Procédures modérées
Restauration par thérapie génique de la fonction auditive et vestibulaire chez des souris modèles de surdités et troubles vestibulaires humains
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
14 305 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections de vecteurs viraux dans l'oreille interne, certaines in utero au quatorzième jour de gestation, puis un suivi auditif toutes les deux semaines pendant six à neuf mois. 972 d'entre elles subissent en plus un test de réflexe de sursaut d'une heure par jour, et d'autres une pièce de maintien posée sous anesthésie suivie de quatre semaines de restriction hydrique, avec deux heures de test quotidien. Le porteur indique qu'il n'existe ni lignée cellulaire ni cellule souche de l'oreille interne et conclut que le modèle murin reste "l'outil indispensable".
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est de développer des thérapies géniques pour restaurer l'audition et l'équilibre dans des modèles murins de pathologie de l'oreille interne humaine, applicables aux patients. Les fonctions d'audition et d'équilibre des mammifères reposent respectivement sur la cochlée et le vestibule, organes sensoriels spécialisés dans l'oreille interne. La surdité et les défauts de l'équilibre sont les troubles sensoriels héréditaires les plus répandus chez l'homme. Environ 1 nouveau-né sur 700 est affecté par une surdité congénitale, dont 80 % ont une cause génétique, avec 30 % de ces cas associés à des troubles de l'équilibre. A ce jour, il n’existe aucune approche thérapeutique pour soigner la surdité et les troubles de l’équilibre. Cependant, les virus adéno-associés (AAV) sont récemment apparus comme des vecteurs prometteurs pour la thérapie génique (TG). Bien qu’elle se soit révélée encourageante dans les essais précliniques et cliniques pour divers troubles héréditaires, la TG n’a pas encore été utilisée pour traiter la perte auditive. Au cours de la dernière décennie, nos recherches se sont concentrées sur le développement de la TG virale pour restaurer l'audition et l'équilibre chez des modèles murins de surdité humaine. Récemment, nous avons rapporté la première preuve de principe selon laquelle la TG peut inverser le phénotype de surdité profonde d’un modèle murin, suscitant l'espoir de futurs essais cliniques chez certains patients. Néanmoins, de nombreux défis persistent. Premièrement, le début de l'audition se produit après la naissance chez la souris et in utero chez l'homme, ce qui rend difficile la transposition des fenêtres temporelles thérapeutiques murines aux patients. Cela implique que la TG doit être administrée à l'oreille interne de souris (mâles et femelles sans distinction) presque adultes. Cependant, le taux de transduction des cellules sensorielles auditives et vestibulaires par les AAV diminue considérablement avec l'âge, soulignant le besoin crucial d'identifier de nouveaux variants AAV avec un fort tropisme pour ces cellules. Deuxièmement, il est essentiel de déterminer si la TG périphérique restaure une perception auditive centrale normale étant donné qu’il existe une période critique (PC) de plasticité, au cours de laquelle les circuits auditifs centraux perdent progressivement leur capacité à encoder correctement de nouveaux signaux acoustiques.
Bénéfices attendus
Notre projet de recherche vise à apporter une contribution significative à la compréhension de la physiopathologie de l'oreille interne et des voies auditives. Les résultats de notre étude devraient non seulement avoir un impact décisif sur le développement d'approches thérapeutiques pour les surdités humaines héréditaires, mais aussi mettre en lumière le rôle crucial de la thérapie génique dans la restauration de la perception auditive et des troubles de l'équilibre dans les modèles animaux de déficiences de l'oreille interne chez l'homme. En étudiant la faisabilité et la fiabilité de la thérapie génique pour restaurer l'audition et l'équilibre dans des modèles murins de surdité humaine, dans une fenêtre temporelle transposable à l’homme, nous espérons avoir un impact significatif sur la santé et la société. En effet, l'acquisition anticipée de connaissances sur l'impact de la fenêtre temporelle et de la période critique sur la thérapie génique pour la surdité, ainsi que l'identification de vecteurs spécifiques à l'oreille interne, seront cruciales pour la conception des futurs essais précliniques. Ces avancées auront à leur tour des répercussions médicales, sociales et économiques majeures, étant donné le fardeau considérable que représente la surdité pour la santé publique et les interactions sociales.
Procédures
- Une biopsie (30 secondes) sera effectuée sur tous les animaux du projet afin de les marquer et de les génotyper. - Nous effectuerons des injections (environ 20 minutes) à différents niveaux du système auditif via différentes voies d’administration. - Un suivi audiologique (environ 20 minutes) sera réalisé sur nos modèles souris ayant reçu une injection de vecteurs Cette procédure sera répétée tous les 2 semaines pendant 6 à 9 mois de vie de l’animal. - Nous effectuerons un suivi comportemental des modèles souris de surdité humaines ou de synaptopathies. Un test de réflexe de sursaut sera effectué une fois par jour (environ une heure) pendant 2 à 3 jours par intervalle de deux semaines sur une période de 2 à 3 mois (n= 972 animaux. Un autre test impliquant la pose au préalable d’une pièce de maintien (sous anesthésie, durée une heure) puis l’application d’un protocole de restriction hydrique, aura lieu tous les jours (environ 2 heures) pendant 4 semaines. Enfin, des tests locomoteurs vestibulaires (30 minutes pour l’ensemble des tests) auront lieu tous les 15 jours sur une période de 1 à 5 mois.
Impact sur les animaux
A l’exception du modèle murin du syndrome d’Usher de type 1G qui présente un défaut vestibulaire bilatéral, se caractérisant par un hochement de tête et une tendance à tourner en rond en permanence, nos autres modèles murins ne manifestent, outre la surdité, aucun autre symptôme et leur phénotype est indiscernable de celui des souris sauvages. Pour les mesures perceptuelles, les souris peuvent être soumises à du stress et de l’angoisse pendant les épisodes de contention. De plus, le protocole de restriction hydrique peut entraîner une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés empêchant tout replacement ou adoption. Par ailleurs, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations de physiologie, ou d’immunohistochimie. Les autres procédures impliquent des interventions comme des injections ou des entraînements comportementaux auditifs ou des chirurgies. On ne peut donc pas considérer ces animaux comme naïfs expérimentalement. De plus, la plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant leur réutilisation, par exemple par d’autres équipes, encore plus difficile. Leur réutilisation pourrait donc mettre en péril les conclusions des nouvelles expériences car trop de paramètres pourraient ne pas être contrôlés. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles. Ces partages se font typiquement à l’échelle de l’Institut au-delà de notre équipe de recherche.
Remplacement
Près de 100 gènes responsables de surdité chez l’Homme ont été identifiés, mais autant restent à découvrir. La restauration de l’audition par thérapie génique chez des souris modèles de surdités humaines représente une étape cruciale pour ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme. A ce jour, nous ne disposons ni de lignées cellulaires ni de cellules souches de l’oreille interne, en raison de la complexité anatomique et histologique de l’organe de l’audition. Dans ce contexte, le modèle murin reste l’outil indispensable pour étudier la physiopathologie des surdités et mettre au point des traitements curatifs. Afin de réduire le nombre de souris utilisées, l’expression de la totalité des gènes thérapeutiques utilisés dans ce projet a été testée préalablement sur des lignées cellulaires.
Réduction
Afin de minimiser l’utilisation des animaux, nous adopterons une stratégie d’expérimentation et de statistiques visant à obtenir des résultats significatifs tout en réduisant au strict minimum le nombre d’animaux impliqués. Pour chaque modèle murin, nous réaliserons une injection de vecteur à différents stades du développement. Les souris ainsi injectées seront ensuite utilisées dans plusieurs protocoles distincts, incluant des tests auditifs, comportementaux, des analyses électrophysiologiques et des marquages immunohistochimiques. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons dans la mesure du possible un nombre équivalent de mâles (50%) et de femelles (50%), et nous nous concentrerons sur le nombre limité d’animaux en fonction de la capacité des dispositifs expérimentaux et de l’application des mesures sur le même animal le cas échéant. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage recevront au moins 2 traitements différents. Enfin, les groupes d’animaux sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 10% minimum. Cette approche statistique rigoureuse vise à minimiser le nombre d'animaux tout en garantissant une évaluation fiable et significative des résultats.
Raffinement
Dans le souci du bien-être optimal des animaux tout au long des procédures expérimentales, des traitements analgésiques et antalgiques seront mis en œuvre et adaptés au stade de développement des animaux en pré-opératoire et post-opératoire afin d’assurer une analgésie optimale pour chaque procédure. Une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sera soigneusement réalisée. Des tapis chauffants seront utilisés pour limiter le risque d’hypothermie lors des chirurgies. Les souris gestantes seront placées dans des cages isolées après la chirurgie, assurant ainsi un rétablissement dans un environnement calme. De plus, un gel buvable et de la nourriture humidifiée seront disposés sur la litière de leur cage pour permettre aux souris d’accéder à la nourriture sans exercer de tension sur les sutures. Durant une période minimale de 5 jours suivant la chirurgie, une surveillance attentive de la plaie sera effectuée afin de détecter tout signe éventuel d’infection. Le suivi systématique de l’état général de santé des souris sera suivi pendant une semaine après la procédure afin de détecter d’éventuels signes de souffrance ou d’inconfort, tels que les changements de posture, les yeux plissés ou manque de toilettage. Enfin, en vue d’enrichir leur environnement, un igloo en plastique sera ajouté à chaque cage.
Choix des espèces
Près de 95% du génome de la souris est identique à celui de l’Homme. De plus, les modèles murins utilisés dans ce projet miment fidèlement les formes de la surdité humaine. Grâce à la transposabilité des résultats entre la souris et l’Homme, nos résultats devraient faire progresser de manière significative notre compréhension de la fonction de la synapse auditive et accélérer le développement de la thérapie génique en tant qu’alternative prometteuse pour un traitement curatif des surdités génétiques chez l’Homme. Preuve en est, les résultats antérieurs provenant d’une étude sur un modèle murin de surdité humaine, ont jeté les bases du premier essai clinique en cours. Nous proposons d’injecter les préparations virales à différents stades clés du développement et de la maturation du système auditif : afin de déterminer la fenêtre temporelle qui permet une meilleure restauration des fonctions auditive et/ou vestibulaire pour chaque surdité traitée. 1) Dans l’hypothèse où l’apport du gène serait trop tardif par rapport à la mise en place de la machinerie de mécano-transduction des cellules sensorielles auditives (à E15), une solution possible serait d’effectuer la thérapie génique avant la mise en place de la touffe ciliaire. Nous allons donc effectuer des injections in utero dans l’otocyste à l’age de 14 jours embryonnaires (E14). 2) immédiatement après la naissance, entre le premier et le troisième jour postnatal (P1 à P3) 3) à un stade mature de l’audition (entre P15-P30) Les tests auditifs seront réalisés chez des souris âgées de 21 jours à 30 semaines afin de pouvoir évaluer la restauration de l’audition dans le temps. Les mesures de patch-clamp sont effectuées sur des cochlées de souris âgées entre P20 et P35. Les tests comportementaux seront réalisés 30 à 45 jours post-traitement.
