Procédures modérées

Une biopsie de peau, la greffe d'un feuillet d'épiderme humain sous anesthésie, puis six semaines d'isolement en cage individuelle parce que les rats rongent l'implant de leurs congénères. 136 rats nude, dépourvus de défenses immunitaires, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 tués et autopsiés, 16 n'ayant reçu qu'un examen ophtalmologique étant réutilisés dans d'autres projets. L'étude est une toxicologie réglementaire, prérequis administratif aux essais cliniques d'un implant cutané destiné aux ulcères de la peau. Le porteur écrit n'attendre aucun effet indésirable important, tout en prévoyant la mise à mort des animaux en cas de nécrose cutanée, de rejet du greffon ou de douleur sévère, et rapporte l'effectif à des lignes directrices internationales dont il ne dit pas ce qu'elles exigent.

Objectifs

Réaliser une étude de toxicologie réglementaire, chez le rat immunodéficient, d’une greffe de tissu humain avant administration à l’Homme pour traiter les ulcères de la peau, c'est à dire évaluer la toxicité, la tumorogénicité et la biodistribution de la greffe de cellules souches pluripotentes humaines.

Bénéfices attendus

L’étude de toxicologie menée dans le cadre de ce projet est le prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III. C’est une étude de toxicologie réglementaire selon les guidelines ICH/EMA. Elle vise à définir le profil de toxicité, de tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques, dans les différents organes et tissues. Elle permet donc de démontrer l’absence de risque du modèle de d’implant avant de le réaliser chez l’Homme. Elle permet d’évaluer la sécurité du médicament, qui est ici l’implant de tissu (un modèle d’épiderme obtenu par culture cellulaire de cellules souches pluripotentes humaines) Elle permettra de collecter des données sur la toxicité, la tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques chez un organisme entier, en l’absence de méthodes alternatives actuelles permettant d’obtenir toutes ses données. Il permet de récolter des données réglementaires pour la préparation des essais cliniques. En effet, ces études permettent d’augmenter les chances de tester cliniquement un produit dépourvu d’effets toxiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie et analgésie adaptées : une biopsie de la peau est effectuée et d’un greffon de cellules épidermique humain est mise en place sur la zone biopsiée La durée de la chirurgie est d’environ 30 min. Un suivi post opératoire bi quotidien est ensuite réalisé avec administration d’un analgésique pendant 3 jours (doses pouvant être augmenté si nécessaire). Des prélèvements sanguins seront effectués sur l’ensemble des animaux pendant la durée de l’étude (au maximum 26 semaines) : jusqu’à 4 prélèvements, sous anesthésie légère.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu d’effets indésirables importants lié à l’implant de tissu épidermique chez l’animal en raison d’une procédure d’anesthésie/analgésie mise en place par un vétérinaire, d’une chirurgie de courte durée (environ 30 minutes) effectué par un personnel compétant et un suivi post-opératoire et quotidienne pendant l’ensemble de la durée de la procédure. L’utilisation d’animaux immunodéficients réduits le risque d’inflammation importante et le risque de rejet de l’implant de tissues épidermiques. De plus, les prélèvements sanguins effectués au cours de la procédure sont des gestes peu invasifs et peu douloureux d’autant plus lorsqu’ils sont effectués par du personnel expérimenté selon les lignes directrices EFPIA / ECVAM (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations / European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development. Cependant, en cas de signes d’infections, de rejet du greffon, ou d’effets toxiques importants liés à l’implant (perte de poids importante, inflammation sévère, nécrose cutanée, douleur sévère) l’animal sera euthanasié afin de procéder à un examen anatomopathologique dans le cadre de l’étude de toxicité réglementaire, selon les recommandations l’ICH/EMA.

Devenir

Les animaux n'ayant reçu qu'un examen ophtalmologique (non invasif) pourront être réutilisés dans d'autres projets. Les animaux ayant subi la chirurgie sont euthanasiés et autopsiés, comme définit par les lignes directrices ICH/EMA encadrant le déroulement des études de toxicologie règlementaire.

Remplacement

L’étude de toxicologie menée dans le cadre de ce projet est une étude de toxicologie réglementaire selon les guidelines ICH/EMA, prérequise aux essais cliniques de phase I, II et III. Elle vise à définir le profil de toxicité, de tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques, dans les différents organes et tissues. Elle permet d’évaluer la sécurité du médicament, qui est ici l’implant de tissu (un modèle d’épiderme obtenu par culture cellulaire de cellules souches pluripotentes humaines). Les études de toxicologie règlementaire doivent être effectuées sur des modèles animaux selon les guidelines ICH/EMA, il n’est donc pas possible actuellement de remplacer les modèles in vivo par des modèles in vitro ou in silico

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser par groupe est fixé par les lignes directrices ICH/EMA. Il est considéré comme le minimum acceptable des études réglementaires afin de permettre une interprétation scientifique des données et d’évaluation précise des possibles effets toxiques.

Raffinement

Afin de réduire les nuissances liés à la chirurgie, un protocole anesthésie/analgésie est avec une prémédication (qui permet de rendre plus rapide et plus stable l’anesthésie et d’apporter une analgésie), une application d’anesthésique locale avant l’incision et générale en fin de chirurgie et une anesthésie générale gazeuse avec inhalation d’isoflurane sont mis en place pour permettre une chirurgie et un réveil rapide et sans douleur. Le suivi post-opératoire sera biquotidienne, et inclus l’administration d’analgésie injectable (si nécessaire) et par voie orale (dans l’eau de boisson) systématiquement durant 2 à 3 jours. Un hébergement individuel est requis pendant 6 semaines pour éviter tout risque de destruction de l’implant qui a été observé lors des études préliminaires avec hébergement collectif : les rats rongent systématiquement l’implant du congénère lors des 1ères semaines post-opératoires. L’hébergement sera enrichie (object en bois spécifiques pour les rongeurs de différentes formes et tailles, en plus des enrichissements déjà prévus pour une hébergement collectif - tunnel, matériaux de nidification, bois à ronger - et une litière de cellulose favorisant le confort des rats nude) pour maintenir le bien être de l’animal sous supervision de la SBEA. Les animaux seront isolés dès la semaine d'acclimatation, afin d'éviter tout risque de blessures cutanées liées à un jeu ou une bagarre et réduire l'impact de l'isolement au réveil de la chirurgie. Les prélèvements de sang seront réalisés sous sédation par inhalation d’isoflurane, afin de limiter le stress induit par la contention manuelle ou des lésions vasculaires lorsqu’un animal est agité. Enfin, pour réduire les nuissances liés à la greffe et la chirurgie (principalement l'inflammation et le rejet du greffon), une souche de rat immunodéprimé est utilisée. Comme cette souche peut être plus sensibles aux agents pathogènes, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages type III H permettant à l'animal de se redresser (dimension 374x214x185 prévue intialement pour 2 à 4 rats) sous couvercle filtrant , puis en groupe dans des portoirs ventilés. Les salles d'hébergements et de test utilisées seront dédiées à cette souche uniquement avec d'éviter des contaminations croisées et l'ensemble de l'étude se déroulera dans une zone SPF (Specific Pathogen Free). Des points limites ont été définies afin de permettre la mise en place d'actions correctives afin d'éviter tout souffrance.

