée, les tests statistiques appropriés seront utilisés pour évaluer la significativité des effets observés dans nos procédures. Certains animaux seront utilisés pour mener des investigations post-mortem et répondre à plusieurs questions scientifiques. Pour chacune des procédures conçues, un nombre d’animaux inférieur à celui prévu sera utilisé si nos résultats sont statistiquement fiables avant l’utilisation de l’ensemble des animaux envisagés. En particulier, nous tenterons de développer une technique de biologie moléculaire nous permettant de caractériser génétiquement chaque animal de façon précoce avant leur mise en élevage. Si cette implémentation s’avère fructueuse, un nombre moins important d’animaux sera effectivement utilisé, notamment pour les groupes témoins, pour atteindre des résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée, où les paramètres environnementaux sont vérifiés, contrôlés et adaptés si nécessaire (qualité et température de l’eau, cycle lumineux, etc.). Les animaux seront nourris 1 à 2 fois par jour avec une alimentation adaptée à leur stade physiologique. Les mesures spécifiques de raffinement qui seront prises incluent : (i) une surveillance accrue des mutants étudiés et des animaux soumis aux traitements pharmacologiques permettant d’induire des scolioses, afin de détecter et limiter les signes de mal-être liés à leur désalignement axial ou à l’exposition au composé pharmacologique utilisé à cet effet, (ii) l’hébergement des animaux par groupes de phénotypes semblables dès que possible au cours du développement post-embryonnaire afin de limiter un accès compétitif à la nourriture si cela est pertinent, (iii) l’utilisation d’une grille de score standardisée au sein de la structure d’hébergement, permettant d’évaluer les signes de mal-être, de douleur ou de souffrance et permettant une prise en charge rapide et optimale par l’utilisateur en coordination avec la structure chargée du bien-être animal et l’équipe vétérinaire, (iv) l’identification de points limites pour chacune des procédures permettant une prise en charge rapide et optimisée en fonction des procédures expérimentales, (v) l’utilisation d’un composé non aversif et à induction rapide pour l’anesthésie et l’euthanasie, (vi) le choix de manipulations douces des animaux avec des instruments atraumatiques (épuisette, cuillère), (vii) la mise en place d’une habituation des animaux à un changement environnemental lorsque cela est pertinent, (viii) l’optimisation d’une technique de biologie moléculaire permettant de caractériser génétiquement chaque animal de façon précoce avant sa mise en élevage afin de permettre l’hébergement d’animaux qui auront des signes cliniques comparables, avant que ces derniers ne se déclarent ; (ix) une technique de biopsie sur animaux adultes sous anesthésie générale à induction rapide incluant des manipulations atraumatiques et un prélèvement limité avec des outils désinfectés.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre constitue un modèle de choix pour l’étude de la scoliose idiopathique de l’adolescent. En effet, sa colonne vertébrale partage les mêmes caractéristiques morphoanatomiques que celles de l’homme. Elle est soumise, du fait qu’il évolue en milieu dense, à des forces biomécaniques similaires à celles des espèces bipèdes, contrairement aux quadrupèdes dont le rachis subit des sollicitations influencées par une perception différente de la gravité. Le poisson zèbre possède un génome conservé à 70 pour cent avec celui de l’homme, permettant des analyses étiologiques poussées. Il présente enfin l’avantage de se reproduire en milieu externe et de rester optiquement transparent pendant une large partie de son développement post-embryonnaire, permettant d’implémenter des méthodes non invasives basées sur la microscopie in vivo afin de mener les investigations appropriées sans induire de dommages durables. Chez le poisson zèbre, des animaux âgés de 4 à 29 jours post fertilisation sont considérés comme des larves, des animaux âgés entre 30 et 89 jours post fertilisation sont considérés comme des juvéniles, et au-delà de 90 jours post fertilisation comme des adultes. Dans ce projet, 1556 animaux seront utilisés au stade larvaire (7 jours à 4 semaines post fertilisation), 52 animaux au stade juvénile (6 semaines post fertilisation) et 404 animaux au stade adulte (12 et 32 semaines post fertilisation) afin de répondre aux questions scientifiques testées.
