Procédures modérées
Etude des doses limites de l’essentialité de l’acide linoléique et de sa capacité à être remplacé par l’acide pentadécanoïque chez le rat Wistar
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
168 jeunes rates surnuméraires seront transférées vers d'autres projets de recherche et d'enseignement, les mères et les ratons mâles étant tués au terme des régimes pour prélever foie, tissus adipeux et cerveau. 403 rats vont être utilisés au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les rates sont soumises pendant la gestation puis l'allaitement à des régimes carencés ou surchargés en acide linoléique, leurs ratons continuant ces régimes jusqu'à 4 ou 5 mois, avec des prélèvements sanguins toutes les deux semaines et des tests comportementaux répétés vingt fois en cinq jours. Le porteur annonce chez les rats carencés une croissance ralentie et des troubles cognitifs, chez les rats en surcharge une inflammation et une stéatose hépatique, et affirme dans la même page que ces perturbations n'induiront ni mal-être ni anxiété ni douleur.
Objectifs
Cette étude de recherche fondamentale s'inscrit dans le domaine des liens entre consommation alimentaire de lipides et santé (lipides-nutrition-santé). L’objectif est de mieux définir les bonnes doses de consommation de certains acides gras, en prévention des pathologies nutritionnelles (obésité, diabète de type 2…). L’étude s’intéresse en particulier à l’acide linoléique, qui est un acide gras d’origine végétale uniquement, et que l’animal (dont l’homme) doit consommer de manière indispensable. Le caractère indispensable de cet acide gras dans l’alimentation humaine est démontré depuis longtemps, mais la dose optimale d’apport de cet acide gras reste très controversée. En fonction des modèles d’étude, des doses alimentaires utilisées et du temps de traitement, cet acide gras peut devenir délétère pour la santé et induire l’accumulation de graisses au niveau hépatique (stéatose ou foie gras) ou au niveau des tissus adipeux (obésité), et contribuer ainsi à une inflammation chronique, source de problèmes cardio-vasculaires à terme. Le 1er objectif de cette étude est donc de définir la limite maximale d’apport alimentaire de cet acide gras, au-dessus de laquelle ses effets deviennent délétères sur le long terme. Pour cela, des rates gestantes puis les ratons issus de ces mères seront nourris par des doses croissantes en acide linoléique, depuis la période gestationnelle chez la mère jusqu’à l’âge de 4-5 mois. Les effets potentiellement délétères de chaque dose seront observés. De plus, il est apparu récemment dans la littérature scientifique qu’un acide gras spécifiquement retrouvé dans les produits laitiers et principalement dans le lait, l’acide pentadécanoïque, montre un réel intérêt par sa “proximité biochimique et métabolique” à l’acide linoléique et son potentiel “rôle de remplacement” dans le cas d’une carence. Le second objectif de cette étude est donc de montrer la capacité potentielle de l’acide pentadécanoïque alimentaire à se substituer à l’acide linoléique (en situation de carence) et à assurer certaines fonctions structurales et physiologiques similaires. Pour cela, des rates gestantes puis les ratons issus de ces mères seront nourris par des régimes carencés en acide linoléique mais supplémentés en acide pentadécanoïque, depuis la période gestationnelle chez la mère jusqu’à l’âge de 4-5 mois.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus au terme de cette étude sont : (i) Définir un seuil limite d’excès nutritionnel d'acide linoléique (ii) De mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de la mise en place de la stéatose hépatique d’un excès nutritionnel d'acide linoléique. (iii) De caractériser les effets de l’acide pentadécanoïque en nutrition, effets potentiellement indispensables. (iv) De mettre en exergue le potentiel rôle de substitution de l’acide pentadécanoïque aux acides gras essentiels (acide linolénique, acide linoléique) et selon quelles doses. Ces bénéfices représentent de réels enjeux de santé publique d’un point de vue nutritionnel, dans la réévaluation des apports nutritionnels conseillés en acide linoléique mais également pour la consommation de produits laitiers. Le bénéfice attendu premièrement d’apport des connaissances sur l’apport de l’acide pentadécanoïque en nutrition et définir si cet acide gras peut être une voie de substitution d’acide gras essentiels historiques en situation de carence. Le second bénéfice est de découvrir lors d’une situation de surcharge en acide linoléique, à partir de quelle dose cet acide gras peut nuire à la santé en induisant une stéatose hépatique chez le rat.