Choix des espèces

Les études de sécurité et d’efficacité pré-clinique sont des études réglementaires in vivo (régies par les lignes directrices ICH M3(R2) et ICH S3A et ICH S6(R1)) qui nécessitent l’utilisation d’au moins une espèce animal. Le rat nude immunodéficient permet d’implanter en sous cutanée l’implant de cellule humaine sans risque de rejet immédiat et il permet l’évaluation de la toxicité, la tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques chez un organisme entier, en l’absence de méthodes alternatives actuelles avant de faire les essais cliniques chez l’Homme A partir de 6 semaines, selon l’âge recommandé par les lignes directrices ICH/EMA

Mesurer la puissance paralysante de formulations de toxine botulique, destinées au traitement de la spasticité comme à des usages cosmétiques, occupe ici 4 650 souris et 1 550 rats. Tous vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous seront tués, par prélèvement intracardiaque, le dernier jour. La toxine est injectée dans le muscle du mollet sous anesthésie, ce qui provoque une paralysie plus ou moins marquée des membres postérieurs, une perte de poids et des difficultés à atteindre la mangeoire, puis chaque animal passe dix à trente tests d'écartement des orteils sur cinq à vingt-cinq jours. Le porteur indique que des cultures de neurones humains ont été proposées comme alternative sans être validées par la communauté scientifique ni par les autorités, et conclut que l'étude ne peut se faire que sur animaux vivants.

Objectifs

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sont utilisées depuis près d’un demi-siècle dans le traitement des troubles liés à une contractilité musculaire excessive. Elles sont classiquement utilisées dans le soulagement des troubles du mouvement tels que la dystonie et la spasticité, ainsi que pour des fins cosmétiques. En plus les formulations dérivées de BoNTs bénéficient à un éventail beaucoup plus large de patients souffrant de vessie hyperactive, de dysfonction érectile, d’arthropathie, de douleurs neuropathiques et de cancer. La recherche de nouvelle formulation de BoNTs est très active en ce moment et il est nécessaire de mettre au point de test in vivo rapides mais précis, pour évaluer l’efficacité de différents types de BoNTs, autant naturels que recombinants. L’objectif de cette étude est de réaliser une évaluation in vivo de l’efficacité de molécules thérapeutiques à base de neurotoxine botulique nouvellement développées ; le protocole expérimental consiste à exécuter le test du score d’abduction des orteils (DAS) chez le rongeur. La puissance d’une préparation de neurotoxine botulique (BoNT) donnée peut être évaluée régulièrement en utilisant le test DAS, qui mesure la réduction de la force musculaire des doigts de la patte après injection de BoNT dans le muscle squelettique de la patte arrière chez les rongeurs. Il est bien connu en littérature que les rats ont des sensibilités différentes aux différentes types de toxines botuliques par rapport à la souris. Selon le type de toxine étudié, il sera donc nécessaire d’utiliser l’espèce animale la plus sensible entre le rat et la souris.

Bénéfices attendus

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sont utilisées dans le traitement des troubles liés à une contractilité musculaire excessive. Ils sont classiquement utilisés dans le soulagement des troubles du mouvement tels que la dystonie et la spasticité, ainsi que pour des fins cosmétiques. En plus les formulations dérivées de BoNTs bénéficient à un éventail beaucoup plus large de patients souffrant de vessie hyperactive, de dysfonction érectile, d’arthropathie, de douleurs neuropathiques et de cancer. La recherche de nouvelle formulation de BoNTs est très active en ce moment et il est nécessaire de mettre au point de test in vivo rapides mais précis, pour évaluer l’efficacité de différents types de BoNTs. Nos études vont participer à la recherche et la mise en place de ces nouvelles formulations de toxine botulique et aider dans le futur les patients atteint de ces troubles.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs test DAS (test du score d’abduction des orteils) entre 10 à 30 tests, sur une durée de 5 à 25 jours. La durée d'un test DAS est de 3 minutes. Les animaux seront soumis également à une seule injection en intra-musculaire de toxine botulique sous anesthésie. La durée de cette intervention est de 10 minutes. Et pour finir les animaux seront soumis à un seul prélèvement en intra-cardiaque, le dernier jour d'expérimentation. La durée de cette intervention est de 15 minutes.

Impact sur les animaux

À la suite de l'injection dans le muscle gastrocnémien, avec la toxine botulique, les animaux vont développer une paralysie des membres inférieures plus ou moins élevées ; les animaux risquent également de présenter une perte de poids, des poils piqués, la présence d'un excédent de porphyrine. Une difficulté à atteindre la mangeoire risque d'être présent, mais pour permettre à l'animal de se nourrir et de boire, une alimentation spécifique sera mise en place.

Devenir

Etant donné la réalisation d'un prélèvement de sang et des muscles, les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'intracardiaque.

Remplacement

A ce jour, à cause de la complexité de la structure protéique de la toxine botulique, il n’y a pas de test in silico validés pour effectuer un criblage des effets paralysant des différentes toxines botuliques et de ses dérivés. Afin de tester un grand nombre de dérivés de la toxine botulique, des modèles in vitro alternatif à l’expérimentation animale ont été proposé par le passé, en utilisant des cultures cellulaires de neurones humains. Toutefois ces modèles in vitro ne sont pas encore validés par la communauté scientifique ni par les autorités régulatoires, car ne sont pas capables de prédire exactement les effets des toxines botulique chez l’homme ou l’animal, donc l’étude ne peux se faire que sur animaux vivants.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera de 6 à 10 animaux, étant donné la variabilité interindividuelle que nous pourrions rencontrer. Le nombre de groupes est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux (entre 5 à 31 groupes expérimentaux, nombre d'animaux par groupes égal à 6 à 10) seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés. Pour déterminer le chiffre exact d’animaux par groupe, cela dépendra des premiers résultats des premiers animaux, le chiffre 10 ne sera pas dépassé. Nous utiliserons les tests statistiques les plus appropriés afin d'analyser nos données.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les cages sont de type IVC (cage individuelles ventilée pouvant contenir plusieurs animaux par cage) en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés 5 ou 6 par cage pour les souris et 2 ou 3 par cage pour les rats, en fonction de leur poids corporel et ainsi permettre aux animaux de pouvoir interagir et entretenir des liens sociaux avec leurs congénères, tout en gardant un espace suffisant. Des morceaux de coton, des igloos, des tunnels et des bâtonnets en bois seront intégrés dans les cages d'hébergement. Après les intra-musculaires, quelques croquettes d'aliment seront placées dans le fond de la cage et de la pâté humide sera également donnée, au cas où les animaux n'arrivent plus à s'alimenter et la taille des tétines des biberons seront ajustées en conséquence. Des tapis chauffants seront utilisés pendant la durée des anesthésies et les réveils des animaux. Les responsables de l'application des procédures, de la manipulation et du bien-être des animaux, sont une technicienne en recherche et développement et un ingénieur, tous deux expérimentés et formés pour reconnaitre tout signes éventuels de stress, douleurs et inconfort. Ils observeront les animaux tous les jours (du lundi au dimanche), pour déceler les mauvais signes cliniques et remplirons quotidiennement une fiche de suivi par animal. La zootechnicienne, en charge de la surveillance et du change des animaux, observeras également les animaux une fois par jour (du lundi au vendredi) et s'assurera que tous les animaux disposent assez d'aliment et d'eau de boisson.