Etude de la vulnérabilité aux maladies psychiatriques chez un modèle murin hypocholinergique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Quinze minutes d'observation par jour pendant trois semaines sous pulvérisations de spray sucré, dix injections intrapéritonéales en dix jours, une restriction alimentaire faisant perdre jusqu'à 25 % du poids : 1 000 souris vont être utilisées, 336 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 664 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Certaines subissent en plus une chirurgie cérébrale de deux heures pour injecter un virus et implanter des fibres. Le porteur cherche à provoquer des comportements compulsifs, toilettage excessif, anorexie d'activité sur roue, effets de substances psychoactives, chez une lignée porteuse d'un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques. Il affirme que l'absence de méthodes alternatives l'"oblige" à recourir à ces modèles murins, et ne dit rien de ce qu'un comportement de souris permet de conclure sur un trouble psychiatrique humain.
Objectifs
Ce projet de recherche s’intéresse aux mécanismes communs sous jacents aux maladies psychiatriques. Les comportements habituels persistants et la compulsion sont considérés comme des caractéristiques communes à plusieurs pathologies telles que les troubles obsessionnels compulsifs, les troubles liés à la consommation de substances et les troubles du comportement alimentaire. L’identification d’un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques constitue un atout pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux pouvant être à l’origine de ces désordres psychiatriques à composante compulsive sur un modèle murin. Les objectifs de ce projet sont 1) identifier la vulnérabilité aux compulsions de ce modèle murin, 2) comprendre comment ce variant module l’activité de certaines régions cérébrales au cours de la mise en place de ces comportements compulsifs et 3) identifier des stratégies thérapeutiques pharmacologiques pour rétablir un comportement normal chez ce modèle murin.
Bénéfices attendus
Notre projet tend à comprendre les mécanismes neuronaux sous jacents à la mise en place de maladies psychiatriques à composante compulsive. A l’heure actuelle très peu de données permettent d’y voir clair et d’envisager une thérapie visant à empêcher voir réduire la sévérité de ces pathologies pour certaines mortelles. Notre travail permettra une meilleure compréhension sur ce sujet ainsi que d’approfondir nos connaissances sur ces pathologies psychiatriques. Nos travaux identifieront des facteurs et des processus qui permettront par la suite d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques afin de lutter contre ces maladies dévastatrices.
Procédures
Six procédures expérimentales seront effectuées afin de comprendre les bases neurobiologiques des désordres compulsifs. En utilisant des modèles murins nous évaluerons l’efficacité d’un traitement pharmacologique sur le rétablissement d’un comportement normal. Un premier aspect consistera à s’intéresser à la mise en place comportementale de la compulsion en étudiant le toilettage compulsif chez les animaux (procédures 1 et 4) à travers l’exposition et l’analyse comportementale des animaux exposés à des pulvérisation de spray sucrée sur le pelage (15 min d’observation quotidienne durant 3 semaines max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (10 injections max à raison 1 fois par jour pendant 10 jours–quelques secondes). Nous nous intéresserons ensuite à la compulsion observée lors de la mise en place de troubles du comportement alimentaire (procédures 2 et 5). Les animaux seront individualisés, exposés à une roue d’activité (libre accès dans la cage durant 3 semaines environ) et l’apport en aliment sera contrôlé (sur une période de 10 jours max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (7 injections max à raison 1 fois par jour pendant 7 jours max–quelques secondes). Enfin, nous nous intéresserons aux effets après administration ou non de substances psychoactives (procédure 3) délivrées quotidiennement en intrapéritonéale (1 injection par jour durant 6 jours – quelques secondes) et leur comportement sera enregistré avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale en amont (6 injections maxi à raison 1 fois par jour pendant 6 jours–quelques secondes). Les procédures 4 et 5 incluront une unique chirurgie au niveau cérébral qui se déroulera avant la mise en place des comportements de compulsion. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie permettra de pouvoir suivre les modifications neurobiologiques. Enfin, la procédure 6, inclura une chirurgie au niveau cérébral permettant d’administrer des vecteurs viraux permettant de modéliser différents modèles. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront ensuite exposés aux 2 types de compulsions (toilettage et alimentaire) de manière successive avec un temps de repos entre les deux. Les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour effectuer des analyses de prélèvements biologiques.