Etude de la représentation neuronale de l’état du système cardio-respiratoire
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Deux chirurgies, d'une heure puis d'une heure quarante-cinq, pour implanter des électrodes dans le cerveau, une électrode sous la peau du thorax et une canule dans le nez. 128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse histologique de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent ensuite jusqu'à trois heures par jour la tête fixée sur une roue pendant une semaine, certaines étant entraînées une à deux heures par jour pendant plusieurs mois à une tâche auditive, avec des jets d'air et des goûts amers comme stimuli aversifs. Une partie reçoit des substances qui augmentent l'anxiété ou la sensation de panique, que le porteur ne nomme pas, en indiquant seulement que la hausse du stress dure "au maximum quelques heures".
Objectifs
La perception, implicite ou explicite, que nous avons de l’état de notre corps repose sur un sens, appelé interoception. Ce sens participe à réguler nos états affectifs (émotionnels ou motivationnels) et donc affecte les décisions que nous prenons. En conséquence, une dérégulation de cette perception peut être liée à des maladies psychiatriques. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’interoception sont mal connues. Nous ne savons pas par exemple quelle région de notre cerveau représente notre fréquence cardiaque ou respiratoire et avec quelle précision. L’objectif de ce projet est d’une part d’étudier comment le cerveau représente ces informations. D’autre part, nous testerons si cette représentation est modifiée dans des conditions liées à l’anxiété ou les crises de panique. Pour ce faire nous administrerons des agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie qui augmentent ou diminuent respectivement le niveau d’anxiété ou de panique de l’animal. Finalement, nous évaluerons ci cette représentation est modifiée pendant la prise de décision. Pendant ces expériences, le nombre d’animaux nécessaire et le nombre de sessions d’enregistrement seront réduits grâce à l’utilisation de systèmes d’enregistrement de point permettant d’acquérir une grande quantité de données en peu de sessions. De plus, nous raffinerons le protocole en utilisant des traitement anesthésiques et analgésiques adaptés, administrés selon des points limites clairement établis à l’avance et évalués à l’aide de grilles d’évaluation. Nous développerons et calibrerons des méthodes d’enregistrement non-invasifs pour la respiration qui pourront aussi être utile pour la communauté plus largement. A chaque étape, puisque nous enregistrons non seulement le comportement de l’animal mais aussi son état corporel, nous disposerons d’un suivi fin et en temps réel de son état. Ce projet permettra de mieux comprendre notre capacité à percevoir notre corps et contribueront, à plus long terme, à la meilleure compréhension de la participation de notre corps aux états affectifs et à établir comment cette perception intéroceptive peut être dérégulée.
Bénéfices attendus
Il existe de nombreuses hypothèses suggérant que notre corps influence notre état émotionnel et donc les décisions que nous prenons. Ceci découle en partie de l’expérience subjective du lien très fort entre notre état émotionnel et notre corps mais également de mesures en laboratoire qui ont montré que l’état de notre corps et comment nous le percevons varie avec nos émotions. De plus lorsque cette perception du corps dérégulée, des troubles psychiatriques peuvent résulter. Celles-ci peuvent être liées à une intéroception de précision réduite (autisme, trouble du déficit de l’attention) ou hypersensible (anxiété, syndrome de l’intestin irritable). Cependant les zones cérébrales qui sous-tendent cette perception et comment elle est modifiée dans des états émotionnels normaux et pathologiques reste mal connu. Ce projet permettra d’identifier des mécanismes par lesquels le cerveau représente ce que nous percevons de notre corps (par exemple : quelle est notre fréquence cardiaque ? quelle est notre fréquence respiratoire ?). En particulier nous pourrons identifier où dans le cerveau ces informations sont représentées et avec quelles précision. De plus nous testerons si la façon dont notre cerveau représente notre corps est modifié dans deux conditions : d’une part dans des états liés aux crises de panique ou l’anxiété (grâce à l’utilisation d’agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie) et d’autre part lors de la prise de décisions difficiles suscitant des émotions. Une retombée concrète du projet sera de mieux connaître quelles régions corticales encodent l’état de notre corps. Ceci peut permettre de cibler plus efficacement les études de neuro-imagerie chez l’humain qui étudient ces déficits intéroceptifs. De plus, ces mesurer l’impact d’agents pharmacologiques utilisés dans le cas de maladies psychiatriques sur la représentation neuronale de l’état corporel. Ceci permettra d’évaluer si ces agents agissent directement sur la perception du corps, permettant de préciser leurs mécanismes d’action.
Procédures
Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies pendant lesquelles nous implantons des électrodes cérébrales, une électrode sous-cutanée au niveau du thorax et une canule nasale. Les chirurgies durent respectivement 1h et 1h45 maximum et sont séparées d’au moins 5 jours ou plus pour que l’animal récupère un état ‘normal’ d’après notre grille d’évaluation. Tous les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement allant jusqu’à 3h par jour pendant un maximum de 7 jours. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux sont également entraînés dans une tâche auditive pendant une à deux heures par jour sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. A la fin des procédures, les animaux subissent une chirurgie sans réveil pour prélévement du cerveau.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée en fonction de la réponse aux traitements antalgiques administrés. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal, surtout lors des premières sessions d’habituation. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques liés à l’anxiété ou les crises de panique. Parmi ces agents, 2 ont tendance à diminuer soit l’anxieté soit la sensation de panique . Les 2 autres ont tendence à augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Dans ce cas, nous utilisons des doses calibrées pour que l’augmentation du stress dure au maximum quelques heures. Pendant le protocole, l’animal sera soumis à de brefs stimuli légèrement aversifs (goût amer ou jet d’air) qui pourront engendrer une gêne.
Devenir
A la fin de chaque procédure, l’animal est mis à mort afin de réaliser l'analyse histologique du cerveau.
Remplacement
Le projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’interoception à l’état affectif, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue une tâche sensorielle. Finalement, chez l’animal anesthésié, l’encodage neuronal est profondément modifié et le système cardio-respiratoire dans un état très ralenti, totalement différent de l’éveil. D’éventuels résultats obtenus sous anesthésie seraient donc très difficiles à généraliser.
Réduction
Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement électrophysiologies et somatique qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaire pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Nous avons un protocole adapté à cette diminution : - L’utilisation d’électrodes implantées « en aigu » permet d’enregistrer à un endroit différent chaque jour et donc de couvrir efficacement une grande zone anatomique - Nous utiliserons des électrodes qui contiennent un grand nombres de sites d’enregistrement. Ceci augmente l’efficacité de la récolte de données.
Raffinement
Hébergement : Les animaux ont accès à un enrichissement (dôme, coton) et sont hébergés ensemble sauf s’il y a de l’agressivité entre individus dans quel cas ils peuvent être isolés. Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Pendant la chirurgie, l’état de l’animal est suivi à intervalles réguliers pour adapter le niveau d’isoflurane. De plus un analgésique systémique et une analgésique locale sont administrées avant et après l’intervention. En post-opératoire, les animaux reçoivent une analgésie supplémentaire ajouté dans l’eau de boisson ou Dietgel pendant 5 jours) et les animaux sont suivis quotidiennement. Manipulations : Les animaux seront d’abord habitués à la manipulation manuelle nécessaire pour les transporter jusqu’à l’environnement de l’expérience. Toute manipulation par la queue sera évitée. Contention en tête fixée : L’animal est habitué en augmentant progressivement les durées. De plus, il est placé sur une roue où nous avons observé des comportements divers (sommeil, course, toilettage) dans des proportions similaires à un animal libre de ces. A chaque session la respiration, l’activité cardiaque et la température sont enregistrés et le comportement de l’animal suivi par vidéo. La mesure de toutes ces variables permettra, en temps réel, de surveiller très finement l’état de l’animal. Développement de procédures raffinées : Pendant ce projet nous enregistrons la respiration avec une canule intranasale, ce qui nécessite une chirurgie invasive. Nous essayerons de raffiner ce protocole en mettant en œuvre des mesures non-invasives de la respiration : soit avec un capteur externe de pression soit par suivi vidéo en caméra thermique des narines de l’animal. La canule intranasale étant la méthode de référence donnant les informations les plus précises, nous devons d’abord calibrer les autres méthodes contre celles-ci avant d’éventuellement utiliser ces nouvelles approches moins invasives. Utilisation de statistiques adaptées : Les analyses statistiques utilisées dans cette étude seront basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux. Puisque nos méthodes permettent d’enregistrer un grand nombre de neurones par session et par animal, ceci permet d’acquérir une grande puissance statistique avec peu d’individus. Nous utiliserons des statistiques paramétriques et appariées.
Choix des espèces
Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles (pas de poumons, pas de flux d’air nasal ou buccal pour les premiers, non-homéothermes pour les seconds). La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement (donc avec peu d’animaux et dans un temps d’expérience réduit) de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal (implantation aigue d’électrodes multi-sites). De plus, des développements ultérieurs de cet axe de recherche nécessiteront l’utilisation d’outils de manipulation qui reposent sur notre excellente connaissance génétique de la souris. Finalement, l’équipe possède une grande expertise dans la chirurgie et le comportement chez la souris, ce savoir-faire assure une application de qualité des procédures. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.
Etude de la modulation du métabolisme du tryptophane sur la polyarthrite expérimentale
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
La douleur de l'arthrite induite au collagène, qualifiée de sévère dans le résumé lui-même, ne recevra aucun antalgique, aucune molécule contre la douleur n'étant selon le porteur dépourvue d'un effet anti-inflammatoire qui fausserait le résultat. 104 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse histologique de leurs articulations, dont 24 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection intradermique sous anesthésie, puis des injections intrapéritonéales quotidiennes, avec une pesée quotidienne et une mesure du volume de leurs pattes arrière gonflées trois fois par semaine. Le projet, financé par des agences de recherche, vise à accélérer le développement clinique d'une molécule contre la polyarthrite rhumatoïde et à en établir la dose minimale efficace.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires. Cette pathologie touche les articulations mobiles telles que les articulations des mains, des pieds, les poignets et les genoux. Elle est caractérisée par une inflammation articulaire et une destruction progressive des structures cartilagineuses et osseuses. C’est une maladie douloureuse qui affecte la qualité de vie des patients et qui peut provoquer un isolement social. Plusieurs traitements contre la polyarthrite rhumatoïde, notamment les biothérapies, sont actuellement utilisés. Mais des résistances et des échappements thérapeutiques sont fréquents. Ainsi, il a y une nécessité de trouver de nouveaux traitements et de comprendre les mécanismes d’action, et notamment les mécanismes cellulaires, de ces traitements. L'objectif de ce projet financé par des agences de recherche est d'accélérer le developpement clinique d'un médicament contre la polyarthrite rhumatoïde. Les objectifs spécifiques sont de comprendre le mode d'action de cette nouvelle approche thérapeutique ainsi que de déterminer la dose minimale efficace.