Choix des espèces

Les rongeurs sont utilisés très fréquemment en recherche préclinique pour les études utilisant de la toxine BONT/A, dans le cadre d’amélioration de la contractibilité musculaire. Les paramètres physiologiques et pathologiques liés aux problèmes de contractilité musculaire sont très bien caractérisés chez les rongeurs, ce qui facilite la comparaison des résultats entre différents laboratoires. Les rats et les souris seront utilisés, car ces espèces sont largement utilisées pour ce type d’étude (nombreuses références bibliographiques). D’autres modèles expérimentaux, notamment, le chien, le chat et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et d’infrastructures d’hébergement. Adultes, entre 6 et 12 semaines ; car les adultes possèdent des membres inférieurs plus gros et cela permet une meilleure visualisation de la patte et donc le résultat du DAS est plus optimal. Les animaux adultes sont aussi plus résistants face à la perte de poids et aux différents signes cliniques.

Un rat qui cumule hypothermie, prostration et plus de 20 % de perte de poids sur plusieurs jours est tué. 600 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour récupérer tissus et sang. Rendus obèses et diabétiques par un régime hypercalorique servi de la sixième à la trente-deuxième semaine de vie, ils reçoivent des composés une à deux fois par jour, subissent cinq prises de sang précédées chacune de six heures de jeûne, l'implantation d'un cathéter dans la veine fémorale, puis une perfusion continue de 210 minutes appelée clamp. La société qui porte le projet dispose déjà d'une plateforme in vitro pour ce type d'étude, mais affirme que ces modèles ne sont pas un miroir assez fiable de la complexité de l'organisme.

Objectifs

Le diabète a touché 8,5% de personnes de plus de 18 ans dans le monde. 90% des personnes diabétiques sont atteintes de diabète de type 2, forme de diabète associé à l’obésité. Le nombre de personnes diabétiques ne cesse d’augmenter. Le diabète a des conséquences dramatiques sur le fonctionnement de certains organes comme le foie, le système nerveux, les reins ou le cœur et certaines de ces conséquences sont mortelles. Le diabète de type 2 se caractérise par deux phases, la phase de résistance à l’insuline où les niveaux plasmatiques d’insuline sont très élevés pour essayer de contrer l’hyperglycémie puis au fur et à mesure les cellules sécrétant l’insuline se fatiguent, ne sont plus capables de répondre et meurent. On parle alors de phase de dépendance à l’insuline. Plus le diabète de type 2 est traité précocement, moins les conséquences sont dramatiques. Ainsi, il est important de développer des thérapies qui ciblent la phase de résistance à l’insuline. Pour se faire, les animaux rendus obèses par l’ingestion d’un régime gras sur plusieurs semaines constituent le meilleur modèle préclinique pour valider ces thérapies. En effet, l’ingestion d’un régime gras chez la souris ou le rat se traduit par la mise en place d’une résistance à l’insuline. La résistance à l’insuline peut être évaluée de différentes manières : en réalisant des tests de tolérance à l’insuline et au glucose mais la technique la plus précise reste la technique dite "clamp" car elle permet la mesure de la sensibilité à l’insuline au niveau des différents organes et de façon bien précise, en utilisant de la radioactivité. Ainsi, au cours de ce projet, des rats seront rendus obèses puis traités ou non par des molécules et leur résistance à l’insuline sera évaluée par des tests de tolérance puis un "clamp".

Bénéfices attendus

Par cette étude, de nouveaux traitements ciblant la résistance à l’insuline et donc les phases précoces du diabète peuvent être trouvés. Ceci permettra d’éviter les complications induites lors des phases avancées du diabète et d’augmenter les taux de survie des patients.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez le rat, un régime hypercalorique sera mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 32 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Cinq prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (avant traitement et 2, 4, 6 et 8 semaines après traitement) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang se fait sur animal vigile et libre de ses mouvements, il est préalablement habitué à ce geste. La prise de sang dure environ 2 minutes par animal, et nécessite que l'animal ait un jeun de 6h. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectués après 6 semaines de traitement, ces tests durent 120 minutes. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. L’implantation d’un cathéter à demeure dans la veine fémorale : la chirurgie est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. Une manipulation de 210 minutes appelée « clamp » est réalisée après 8 semaines de traitement. Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue.

Impact sur les animaux

1 – Un régime hypercalorique sera mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 32 semaines), cela va induire une obésité et un diabète de type 2. Les animaux se déplacent un peu moins mais ils gardent un bon état général. 2 – Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3 - Pour mesurer les consommations alimentaire et hydrique, les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant la durée du traitement, cela est impactant pour les rats qui ont un caractère grégaire. 4 – Les mises à jeun (6h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress, notamment pour des animaux diabétiques. 5 –La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. 6 – La chirurgie (implantation du cathéter fémoral) est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. L’anesthésie et la cicatrisation sont plus difficiles chez un animal diabétique. 7 – Clamp : Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue. Cette manipulation terminale peut être source de stress. 8- Nous mesurerons de nombreuses fois la glycémie par microprélèvement en bout de queue, l'extrémité de la queue sera désinfecté à la vétédine en fin de manipulation. Cependant, du fait du diabète, certains animaux peuvent avoir des complications (queue hypersensible, infection).

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (comptage des radioéléments, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...).