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à différents régimes supplémentés en divers acides gras pendant 5 mois. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur tous les animaux toutes les 2 semaines. Ces prélèvements seront rapides, de l'ordre de quelques secondes le temps de récolter les volumes nécessaires. Des tests comportementaux seront réalisés sur les animaux selon 2 période : (i) un premier test pendant 5 jours consécutifs, avec 4 essais par jour (avec 5 minutes d'intervalle entre les essais) chaque essai durant 60 secondes. (ii) Un deuxième test sur une semaine avec 3 répétitions du test : 1 test par jour, avec 2 jours d’intervalle entre chaque test, chaque essai durant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Chez les animaux carencés, une légère diminution de la croissance des ratons et l'apparition de troubles cognitifs en absence d’acides gras indispensables est possible. Ces perturbations (diminution croissance et trouble cognitifs) n'induiront pas de mal-être, anxiété ou douleur chez les animaux. Les animaux carencés subiront des tests comportementaux pouvant induire du stress, de l'anxiété et de la fatigue Chez les animaux en surcharge, la mise en place d'une inflammation de bas grade ainsi que d'une stéatose hépatique est possible. Ces perturbations (inflammation et stéatose) peuvent induire une hyperlipidémie et une hépatomégalie potentielle qui ne sont pas léthales et qui n'induiront pas de mal-être, anxiété ou douleur apparente chez les animaux.
Devenir
Les ratons femelles (surnuméraires) seront réutilisées par d’autres chercheurs pour d’autres projets, de recherche et d’enseignement. Les rates mères après gestation et sevrage ainsi que les ratons mâles seront euthanasiées au terme des régimes afin de récolter les échantillons biologiques nécessaires pour nos analyses (foie, tissus adipeux, cerveaux).
Remplacement
L’effet recherché dans cette étude est d’ordre nutritionnel et nécessite donc l’analyse d’un organisme dans son ensemble. En effet, les nutriments diffusent dans le « corps entier » après digestion-absorption des aliments et leurs impacts physiologiques ou physiopathologiques concernent de multiples organes qui interagissent entre eux pour former un système biologique complexe. La substitution totale et complète d'un tel système physiologique ou physiopathologique par d'autres méthodes alternatives n'est donc pas possible.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque condition (8 rats par condition) a été calculé par analyse de la puissance statistique nécessaire pour pouvoir comparer les paramètres étudiés, soit par des tests paramétriques (si la distribution des données le permet), soit par des tests non paramétriques. Ce nombre d’animaux représente la limite basse pour laquelle les effets induits au terme du projet permettront d’observer un effet statistiquement significatif. Dans un souci de bien-être animal, les ratons surnuméraires (femelles) obtenus seront réutilisés par d’autres chercheurs pour d’autres projets, de recherche et d’enseignement.
Raffinement
Les rats seront logés par 3 pour favoriser le lien social, dans des cages de tailles suffisantes pour réduire le stress et permettre l’expression d’un comportement normal des animaux. La supplémentation en acides gras s’effectuera par le biais du régime (ad libitum), contrairement à un gavage récurrent qui engendrerait un stress de l’animal. Un suivi quotidien des animaux sera mené durant toute le projet, afin de déceler tout signe d'angoisse, de douleur ou de souffrance. L'activité physique, la position de l'animal, l'aspect du pelage et le comportement vis-à-vis des congénères seront observés. Le suivi hebdomadaire du poids de l'animal et de la consommation de nourriture seront également utilisés pour déceler tout état de souffrance ou d'angoisse.