Impact sur les animaux
1/ La mise en place de la compulsion de toilettage peut entrainer un stress ou une anxiété chez les animaux (perte de poids 5-1 pourcents) 2/ L’isolement peut entraîner un stress et une souffrance chez les les animaux 3/ L’ABA nécessitant une restriction alimentaire progressive entraine une perte de poids conséquente chez l’animal après plusieurs jours (5-25 poucents) 4/ L’injection ip peut entraîner une douleur légère au point de piqure 5/ Les chirurgies stéréotaxiques (injections de virus et implantation de fibres) peuvent entraîner un affaiblissement des animaux pendant les heures suivant celles-ci. Un risque d’inflammation peut aussi être considéré suite aux sutures 6/ Un risque d’hypothermie est possible sous anesthésie tout comme un arrêt cardio-respiratoire
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses immunohistochimiques et moléculaires.
Remplacement
Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs impliqués dans la mise en place des désordres psychiatriques que nous étudions. Ainsi l’utilisation de rongeurs est nécessaire dans la mise en œuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires, moléculaires et neuronaux rentrant en jeu dans ces pathologies. L’absence de méthodes alternatives quant à l’étude des comportements compulsifs (de toilettage, du comportement alimentaire et de l’addiction) nous oblige à utiliser les modèles murins proposés.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1000 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-individuelles et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux sont hébergés dans les conditions standard sur le plateau de phénotypage. Sauf procédure expérimentale le nécessitant, les souris seront hébergées par groupe de 2-5 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les animaux seront suivis durant l'ensemble de la procédure. A minima, une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire le stress. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent se battre et se blesser ; elles sont, dans ces cas, prises en charge immédiatement avec l’avis du comité de bien être animal et/ou du vétérinaire-référent de notre établissement utilisateur. Nous avons défini des points limites pour toutes les procédures. Si ces points limites sont atteints, nous consultons notre vétérinaire référent pour décider du devenir des souris.
Choix des espèces
Notre projet est basé sur l’étude d’un variant identifié chez des patients humains. L’expression de celui-ci chez la souris est indispensable pour mieux comprendre la vulnérabilité qu’il confère aux humains envers diverses maladies psychiatriques. Ainsi, le modèle souris constitue un atout pour développer efficacement notre projet. L’étude d’animaux est indispensable puisque nous explorerons les altérations physiopathologiques dans le cerveau et leurs conséquences sur le comportement. Les mécanismes qui sous-tendent le contrôle du comportement par le système nerveux central ne peuvent pas être abordés uniquement par des études à l’échelle cellulaire. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour comprendre les dysfonctionnement cérébraux opérants dans la mise en place des comportements compulsifs. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie et génomique). Nos études sur la mise en place des compulsions dans les maladies psychiatriques seront importantes non seulement pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de celles-ci mais permettront également d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques. Dans nos études, nous utilisons des animaux adultes, de plus de 8 semaines au moment du début des procédures décrites. En effet, nos études visant à identifier les bases neurales de la mise en place de comportements compulsifs se focalisent pour le moment chez l’adulte.