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. D’ailleurs, la société possède aujourd’hui une plateforme in vitro pour y répondre. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les étapes de la procédure seront réalisées sur le même animal. Des étapes de screening sont réalisées afin d’obtenir des groupes homogènes et les animaux ayant les meilleurs critères permettant d’avoir des données fiables et exploitables en fin d’étude et d’éviter de répéter plusieurs fois la dite étude. Nous effectuerons des tests statistiques, le nombre de données par groupe nécessaire pour être statistiquement robuste et donc pouvoir conclure sur l’effet d’un traitement est de 10 en fin de clamp.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rats de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Le bout de la queue des rats sera observé de près car le diabète peut induire des complications au niveau de la cicatrisation. De la vétédine sera appliquée après chaque fin de manipulation. Après la chirurgie, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points limites suivants sur plusieurs jours : hypothermie, prostration, perte de poids >20%, ce dernier serait euthanasié. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de soluté de réhydratation est envisagée (5 ou 10mL/kg). En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Des mises au point de chirurgie "double cathétérisation" permettant d'éviter les multiples mesures de glycémie à la queue sont en cours de discussions.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le rat Sprague-Dawley : Sans régime gras, cette souche de rat possède un poids corporel important et est plus à même à développer une obésité marquée lorsqu’elle est placée sous régime gras. Le rat est une espèce adaptée pour l’étude de la résistance à l’insuline par clamp puisque les données obtenues sont assez homogènes. La chirurgie pour la mise en place du cathéter impacte très peu l'obésité et la résistance à l'insuline. Les animaux sont mis sous régime à partir de 6 ou 8 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Trente minutes de nage forcée dans une piscine réparties sur deux jours, puis treize jours d'un test d'apprentissage : 45 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Elles subissent quatre tests de mémoire étalés sur six semaines, mémoire spatiale, reconnaissance d'objets, olfaction et apprentissage d'une tâche, le porteur indiquant que la nage peut provoquer une légère hypothermie. L'objet déclaré est de savoir si la perte d'un gène dans les cellules immunitaires du cerveau modifie la mémoire, dans le cadre d'une forme de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence. Le choix de la souris tient à l'existence de tests comportementaux déjà établis chez elle, et l'effectif de 45 est présenté comme le minimum fixé par des consignes internationales de la discipline.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones (cellule nerveuse spécialisée dans la commande des mouvements) et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA ont une cause non-identifiée, certaines formes sont familiales. Certains cas de SLA peuvent aussi être associés à une Démence Fronto-Temporale (DFT), on appelle ce syndrome SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Les formes génétiques de SLA (et SLA-DFT) sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Récemment, des mutations dans un nouveau gène ont été identifiées comme étant impliquées dans la SLA-DFT. Nous étudions le rôle de ce gène dans différents types de cellules du cerveau. Le but est de savoir si la déficience de ce gène peut changer le comportement des souris, en termes de défaut de mémoire, ce qui est lié aux symptômes de la DFT dans le syndrome SLA-DFT.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intérêt, dans différents types de cellules du cerveau. Ceci est cliniquement important car des mutations dans ce gène peuvent causer la sclérose latérale amyotrophique (SLA) avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT) - donc, SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Si nous montrons que la perte de ce gène dans différents types de cellules du cerveau peut induire des anomalies du comportement, cela aiderait à expliquer pourquoi et comment des mutations dans ce gène peuvent causer la SLA-DFT et donc à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront transportés de l’établissement d’élevage à l’établissement utilisateur à l’âge de 2 mois. Dans l’EU les souris réaliseront 4 tests de comportement répartis sur 6 semaines, à partir de l’âge de 4 mois. Ces tests permettent de tester la mémoire des souris Le premier test permet d’évaluer la mémoire spatiale des souris et nécessite 30 minutes par souris répartis sur 2 jours. Le second test permet d’évaluer la capacité à reconnaitre et mémoriser des objets et dure 10 minutes par jour pendant 4 jours. Il est suivi par un test d’olfaction qui dure 20 minutes sur une journée. Le dernier test permet d’évaluer l’apprentissage d’une tâche, puis la mémoire spatiale, et dure 30 minutes réparties sur 13 jours (soit 1 habituation d’1min + 4 répétitions de 1 minute par jour pendant 7 jours + 2x 1 minute dernier jour). Les tests seront espacés d’au moins 4 jours pour éviter de stresser les animaux. Ces 4 tests de comportement ne produisent pas de douleurs et sont réalisés sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements. Ces tests permettent d’évaluer différentes formes de mémoire des souris. A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées par une méthode règlementaire, et les tissus d’intérêts sont prélevés après vérification de la mort des animaux.

Impact sur les animaux

Les tests de comportement peuvent induire un stress et angoisse chez l'animal. L’un des tests consistera à faire nager les animaux dans une piscine ce qui pourrait induire une légère hypothermie.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées pour prélever des tissus d’intérêts.

Remplacement

Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce projet, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules immunitaires du cerveau (microgliales) avec une délétion du gène d’intérêt, pour tester si les fonctions normales des cellules microgliales sont défectueuses (réaction en réponse à une molécule stimulante). Nos résultats étant prometteurs, nous nous sommes demandé si cela pourrait entrainer un phénotype comportemental subtile in vivo. Même si on peut modéliser certaines interactions pathologiques entre cellules microgliales et cellules neuronales in vitro, déterminer un effet sur le comportement est seulement possible chez l’animal.

Réduction

Pour les tests de comportement, nous avons besoin de 15 souris par génotype avec 3 génotypes étudiés soit 45 souris au total. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique sur le comportement - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc, ALS-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Comme les quatre différents tests de comportement ne produisent qu'un stress mineur sur les souris, nous utiliserons les mêmes souris pour ces 4 tests, avec au moins 4 jours de repos entre chaque test, pour en utiliser le moins d'animaux possible

Raffinement

Les souris seront transférées de l’EU d’élevage à l’EU d’expérimentation. Elles seront mises dans une boite de transport adaptée, entre congénères (1boite par cage). Le transfert sera rapide (moins de 1h), car les deux EU sont géographiquement très proches. Les conditions d’hébergement sont agréées. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et un enrichissement correspondant à leurs besoins. Pour la stimulation environnementale, nous utilisons du coton, permettant de faire des nids dans chaque cage, et des bâtonnets à ronger. Les animaux seront hébergés entre fratrie autant que possible, mais pourraient être séparés en cas de bagarre. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Avant la réalisation des tests comportementaux, une habituation à l’expérimentateur sera réalisée par manipulation des animaux pendant une semaine tous les jours. De plus, avant chaque session de test il y aura une habituation à la pièce pour les animaux en déposant les cages dans la salle d’expérimentation 30min à 1heure avant le début de l’expérimentation. Une surveillance particulière des animaux testés sera faite durant les tests comportementaux. Nous respecterons une période de repos au moins 4 jours entre chaque type de test comportemental et nous réaliserons les tests du moins au plus stressant. Pour le test nécessitant de faire nager les animaux, à la sortie de l’eau ils seront séchés à l’aide d’un torchon avant d’être replacés dans leur cage d’hébergement.

Choix des espèces

Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale): souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre neurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central de mammifère. Par conséquent, nous avons besoin d’un système complexe pour répondre à nos questions. Les tests comportementaux que nous voulons utiliser sont bien établis chez la souris. Il existe également de solides données dans la littérature qui ont montré que la microglie (cellules immunitaires du cerveau) peut influencer le comportement chez la souris. Les souris sont utilisées à l'âge jeune (à 4 mois).

Des souriceaux de vingt et un jours sont gavés d'antibiotiques trois jours de suite, mis à jeun six heures, gavés de glucose, incisés à la queue puis saignés huit fois. 100 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 40 nourries cinq semaines d'un régime pauvre en protéines. Chacune est aussi anesthésiée chaque semaine, cinq semaines durant, pour que sa taille soit mesurée. Le porteur répète que le régime "n'induit pas de sensation de faim ni de phénotype délétère" et que les antibiotiques "ne devraient pas avoir d'effet sur le bien-être", pour un protocole qu'il classe lui-même en souffrance modérée.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur à travers le monde. Des études ont montré que le microbiote (ensemble des micro organismes vivant dans un environnement spécifique chez un hôte) des individus mal nourris était sévèrement impacté. Il est également observé une différence de réponse au régime pauvre en protéines en fonction du sexe, avec des bactéries n’apparaissant que chez les femelles. De plus, ces variations étaient reliées à des variations du métabolisme e chez les souris, ainsi qu’une variation de l’apparition de la puberté. Cela incite donc à explorer de façon détaillée l’effet du microbiote sur le métabolisme et la maturation sexuelle afin de déterminer si celui-ci peut expliquer les différences observées entre les sexes. En utilisant un modèle murin de malnutrition protéique, permettant d’étudier la communication inter-organes, l'objectif de ce projet est de caractériser finement le métabolisme et la maturation sexuelle de souris subissant une ablation partielle du microbiote intestinal par un traitement antibiotique

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition dans un contexte juvénile sont encore mal connues, de même que le rôle précis du microbiote intestinal dans les altérations physiologiques associées. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises qui s’opèrent lors d’un régime métaboliquement délétère et d’évaluer le rôle potentiel du microbiote intestinal, qui sera déplété par un traitement antibiotique. Nous pourrons ainsi identifier au cours du projet de futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition au travers d’un traitement adapté basé sur la nutrition et le microbiote.