Bénéfices attendus
Comme l'enzyme AADAT (notre piste thérapeutique) s'est déjà avéré efficace dans le modèle de polyarthrite par injection d'anticorps anti-collagène, la présente étude permettra d'explorer les potentialités anti-inflammatoires de la molécule dans le but d'avancer cette molécule candidat médicament plus avant vers la clinique, les études prévues dans ce projet permettront entre autres d'aider à résoudre le mécanisme d'action de la molécule et donc d'envisager la mise sur le marché d'un nouveau médicament à terme.
Procédures
Certains animaux recevront des injections intradermiques (une injection unique d'une durée d'1 min environ) sous anesthésie générale. Les autres injections intrapéritonéales (d'une durée de 15 secondes et avec une fréquence maximale d'une injection par jour pendant la durée du traitement comme indiqué en 4.3.1 et 4.3.2) sont réalisées sur animaux vigiles . Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté. Au cours de la procédure les animaux seront pesés (15 secondes maxi par animal avec une fréquence maxi quotidienne) et l'oedème des pattes arrieres mesurès par mesure du volume (1 min maximum par animal à une fréquence maxi de 3 fois par semaine).
Impact sur les animaux
Nuisance n°1 Induction de l'arthrite sous anesthésie générale, d'une durée de 3 min environ, temps d'induction compris, cette anesthésie est réalisée sous isoflurane. Nuisance n°2 Développement de l'arthrite Perte de poids et douleurs pour les animaux induits par l'arthrite. La douleur considérée comme sévère pour le modèle d'arthrite au collagène et modérée pour le modèle d'arthrite aux anticorps anti-collagène, ne peut être prise en charge pharamacologiquement car à ce jour aucune molécule antalgique n'a été identifiée comme dépourvue d'effet anti-inflammatoire. Nuisance n°3 Administration des composés pharmacologiques par injection intrapéritonéale quotidienne .
Devenir
Des analyses histologiques sur les articulations (arthrite) seront réalisées à l'issue des procédures expérimentales nécessitant la mise à mort des animaux.
Remplacement
La présente étude a été planifiée après une recherche documentaire approfondie et de nombreuses études in vitro. Après avoir soigneusement analysé les études thérapeutiques cruciales in-vivo, il a été observé que les modèles de souris utilisés ici sont les modèles de référence pour la polyarthrite rhumatoide. De plus, compte tenu des développements déjà réalisés sur cette molécule, cette étude in-vivo est cruciale et constituera un jalon pour progresser sur l'avenir de notre molécule médicament. Cette étude est une partie impérative du développement préclinique de la molécule. Après avoir consulté la littérature et considéré l'importance de cette étude pilote, le présent projet ne peut être remplacé par aucune autre étude alternative.
Réduction
Ce projet est planifié en gardant à l'esprit le nombre minimum d'animaux nécessaires (8 animaux par groupe) pour atteindre le niveau de signification pour chaque modèle. Le projet est divisé en trois groupes : le groupe témoin inflammatoire, le groupe traité avec AADAT, le groupe contrôle avec le médicament déja approuvé. Pour une étude comparative, il est important d'inclure ce groupe témoin qui servira de norme pour les comparaisons nécessaires pour comprendre l'impact du médicament sur la gravité et la progression de la maladie. Compte tenu de l'importance de chaque groupe dans l'étude, il n'est pas possible de réduire le nombre de groupes et d'animaux. Une analyse statistique sera réalisée pour les comparaisons entre les trois groupes.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 4 dans des cages conventionnelles conformes pour cette espèce (directive 2010/63/EU) au sein de notre animalerie conventionnelle. L'enrichissement est apporté par des objets (tunnel, maison) dédiés à cet usage. Les injections intra-dermiques sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale. Les deux modèles sont bien connus et maîtrisés au laboratoire en termes de douleurs. Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Un changement de litière bi- hebdomadaire puis quotidien lorsque les animaux seront en phase d’arthrite sévère, l'utilisation de tunnel permettra de diminuer le stress occasionné par le changement de litière. Des points limites (liés à la perte de poids et/ou des anomalies du comportement) sont mis en place.
Choix des espèces
Les souris mâles avec un fond génétique de suceptibilité à l'auto-immunité, ont été largement étudiées dans la littérature comme modèle expérimental de la polyarthrite rhumatoïde. L'immunisation avec le collagène de type II provoque une réponse auto-immune similaire à celle observée chez les patients atteints de polyarthrite Des souris adultes mâles seront utilisées pour cette étude afin de diminuer l'influence hormonale des oestrogènes.
Etude du rôle de la protéine Slc20a2/PiT2 dans le métabolisme énergétique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune devant prendre jusqu'à 60 % de son poids sous régime riche en gras et passer cinq heures exposée au froid. S'y ajoutent une prise de sang à la veine mandibulaire, cinq micro-prélèvements en deux heures par incision du bout de la queue, trois injections intrapéritonéales et une séance d'imagerie TEP-scanner sous anesthésie profonde. L'enjeu déclaré tient à une seule protéine, dont l'absence semble protéger les mâles de la prise de poids, et dont le porteur veut savoir si elle protège aussi les femelles. Il conclut que le métabolisme énergétique dépendant de plusieurs organes, il a "besoin de l'organisme entier".
Objectifs
Nous avions montré que l’absence de la protéine X chez la souris modifie le volume du tissu adipeux de la moelle au cours de la maturation squelettique et dans un modèle d’ostéoporose induite. Ces résultats nous ont conduit à étudier le rôle de cette protéine dans la régulation des tissus adipeux périphériques. Ces tissus adipeux jouent un rôle important dans la régulation du métabolisme énergétique grâce à leur fonction de sécrétion d'hormones, leur fonction de stockage des lipides dans les adipocytes blancs et leur capacité à dissiper l’énergie sous forme de chaleur. La régulation de la température par l'organisme est une fonction vitale qui permet de stabiliser la température corporelle et de lutter contre l’accumulation de masse grasse. Nos travaux récents indiquent que les masses de tissus adipeux sont inférieures en absence de la protéine X. Nos résultats préliminaires obtenus chez les mâles soumis à un régime riche en gras indiquent que les mâles dépourvus de cete protéine résistent à la prise de poids. Pour aller plus loin dans la compréhension des mécanismes d’action de cette protéine dans la régulation du métabolisme énergétique, nous allons poursuivre l’analyse du rôle métabolique de cette protéine chez les souris mâles et femelles, en répondant aux questions suivantes : - les femelles n'exprimant pas cette protéine sont-elles résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras ? - la faible quantité de tissus adipeux et la résistance à la prise de poids sous régime riche en gras des souris dépourvues de la protéine X sont-elles dues à une augmentation de l’activité de régulation de la température par les cellules des tissus adipeux ?
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier les mécanismes d’action de la protéine X comme nouveau régulateur de l’activité thermogénique des tissus adipeux. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de certaines maladies métaboliques, telle que l’obésité
Procédures
- pesée des animaux 1x/semaine - un prélèvement de 50µl de sang à la veine mandibulaire – deux injections IP à une semaine d’intervalle - 5 micro-prélèvements sur une durée de 2h - 5h de présence dans un environnement froid – une injection IP (100µl) – une séance d’imagerie TEP/CT sous anesthésie profonde (durée : 10 minutes de TEP, 15 secondes de CT)
Impact sur les animaux
Ce protocole conduira à une prise de poids (maximum 50-60%) et à l’apparition d’une glycémie un peu plus élevée qu’en condition standard mais sans atteindre l’état de diabète (170-200mg/dl versus 140mg/dl). Un stress modéré est attendu lors des injections IP et de la pesée des animaux. Un stress modéré est attendu lors des micro prélèvements sanguins - une douleur légère et de courte durée lors de la petite incision de l’extrémité de la queue. L’exposition au froid induira une baisse transitoire de la température corporelle
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélèvements d'organes (mesure du poids des organes, analyses histomorphométriques et analyses moléculaires)
Remplacement
Le projet concerne l'analyse des effets de l’absence d'une protéine sur la régulation du métabolisme énergétique dans des conditions standard ou dans un modèle d’obésité induite. Le métabolisme énergétique est sous le contrôle de plusieurs organes (tissus adipeux, muscle squelettique, foie, cerveau), nous avons donc besoin de l’organisme entier pour répondre à la question posée.
Réduction
D’après nos travaux antérieurs et nos analyses statistiques, n=12 animaux par groupe est le nombre suffisant pour observer une différence significative. Deux situations peuvent se présenter : 1/ les femelles mutantes sont résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras. Elles seront alors soumises à ce même régime à thermoneutralité pour vérifier si ce phénotype de résistance dépend du processus qui contrôle la température corporelle; 2/ les femelles mutantes se comportent comme les souris contrôles (gain de poids sous régime riche en gras). Le protocole s'arrêtera à cette étape (le nombre de souris total pour cette procédure sera alors réduit de 48 animaux).
Raffinement
Pour la mesure de poids hebdomadaire, les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue. Ce geste limite le stress des animaux. L'hébergement à thermoneutralité aura deux effets possibles : 1/ la résistance à la prise de poids est la même que celle observée à température ambiante dès les 8 premières semaines sous régime riche en gras ou 2/ les souris mutantes perdent leur capacité à résister au régime riche en gras. Dans le cas n°1, nous arrêterons le protocole après 8 semaines de régime puisque nous pourrons conclure sur les effets de la mise à thermoneutralité. La procédure sera donc réduite à 8 semaines au total. Dans le cas numéro 2, nous poursuivrons le protocole pour vérifier si la résistance apparait plus tardivement (maximum 14 semaines de régime riche en gras). Nous avons pris en compte le bien-être animal, un examen régulier permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant les analgésiques adaptés à notre procédure. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate). Nous identifions deux types de points limites. Les points limites généraux applicables à toutes nos expériences utilisant des souris et les points limites spécifiques à la procédure (prises de poids maximales attendues sous régime riche en gras de 50% à 60%). Cette prise de poids peut amener à une légère réduction de la mobilité non dommageable. Pour les tests de tolérance à l’insuline, nous utilisons une dose faible, mais si une souris présente une réponse trop marquée, celle-ci sera euthanasiée.