Choix des espèces
Historiquement, les expérimentations montrant le caractère indispensable d’acides gras ont été réalisé en utilisant le rat comme modèle et plus récemment d’autres études de carences ont été réalisé sur ce même modèle. De plus ce même modèle animal a été utilisé dans l’étude des effets induits par une surcharge en acide linoléique. Des études menées sur d’autres modèles notamment chez la souris, n’ont pas montré de résultats similaires. Le rat est donc un bon modèle pour étudier l’induction d’une carence ou d’une surcharge en acides gras. Ce modèle permet le prélèvement d’organes ou tissus suffisamment volumineux pour réaliser les analyses biochimiques prévues. Les rates soumises aux différents régimes seront gestantes puis allaitantes. Ensuite, les ratons seront nourris avec les différents régimes après la période de sevrage, soit environ 3-4 semaines après la naissance. Ils seront nourris avec ces régimes pendant 14 ou 17 semaines puis euthanasiés. L’induction de la surcharge ou de la carence doit débuter chez les rates gestantes afin d’observer un effet significatif chez les ratons issus de ces mères. L’âge final des ratons correspond au temps nécessaire pour observer la carence ou la surcharge.
Effet de l’inhibition d’un transporteur du tubule proximal sur la fonction rénale des souris atteintes par la maladie Dent
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, chacune passant cinq jours en cage à métabolisme sur une grille métallique de surface réduite. Les souris génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Dent perdent protéines et calcium dans leurs urines et développent une fibrose rénale. À 4 mois, puis pour une partie d'entre elles à 7 et 10 mois, elles subissent une mesure de composition corporelle en tube clos, une anesthésie pour mesurer la filtration rénale avec risque d'hypothermie et de détresse respiratoire, puis un prélèvement sanguin sous-mandibulaire qui peut provoquer une hémorragie. Toutes sont tuées à 4 ou 10 mois pour prélever les reins.
Objectifs
La maladie de Dent de type 1 est une maladie rénale rare caractérisée par une perte urinaire de protéines et de calcium, la présence de calculs rénaux, et une insuffisance rénale progressive. La maladie est causée par des mutations d’une protéine appelée ClC-5. Jusqu'à présent, il n'existe pas de traitement spécifique pour cette maladie. Une souris modifiée génétiquement présentant les mêmes traits cliniques observés chez les patients a été générée. L’objectif de ce projet est d'identifier des pistes thérapeutiques pertinentes pour ralentir la progression de la maladie et freiner l’apparition de l'insuffisance rénale. Certains inhibiteurs de transporteurs du tubule proximal montrent des effets néphroprotecteurs prometteurs dans de nombreuses maladies rénales chroniques. Aucun effet délétère majeur n’a été recensé suite à l’utilisation de ces traitements dors et déjà administrés à de nombreux patients souffrant de problèmes néphrologiques. Notre objectif est d'étudier les effets d’un traitement inhibiteur ciblant un transporteur du tubule proximal sur l’évolution de la maladie de Dent de type 1.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’effet d’un inhibiteur ciblant un transporteur du tubule proximal afin de ralentir l’évolution de la maladie de Dent 1, une pathologie conduisant à l’insuffisance rénale. Il n’existe pour le moment que des traitements symptomatiques de la maladie., en vue d’améliorer la fonction rénale des patients atteints par cette pathologie. En faisant appel à l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés, celui-ci aura un impact significatif sur la santé humaine car il permettra d’apporter une preuve de concept sur la capacité de ce médicament, déjà disponible sur le marché et donc prescriptible, à ralentir l’apparition de l'insuffisance rénale dans le cadre de la maladie de Dent.