Procédures

40 souris seront soumises à un régime nutritionnel pauvre en protéines pendant 5 semaines au maximum. Ce régime n’induit pas de sensation de faim (isocalorique d’un régime contrôle) ni de phénotype délétère. 100 souris auront leur taille mesurée toutes les semaines, pendant 5 semaines, sous anesthésie générale. 100 souris seront pesées chaque semaine, pendant 5 semaines, ce qui prend moins d’une minute. 50 souris seront gavées avec de l’eau (souris contrôles) à P21, P22 et P23, suite à une contention. Ce geste dure environ 10 secondes. 50 souris seront gavées avec un cocktail antibiotique à P21, P22 et P23, suite à une contention. Ce geste dure environ 10 secondes. Les antibiotiques ne devraient pas avoir d’effet sur le bien-être des souris. 50 souris auront des antibiotiques de façon continue dans l’eau de boisson, de P24 à P56. Les antibiotiques ne devraient pas avoir d’effet sur le bien-être des souris. 80 souris seront mises à jeun pendant 6 heures. 80 souris seront gavées avec du glucose après les 6 heures de jeûne, suite à une contention. Ce geste dure environ 10 secondes. 80 souris auront une incision sous anesthésie locale à la queue. Ce geste dure environ 1 seconde. 80 souris subiront 7 prélèvements à la queue d’environ 3 µL de sang. Ce geste dure environ 5 secondes. 80 souris subiront un prélèvement additionnel à la queue d’environ 20 µL par prélèvement pour mesurer l’insulinémie. Ce geste dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Ce projet ne devrait entraîner que des nuisances modérées sur les animaux. Le gavage des animaux ne devrait entraîner qu’un léger stress lié à la contention et un inconfort mineur lors du gavage. Le marquage des animaux à la patte et la mesure de la taille des animaux de (du jour 21 post natal au jour 56) n’induiront qu’un léger stress lors de l’induction de l’anesthésie. Les pesées et la caractérisation de la maturation sexuelle induiront un léger stress associé à la contention de l’animal. Le traitement antibiotique dans l’eau de boisson a été utilisé dans la littérature et n’engendre ni perte de poids ou d’appétit, ni diarrhées. Le jeûne de 6 heures induit un stress léger sur la souris. Le test de tolérance au glucose induira un stress modéré lié à la contention et au gavage des souris, puis à l’incision d’un bout de queue d’environ 1 mm et au prélèvement de gouttes de sang au niveau de la queue

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires et d’une bactérie probiotique, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Chaque groupe expérimental contient 10 animaux. Des tests statistiques appropriés seront utilisés. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agréé. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif. Les mères pourront être réutilisées pour d’autres procédures.

Raffinement

La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine grâce à une anesthésie légère. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Des points limites suffisamment prédictifs seront établis pour anticiper tout stress et toute souffrance animale. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. Le prélèvement terminal est réalisé sous anesthésie générale, avec une analgésie appropriée. Le traitement antibiotique a été décrit dans la littérature et n’entraîne pas de modification du bien-être animal.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un antibiotique dans une étude nutritionnelle. L'objectif du projet est d'étudier les effets d’une déplétion du microbiote sur le métabolisme et la puberté pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour la croissance, la maturation sexuelle et la maturation métabolique.

Quatorze jours d'injections sous-cutanées quotidiennes pour reproduire des symptômes de schizophrénie, et un libre accès à l'alcool dès l'âge de quatre semaines : 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent d'abord une puce sous la peau sous anesthésie, puis passent des tests de locomotion, d'anxiété, de mémoire de travail et d'interaction sociale. Le produit injecté leur provoque une hyperlocomotion, des troubles sociaux et des troubles de mémoire, présentés comme la reproduction des symptômes vécus par les patients. 96 souris sont tuées par chirurgie terminale pour prélèvement d'organes, tandis que 24 autres, utilisées comme "souris attractives" pendant les tests sociaux, partent vers un autre projet.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact de la consommation volontaire d’alcool à l’adolescence sur la symptomatologie (symptômes de type positif et négatif, symptômes cognitifs) dans un modèle pharmacologique de schizophrénie (administration subchronique de PCP) chez des souris mâles et femelles C57Bl/6. En effet, il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'alcool sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool sur les comportements des modèles animaux de la schizophrénie. L’objectif secondaire sera d’étudier une éventuelle consommation exagérée d’alcool à l’âge adulte des modèles animaux de la schizophrénie.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet devrait permettre d’une part, une meilleure compréhension de la comorbidité entre trouble de l’usage d’alcool -schizophrénie, et d’autre part de valider un modèle robuste et reproductif de ce type de comorbidité qui permettra par la suite d’identifier des stratégies thérapeutiques de traitement dans ce domaine.

Procédures

Afin de pouvoir être facilement identifiables, les animaux auront une puce électronique (1,4 mm x 8 mm) implantée en sous-cutanée à l’aide d’un système miniaturisé de micro-injecteur stérile sous anesthésie (durée de la procédure : 5 minutes). Les animaux seront soumis à un traitement chronique par voie sous-cutanée chaque jour pendant 14 jours. Chaque injection nécessite une contention de l’animal et prendra environ 1 minute par souris. Les animaux vont effectuer plusieurs tests comportementaux afin tout d’abord de mesurer de l’activité locomotrice/exploratrice et du comportement de type anxieux (1 session de 10 minutes), puis de mesurer les performances de mémoire de travail (1 session de 5 minutes) et enfin de mesurer les intéractions sociales (1 session de 5 minutes suivie de 2 sessions de 10 minutes). Pour finir, les animaux subiront une procédure sans réveil sous anesthésie et analgésie en vue de prélèvement d’organes (durée de la procédure : 10 minutes).

Impact sur les animaux

Durant deux périodes, les animaux auront à leur disposition un libre choix entre eau et alcool (nuisance légère). Les autres nuisances attendues sur les animaux sont tout d’abord liées au modèle de schizophrénie choisi. Il s’agit d’un modèle pharmacologique basé sur un traitement chronique par voie sous-cutanée chaque jour durant 14 jours (nuisance modérée). Outre les aspects stressants des injections quotidiennes, ces administrations induisent des modifications comportementales qui miment certains symptômes rencontrés dans la schizophrénie (hyperlocomotion, troubles sociaux, troubles de mémoire, etc.). A la fin de l’étude comportementale, les animaux seront mis à mort par une chirurgie terminale (procédure sans réveil).

Devenir

Les 96 animaux réalisants les tests comportementaux seront mis à mort alors que les 24 souris servant de souris attractives lors du test des interactions sociales seront réutilisées pour un autre projet.