Choix des espèces
Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques comme l’obésité. Le modèle murin est utilisé de longue date pour comprendre les mécanismes physiopathologiques des maladies métaboliques. Ce projet est la poursuite de la caractérisation phénotypique de souris invalidées pour le gène X qui nous a permis de mettre en évidence, pour la première fois, un rôle potentiel de la protéine X dans la régulation du métabolisme énergétique (résultats non publiés). Sans ce modèle, cette nouvelle fonction n’aurait pas pu être découverte. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines, âge auquel le métabolisme énergétique est stable.
Décryptage des mécanismes moléculaires déclenchés par la sur-expression d’un facteur de croissance dans un modèle murin de dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Quatre injections dans le muscle à sept jours de vie, sous anesthésie, puis pour une partie des souris une mesure de l'activité électrique du nerf de trente minutes et une mesure de contractilité musculaire de vingt-cinq minutes. 812 souris vont être utilisées, 584 porteuses de la dystrophie musculaire de Duchenne et 228 témoins, toutes tuées à l'issue pour les prélèvements. Le porteur décrit chez les souris malades de l'anxiété, une crise inflammatoire de trois semaines, une faiblesse musculaire à deux mois, un pelage terne et le dos vouté à trois mois, une atteinte de l'audition à cinq mois, et déclare pourtant 776 de ces 812 animaux en niveau de souffrance légère. Le facteur de croissance testé pourrait, à long terme, compléter les thérapies géniques en cours de développement chez les patients.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénérescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, nous envisageons de poursuivre nos investigations sur les mécanismes moléculaires mis en jeu suite à l’injection d’un facteur de croissance qui possède un réel potentiel thérapeutique en améliorant l’intégrité du muscle dystrophique.
Bénéfices attendus
Nous attendons, comme bénéfices à court terme, une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris sont traitées avec le facteur de croissance d’intérêt. A long terme, cette molécule pourrait être utilisable chez le patient atteint de dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions telles que : 1/ Quatre injections intramusculaires (10 minutes) effectuées sous anesthésie et analgésie à un stade précoce suivies d’une euthanasie par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses. 2/ Quatre injections intramusculaires (10 minutes) effectuées sous anesthésie et analgésie à un stade précoce (10 minutes) associés à deux injections intrapéritonéales sur animal vigile espacées de 24h (1 minute/injection) suivi d’une euthanasie par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses. 3/ Quatre injections intramusculaires (10 minutes) effectuées sous anesthésie et analgésie à un stade précoce suivies d’une mesure ayant pour but de mesurer l'activité électrique des nerfs et des muscles effectuée sous anesthésie et analgésique (30 minutes) et enfin une mesure de la contractilité musculaire sous anesthésie et analgésie (25 minutes) après laquelle les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
La souris mdx présente un phénotype dommageable pouvant s'expliquer par un phénotype anxieux, l'apparition d'une crise inflammatoire d'une durée de 3 semaines à 3 semaines de vie et d'une faiblesse musculaire à 2 mois de vie. Certains animaux peuvent avoir un pelage terne et le dos vouté à partir de 3 mois de vie et des problèmes d'audition à partir de 5 mois de vie. Lors du transport entre l'animalerie fournisseur et notre animalerie et à l’arrivée dans leur nouvel environnement, les animaux pourront subir un stress dû aux mouvements des cages de transport, lors de leur transfert dans leur nouvelle cage, pendant les premiers jours après leur arrivée et si l’alimentation n’est pas identique. Au moment des injections intramusculaires et des procédures d’analyse fonctionnelle, les animaux subissent un stress lorsqu’ils sont placés dans la cage à induction pour l’anesthésie gazeuse et une douleur/inconfort équivalent à l'introduction d'une aiguille lors des injections en intrapéritonéal. Suite à l’injection intramusculaire, une gêne et/ou une anomalie au niveau du site d’injection pourrait éventuellement apparaître. De même, lors de la procédure permettant la mesure de l'influx nerveux, des électrodes sont placées en sous-cutané dans le tibialis anterieur, ce qui peut induire une gêne au réveil de l’animal. Au cours de l’anesthésie profonde, les animaux pourraient être victimes d’hypothermie ou d’arrêt cardio-respiratoire suite à l’administration de l’anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses prévues. Les géniteurs seront euthanasiés après 8 mois de vie ou après la génération de 4 portées pour les femelles.
Remplacement
Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent rendent compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Ce modèle est celui qui est signalé dans les directives pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. Il s'agit du modèle le plus approprié car il est bien caractérisé, avec un phénotype connu et avec beaucoup de littérature à l'appui. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d'analyse, 5 à 8 animaux est un nombre d'échantillons minimum pour obtenir des résultats statistiquement analysables. Néanmoins, considérant une forte hétérogénéité chez les souris dystrophiques, des groupes de 6 à 12 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et pour éviter de les répéter. Au total, nous prévoyons d'utiliser 812 animaux (584 souris dystrophiques et 228 souris contrôles). La taille des effectifs sera établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Nous respecterons une période d’acclimatation de 2 semaines pour les animaux sauvages provenant d’un éleveur extérieur. Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et de tunnels de carton dans les cages d'accouplement. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante thermorégulée à 37 degrés. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Nous procèderons à l’euthanasie compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
Le but de notre projet est la caractérisation de nouvelles voies moléculaires et l’identification de cibles thérapeutiques potentielles pour le maintien de la masse musculaire du muscle dystrophique. La souris présente l’avantage de permettre des études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé est celui qui est signalé dans les directives pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. Ce modèle est le plus approprié car il est bien caractérisé, avec un phénotype connu et avec beaucoup de littérature à l'appui. Nous utiliserons des souris âgées de 7 jours car nous souhaitons étudier l’impact de la sur-expression de notre facteur de croissance d'intérêt sur le processus de nécrose régénération qui a lieu à 4 semaines de vie. Et nous utiliserons des géniteurs âgés de 2 à 8 mois.
Évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un inhibiteur enzymatique chez des animaux atteints d’une myopathie génétique.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Des rats porteurs d'une mutation du gène DMD, à l'origine d'une dystrophie musculaire, reçoivent chaque jour pendant trois mois un composé par injection sous la peau ou par la bouche, et passent quatre fois un test d'agrippement et un électrocardiogramme. 80 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester ce composé déjà essayé chez des souris atteintes d'une forme légère de dystrophie. Le porteur décrit des rats "atteints de dystrophies sévères", aux "effets dévastateurs sur les muscles et le cœur", et les effets néfastes qu'il prévoit pour eux se résument à une griffe cassée pendant le test d'agrippement, un figement de quelques minutes et des réactions de la peau aux injections. Tous sont tués à l'issue, après une prise de sang sous anesthésie, pour des analyses histologiques et moléculaires.
Objectifs
Les dystrophies musculaires sont des myopathies génétiques rares qui touchent principalement les muscles et le cœur. La dystrophie de Duchenne est causée par des changements dans le gène DMD et touche surtout les hommes. Le gène DMD produit normalement une protéine appelée "dystrophine". Chez les patients, la quantité réduite de dystrophine induit une détérioration progressive des muscles, provoquant une faiblesse musculaire. La forme la plus sévère (absence complète de dystrophine) apparaît dès l'enfance et entraîne un déclin progressif de la mobilité et du fonctionnement cardiaque, fatale de façon prématurée. Jusqu'à présent, aucun traitement n'a été trouvé pour prévenir la maladie chez les personnes porteuses d'anomalies génétiques. L'objectif de notre étude est d'arrêter la progression de la maladie en utilisant de nouvelles substances qui empêchent la perte musculaire et améliorent la connexion entre les muscleset les nerfs qui déclenchent leur contraction. Il est attendu que ces substances contribueront à une amélioration de la contraction synchronisée des muscles et du cœur.
Bénéfices attendus
Notre laboratoire évalue des thérapies novatrices que nous testons sur des modèles aussi pertinents que possible. Le composé innovant étudié ici, dont l'efficacité a été démontrée sur un modèle de dystrophie légère chez la souris, sera évalué dans nos modèles atteints de dystrophies sévères, similaires à celles identifiées chez les patients. Ces dystrophies ont des effets dévastateurs sur les muscles et le cœur. Le composé innovant cible plusieurs mécanismes originaux qui, combinés, devraient limiter la perte musculaire et améliorer la connexion entre les cellules. Cela favorisera la contraction harmonieuse des muscles utilisés pour marcher, respirer et faire circuler le sang. Dans l'ensemble, nous espérons que l'administration de ce traitement chez les patients permettra de réduire la fonte musculaire qui les handicape.
Procédures
Avant le début de la procédure, chaque animal sera soumis à deux tests légers : un test d'agrippement et un électrocardiogramme (ECG), chacun durant respectivement 20 et 10 minutes. Ensuite, le traitement sera administré chaque jour sous la peau par injection ou par la bouche. L'administration dure 15 secondes. Un mois, deux mois et trois mois après le début du traitement, les animaux seront à nouveau soumis à un test d'agrippement et à un ECG. À la fin du traitement, soit trois mois après son démarrage, les animaux seront anesthésiés une ou deux fois par une injection sous la peau (20 secondes). Une fois endormis, les animaux se verront prélevés leur sang au moyen d'un geste de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Un effet indésirable du test d’agrippement est la cassure d’une griffe trop longue lors du saisissement de la barre. Les rats DMD peuvent exprimer une réponse aiguë de stress supérieure à la normale. Ils se figent pendant quelques minutes. Également, de possibles réactions de la peau consécutives aux injections multiples sur un même site.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Tout ce qui pouvait être testé sur l'efficacité des composés sans utiliser d'animaux a été réalisé avant le début de ce projet. Nous avons confirmé l'absence de toxicité des substances et de tous leurs métabolites chez les souris et les rats. Sur la base de ces résultats solides, notre objectif dans ce projet est de répondre à la question qui ne peut être abordée que chez l'animal vivant, avec tous ses organes en interaction constante : est-ce que l'action des substances innovantes testées permettra de ralentir efficacement la progression de la maladie musculaire ? Le cas échéant, par quels mécanismes moléculaires à l'intérieur des cellules ?