Procédures
Un premier lot de souris recevra ou non un traitement dans leur nourriture en croquette. Ces souris ne changeront plus de régime alimentaire jusqu'à la fin de leur vie. A 4 mois, une mesure non invasive de composition de la masse corporelle sera effectuée en plaçant les souris dans un tube clos pour la mesure (environ 2 minutes). Ensuite, une mesure de la filtration rénale sera effectuée impliquant une anesthésie, la pose d’un capteur de fluorescence maintenu par un adhésif adapté, une injection intra-veineuse du traceur fluorescent (environ 10 minutes) puis un suivi sur animal vigile d’environ 2 heures. Après, ces souris seront placées en hébergement dans une enceinte spécifique permettant de prélever l’urine durant 5 jours (3 jours d’habituation et 2 jours de d'expérience). A l’issue de cet hébergement, un prélèvement sanguin de faible volume sera réalisé sur souris vigiles (environ 1 minute). Ensuite, les animaux seront soit euthanasiés (groupe 4 mois) ou retourneront en stabulation en attendant la prochaine phase d’analyse (groupe 10 mois). En effet, le groupe 10 mois, repassera par la même série d’analyses précédemment décrites à 7 mois et à 10 mois avant euthanasie et prélèvements. Un second lot de souris recevra ou non un traitement dans leur nourriture en croquette. Ces souris ne changeront plus de régime alimentaire jusqu'à la fin de leur vie. A 4 ou 10 mois, les organes seront récupérés après l’euthanasie effectué sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les souris présentent un phénotype dommageable avec une diminution de la filtration rénale, une augmentation de l’excrétion de solutés tels que les protéines et le calcium, augmentation de la fibrose rénale. Toutefois, nous anticipons une amélioration progressive avec l’âge de la fonction rénale des animaux génétiquement modifiés et traités. Cependant, l’addition dans la nourriture de l’inhibiteur de transporteur du tubule proximal pourrait engendrer un léger stress des souris. Les souris seront hébergées en cage à métabolisme. Ce type d’hébergement peut générer des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont hébergés, et ils se déplacent sur une grille métallique de surface réduite. A l’issue de leur hébergement en cage à métabolisme, les souris auront un prélèvement de sang sous-mandibulaire. Celui-ci est susceptible de causer une douleur de courte durée associée à la piqûre de l’aiguille, mais également une hémorragie. Par ailleurs, les souris seront anesthésiées pour la mesure de leur débit de filtration glomérulaire. Cette intervention est susceptible de générer une hypothermie et une détresse respiratoire. Enfin les souris seront placées dans un tube clos pour la mesure de la composition corporelle pouvant entraîner un léger stress le temps de la mesure de résonance nucléaire magnétique.
Devenir
L’ensemble des animaux devront être euthanasiés à 4 ou 10 mois pour permettre de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Remplacement
Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux pour des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront de déterminer l’effet des traitements sur leur phénotype rénal (notamment les modifications des contenus urinaires et plasmatiques, les altérations histologiques et moléculaires des cellules rénales) en comparaison avec celui des animaux non traités.
Réduction
Ce projet a une durée de 5 ans, et nécessitera l’utilisation de 176 souris. La taille des effectifs est déterminée par notre expérience concernant ce type d’expérimentation que nous avons mené dans d’autres projets au laboratoire. Il sera par ailleurs nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats (ANOVA un ou 2 facteurs et test de student). Nous limiterons le nombre d’animaux en réalisant des expériences sur les mêmes animaux.
Raffinement
Durant leur hébergement en stabulation, les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. L’environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal, des cylindres en carton, des bouts de bois et/ou des maisons. L'hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l'établissement utilisateur. Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites nécessitant une euthanasie de l’animal. De plus, la mesure de la filtration rénale sera effectuée sous anesthésie. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux recevront au préalable une anesthésie suivie d’une euthanasie. L’ensemble des expériences sera mené en présence de personnels hautement qualifiés dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur.
Choix des espèces
Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car seuls des modèles animaux nous permettront d’évaluer l’effet de cet inhibiteur de transporteur du tubule proximal visant à ralentir l’évolution de la maladie de Dent 1. Nous utilisons des souris mâles contrôles et transgéniques âgées de 4,7 et 10 mois afin d’évaluer l’effet du traitement sur l’évolution de la maladie.
Effets d’un composé X en développement sur le poids corporel et les dépenses énergétiques chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisses
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Tester le candidat médicament d'un client, seul ou associé au sémaglutide : 30 souris mâles rendues obèses par quatorze semaines de régime gras chez le fournisseur vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de sang et d'organes. Chacune reçoit trente-cinq administrations dans le ventre, décrites comme source de douleurs aiguës, subit dix-huit pesées, deux sessions de mesure des dépenses énergétiques de soixante-douze heures et une mise à jeun de quatre heures. Elles sont hébergées seules pendant toute l'étude, le porteur reconnaissant que cet isolement constitue une nuisance pour un animal social. L'étude se limite aux mâles parce qu'inclure des femelles obligerait à doubler les effectifs, une seconde étude chez la souris femelle n'étant prévue qu'en cas d'efficacité constatée chez le mâle.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché (sémaglutide). Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament (Composé X) sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (18 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule, du composé X ou du composé de référence par voie intrapéritonéale (35 administration; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (2 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Prélèvements sanguins (1 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 5) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 72h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement de sang et d'organes (durée: 10 minutes).