Remplacement

Le projet présenté ici concerne une pathologie psychiatrique très complexe mettant en jeu de multiples facteurs liés au fonctionnement du cerveau. Ces facteurs qui ne sont pas tous connus, ni maitrisés nécessitent d’utiliser des animaux vivants et entiers. De plus, les aspects comportementaux qui seront étudiés et qui miment les symptômes très invalidants que vivent les patients, ne peuvent à l’heure actuelle pas être modélisés d’une autre manière.

Réduction

L’étude sera réalisée en parallèle chez des souris mâles et femelles. Pour ailleurs, nous utiliserons une seule cohorte d’animaux pour toute l’expérience afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. Les animaux seront suivis de façon longitudinale et réaliseront toute l’expérience. Un total de 120 souris sera nécessaire pour cette étude (48 femelles et 48 mâles pour les tests et 12 mâles et 12 femelles comme souris attractives lors du test des interactions sociales), nombre permettant d’obtenir une puissance des analyses statistiques suffisante.

Raffinement

Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisés que par du personnel formé et ayant un livret de compétences à jour. Après leur arrivée au laboratoire, une période d’acclimatation de 5 jours (cycle inversé) est effectuée où les animaux seront stabulés par groupe de 6 souris (mâles et femelles séparés), avec un enrichissement de la cage d’hébergement (maisonnette, papier kraft, tunnel et bâtonnet en bois). Durant cette période, ils seront manipulés (5 min par jour) et pesés quotidiennement. A leur arrivée au laboratoire et en tenant compte de leur jeune âge (3 semaines), des coupelles de croquettes humides seront mises à disposition des animaux. Ceci sera prolongé jusqu’à 2 jours après le puçage (période de récupération de l’anesthésie). Le puçage est fait 5 jours après leur arrivée sous anesthésie gazeuse et sur couverture chauffante. Une semaine après leur arrivée, les souris seront hébergées par 12 dans des cages intelligentes, pendant 16 jours (2 jours d’adaptation puis exposition choix eau/alcool), puis replacées dans les cages classiques pendant 6 semaines puis de nouveau hébergées pendant 3 semaines dans les cages intelligentes (accès intermittent à l’alcool). L’intérêt de l’utilisation des cages intelligentes est en particulier d’éviter l’isolement des animaux durant les périodes d’exposition à l’alcool et donc de minimiser le stress induit par cet isolement, tout en pouvant contrôler leur consommation individuelle (mesure du nombre de « licks » de chaque biberon). Les animaux seront pesés deux fois par semaine (suivi de poids individuel). Si, au cours de ce projet, des animaux ont des difficultés à s’alimenter (aucune difficulté observée dans de précédents protocoles), nous adapterons l’alimentation par l’ajout de gelée alimentaire. L’utilisation d’anesthésique volatil sera effectuée pour chaque mise à mort et un analgésique puissant sera également utilisé afin de réduire la douleur lors de la procédure de perfusion.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (mus musculus). Il s’agit, comme le rat, d’un animal sur lequel ont été mis au point des modèles de schizophrénie très utiles à la recherche des dysfonctionnements cérébraux liés à cette pathologie. La souris est une espèce plus facile que le rat à maintenir, en termes de coût et de place. Son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (mémoire à court et à long terme, sociabilité, activité spontanée). Par ailleurs, les cibles pharmacologiques des traitements sont similaires chez l’homme et la souris (récepteurs NMDA pour la PCP). Les animaux seront utilisés à l’âge adolescent (ou jeune adulte) (arrivée au laboratoire à l’âge de 3 semaines et début de l’exposition volontaire à l’âge de 4 semaines) car l’étude vise à étudier l’effet de l’exposition à l’alcool au stade de l’adolescence. L’étude longitudinale se poursuivra jusqu’à l’âge de 18 semaines. Les souris stimuli seront âgées de 6 semaines au moment des tests de sociabilité et reconnaisssance sociale sur la base de données bibliographiques.

Toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes, 3 900 souris vont être utilisées dans des travaux menés en prestation pour des laboratoires privés et publics, avec un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par gavage ou injection cinq à dix jours de suite, ou dans leur nourriture pendant un mois, puis un second composé dans l'eau de boisson qui leur provoque une inflammation aiguë de l'intestin, avec perte de poids et diarrhées. Le nombre, la durée et la voie d'administration des composés immunothérapeutiques sont fixés par le partenaire commercial. Ni analgésique ni anti-inflammatoire ne leur seront administrés, le porteur écrivant que cela biaiserait la réponse observée, et il justifie le recours aux souris par une évaluation à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaitre la fonction de gènes d’intérêts sur le système immunitaire en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale et dans certain cas tester des traitements pour voir l’impact de ceux-ci sur le système immunitaire en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale lorsque la fonction d’un gène est modifiée. En utilisant un système moléculaire inductible à un traitement appelé tamoxifène, nous pouvons réguler l’expression de gènes d’intérêt en les supprimant, ou en les augmentant (surexpression). En effet, ce système permet de contrôler l’expression de gènes dans le temps et l’espace ouvrant ainsi de nouvelles possibilités pour l’étude de la fonction des gènes. Ainsi, nous traiterons avec du tamoxifène des souris génétiquement modifiées pour lesquelles le gène d’intérêt est modulable et nous évaluerons l’effet de sa suppression ou surexpression sur le système immunitaire à l’état basal. Nous évaluerons aussi l’effet de la modulation de ce gène en condition pathologique où nous induirons une inflammation intestinale. Enfin nous évaluerons également l’impact d’un traitement sur le système immunitaire lorsqu’un gène est supprimé ou surexprimé en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation de modèles animaux génétiquement modifiés pour des études précliniques in vivo. Il vise donc à évaluer de façon qualitative et quantitative l’impact de la régulation de gène d’intérêt par induction au tamoxifène et/ou l’impact d’un traitement immunothérapeutique en présence ou non d’une inflammation aigüe de l’intestin.

Procédures

La procédure expérimentale consiste en l’induction d’un gène cible, par administration d’un premier composé chimique, afin d’évaluer sa fonction sur le système immunitaire de la souris, dans les conditions ou non d’une inflammation aigüe de l’intestin qui sera elle induite par l’administration d’un second composé chimique 1) L’administration du 1er composé peut se faire de différentes manières en fonction du type de gène à moduler, du type cellulaire et/ou tissulaire ciblé et de la demande du partenaire et sur 5 jours minimum (sans jamais excéder 10 jours) par injection et gavage ou sur 1 mois maximum dans l’alimentation : -Par injection : sur souris vigile, la souris sera pesée puis une contention sera réalisée afin de réaliser l’injection (30 secondes par souris). Ou -Par gavage : sur souris vigile, la souris sera pesée puis une contention sera réalisée afin de pouvoir réaliser le gavage à l’aide d’une aiguille de gavage (30 secondes par souris) . Ou -Par alimentation : Les souris seront soumises à un régime alimentaire avec des croquettes au tamoxifène. 2) Des pesées hebdomadaires : sur souris vigiles (10 secondes par souris). Deux collectes de sang : sur souris vigile, une contention sera réalisée afin de pouvoir réaliser le prélèvement (30 secondes par souris). Dans le cas où nous devrons être dans les conditions d’une inflammation aigüe de l’intestin : 3) Suite à l’induction par le 1er composé, les souris seront traitées avec le second composé (sur une durée de 7 jours consécutifs). Le second composé est préparé dans de l’eau de boisson + des pesées quotidiennes sur souris vigiles (10 secondes par souris). Dans le cas où nous devrons traiter les individus avec un composé immunothérapeutique : 4) Les administrations des composés immunothérapeutiques (le nombre, la durée et la voie d’administration sera défini par le partenaire). Suivant la voie d’administration sélectionnée par le partenaire, celles-ci seront réalisés sur souris vigiles (30 secondes/souris) ou sur souris anesthésiées (anesthésie gazeuse courte : 1minute/souris).