Réduction
Notre laboratoire a rassemblé une grande quantité de données à partir des modèles de rats utilisés dans ce projet. Nous avons perfectionné la correction des données avant de les analyser statistiquement. En se basant sur le calcul de la puissance statistique, il est recommandé d'utiliser seulement 8 rats par groupe. Ce nombre a été confirmé par d'autres projets similaires déjà terminés, pour lesquels des conclusions biologiques ont été obtenues. Pour nos analyses, nous employons des méthodes statistiques adaptées selon que nous comparons 2 ou 3 groupes d'animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des pièces avec contrôle continu de la température et de l'humidité de l'air ambiant. Le cycle d'éclairage des pièces respecte une alternance jour/nuit fondée sur les besoins naturels des animaux. Nous avons choisi de les élever dans les plus grandes cages disponibles sur le marché, leur permettant de marcher et de se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est adapté à l'évaluation de leur capacité locomotrice. Dans les cages, les rats ont un accès libre à la nourriture et à l'eau fournies à volonté. Les rats sont des animaux sociaux. Aussi, nous les hébergeons avec des congénères dans la même cage. Leur environnement est par ailleurs enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons en bois à ronger, des balles, des tunnels et des carrés de coton compacté. Pour éviter toute réponse de stress, les animaux sont habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, de la manière la plus douce possible. Le suivi des animaux est assuré par un personnel compétent capable de reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur chez les animaux. Nous avons établi une grille d'évaluation de la douleur, avec des points limites définis et affichés dans les pièces d'hébergement. Les rats sont constamment évalués en observant chaque individu, même les week-ends et les jours fériés. En cas d'anomalie, des mesures correctives sont prises. En cas d'absence de bénéfice suite au traitement prescrit, nous pratiquons une euthanasie compassionnelle. Elle permet d'éviter toute souffrance à l'animal.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère évolutivement proche de l'humain, ce qui en fait un modèle apprécié pour la recherche. Grâce aux récents outils de modification du génome, le rat est devenu un choix privilégié pour l'étude des troubles musculosquelettiques. Nos modèles de rats reproduisent fidèlement les myopathies humaines et sont appréciés en recherche médicale. Pour ce projet, les animaux utilisés seront âgés de 3 à 9 mois. À cet âge, l’impact de la maladie sur les muscles est détectable par des analyses de sang, de force, cardiaques et respiratoires. En utilisant des animaux de cet âge, il sera possible de conclure sur l’efficacité d’un traitement à un stade précoce de la malade.
Circuits de l’addiction à la nicotine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux chirurgies crâniennes de quarante minutes par animal, puis des séances d'enregistrement cérébral de cinq heures sous anesthésie profonde : 2 377 souris vont être utilisées, toutes tuées pour le prélèvement de leur cerveau. Pour 1 015 d'entre elles, les procédures sont menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil, les 1 362 autres subissant un niveau de souffrance modéré. Entre les opérations, elles passent vingt à quarante jours de tests, consommation de nicotine en cage individuelle, exploration, locomotion, anxiété et interactions sociales, pour cartographier les circuits cérébraux de la dépendance au tabac. Le porteur écarte le rat et le singe au motif que les outils génétiques y sont trop peu nombreux, et retient la souris parce qu'elle vit en groupe, ce qui permet d'étudier chez elle l'effet de la nicotine sur les rapports sociaux.
Objectifs
Le tabagisme est la première cause de mortalité évitable au monde (OMS). L'usage de la nicotine peut entraîner une dépendance par le biais de processus complexes qui sont régulés à la fois par ses effets récompensants et par ses effets aversifs. L’effet primaire de la nicotine sur le système nerveux central est d’activer les récepteurs de la nicotine, modifiant ainsi l’activité électrique des neurones. Ces récepteurs sont normalement activés par une molécule fabriquée par le cerveau : l’acétylcholine. Identifier et comprendre le rôle des différents récepteurs nicotiniques et des voies neuronales dans la transmission des effets récompensants et aversifs de la nicotine est crucial à la compréhension des mécanismes de la dépendance au tabac et au développement de nouvelles thérapies. Nous nous focaliserons sur deux voies distinctes. Premièrement, la voie de la résompense, qui fabrique de la dopamine et est impliquée dans les phénomènes de renforcement aux drogues et de motivation, mais aussi dans les effets anxiogènes de la nicotine. Nous étudierons cette voie dans le contexte du lien entre addiction à la nicotine et interactions sociales. Deuxièmement, nous étudierons une voie qui joue un rôle clé dans l’aversion à la nicotine et également un rôle de frein sur les proprétés récompensantes de la drogue. Le lien fonctionnel entre ces deux voies reste à élucider, et c’est l’objectif de ce projet.
Bénéfices attendus
La dépendance à la nicotine demeure un problème majeur de santé publique dans le monde entier, et les traitements pour les fumeurs qui veulent arrêter de fumer ne restent que marginalement efficaces. L'usage de la nicotine peut entraîner une dépendance par le biais de processus complexes qui sont régulés à la fois par ses effets récompensants et par ses effets aversifs. En fait, les humains comme les animaux de laboratoire régulent leur consommation de nicotine lorsqu’ils s’auto-administrent de la nicotine, en jouant sur cette balance renforcement/aversion. Identifier et comprendre le rôle spécifique de certains types de récepteurs nicotiniques et de certaines voies neuronales dans la transmission des effets récompensants et aversifs de la nicotine est crucial à la compréhension des mécanismes de la dépendance au tabac et au développement de nouvelles thérapies.
Procédures
1) Chirurgies réalisées sous anesthésie générale (durée 40 min), deux fois par animal maximum, avec 1 semaine de récupération entre deux chirurgies. 2) Prélèvement du cerveau : procédure réalisée sous anesthésie profonde (durée 10 minutes) une seule fois par animal. 3) Biopsie de la queue pour génotypage, réalisée une seule fois par animal. Durée 30 secondes. 4) Enregistrements des signaux électriques du cerveau in vivo (durée 5h) : procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie profonde, une seule fois par animal. 5) Tests comportementaux (consommation de nicotine, exploration, locomotion, tests d'anxiété, et interactions sociales), dont la réalisation s’étend de 20 à 40 jours, avec 1 jour de repos minimum entre deux tests. 6) Injections intraveineuse de composés : procédure réalisée sous anesthésie profonde, une fois par animal (durée 5 h).
Impact sur les animaux
Douleurs post opératoire minorées par l’emploi d’antalgiques, s’accompagnant d’une perte de poids durant environ 48 h. Des signes d'infection autour de la zone de chirurgie peuvent apparaître. Pour le test de consommation de nicotine, les animaux sont isolés, ce qui peut les stresser. Douleur légère de courte durée pour les animaux génotypés qui subissent une biopsie de la queue.
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés, afin de récupérer les cerveaux pour analyses histologiques et moléculaires, ou bien pour vérifier les sites d’injection.
Remplacement
La mise en place de l’addiction à la nicotine est un phénomène complexe qui fait intervenir plusieurs régions du cerveau et qui entraine des remaniements cérébraux à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition, le maintien et la rechute de ce trouble psychiatrique nécessite de travailler chez l’animal. En effet, les cultures de cellules ne permettent pas de reproduire la complexité des circuits neuronaux qui régissent ces différentes étapes de l’addiction. Ces circuits neuronaux doivent être étudiés soit sur organe prélevé (expériences d’électrophysiologie patch clamp) soit sur animal intact pour préserver les circuits (électrophysiologie in vivo, photométrie fibrée, optogénétique…). Par ailleurs ces expériences de physiologie sont mises au regard des comportements addictifs observés chez les animaux, comportements qui ne peuvent aujourd’hui être modélisés in silico. Par ailleurs, nous étudions l’impact de la nicotine sur les interactions sociales entre souris, et les circuits impliqués, ce qui ne peut être réalisé que chez un animal avec ses congénères.
Réduction
Le nombre d'animaux, pour ce projet, est déterminé sur la base d'une littérature vaste et robuste dans des domaines similaires mais aussi sur notre expertise personnelle en physiologie et analyses comportementales. Afin de minimiser l'utilisation de souris, nous nous imposerons un cahier des charges strict. Pour ce faire, les procédures ont été pensées pour qu'une même souris puisse passer dans un nombre maximum d'expériences (notamment les tests comportementaux) afin de réduire l'utilisation de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. Nous utiliserons dans la mesure du possible tant les souris mâles que femelles, afin d’utiliser toutes les souris issues d’une même portée. Les groupes d’animaux testés seront définis de manière à réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire pour obtenir des résultats robustes, dans les différentes conditions.
Raffinement
Le bien-être des souris est conditionné par la mise en place de protocoles visant à réduire les éventuelles souffrances animales (administration d'analgésique lors de chirurgies ou après agression entre congénères, utilisation d'anesthésique local au niveau des oreilles pour les injections stéréotaxiques). Un tapis chauffant est utilisé lors des chirurgies pour maintenir la température coroporelle constante. L’anxiété des animaux est réduite par un maintien en groupe et par une manipulation régulière. Les jours suivant l’opération chirurgicale, les animaux sont surveillés quotidiennement afin de détecter d'éventuelles infections post-chirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. Les signes de douleur contrôlés sont : apparence générale, alimentation, consommation d'eau, irritation au site de la chirurgie, vocalisation, tremblements, léthargie, agressivité etc.... En cas de signes de douleur (isolement, immobilité, perte de poids de plus de 10%, blessures contaminées, hyper-réactivité quand on le prend, posture, poils hérissés) persistant au-delà de 12h après la chirurgie, nous procéderons à une nouvelle injection d’antalgique et potentiellement à une application locale de pomade antibiotique sur une potentielle plaie infectée. Si les points limite persistent, une grille d’évaluation sera utilisée pour déterminer si l’animal doit continuer à être traité avec des analgésiques, ou euthanasié. Dans le cas où les animaux doivent être isolés (en cas de blessure ou pour enregistrement de consommation de boisson), un abri en carton ainsi que du tissu papier seront déposés dans les cages de manière à enrichir l’environnement des animaux et leur permettre de fabriquer un nid.
Choix des espèces
D’un point de vue anatomique et fonctionnel, les systèmes dopaminergiques et cholinergiques sont bien conservés chez l'ensemble des mammifères et en particulier chez les rongeurs. Plus particulièrement, les afférences cholinergiques sont organisées de manières similaires que chez l'homme. Ce n’est pas le cas chez les invertébrés, les poissons ou les oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulation des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles animaux. L’organisation anatomique des modèles d’invertébrés et poissons est trop différente pour qu'ils puissent être utilisés pour comprendre la modulation cholinergique et dopaminergique. Finalement la souris étant un mammifère social qui vit en groupe, c’est un modèle pratique pour pouvoir étudier le comportement social en groupe chez les animaux sociaux. Des modèles d’autres mammifères sociaux (rat, singe) ne se justifient pas car les outils génétiques nécessaires pour disséquer les mécanismes sous-jacents sont peu nombreux chez ces espèces. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (> 8 semaines) car leur cerveau est complètement développé et les circuits de la récompense sont arrivés à maturité.