Impact sur les animaux
De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins pratiqués à D-3, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieur et une crème à base de lidocaïne sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée (Buprénorphine).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 18 semaines (25 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de pré-conditionnement au régime enrichi en graisse chez le fournisseur.
Influence de la consommation d’alcool sur la consommation de cocaïne
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
240 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement du cerveau. Chacun subit une chirurgie d'une demi-heure pour la pose d'un cathéter permanent dans la veine jugulaire, puis s'auto-administre cocaïne et alcool pendant environ quatre mois, avec jusqu'à trois prises de sang par ce même cathéter. Le porteur attend un taux d'attrition de 20 % sur la durée et prévoit deux cohortes de trente rats par variable testée. Il présente le choix de l'espèce comme un compromis évolutif, le rat étant assez proche de l'humain pour valoir modèle et assez éloigné des primates non-humains, qu'il range parmi les espèces plus sensibles.
Objectifs
La cocaïne est la deuxième drogue illégale la plus consommée en Europe et son utilisation a augmenté au cours des 10 dernières années. Cette consommation est souvent associée à une consommation d’alcool. Notre projet a pour but d’étudier chez le rat de laboratoire l’influence de l’alcool sur la prise de cocaïne et d’identifier la signature neurobiologique de cette influence en mesurant l'activité globale du cerveau. Selon notre hypothèse générale, l’état d’intoxication produit par l’usage d’alcool devrait non seulement inciter à une consommation accrue de cocaïne mais aussi à un affaiblissement des capacités de contrôle sur cette consommation, notamment dans les situations qui requièrent qu’un tel contrôle soit exercé. Au plan neurobiologique, l’influence de l’alcool sur la consommation de cocaïne devrait se traduire par une diminution correspondante de l’activité neuronale dans les régions du cerveau responsables du contrôle de la récompense et de la motivation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera de préciser la nature de l’influence de l’état d’intoxication produit par l’usage d’alcool sur la perte de contrôle sur la consommation de cocaïne. Le second bénéfice sera d’identifier les régions du cerveau responsables de cette influence grâce à une mesure de l'activité globale du cerveau.
Procédures
Tous les rats seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure. Cette chirurgie est effectuée sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie chimique et sous analgésie. Un prélèvement de sang veineux (0,15 ml) sera réalisé pour mesurer l’alcoolémie et certains métabolites de la cocaïne. Ce prélèvement sera effectué via le cathéter intraveineux installé à demeure dans la jugulaire. Cette méthode de prélèvement est indolore. Ce prélèvement sera répété au maximum 3 fois, avec un intervalle d’au moins 2 semaines entre prélèvements.
Impact sur les animaux
Les animaux seront testés dans des procédures dont le degré de gravité principal est léger et qui ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, traitement antibiotique, suivi post-opératoire…), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir suite à la chirurgie ou pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection ; une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée ; une perte des points de suture avant cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool, hormis un possible risque d’infection lié à l’utilisation chronique de la voie d’administration intraveineuse. Les animaux seront sous surveillance quotidienne pour repérer et prévenir tout problème éventuel.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux seront prélevés post-mortem pour effectuer une mesure de l'activité globale du cerveau.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles et femelles), vivant en groupe dans un environnement enrichi contenant un tunnel en carton et un os à ronger. Ce recours à l’animal se justifie pour les raisons éthiques suivantes : 1) l’éthique humaine actuelle interdit l’utilisation d’interventions invasives chez l’homme, compliquant ainsi l’étude directe des relations causales entre usages de différentes drogues ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces relations causales ; 3) l’influence de l’usage d’alcool sur la prise de cocaïne ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à la bonne réalisation du projet sera réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis entre le principe de réduction, les contraintes expérimentales propres au projet et les différentes variables à tester. Pour tester chaque variable, il faudra deux cohortes de 30 rats chacune (une de mâles et une de femelles) pour un obtenir un effectif final suffisant, prenant un taux d’attrition de 20 pourcents au bout de 4 mois. Donc le nombre total d’animaux utilisés pour tester les quatre variables du projet sera égal à 240 rats.