Impact sur les animaux

Prérequis : Les tests de toxicité des composés immunothérapeutiques seront effectués en amont par les partenaires. Les doses injectées n'induiront donc aucun effet indésirable sur les animaux dans le cadre de ce projet. Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress tel que : 1) Les administrations du composé n°1 soit par gavages oraux ou injections intrapéritonéales sur 5 jours consécutifs minimum (sans jamais excéder 10 jours) ; 2) Des pesées hebdomadaires ; 3) Deux prélèvements de sang (60 à 100μL), Une semaine d’écart entre les prélèvements sera impérativement respectée ; 4) En fonction du projet, un traitement par un second composé dans l’eau de boisson suite à l’administration du 1er composé afin de créer une inflammation aiguë de l’intestin pouvant amener à une perte de poids et des selles molles/diarrhées. 5) Injections de composés immunothérapeutiques par voie sous cutanée, intra péritonéale, intramusculaire, intraveineuse ou gavage.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des organes et à leur analyse.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, l’étude du système immunitaire et le modèle inflammatoire testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.

Raffinement

Les animaux en expérimentation seront hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu sera enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un nid compact de lanières de papier Kraft. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et un temps d’acclimatation d’une semaine sera respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de zootechnie formé et qualifié et des points limites seront préalablement établis. En ce sens, une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation. Des points limites seront établis pour chaque observation (valeur maximale de la grille de score) qui entraineront la mise à mort de l’animal s’ils sont atteints. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique. De plus, dans le cas de l’inflammation aigüe de l’intestin, nous étudierons l’impact de la surexpression ou délétion d’un gène dans la modulation d’une inflammation, aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré aux souris.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, la souris est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose de bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons des souris adultes uniquement, à partir de 8 semaines pour une analyse du système immunitaire mature. L’étude d’un système immunitaire en développement ou vieillissant ne fait pas l’objet de ce projet.

Pour trier des souris entre résilientes et vulnérables à la dépression, 528 d'entre elles sont soumises huit semaines à des conditions d'hébergement rendues stressantes et imprévisibles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur état est mesuré par un test de désespoir, un test de motivation, un test d'anxiété et une mesure hebdomadaire de deux heures de leur consommation de sucre, censée révéler la perte de plaisir. Celles qui sont classées vulnérables reçoivent ensuite un antidépresseur en injection quotidienne pendant cinq semaines, avant que toutes soient tuées pour analyse métabolique et génomique. Le porteur chiffre le coût mondial de la dépression à 350 milliards de dollars par an et renvoie les retombées à des biomarqueurs qui restent à identifier.

Objectifs

La prévalence au cours de la vie (environ 20 %) et le fardeau économique (350 milliards de dollars par an) associés aux troubles de dépression majeure (TDM) en font l'une des maladies neuropsychiatriques les plus courantes et les plus débilitantes. Le diagnostic du TDM et des comportements suicidaires est subjectif et il manque des biomarqueurs quantitatifs pour une détection précoce et une évaluation à long terme. Sans ces biomarqueurs objectifs, le diagnostic, la surveillance et les ajustements thérapeutiques reposent exclusivement sur un examen clinique sous-optimal. L’accent mis sur l’utilisation du carburant cérébral comme différenciateur de la vulnérabilité et de la résilience au stress est un concept nouveau et original qui n’a pas été exploré de manière approfondie.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus peuvent conduire à une compréhension étendue et plus détaillée du métabolisme du cerveau et du corps normal et dysfonctionnel. L'étude a le potentiel d'identifier de nouvelles cibles innovantes pour promouvoir la résilience et améliorer le diagnostic, la surveillance et le traitement du TDM. L’étude des liens mécanistiques à travers les niveaux d’analyse (épigénome, métabolome, comportement) aidera à expliquer comment et quand des facteurs de stress spécifiques et divers conduisent à des changements durables dans le cerveau et produisent des déficits fonctionnels durables en matière de santé mentale liés au comportement. Nous allons rechercher ces changements qui contribuent au maintien de la santé ou des états pathologiques.

Procédures

Nous modifions les conditions d'hébergement stressantes sans que celles-ci puissent être anticipées. Les animaux peuvent alors engager 2 styles d'adaptation: la résilience ou la vulnérabilité au développement de troubles du comportement de type dépressif et anxieux que nous mesurerons par des tests de désespoir, de motivation et d'anxiété appliqué une seul fois sur une durée de 10 minutes au cours des 8 semaines de protocole. Le 1er objectif vise à sélectionner les sujets résilients ou vulnérables à la dépression. Le 2e objective vise à évaluer la stabilité du trait phénotypique avec ou sans traitement antidepresseur (injection quotidienne pendant 5 semaines). Le protocole débutera à l'age de 3 mois et durera 8 semaines. Dès la 3e semaines d'exposition les animaux seront triés en groupes de résilients et de vulnérables selon leurs scores de consommation de sucrose lors d'un test de mesure d'anhédonie (diminution de la capacité à ressentir le plaisir), pratiqué 1 fois sur 2 heures par semaine pendant 8 semaines. Des prélèvements sanguins (20 microlitres) sur deux minutes sont prévus à l'issu du 1er objectif (1 fois à la 3e semaine) et du 2e objectif (1 fois à la 8e semaine).

Impact sur les animaux

Stress léger chronique chez la souris Douleurs d’injection Douleurs de prélèvements de sang

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de vérifier la validité des interventions génétiques et phamarcologiques. Des échantillons seront prélevés pour permettre les analyses métaboliques et d'expression du génome qui differencieraient les individus résilients des vulnérables malgré leur exposition identique au stress chronique léger.

Remplacement

Les facteurs de stress sont hétérogènes et ne peuvent être réduits à une seule expérience. Un paradigme peut conduire à des réponses uniques chez différentes espèces. Par conséquent, il sera testé plusieurs modèles complémentaires avec des collaborateurs. Cette application concerne un modèle murin exclusivement. Une manipulation expérimentale rigoureuse est obligatoire étant donné que la réponse au stress peut varier en fonction du moment, de l'intensité, de la durée, de la chronicité, du contexte et des sexes biologiques. Les réponses des sujets sont à la fois dynamiques et multiformes, nécessitant des études longitudinales sur les mêmes sujets. La précision de la conception expérimentale nous a amenés à choisir le stress chronique léger (CMS) comme paradigme expérimental adapté aux rongeurs pour développer de nombreux styles d'adaptation (résistance et vulnérabilité) comme chez les êtres humains. Nous utiliserons la souris comme modèle, qui selon l’état de l’art peut résister ou être susceptibles aux conséquences néfastes liées au stress. Les autres collaborateurs impliqués dans ce projet étudient le rat, ou bien des souches murines sélectionnées pour leurs critères de résistance ou de vulnérabilité innés, ou bien des patients atteints de dépression majeure. Chaque centre utilise un modèle complémentaire pour interroger les mécanismes conservés entre espèces. Il n’est pas raisonnable d’utiliser des modèles alternatifs réducteurs in vitro pour étudier la relation physiologique entre le cerveau et le comportement des résilients et des vulnérables. Il n’existe pas de solution in vitro alternative conservant les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet. Nous étudierons des modèles génétiques murins caractérisés pour leurs similitudes génétiques et physiologiques aux corrélats de pathologies humaines.