Evaluation de 2 nouvelles formulations à 2 doses sur la cicatrisation chez la souris Hairless Skh-1
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Tester deux formulations de gel cicatrisant à deux doses mobilise 40 souris hairless, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie de 6 mm est découpée sur toute l'épaisseur de la peau du flanc gauche de chaque souris sous anesthésie générale, puis traitée et pansée tous les deux jours sous anesthésie jusqu'à cicatrisation complète. Chaque souris reste seule en cage transparente pendant toute l'étude, pour éviter qu'elles ne s'arrachent mutuellement leurs pansements. Le porteur prévoit la mise à mort de celles qui perdent plus de 20 % de leur poids maximal ou 15 % entre deux pesées, comme de celles qui présentent cachexie, vocalises ou convulsions.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’évaluer les effets de 2 nouvelles formulations sous forme liquide formant un gel, administrées par application cutanée locale (voie topique) à 2 doses, sur le processus de cicatrisation sur un modèle de plaies cutanées induites par excision cutanée complète chez la souris. Une plaie cutanée sera réalisée sur le flanc gauche de chaque souris. Les 2 nouvelles formulations seront appliquées tous les 2 jours directement sur les plaies cutanées induites jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. Après cicatrisation complète de leur plaie cutanée, les souris seront euthanasiées avant réalisation d’un prélèvement cutané pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité sur la cicatrisation de 2 nouvelles formulations en cours de développement, formulations ayant montré des effets bénéfiques sur la prolifération cellulaire in vitro. L’évaluation se fera par des observations tous les 2 jours des plaies cutanées avec scorage de différents paramètres, la mesure de leur surface, la détermination du temps nécessaire à la cicatrisation complète, et après cicatrisation complète, par des analyses biologiques de prélèvements cutanés effectués au large de la région d’induction des plaies cutanées. Les données issues de ce projet sont d’un intérêt majeur pour déterminer les effets biologiques sur le processus cicatriciel de ces 2 nouvelles formulations in vivo dans un modèle préclinique avant d’envisager des études cliniques chez l’Homme avec l’une et/ou l’autre des 2 formulations testées.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction des plaies cutanées. Sous anesthésie générale, une plaie cutanée de 6 mm de diamètre sur toute l’épaisseur de la peau sera effectuée sur le flanc gauche de chacune des 40 souris nécessaires à la réalisation de ce projet. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures après. La chirurgie sera réalisée en 5 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les plaies cutanées seront traitées immédiatement après leur induction puis tous les 2 jours jusqu’à cicatrisation complète. Les plaies cutanées seront protégées par un pansement de couverture changé tous les 2 jours sous anesthésie générale et seront observées et scorées lors de chaque change effectué. Chaque retrait du pansement de couverture, observation et traitement des plaies cutanées et mise en place d’un nouveau pansement de couverture seront réalisés en moins de 10 minutes pour chaque souris. Un suivi quotidien des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des souris en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci.
Impact sur les animaux
L’induction des plaies cutanées peut engendrer une douleur au cours des premières heures suivant celle-ci. La répétition des anesthésies même de courte durée (moins de 10 minutes), nécessaires afin d’enlever délicatement le pansement de couverture pour observer, photographier puis traiter les plaies cutanées avant de mettre en place un nouveau pansement de couverture, induiront une nuisance pour les souris. D’autre part, un stress dû à la limitation des interactions sociales directes pourra être induit par l’hébergement en cage individuelle transparente des souris, rendu nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale permettant l’induction des plaies cutanées puis le traitement et le suivi de celles-ci jusqu’à leur cicatrisation complète, les souris seront euthanasiées. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la zone d’induction des plaies cutanées pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser les effets des traitements effectués sur la régénération du tissu cutané.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules cutanées) ou ex vivo (explants cutanés) qui ne pourraient pas être maintenus dans un état physiologique pendant une durée prolongée, au moins 2 semaines selon notre expérience du modèle de plaie cutanée utilisé. D’autre part, le processus cicatriciel met en jeu des mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé par un calcul de puissance statistique effectué à l’aide d’un logiciel adapté. Selon ce test de puissance statistique, il est ainsi nécessaire de n’utiliser que 8 animaux avec 1 plaie cutanée par animal (soit 8 plaies cutanées) par groupe expérimental pour mettre en évidence des différences significatives.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celles-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré tous les 2 jours à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, d’infection des plaies cutanées ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront placées individuellement dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé afin d’observer leur comportement avant et après traitement pendant leur phase active. Cela permet de respecter leur horloge biologique (chronobiologie) et d’évaluer l’influence des traitements sur leur activité (chronopharmacologie). Des morceaux de papier absorbants et de papier kraft seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière effectué 2 fois par semaine.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire des plaies cutanées représentatives des plaies à traiter chez l’Homme, et la souris Hairless est un modèle très utilisé et largement décrit dans la littérature scientifique pour les études dans le domaine de la Dermatologie et plus spécifiquement sur la cicatrisation. De plus, elle présente une structure de la peau relativement proche de celle de l’Homme permettant ainsi une bonne transposition des résultats obtenus. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur la cicatrisation (généralement 6 à 8 semaines), et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats très intéressants.