Raffinement
Les animaux seront logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi contenant un tunnel en carton et un os à ronger afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies (30 min en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie, sous anesthésie chimique et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement. Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures de nursing avec un accès facilité à l’aliment (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique. L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique. Enfin, si cela ne suffit pas au rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance.
Choix des espèces
Le choix du rat de laboratoire (R. Norvegicus, lignée Wistar) constitue une sorte de compromis du point de vue de l'évolution biologique. Cette espèce est suffisamment proche de l'espèce humaine (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 MYA) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple, les invertébrés, à l’exception sans doute des céphalopodes) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (par exemple les primates non-humains). Les espèces invertébrées (par exemple, C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider certains mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux des drogues mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’être humain pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés seront tous de jeunes adultes au début des expériences (âge moyen 3 mois demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.
Modulation des niveaux de BIN1 et DNM2 dans le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
La queue plongée dans un bain-marie jusqu'à vingt secondes, les pattes posées sur une plaque chauffée jusqu'à trente secondes, la queue tirée par l'expérimentateur pour mesurer la force d'agrippement, la course sur tapis roulant puis sur cylindre rotatif : 720 souris passeront cette série de tests à six mois puis à un an. 1 246 souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth vont être utilisées au total, 1 104 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour analyse histologique. 584 reçoivent une injection de virus adéno-associés entre le premier et le vingt et unième jour après la naissance, et des femelles sont isolées une semaine pour que leurs ultrasons soient enregistrés. Le porteur écrit que ces lignées ne présentent aucun signe de douleur ni incapacité locomotrice, alors qu'il déclare lui-même 1 104 souris en gravité sévère.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles souris. La maladie se manifeste au début de l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par des repliements complexes des gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses et une vitesse de conduction nerveuse réduite. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression de deux gènes impliqués dans une voie de signalisation associée à la CMT pour tenter d'atténuer les symptômes associés aux anomalies de la myéline. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique ainsi que par l'injection de virus adéno-associés couramment utilisés dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre quelle(s) voie(s) de signalisation sont impliquée(s) dans le dévelopement de la CMT. Une meilleure connaissance des processus moléculaires permettra de mieux comprendre la maladie et potentiellement de proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Procédures
Pour réguler l'expression des gènes impliqués dans la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, une partie de nos animaux (584 sur 1246) sera injectée (durée d'injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés entre le 1er et le 21ème jour après la naissance A soix mois et à un an, 720 souris (dont 360 injectés avec des virus adéno-associés) seront soumises à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire, la coordination motrice, la sensibilité, ainsi que la conduction nerveuse. Pour évaluer la force musculaire, les souris sont placées sur la grille d'un dynamomètre et la force d'agripement sera mesurée. Pour évaluer la coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant et sur un cylindre rotatif. Pour évaluer la sensibilité, les queues des souris seront mises dans un bain-marie et la latence d'enlèvement de la queue sera mesurée avec une durée limite du test de 20 secondes. Les animaux seront également placés sur une plaque chauffée et la latence de réaction sera notée avant de sortir l'animal avec un temps limite de 30 secondes.Pour évaluer la conduction nerveuse, la mesure de l'activité électrique musculaire des animaux se fera sous anesthésie générale. Amendement. Nous isolerons les femelles pendant 1 semaine puis nous les mettrons en contact avec des femelles wt plus jeunes pendant 10 minutes durant laquelles nous mesurerons les ultra-sons émis par les animaux isolés.