Réduction

Une seule souche de souris sera utilisée ce qui limitera le nombre d'animaux à utiliser. Le nombre d'animaux utilisés sera réduit grâce à une approche longitudinale rationnelle et qui augmentera la puissance statistique des données collectées. Nous ne pouvons pas étudier un seul sexe puisque les différences entre les sexes sont associées à la physiopathologie de la depression et à la réponse au traitement.

Raffinement

Une grille de score des points limites adaptés est mise en place pour identifier quand raffiner. Un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance est établi pour déterminer quels individus sont concernés. L'administration d'analgésique permettra de corriger des douleurs éventuelles. La mise à mort en dernier recours serait effectué si le score des points limites venait à dépasser les critères de raffinement prérequis.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal présentant une grande similitude avec le cerveau humain en terme de structure, d’organisation et de connectivité. Un modèle mammifère semble donc être le plus adapté pour répondre à nos besoins. Les rongeurs ont été choisi à cause de leurs manipulations génétiques bien étudiées. De plus, les rongeurs ont déjà été utilisés comme modèle fiable et solide pour l'étude de conditions de vulnérabilité et de résilience au stress. Les processus que nous étudierons ne sont pas reproductibles à ce jour par des modèles in vitro ni par la modélisation in silico. La souris demeure le modèle de choix. Les souris seront âgées de 3 mois au début du protocole de stress qui durera pendant 8 semaines. Nous ciblons en particulier des jeunes adultes afin de comparer les résultats avec l'étude clinique chez l'homme conduites chez les patients dépressifs par notre collaborateur. Le même protocole de stress léger sera aussi appliqué par nos collaborateurs sur des espèces complémentaires.

Cinq lapins reçoivent dans l'œil, à quatre reprises, un laser dont l'éclairement dépasse d'un facteur dix la limite fixée par la norme ISO, avec une lame de verre posée sur la cornée. Ces séances de quarante-cinq minutes se déroulent sous anesthésie générale et relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce des ulcères de l'épithélium cornéen, des lésions de l'endothélium et une cataracte par effet thermique comme atteintes possibles, et précise que l'étude est faite "justement" pour en constater la survenue. Tous les lapins sont tués pour histologie oculaire, leurs os et leur cochlée partant à d'autres équipes, afin qu'une startup française puisse déposer un dossier d'autorisation pour son appareil.

Objectifs

Une startup française a développé une technologie de tomographie à cohérence optique (OCT) nommée LC-OCT permettant d'effectuer des images proche de l'histologie classique ou des images du type confocale. Ces observations peuvent être compilées sous forme de stack permettant une reconstruction 3D du tissu en haute définition. Cette technologie est un excellent outil de diagnostic dermatologique et pourrait apporter les mêmes avantages en ophtalmologie, surtout dans le domaine des tissus de la surface oculaire. L'utilisation de cet OCT sur l'oeil pour des observations ne doit pas avoir d'effets indésirables sur les tissus de l'oeil. Des calculs de normes portent à penser que la rétine ne subira aucun dommage lors de l'imagerie de la cornée. La présente étude propose ainsi d'évaluer la safety sur les tissus oculaires de cette nouvelle technologie d'OCT lors de l'imagerie de la cornée. Sera étudiée, à court terme, l'apparition d'œdème cornéen, de cataracte et de modifications rétiniennes.

Bénéfices attendus

Le projet permettrait de connaître la sécurité de cette nouvelle technologie d'OCT comme outil de diagnostic clinique des atteintes des tissus de la surface oculaire proche d'une étude histologique. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise développant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique (si les résultats ne montrent pas d'effets délétères) et in fine la rédaction de dossiers pour autorisation par les instances de santé. Si des atteintes rétiniennes venaient à être observées, des atteintes de la vision sont possibles et par conséquent un éventuel stress pouvant se traduire par une perte ou prise de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme des selles liquides.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'imagerie ophtalmologique contact et sans contact avec l'oeil sous sédation et l'animal sous anesthésie général. Ces imageries de suivi seront faites 4 fois. La durée de chaque observation de suivi dure environ 45 minutes. L'imagerie avec la nouvelle technologie OCT durera 5 minutes.

Impact sur les animaux

L'éclairement du laser du LC OCT est de 820 mW/cm² au niveau de la cornée, 0.02 W/cm² au niveau de la rétine. En prenant en compte la norme ISO 15004-2, il a été déterminé que cela dépassait d'un facteur 10 la limitation en éclairement au niveau de la cornée, mais pour l'éclairement de la rétine la puissance est très inférieure à la limitation (inférieur à la limite d'éclairement d'un facteur 35). Au vu de ces données il est attendu aucun problème sur la rétine de l'animal, mais il est possible qu'une atteinte des tissus cornéens soit à prévoir (ulcères épithéliaux, lésions de la couche endothéliale). De plus, le système de mesure se fait en contact avec la cornée via une lame de verre. Il est donc possible, là aussi, que nous ayons des atteintes du tissu cornéen. Cette étude est justement faite pour se rendre compte de la présence de ces atteintes avec des paramètres de laser au-dessus de la norme. Le cristallin pourrait aussi être atteint par effet thermique (cataracte).

Devenir

En fin de procédure les animaux seront mis à mort pour étude histologique des tissus oculaires. D'autres équipes de recherche récupéreront les os et la cochlée des animaux.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois cet LC-OCT chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de ses composants, ainsi que la réponse à un passage d'un laser potentiellement néfaste pour les tissus oculaire. L'effet cataractogène peut se déclarer 1 à 2 semaines après le passage du laser.

Réduction

Tout d'abord nous utilisons l'oeil gauche de chaque animal comme oeil contrôle réduisant de moitié le nombre d'animaux nécessaire. Ensuite, Compte tenu de la faible variabilité interindividuelle habituellement observée dans les études ophtalmologiques utilisant l'imagerie non invasive, ainsi que de notre objectif de comparer, par suivi clinique et histologie post-mortem, l'état des tissus oculaires des yeux contrôles (OG) et des yeux analysés (OD) pour chaque animal à l'aide d'une échelle de graduation semi-quantitative, et afin d'obtenir un échantillonnage suffisant pour effectuer une analyse statistique avec des tests de rangs non paramétriques (OG vs OD), nous avons déterminé qu'un minimum de 5 animaux est nécessaire pour tirer des conclusions valables. En effet, avec moins de 5 lapins, les tests statistiques perdent de leur pertinence, tandis qu'un nombre supérieur à 5 semble excessif.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (sédation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Seul l'observation avec l'OCT en contact avec l'oeil. Toutes les observations se feront sous anesthésie générale et l'OCT sera effectué sous AG + anesthésie locale. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale.

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que l'observation soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).