Campagnes Sturat. Suivi de la fraction estuarienne de la population soutenue d’esturgeons européens et des espèces piscicoles du milieu (Avenant)
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres poissons : 9000
Remis à l'eau sur leur lieu de capture, 9 070 des 9 200 poissons annoncés dans ce projet sont déclarés rendus vivants au milieu, l'écart de 130 individus restant sans explication dans le résumé. Les procédures impliquent un niveau de souffrance légère pour 9 150 poissons et modéré pour 50 d'entre eux, capturés par 126 traits de chalut de fond de trente minutes par an. Les esturgeons européens, espèce en danger critique d'extinction, sont anesthésiés puis marqués par pit-tag intramusculaire et marque transmusculaire, biopsiés à la nageoire, échographiés, photographiés et, pour 70 à 75 % d'entre eux, soumis à un lavage gastrique provoquant des spasmes pour faire régurgiter leur contenu stomacal. Le porteur estime à une cinquantaine par an les esturgeons capturés et juge cet effectif "raisonnable pour une espèce en danger critique".
Objectifs
Le projet consiste à réaliser un suivi des populations de poissons en milieu estuarien et plus particulièrement, celui d’une espèce de poisson en danger critique d’extinction, qui a bénéficié d’un plan de sauvegarde national et de soutiens via des programmes européens, l’esturgeon européen. Ces mesures ont permis de maîtriser la reproduction en captivité de ce dernier et de lâcher dans le milieu naturel des juvéniles issus de ces reproductions pour soutenir la population sauvage. Afin de connaître l’évolution de cette nouvelle population dans son milieu naturel et d’évaluer le succès de ces pratiques de repeuplement, un suivi régulier doit être mis en place. Celui-ci sera réalisé dans le milieu estuarien puisque c’est là que ces poissons vont séjourner plusieurs années avant de partir grossir en mer et de revenir en estuaire pour entamer leur migration de reproduction jusqu’aux frayères fluviales. Les possibilités de trouver des individus seront donc beaucoup plus importantes dans ces endroits qu’en pleine mer. L’espèce ayant décliné avant l’acquisition de connaissances la concernant, il est nécessaire de mieux documenter son écologie en milieu naturel (régime alimentaire, croissance, structure en âge, préférences environnementales, migrations). Lors de précédentes campagnes d’échantillonnage, une procédure-pilote de marquage et de monitoring de quelques spécimens par marque satellite a permis de documenter pour la première fois leur comportement en mer ainsi que leurs migrations entre l’estuaire et la mer. Depuis ces dernières années, quelques grands spécimens adultes ont été observés dans les fleuves (déclarations de pêcheurs professionnels), mais il n’y a aucun signe de reproduction naturelle à ce jour. Mis à part la description de sites de frayères historiques potentiels, le comportement de reproduction de l’espèce reste inconnu. Pour l’étudier, nous nous proposons de remplacer la procédure de marquage satellite par des marquages acoustiques chez quelques grands spécimens, ce qui permettra de suivre par télémétrie leurs trajectoires pour la reproduction jusque dans les fleuves.