Réalisation d’une étude de toxicologie préliminaire chez le chien
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Documenter la toxicité d'un candidat anticancéreux avant une demande d'autorisation de mise sur le marché : deux chiens vont être utilisés, tués à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre perfusions intraveineuses de dix minutes en huit jours, à jeun jusqu'à douze heures avant, puis se voit prélever du sang à quatorze reprises, dont six fois en vingt-quatre heures et six fois en six heures. Après chaque administration, les deux chiens sont séparés pendant six heures et gardés en contact visuel et auditif. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal entier et écrit que deux animaux constituent le minimum interprétable, sans qu'aucune approche statistique n'ait été réalisée.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets toxicologiques d'un élement test après une administration intraveineuse répétée 4 fois à 2 ou 3 jours d'intervalles.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet est de développer un nouveau médicament contre le cancer (Leucémie myéloide aigue récidivante ou réfractaire et le Lymphome diffus à grandes cellules récidivant ou réfractaire) chez l'homme.
Procédures
L'élément test sera administré par voie intraveineuse en perfusion de 10 minutes en quatre occasions: le premier jour, troisième, cinquième et huitième jour. Volume d'administration: 4 mL/kg. Temps de l'administration 10 minutes. Puis les animaux auront des prélèvements sanguins: - Jour -7 : 2.7 mL - Jour 0: 6 temps dans les 24h après traitement. Un volume de 0.3 mL de sang sera collecté à chaque temps de prélèvement. -Jour 7: 6 temps dans les 6 H aprés traitement Un volume de 0.3 mL de sang sera collecté à chaque temps de prélèvement. - Jour 8 : 3.0 mL. Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute pour tous les prélèvements
Impact sur les animaux
Le produit test fait partie de la classe thérapeutique oncologie. Les effets indésirables susceptibles d'être observé suite aux traitements sont une hypotonie. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires. Dans ce projet les nuisances sont: l'administration des éléments tests par voie intraveineuse avec mise à jeun au maximum 12h avant. Cela necessite une contention legère des animaux. Effets indésirables susceptibles, manque de mobilité . Les prélèvements sanguins seront réalisés. Les sites de prélèvements seront alternés autant que possible. Les prélèvements seront réalisés par un personnel formé et conformément à la réglementation en vigueur. Les prélèvements sanguins peuvent engendrer du stress pour l'animal, de l'inconfort lié à la contention et peut être une douleur au niveau du site de prélèvement. On ne s'attend pas à d'autre effet indésirable en particulier.
Devenir
Les animaux, aupréalablement anesthésiés, sont euthanasiés à l'issu de la procédure pour prélever les organes.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux, ni de mimer la toxicité des produits administrés, il est indispensable de recourir à l’animal entier. L'utilisation des animaux reste une exigence dans le cadre de la réglementation liée à l'autorisation de mise sur le marché (AMM) d'un nouveau médicament. Les méthodes alternatives: travail in vitro, ou le travail sur cellules isolées par exemple ne peuvent pas remplacer l'animal.
Réduction
Deux animaux seront inclus. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables. Aucune approche statistique a été réalisé pour ce projet.
Raffinement
Les deux chiens seront hébergés ensemble pendant la période d'acclimatation. Les animaux seront hébergés de manière individuelle aprés chaque administration pendant 6h. Durant cette période les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. De l'enrichissement (exemple: jouet) sera présent dans chaque box autant que possible. Tout geste réalisé sur l'animal sera fait par un personnel formé. Si un animal présente un signe de souffrance, un problème de comportement, un signe clinique sévère ( exemple vomissement trés intense à répétition, trouble de la miction ou troubles de l'alimentation), cet animal pourra être pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra avoir un traitement adapté pour soulager ses maux ( exemple administration d'un antivomitif, distribution d'aliment humide si nécessaire) Après le dernier prélèvement l'animal sera anesthésié puis euthanasié par une méthode chimique administrée par voie intraveineuse.
Choix des espèces
Espèce requise pour un produit pharmaceutique à visée humaine. Adultes. Animaux adultes necessaire pour ce type de projet. Animaux qui ont fini leur croissance.
Evaluation de l’effet de souches probiotiques sur les altérations de fonction barrière de l’intestin et l’hypersensibilité viscérale induites par un stress chronique chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Soumis une heure chaque matin pendant quatre jours à un stress d'évitement de l'eau, puis gavés quotidiennement pendant quinze jours, 200 rats Wistar vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la moitié d'entre eux en souffrance sévère. Vient ensuite une chirurgie de trente minutes sous anesthésie pour implanter un dispositif d'enregistrement, dix jours de récupération, puis une distension colorectale en trois paliers de cinq minutes, animal vigile maintenu dans un tunnel de contention. Le porteur, qui travaille avec un partenaire industriel, cherche à savoir si huit souches probiotiques corrigent la perméabilité intestinale et l'hypersensibilité viscérale du syndrome de l'intestin irritable. Tous les rats sont tués en fin de procédure, ceux qui ont reçu un radioélément ne pouvant plus, selon lui, être prélevés ensuite pour des raisons de sécurité.
Objectifs
Le Syndrome de l’intestin irritable (SII) est défini comme une maladie chronique définie par ses symptômes à savoir des troubles du transit intestinal (diarrhée ou constipation, voire une alternance des 2) et des douleurs abdominales (fortes douleurs au ventre, spasmes, ballonnements). Il a un retentissement très important sur la qualité de vie des personnes qui en sont atteintes, jugé équivalent ou supérieur à d’autres pathologies chroniques digestives. Cette maladie est très répandue à travers le monde et en France elle affecte 5% de la population soit plus de 3 millions de personnes. Les causes du SII ainsi que les dysfonctionnements et anomalies qui génèrent les symptômes sont multifactoriels et restent mal connues. Parmi les facteurs qui peuvent générer et/ou exacerber les symptômes du SII le stress occupe une place importante. Concernant les dysfonctionnements impliqués dans cette maladie, une mauvaise communication intestin-cerveau, un intestin poreux ou encore des modifications du microbiote intestinal ont été incriminés. Face à cette diversité de causes et dysfonctionnements, les traitements médicamenteux restent peu efficaces. Parmi les pistes thérapeutiques en développement figure l'utilisation de micro-organismes (bactéries et levures) qui ont des effets bénéfiques sur la santé quand ils sont consommés en quantité suffisante (ces micro-organismes sont appelés probiotiques). Dans ce projet nous évaluerons les effets des traitements par différentes souches probiotiques (8) sur l’augmentation de la perméabilité intestinale et de la sensibilité viscérale (dysfonctionnements observés dans le SII) induites par un stress (facteur impliqué dans le SII) à l’aide d’un modèle de stress chronique chez le rat (stress d’évitement passif de l’eau WAS)
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre d’identifier des souches probiotiques intéressantes dans la restauration de la fonction barrière de l’intestin et de la sensibilité viscérale altérées par le stress et les mécanismes impliqués dans ces effets. Outre l’apport de connaissances sur le rôle des probiotiques dans la santé digestive, ce projet vise à apporter du rationnel pour le développement de traitements préventifs et thérapeutiques pour le SII, sur la base des propriétés des souches testées
Procédures
Tous les animaux seront soumis au stress d’évitement passif de l’eau d’une durée de 1h, à heure fixe le matin pendant 4 jours consécutifs. Tous ces animaux recevront par voie orale des souches probiotiques ou du sérum physiologique d’un volume de 1ml à une fréquence de 1 fois par jour pendant 15 jours consécutifs. La durée d’ administration orale est de courte durée de 30 secondes par animal. Pour la mesure de la perméabilité intestinale, les animaux recevront une dose unique d’un volume de 500 µl molécule marquée. Ce geste d’ administration orale est aussi de courte durée, d’environ 30 secondes. Pour la mesure de la sensibilité viscérale, les animaux seront équipés d’un dispositif d’enregistrement, nécessitant une chirurgie. Les chirurgies étant réalisées et maitrisées par des agents expérimentés sont de courte durée maximum de 30 minutes, ce qui facilitent au mieux la récupération des animaux. Après 10 jours de récupération de l’acte chirurgical , les animaux seront soumis à une distension colorectale de 3 paliers successifs d’une durée chacun de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les souches probiotiques seront administrées par voie orale et des nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être : Une mobilité réduite liée à la préhension pour le gavage, geste d’une durée de 1 minute ainsi qu’une douleur ou irritation du tube digestif lors des premiers jours d’administration des souches probiotiques -Le stress d’évitement passif de l’eau d’une durée d’1 heure pendant 4 jours successifs pourrait engendrer une perte de poids. Des signes d’anxiété pourraient être observés. -Pour la mesure de la perméabilité intestinale. les animaux seront placés en cages métaboliques, ce qui pourrait engendrer un stress à ce nouvel environnement, -Pour la mesure de la sensibilité viscérale, tous les rats seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale à raison d’un temps maximum de 30 minutes par intervention et pourrait engendrer un inconfort au réveil. - La distension colorectale nécessite de placer l’animal vigile en tunnel de contention, les effets indésirables pourront être une mobilité réduite et un inconfort pour l’introduction du ballonnet et la mesure de contractions.
Devenir
Tous Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer des prélèvements de tissus post-mortem pour différentes analyses, et dosages. Les animaux qui ont reçu un radioélément empêche leur utilisation et prélèvements ultérieurs pour des raisons de sécurité et seront euthanasiés à la fin de la procédure conformément à la réglementation.
Remplacement
Le SII est une maladie dont les causes sont méconnues et les mécanismes complexes (ex. altération de l’axe intestin-cerveau incluant la douleur viscérale, augmentation de la perméabilité intestinale, altération de la flore intestinale etc..).L’utilisation du modèle in vivo se révèle indispensable pour mimer le SII qui implique la communication inter-organes (intestin-cerveau), et des conséquences à l’échelle de l’organe (intestin poreux). Cette approche à l’échelle de l’organisme est pertinente pour l’évaluation pré-clinique des traitements probiotiques en vue d’un futur développement chez l’Homme dans la thérapie du SII. Ainsi dans l’objectif de tester des traitements en l’occurrence des probiotiques sur les paramètres le plus caractéristiques pour cette pathologie comme la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale totale du tractus digestif, le modèle animal semble l’approche pré-clinique la plus appropriée.