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons trois lignées de souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Au vu des phénotypes observés chez les animaux modèles âgés (et donc montrant un pourcentage plus important des repliements de la myéline), nous n’anticipons pas que nos modulations d'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée n'engendre de phénotypes plus grave qu’une diminution de la coordination motrice. Nous effectuerons néanmoins une étude des phénotypes dommageable sur ces animaux. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force musculaire, l’expérimentateur tire progressivement la queue de l’animal agrippé sur la grille du dynamomètre afin d’obtenir la force développée par la souris. Pour la coordination motrice, le fait de se déplacer sur un cylindre rotatif surelevé engenre du stress physique chez l'animal. Pour les tests de sensibilité, la chaleur ressentie par l'animal engendre un stress physique. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale. La chirurgie pour l’injection de virus adéno-associés au niveau du nerf sciatique sera réalisée sous une anesthésie générale, une antalgie en sous-cutané et en local sera réalisée avant et après la procédure. Amendement. Pour les tests de vocalisation, l'isolement des animaux pendant 1 semaine provoquera un stress de classe modérée mais l'isolement est le seul moyen de stimuler la vocalisation des femelles avant de faire le test.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements d'organes pour des études histologique.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquée dans le développement de cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptomes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 8 souris par groupe pour l'étude de phénotypes dommageables et 15 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats. Une première étude pilote sera réalisée à 6 mois avec un nombre réduit d'animaux. Nous effectuerons ensuite une étude de phénotypes dommageables et une étude histologique (8 animaux par groupe) à six mois. Nous réaliserons finalement une étude comportementale à 6 mois et 1 an tout en effectuant une étude histologique à 1 an (15 animaux par groupe).
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. La pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). En cas de douleur, et particulièrement après les injections intrathécales et intracérébroventriculaires, un analgésique pourra être administré et l’étude pourra être prématurément stoppée. La douleur sera évaluée à l'aide d'un score. L'étude sera stopée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure des nerfs est trop différente. D'une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation sur le bénéfice de la structure des fibres nerveuses, de la coordination motrice, de la sensibilité et de la vitesse de conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, nous injecterons des virus adéno-associés chez des animaux âgés entre 1 et 21 jours selon la voie d'administration choisie pour cibler les cellules de Schwann avant l'apparition des symptomes. Les défauts de myélinisation s'aggravent avec l'âge des animaux modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Nous voulons donc réaliser une première étude histologique à 6 mois, âge auquel 10% des fibres présentent des défauts de myéline chez les animaux modèles de la CMT. Nous réaliserons ensuite une étude comportementale suivie d'une étude histologique à 12 mois, âge auquel les animaux modèles de la CMT présentent des déficits de coordination motrice et de vitesse de conduction nerveuse.
Etude de la cardioprotection au cours de l’infarctus en ciblant la voie extrinsèque de l’apoptose. Influence du sexe et des hormones femelles
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Commandées chez un fournisseur à 7 ou 11 semaines pour subir un infarctus entre 12 et 14 semaines, 2 595 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 1 611 d'entre elles et sévère pour 984, toutes tuées pour prélèvement du cœur. Une ligature d'artère coronaire suivie de reperfusion leur provoque l'infarctus, certaines femelles subissant en plus une ovariectomie, la pose d'un implant hormonal et deux frottis vaginaux, dont l'un sur animal vigile. Les protocoles longs ajoutent cinq prélèvements sanguins sur animal vigile et quatre échocardiographies d'une demi-heure sous anesthésie. Sur la réduction, le porteur indique que l'analyse statistique se fera au fil des expériences afin d'arrêter d'inclure des animaux dès que la différence devient significative.