Bénéfices attendus
L’esturgeon européen (A. sturio) ayant décliné avant l’acquisition de connaissances, il est important de mieux documenter son écologie en milieu naturel. Ce projet permettra la collecte de données sur les régimes alimentaires, structures en âge des populations, croissance, préférences environnementales, migrations. Outre leur intérêt fondamental, les résultats informeront sur l’évolution, dans son milieu, de cette population soutenue et permettront d’évaluer le succès des pratiques de repeuplement. Suite au repeuplement dans le bassin versant de plus de 1.7 M de juvéniles d’esturgeon européen entre 2007 et 2015, les individus sont actuellement en âge de se reproduire. Durant les campagnes d’échantillonnages précédentes, le marquage de grands spécimens avec des marques satellites a documenté pour la 1ère fois leur comportement en mer et leurs migrations trophiques entre l’estuaire et la mer. Cette procédure-pilote s’est avérée très informative. La modélisation des données est en cours pour reconstituer les trajectoires maritimes a posteriori ; les 1ers résultats sont encourageants mais nécessitent une analyse approfondie avant d’envisager la pose de nouvelles marques satellites. Ces dernières années, quelques grands spécimens adultes ont été observés dans les fleuves par des pêcheurs professionnels, mais il n’y a aucun signe de reproduction naturelle. Nous supposons qu’il s’agissait d’individus mâles en exploration et qu’il n’y a pas encore eu de remontée d’individus femelles. Excepté la description de frayères historiques potentielles suite aux concentrations d’individus observées par le passé, le comportement de reproduction de l’espèce reste inconnu. Le marquage par télémétrie acoustique d’une dizaine d’autres grands spécimens entre septembre 2024 et juin 2025 permettra de suivre en continu sur les prochaines années leurs trajectoires jusqu’aux fleuves. Grâce au monitoring dans les fleuves et à l’embouchure de l’estuaire, nous disposerons d’informations sur la migration de reproduction et le retour en mer des individus (trajets, périodes, vitesses). L’intérêt est l’obtention de données individuelles 1/ complémentaires, indépendantes des captures accidentelles déclarées sur la base du volontariat car l’espèce est protégée, 2/ sans avoir besoin de recapturer le poisson et 3/ sur le long terme (jusqu’à 6 ans), certains individus pouvant se reproduire chaque année ou tous les deux ans.
Procédures
Tous les 2 mois (6 campagnes/an), un échantillonnage piscicole par chalutage de fond est réalisé dans des secteurs estuariens adjacents aux fleuves dans lesquels les juvéniles d’A. sturio ont été déversés. Il s’agit de recapturer ces individus pour estimer l’évolution de leur abondance et connaître les autres populations de poissons présentes pour identifier les interactions possibles. Par campagne sont réalisés 21 traits de chalut, d’une durée de 30 min. A chaque trait, toutes les espèces présentes sont identifiées le plus rapidement possible, en les maintenant humides ou immergées (viviers), puis relâchés sur le lieu de capture. S’il s’agit d’A. sturio, on renseigne leur nombre, longueur, poids, état et numéro des marques d’identification s’ils en sont déjà dotés au moment de la capture. Si ce n’est pas le cas, les individus sont marqués pour identification (Pit-tag interne et marque numérotée externe) et de petits morceaux de nageoire sont prélevés pour réaliser des analyses génétiques (origine repeuplement ou sauvage) et isotopiques (utilisation des habitats) et estimer leur âge (durée de ces marquages et prélèvements : 2 à 3 min). En fonction de leur état, on réalise une échographie (maturité, sexage), une photographie (morphologie générale) et un lavage gastrique (exploration du régime alimentaire) (durée totale de ces 3 manipulations moins de 10 min). S’ils ont un poids suffisant, une marque à mémoire externe enregistrant température, oxygène et salinité du milieu est fixée à la base des écussons dorsaux pour documenter leurs préférences environnementales (moins de 5 min pour la pose de cette marque). Les plus gros spécimens sont aussi dotés d’une marque acoustique pour suivre leurs trajectoires, posée en interne (cavité abdominale) ou externe (à la base des écussons dorsaux) selon la date de capture et l’avancée présupposée de la maturation (environ 5 min pour cette manipulation). Pour toutes les manipulations, les esturgeons européens sont anesthésiés.