Réduction
L’amélioration du bien-être animal acquise par les études précédentes a abouti à une réduction du nombre d’animaux utilisés. Ainsi, l’amélioration de la prise en charge post-opératoire par l’acquisition d’armoires ventilées a permis d’augmenter la survie des animaux et d’éviter des études en répétition et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre calculé (basé sur des études antérieures) au plus juste d’animaux nécessaire est de 10 rats par groupe, étant donné la variabilité inter-individuelle liée à la sensibilité viscérale (mesure de la variable « contraction musculaire abdominale) et à la mesure de perméabilité intestinale totale (mesure de la variable « volume totale d’urines »).
Raffinement
Pour assurer une fiabilité des résultats et limiter le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière sera accordée au bien-être de l’animal (contrôle de l’environnement, respect du cycle jour nuit). A leur arrivée les animaux seront hébergés collectivement (n=5/cage) au calme et surveillés pendant une période d’acclimatation (7 jours). L’acclimatation permet de récupérer du stress lié au transport et de s’adapter aux nouvelles conditions de vie. Ce n’est qu’à l’issue de cette période que les animaux seront inclus dans l’étude. Dans le but d’améliorer le bien-être de ces animaux, des bûchettes en peuplier et maisonnette en inox seront disposées dans chaque cage. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée pour détecter à temps toute anomalie et minimiser la durée de toute souffrance constatée. Un procédé de notation (grille de scoring) fondé sur la mise en place de points limites permettant de déterminer la capacité de l’animal à rester en procédure et adapté à chaque procédure est établi afin d'effectuer une surveillance de l'état général des animaux. Toutes les mesures seront prises pour réduire le stress et la douleur (habituation à des nouveaux environnements, prise en charge de la douleur pré-post opératoire, réhydratation, tapis chauffant, armoires ventilées, mesures des poids, état général des animaux).
Choix des espèces
Le modèle animal rat souche Wistar est un modèle largement utilisé dans la littérature pour comprendre les effets et mécanismes impliqués dans le SII. Nous utiliserons donc cette espèce qui a fait aussi l’objet de nos précédents travaux académiques et de collaboration avec ce partenaire industriel sur les effets du SII permettant de respecter l’utilisation d’un nombre d’animaux réduits plutôt que d’ajouter un paramètre de variabilité par l’utilisation d’une autre espèce et souche nécessitant de mises au point et des répétitions. Les animaux seront commandés à l’âge adulte (100-125g correspondant à 28-30 jours) et n'entreront en procédure qu'après une semaine d'acclimatation. Les animaux utilisés sont adultes car il est indispensable d’avoir un tractus digestif à pleine maturité physiologique.
Etude des effets protecteurs d’une molécule qui s’oppose aux effets du récepteur aux hydrocarbures aromatiques sur la carcinogenèse hépatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Provoquer un cancer du foie par deux produits chimiques puis y ajouter de la dioxine pour voir si une molécule expérimentale freine les tumeurs : 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une première injection de diéthylnitrosamine leur est faite à quinze jours de vie, suivie à partir de huit semaines de deux injections de tétrachlorure de carbone par semaine pendant douze semaines et d'un gavage hebdomadaire de dioxine jusqu'à vingt semaines. Le porteur indique que les tumeurs hépatiques ainsi obtenues restent indolores à leurs débuts et deviennent douloureuses aux stades tardifs. Il annonce que toute souris chez qui une douleur serait observée serait mise à mort par anticipation, sans décrire ce qu'il surveille au-delà d'une observation quotidienne du comportement.
Objectifs
La dioxine est un polluant environnemental qui est présent dans notre alimentation et qui peut induire le développement d’un cancer du foie après une exposition chronique. La toxicité de la dioxine résulte pour une grande part de l'activation du récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AHR). Dans ce projet, nous étudierons la capacité d'une molécule qui s'oppose aux effets d’AHR (antagoniste AHR) à réduire le développement du cancer du foie induit par la dioxine. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de cancer du foie induit par deux produits chimiques, le dihétylnitrosamine (DEN), administré aux souris âgées de 15 jours, et le tétrachlorure de carbone (CCl4), administré aux souris 2 fois par semaine pendant 12 semaines à partir de l’âge de 8 semaines. Ce modèle permet le développement de tumeurs hépatiques (induites par le DEN) sur un foie avec une fibrose (induite par le CCl4). Les souris seront également soumises à une administration chronique de dioxine ou son diluant (corn oil) par gavage une fois par semaine à partir de l'âge de 8 semaines jusqu'à 20 semaines. Cette administration de dioxine combinée avec le DEN/CCl4 permet de mimer la physiopathologie observée chez l’Homme au cours de laquelle les polluants environnementaux agissent comme des co-facteurs de développement et de progression des cancers. La dioxine agit alors comme un promoteur de tumeurs. Son administration sans DEN/CCl4 permettre d’étudier son effet en tant qu’initiateur de tumeurs. Les souris seront également soumises à une administration de l'antagoniste d'AHR qui sera incorporé à l'alimentation pendant 4 semaines (pendant les semaines 17 à 20). Ces expériences seront réalisées chez des souris contrôle ainsi que des souris génétiquement modifiées pour étudier les effets de l'absence du gène AHR dans un type cellulaire particulier. Ce projet est dans la continuité d'un autre projet visant à étudier les mécanismes par lesquels la dioxine favorise le développement du cancer du foie et qui a permis de montrer un rôle de la voie AHR des cellules endothéliales dans les effets pro-tumoraux de la dioxine.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de déterminer si une approche thérapeutique basée sur l’utilisation d’un antagoniste d'AHR permet de contrer les effets des polluants environnementaux sur la carcinogenèse hépatique.
Procédures
Les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale 15 jours après la naissance ; deux injections intrapéritonéales par semaine à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 12 semaines ; un gavage par semaine à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 12 semaines. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 15 secondes par souris et les gavages de 30 secondes par souris. Les souris auront un prélèvement de sang au moment de la mise à mort.
Impact sur les animaux
Les souris auront une administration de diétylnitrosamine ou vehicle (douleur légère de courte durée) ; des administrations de tétrachlorure de carbone ou vehicle (douleur légère de courte durée) ; des administrations de TCDD (douleur légère de courte durée). Les souris traitées avec DEN/CC4 développeront des tumeurs hépatiques (sans douleur aux stades précoces et modérée aux stades plus tardifs).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets de l'antagoniste d'AHR.
Remplacement
L'utilisation de modèles animaux est essentielle pour étudier les effets d'un antagoniste d'AHR sur le développement tumoral induit par la TCDD. Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives. En effet, il n’existe aucun moyen de remplacer une telle étude dans laquelle la réponse physiopathologique est complexe et met en jeu plusieurs types cellulaires (hépatocytes, cellules endothéliales, cellules inflammatoires, fibroblastes, …).
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé comme celui permettant de démontrer une différence statistiquement significative de 30 % de l'aire tumorale.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrés de coton pour faire leur nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose. Par ailleurs, nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée.
Choix des espèces
La souris est l’espèce couramment utilisée dans ce protocole de carcinogenèse hépatique. De plus, nous avons utilisé le même modèle pour mettre en évidence le rôle de la voie AHR dans les effets pro-tumoraux de la TCDD. Ainsi, cette étude permettra de montrer l'effet protecteur d'un antagoniste d'AHR dans le même modèle. Enfin, ce modèle présente l'avantage qu'il nous permet de travailler avec des souris génétiquement modifiées. En effet, nous disposons de souris génétiquement modifiées pour étudier les effets de l'absence du gène AHR dans les cellules endothéliales. Le diétylnitrosamine est un produit chimique qui induit des cancers du foie s’il est administré chez le souriceau de 15 jours en combinaison avec des administrations de CCl4 à partir de l’âge adulte (8 semaines).
Cibles thérapeuthiques et mécanismes de maladies inflammatoires chroniques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Une injection d'huile minérale dans le ventre déclenche chez les souris de ce projet un lupus qui se développe ensuite sur huit à vingt-quatre semaines. 1 940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent jusqu'à dix injections intrapéritonéales en quinze jours et un prélèvement sanguin sous anesthésie, l'objectif étant de savoir si la suppression d'une cellule immunitaire rare, le basophile, freine la maladie. Le porteur écrit que ni douleur chronique ni souffrance permanente ne sont attendues et qu'aucun médicament contre la douleur n'est donc "nécessaire", tout en décrivant une maladie inflammatoire chronique entretenue pendant six mois.
Objectifs
Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles) dans l'amplification des facteurs responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs protéines dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de la suppression de ces cellules dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de Lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.
Procédures
Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : des injections dans le ventre (« intrapéritonéales »), des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) et certains seront soumis au prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale une seule fois dans le but d'induire la maladie étudiée. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois sur une période de 8 ou 24 semaines: une fois dans le but de d'induire la maladie étudiée et 4 fois dans le but d'éliminer les cellules étudiées sur une période de 10 jours. Ces dernières souris auront un prélèvement sanguin sous anesthésie générale une seule fois avant d'éliminer les cellules d'intérêt la première fois. Cela nous permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant et après élimination des cellules. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale de huit à dix fois sur une période de 15 jours dans le but d'étudier l'effet de l'élimination des cellules d'intérêt dans un modèle de vaccination.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables induits sur les animaux sont de deux catégories. La première catégorie concerne le stress et les douleurs brèves induites par la contention manuelle des animaux, les injections intrapéritonéales multiples et les prélèvements sanguins (une seule fois) sous anesthésie générale. La deuxième catégorie concerne l’induction d’une maladie inflammatoire chronique (le lupus) par l’injection d’une huile minérale (pristane) dans le péritoine (le ventre) des souris. Cette huile peut induire, chez un faible pourcentage de souris, une difficulté respiratoire sur 2-3 jours, 2 à 3 semaines après l’injection. Après ce stade, la gêne disparaît. Les souris seront suivies de très près pendant cette phase pour s’assurer qu’aucune ne développe une forme respiratoire grave. La maladie induite (lupus) se développe alors sur une période de 8 à 24 semaines.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'en analyser différents organes. La mort sera confirmée par vérification de l'arrêt cardio-respiratoire.
Remplacement
Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.
Réduction
L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des procédures seront également utilisés pour réaliser des cultures cellulaires et des expériences in vitro après leur mise à mort. Les échantillons des souris chez lesquelles la maladie a été induite serviront de contrôles positifs pour des expériences ultérieures. Le but est de valider nos approches thérapeutiques afin de pouvoir les développer pour la pathologie humaine. Le nombre d’animaux qui seront utilisés est réduit au minimum mais est suffisant pour pouvoir obtenir des conclusions scientifiques solides.