Impact sur les animaux
Ces effets sont liés au stress de capture, voire de stabulation et biométrie (confinement, émersion). La durée de chalutage est de 30 min pour limiter les blessures des poissons prélevés. Les esturgeons européens peuvent aussi subir du stress et/ou blessures occasionnés par les actes expérimentaux successifs suivants : 1) marquage individuel (Pit-tag en intramusculaire et marque numérotée en transmusculaire) et 2) prélèvements de tissus de nageoires, qui peuvent entrainer des blessures tissulaires de type plaie cutanée, mais qui ne sont pratiqués que si nécessaire (i.e. individu échantillonné pour la 1ère fois) ; 3) échographie (état de maturité, sexage) et photographie (morphologie générale), qui bien que non invasives, ne sont opérées qu’en fonction de l’état du poisson ; 4) lavage gastrique provoquant des spasmes transitoires facilitant la régurgitation du bol alimentaire, fait seulement si l’individu est en bon état ; 5) selon sa taille, pose d’une marque DST externe (fixée à la base des écussons dorsaux pour éviter d’endommager la musculature) et 6) pour les plus gros poissons, pose d’une marque acoustique interne (intra-abdominale) ou externe (à la base des écussons dorsaux) si l’individu est en période de reproduction et auquel cas, il n’est pas doté d’une DST.
Devenir
Etant donné que le projet porte sur le suivi des espèces piscicoles de l’estuaire et notamment sur le suivi, dans son milieu, de la population soutenue d’esturgeon européen, l’objectif de l’étude ne peut pas être atteint en dehors du milieu naturel. A l’issue des procédures, les poissons sont remis en liberté dans leur secteur de capture, ce qui est couvert par une autorisation préfectorale. Les esturgeons européens sont traités à part en priorité (biométrie, échographie, marquage d’identification, prélèvements tissulaires et lavage gastrique). Ils sont ensuite conservés en vie. Ceux dont l’état ou la taille ne permet pas un marquage supplémentaire (avec marque à mémoire et/ou marque acoustique), seront remis à l’eau rapidement sur leur lieu de capture. Il en sera de même pour les plus gros individus qui auront été marqués. De par l’objectif de l’étude, il est nécessaire de relâcher les esturgeons européens marqués au niveau de leur secteur de capture afin d’étudier la population en milieu naturel. La décision du moment du lâcher est prise par les intervenants qui sont formés à l’expérimentation animale et à la pratique de la chirurgie expérimentale. Ce moment sera fonction de l’état du poisson au réveil (reprise d’un comportement de nage normal). Nous bénéficions de toutes les autorisations réglementaires pour impliquer dans ce projet cette espèce d’esturgeon qui est protégée.
Remplacement
Aucun remplacement des poissons étudiés ne peut être effectué puisque les données recherchées ne peuvent être fournies que par les espèces elles-mêmes vivant dans le milieu naturel. Comme indiqué précédemment, afin de connaître l’évolution, dans son milieu, de la population soutenue d’A. sturio et d’évaluer le succès des pratiques de repeuplement mises en place dans le cadre du PNA, un suivi régulier doit être réalisé dans des secteurs estuariens adjacents aux fleuves dans lesquels les juvéniles d’esturgeons européens ont été déversés. Il s’agit de recapturer ces individus pour estimer l’évolution de leur abondance et connaître également les autres populations de poissons présentes dans l’estuaire pour identifier les interactions possibles. Par conséquent, pour réaliser le suivi des populations piscicoles estuariennes et en particulier, de l’état de la population soutenue d’esturgeons européens, il est nécessaire de capturer les poissons pour pouvoir les dénombrer (estimer les abondances), les mesurer, les marquer (suivi individuel de croissance), les équiper de marques spécifiques (étude des déplacements et des préférences environnementales).