Raffinement
Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Aucun médicament contre la douleur n'est donc nécessaire. Tous les animaux seront observés quotidiennement par le personnel compétent de l'animalerie. Afin de réduire au minimum le stress et la douleur qui pourraient être ressentis par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions : Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents infectieux. L’enrichissement de l’environnement des souris dans les cages (cotons pour construire des nids, maisonnettes en plastiques pour se cacher…) permet d’optimiser le bien-être des animaux. Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures). Les animaux devant être prélevés d'un peu de sang pour des analyses le seront après une brève anesthésie générale. Différentes actions seront mises en place allant de l’ajout de nourriture dans la cage à l’euthanasie anticipée de la souris. Les procédures dureront 24 semaines maximum pour notre modèle induit (souris âgées de 32 à 36 semaines au maximum en fin de procédure). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour analyse des paramètres de la pathologie. Aucun animal ne sera réutilisé dans des expériences ultérieures. L’état général des animaux chez qui la pathologie est induite sera suivi sur une grille de score permettant de s’assurer que l’état des animaux n’est pas altéré. En cas d’altération trop marquée, les animaux concernés seraient euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris) est le seul modèle de mammifères disposant des animaux modifiés génétiquement pertinents pour les objectifs scientifiques de notre projet ayant trait au lupus. Toutes les souris entreront en procédure à l’âge adulte (minimum 8 semaines d’âges) et seront analysées au maximum à 36 semaines d’âge.
Thérapie génique par transfert viral du gène ASAH1 chez un modèle murin du deficit en céramidase acide
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
Nées avec une mutation qui bloque la dégradation du céramide, les souris de ce projet ont une espérance de vie de 100 jours et développent dès trois semaines un retard de croissance, un gonflement du foie et de la rate et une faiblesse musculaire qui leur rend l'accès à la nourriture difficile. 1 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des vecteurs viraux censés apporter une copie fonctionnelle du gène ASAH1. Chaque mois, elles subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie au sinus rétro-orbital ou à la mandibule, une mesure de conduction nerveuse de vingt minutes et une heure trente d'observation de leur activité, avant un prélèvement terminal de muscles et une perfusion de fixateur par le flux sanguin. Les souris qui héritent de la mutation partent toutes en expérimentation puis sont tuées, celles qui n'en héritent pas sont mises à la reproduction pour entretenir l'élevage ou tuées faute d'usage.
Objectifs
La maladie de Farber et l’amyotrophie spinale associée à une forme d’épilepsie progressive myoclonique (SMA-PME) sont deux maladies génétiques rares causés par des mutations dans le gène ASAH1. Ce gène produit une enzyme appelée céramidase acide, qui décompose une substance appelée céramide dans les cellules. Lorsque ce gène est défectueux, l'enzyme ne fonctionne pas correctement, entraînant une accumulation toxique de céramide dans les cellules. Ces maladies affectent principalement le système nerveux et d'autres tissus du corps. Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif pour ces maladies. Notre projet vise à développer une thérapie génique pour traiter le déficit en céramidase acide. Pour cela, nous utilisons de virus modifiés appelées AAV comme transporteurs pour introduire une version correcte du gène ASAH1 dans les cellules des patients. Nous avons testé cette thérapie chez des souris modèles représentant la maladie de Farber. Deux méthodes d'injection ont été explorées : l'injection dans tout le corps et l'injection directement dans le cerveau. Les deux méthodes ont montré une amélioration de la survie des souris et une correction des symptômes de la maladie. Cependant, l'utilisation de ce vecteur à des fortes doses peut provoquer des altérations dans certains tissus après injection dans tout le corps. Par conséquence, l'objectif actuel de notre projet est de tester de nouveaux virus AAV qui ciblent plus efficacement les cellules malades. Cela nous permettrait de réduire la dose nécessaire pour obtenir un effet thérapeutique après injection dans tous les corps, minimisant ainsi les risques d'inflammation. Enfin, pour l’injection directe dans le cerveau il est important de confirmer si une telle méthode d’administration pourrait représenter une stratégie efficace pour traiter les formes du déficit en céramidase acide qui affectent principalement le système nerveux central et, secondairement, les autres organes.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’identifier de nouveaux candidats médicaments et d’investiguer sur des défauts tissulaires dû à la maladie pour à terme apporter une solution thérapeutique adaptée aux patients qui aujourd’hui n’existe pas. D’abord nous allons investiguer sur la présence ou non d’une atteinte au niveau de la barrière hémato-encéphalique. Si cette hypothèse se révèle correcte, nous en tiendrons compte pour ajuster la conception des thérapies, y compris le choix du vecteur et la dose, afin de favoriser une distribution optimale du traitement. Par la suite, nous espérons choisir un vecteur AAV qui cible mieux les cellules affectées par la maladie. Cela nous permettrait d'utiliser une dose plus faible pour obtenir une correction complète, réduisant ainsi les coûts de production du produit et les effets secondaires liés aux doses élevées, comme observé lors des études précédentes. Enfin, nous aurons une vue plus claire sur l'efficacité de l'injection directe dans le cerveau comme méthode d’administration pour traiter les formes de déficit en céramidase acide qui affectent principalement le système nerveux central et, secondairement, les autres organes.
Procédures
Le prélèvement d’un petit bout de queue (2/5 mm) sera effectué sur des souris à la naissance ou à 15 jours de vie (5sec). L’administration des vecteurs AAV sera réalisé par voie intraveineux (15sec si volume ≤100 µL/20g; jusqu’à 1min si volume ≤ 250µL/20g) et par voie intra-cérébro-ventriculaire (ICV) (15sec). Afin d’évaluer l’efficacité du traitement lors des études, des tests fonctionnels pourront être réalisés chez des animaux vigiles : évaluation de leur activité tous les mois pendant 1h30 et analyse de leur force musculaire toutes les semaines pendant 10min. La force spécifique d’un muscle sera étudié chez d’autres animaux anesthésiés pendant 1h15 par animal une seule fois lors de l’étude. L’analyse de la transmission électrique entre les nerfs et les muscles sera réalisée chez des animaux anesthésiés pendant 20min tous les mois lors de l’étude. Chaque mois afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique, tous les animaux seront anesthésiés pendant moins de 5min pour réaliser un prélèvement de sanguin. En fin d’étude, des prélèvements de muscles (5min) ainsi que l’injection d’un fixateur par perfusion via le flux sanguin (5min) seront réalisés sous anesthésie générale et sans réveil pour l’animal.
Impact sur les animaux
La mutation dans le gène Asah1 chez la souris entraîne une accumulation toxique de céramide dans plusieurs organes de l’animale en accord avec les manifestations cliniques aussi décrites chez l’homme. Les animaux ont une espérance de vie de 100 jours, avec des symptômes apparaissant dès 3 semaines de vie : retard de croissance, gonflement du foie et de la rate, et faiblesse musculaire généralisée, rendant les déplacements et l'accès à la nourriture difficiles. Le test d'échappement peut causer une légère nuisance avec un pincement de la queue, provoquant rarement un léger saignement. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent occasionner une douleur légère liée à la piqûre.
Devenir
Certaines souris issues des croisements mais ne présentant pas de pathologie seront utilisées pour les accouplements nécessaires au maintien et à l'amplification de l'élevage. Les animaux issus des croisements mais ne présentant pas de pathologie et non nécessaires au maintien et à l'amplification de l'élevage seront euthanasiées. Toutes les souris présentant le phénotype pathologique seront incluses dans les procédures expérimentales et seront euthanasiées à la fin de la procédure expérimentale ou en cours de procédure si leur état de santé le nécessite.
Remplacement
Le modèle murin utilisé dans ce projet est le premier modèle pertinent publié dans la littérature qui récapitule les symptômes retrouvés chez les patients affectés par la maladie de Farber. Des modèles in vitro 2D existent, mais ils ne permettent pas d’étudier certains défauts majeurs de la pathologie, tels que l'infiltration de cellules immunitaires dans les organes cibles de la maladie. Les modèles in vitro 3D (ou organoïdes) ne possèdent pas à ce jour toutes les structures anatomiques spécifiques de chaque organe. De plus, on ne peut pas reproduire exactement la biodistribution du vecteur après administration dans le corps entier, ce qui limiterait les informations collectées pendant les études pour la transposabilité des résultats vers des études précliniques. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour cette étude.
Réduction
Le nombre minimal d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été déterminé à l’aide de calculs statistiques. Cela permet d’observer les différences entre les animaux sains et malades concernant la barrière hémato-encéphalique, d’étudier le potentiel thérapeutique de chaque vecteur testé et de maintenir les lignées tout au long du projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies avec du coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. Concernant les souris porteuses de la mutation pour le gène Asah1, des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 2 fois par semaine, en plus de l’observation quotidienne des animaux. De plus, un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès à la nourriture des souris malades. Afin de réduire la souffrance et le stress de ces animaux, des points limites ont été établis pour chaque procédure et manipulation. En cours du suivi du traitement, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie mandibulaire ou rétro-orbitale, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et le prélèvement sera au maximum du 10% de volume sanguin total de la souris. La méthode de prélèvement sanguin sera adaptée et réalisée au sinus rétro-orbital dans le cas où un processus de cicatrisation serait en cours (présence de croute, hématome, rougeur ou gonflement). L’œil sur lequel le prélèvement est effectué sera noté sur la fiche de suivi de l’animal afin de privilégier l’autre côté pour un prélèvement le mois suivant. Raffinement pour analyses fonctionnelles et prélèvement des muscles : afin de réaliser une mesure de force musculaire, l’animal recevra une injection d’analgésique en sous-cutanée, ce qui permettra de soulager les douleurs intenses éventuelles, et sera anesthésié par voie intrapéritonéale. L’animal sera également disposé sur un support chauffant tout au long de l’anesthésie.
Choix des espèces
Pour évaluer des stratégies thérapeutiques contre le déficit en céramidase acide, le modèle murin porteur d’une mutation dans le gène Asah1 a été choisi car il reproduit très fidèlement les symptômes de la maladie observées chez l’homme. Pour générer les animaux nécessaires à l’étude, les souris seront mises en reproduction entre l’âge de 8 semaines et 6 mois. Afin d’investiguer un défaut de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, les animaux contrôles et malades seront injectés à l’âge de 7 semaines et euthanasiés 8 jours après le traitement. À ce stade, la pathologie est suffisamment avancée pour déterminer si une altération existe et pour étudier les conséquences à court terme sur la capacité du vecteur à atteindre les régions touchées par la maladie. Lors de l’étude visant à identifier la combinaison vecteur-dose la plus efficace après injection via la veine de la queue, les souris seront traitées à l’âge de 7 semaines. Pour évaluer si l’injection directement dans le cerveau de vecteurs sélectionnés peut prévenir l’état inflammatoire dans le système nerveux central ainsi qu’au niveau des tissus périphériques pour les formes les plus sévères et précoces de la maladie, les animaux seront traités le jour de leur naissance.