Réduction
D’après les échantillonnages historiques, on peut s’attendre à capturer en moyenne une cinquantaine d’esturgeons européens par an au grand maximum. Tous seront marqués individuellement pour identification afin d’avoir un suivi le plus exhaustif possible de la population. En effet, étant donné la faible abondance de l’espèce (soutien de population) et de l’effort de capture ciblant l’espèce relativement faible (campagnes bimestrielles en estuaire, captures accidentelles par des pêcheurs), le taux de recapture attendu est faible (150 cm pour les marquages acoustiques de géniteurs). Cela représente sur l’année environ 10-15 individus marqués avec une DST dont une dizaine par acoustique. Les effectifs capturés dans l’estuaire peuvent varier d’une année à l’autre en fonction notamment des actions de repeuplement. D’après nos estimations, l’effectif envisagé correspond en moyenne, à l’échelle de l’année, au nombre d’animaux qui ont un poids supérieur au poids minimal requis pour le marquage sur le maximum d’individus possible, et il peut être considéré comme raisonnable pour une espèce en danger critique telle que l’esturgeon européen.
Raffinement
- 21 traits de chalut de fond par campagne (soit 126 traits/an) sont effectués dans des secteurs médian et aval chalutables de l’estuaire en suivant 2 grilles d’échantillonnages légèrement décalées alternativement d’une campagne à l’autre. Cela représente environ 1 % de la surface totale de l’estuaire subtidal (i.e. les secteurs non soumis au marnage), soit un impact sur le fond de l’estuaire qui nous parait négligeable sachant que ce dernier est par ailleurs soumis à des dragages réguliers et importants pour les besoins de la navigation. - La durée de chalutage de 30 min est fixée sur la base d’échantillonnages historiques qui mettaient en évidence qu’elle limitait les blessures des poissons prélevés. A la remontée du chalut, les poissons sont réceptionnés sur un matelas, et transférés dans un ou des viviers alimentés en circuit ouvert. - Quelle que soit l’intervention, l’A. sturio est anesthésié au préalable pour limiter stress et douleur (les dosages du produit anesthésiant sont adaptés à sa taille et au type d’intervention). Durant les manipulations, il est immergé, ou alimenté, via un tuyau, d’anesthésique à dose sédative ou arrosé d’eau claire de l’estuaire (maintien humidité cutanée). L’ensemble est réalisé avec le plus grand soin par des intervenants ayant une bonne expérience de ces pratiques et parfaitement conscients de la fragilité de l’espèce. Après son réveil dans un vivier alimenté en eau courante de l’estuaire bien oxygénée et sa reprise d’un comportement de nage normal, l’A. sturio est relâché sur le lieu de capture à l’aide d’un toboggan. Les procédures seront adaptées à la situation : réduction si l’individu est blessé ou maigre et/ou s’il y a beaucoup d’individus, pas de lavage gastrique chez ceux marqués par acoustique.
Choix des espèces
- Etant donné que l’étude porte sur le suivi des espèces piscicoles de l’estuaire, l’ensemble des espèces capturées sont identifiées et traitées. En plus des esturgeons européens (Acipenser sturio), on s’attend à capturer en majorité les espèces suivantes : mulet-porc (Chelon ramada), maigre (Argyrosomus regius), anguille européenne (Anguilla anguilla), bar franc (Dicentrarchus labrax) et bar moucheté (Dicentrarchus punctatus), flet (Platichthys flesus), merlan (Merlangius melangus), sole (Solea solea), sprat (Sprattus sprattus), anchois (Engraulis encrasicolus), gobies (Pomatoschistus spp.), raie bouclée (Raja clavata), alose feinte (Alosa fallax) et grande alose (Alosa alosa), congre (Conger conger), lamproie marine (Petromyzon marinus), ainsi que 2 espèces d’esturgeons exotiques suite à des échappements de piscicultures : l’esturgeon sibérien (Acipenser baeri) et l’osciètre (Acipenser gueldenstaedti). - En fonction des espèces capturées et de la saison, il s’agira de poissons de stades juvéniles ou adultes. Pour l’esturgeon européen, il s’agira de juvéniles de plus d’un an. Il est également possible que des adultes en migration de reproduction (âge> 12 ans) soient capturés.