Objectifs
Le seul traitement pour sauver un patient lors de l’infarctus du myocarde est de réouvrir l’artère occluse le plus rapidement possible. Cependant, malgré des effets bénéfiques immédiats associés à l’arrêt des lésions d’ischémie, la reperfusion induit des effets indésirables, appelés lésions de reperfusion, du fait du retour brutal du sang oxygéné dans le muscle cardiaque ischémique. Il est admis que le taux de mortalité précoce (30 jours post-infarctus) est plus élevé chez les femmes que les hommes. Bien que le rôle des hormones sexuelles au cours de l’infarctus soit loin d'être univoque, de nombreuses données suggèrent que les hormones sont impliqués dans les différences liées au sexe au sein des maladies cardiovasculaires et ont été montrées cardioprotectrices. Il est essentiel de mener des recherches expérimentales pour mettre au point des stratégies thérapeutiques spécifiques aux femmes. Nous avons montré que la voie des récepteurs de mort joue un rôle crucial dans les lésions de reperfusion. Des travaux de la littérature montrent chez des femelles ovariectomisées des lésions d’infarctus plus sévères et suggèrent un lien entre hormones et mort cellulaire. Nous avons développé des stratégies thérapeutiques permettant de bloquer cette cascade de mort cellulaire au cours de l’infarctus et de la reperfusion. L’objectif de notre projet sera donc d’évaluer l’efficacité de ces stratégies thérapeutiques dans le cœur de souris femelles au cours de l’IR myocardique et d’étudier l’influence des hormones sur la mort cellulaire à court et long termes.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe aucun traitement pharmacologique disponible pour traiter les lésions de reperfusion au cours de l’infarctus. Les études jusqu’à présent n’ont considéré que de jeunes animaux de laboratoire (jeunes adultes de 8 à 12 semaines) et en majorité des mâles afin de s’affranchir de l’influence des hormones femelles qui sont décrites comme cardioprotectrices. Ce projet permettra une meilleure connaissance de la physiopathologie de l’infarctus dans le cœur de femelles, afin de pouvoir développer et de tester des stratégies thérapeutiques pour le sexe féminin, répondant à un besoin sociétal actuel compte tenu de la recrudescence des cas observés les 15 dernières années. De plus, ce projet sera le premier à étudier l’implication de la mort cellulaire dans les cœurs de souris femelles au cours de l’infarctus et sa dépendance au statut hormonal ainsi que dans l’insuffisance cardiaque post-infarctus. Puis, ce sera également la première évaluation de l’effet cardioprotecteur des nos molécules thérapeutiques dans le cœur féminin . Ce projet devrait permettre de réussir la translation vers la clinique en permettant notamment de développer un traitement de l'infarctus, destinés aux patients (2ème cause de mortalité masculine) et à des patientes (1ère cause de mortalité féminine devant le cancer du sein) à risque d’infarctus.
Procédures
In vivo court terme : 3 injections de produits anesthésiants + 1 chirurgie sous anesthésie ; 1 injection létale et 1 prélèvement sang total et cœur (10 min) In vivo court terme avec réveil : 3 injections de produits anesthésiants; 1 chirurgie sous anesthésie (selon procédure de 1h10 à 1h30) + 1 injection létale et 1 prélèvement sang total et cœur (10 min). 3 prélèvements sanguins sur animal vigile In vivo long-terme avec réveil: 5 injections de produits; 1 chirurgie sous anesthésie + 5 prélèvements sanguins sur animal vigile + 4 échocardiographies sous anesthésie gazeuse (30 min chacune) + 1 injection létale + 1 prélèvement sang total et cœur (10 min). * en plus pour les femelles: 1 frottis vaginal sur animal vigile et 1 frottis vaginal sous anesthésie . Quand ovariectomie : chirurgie sous anesthésie gazeuse (30 min); 5 injections de produits, 1 Pose d’implant (10 min);
Impact sur les animaux
- Pour le frottis vaginal, les souris subiront l'inconfort de la contention et du geste gynécologique. - Pour le protocole in vivo d’échographie, les animaux subiront le stress de la préhension par l’expérimentateur puis ils auront une anesthésie gazeuse avec une première phase d’induction le stress sera de courte durée à l’endormissement et au réveil. - Pour l’ovariectomie et la mise en place d’implants, outre le stress de préhension qui sera de courte durée avant l’anesthésie gazeuse, les animaux subiront des douleurs post-chirurgicales qui seront gérées par des antalgiques lors des phases de réveil. - Pour le protocole de chirurgie d’ischémie-reperfusion myocardique, les animaux subiront un stress lié à la contention et une douleur légère de courte durée à l’injection intramusculaire d’anesthésiques ainsi qu’un inconfort lié aux sutures. Les douleurs post- chirurgicales seront gérées avec des analgésiques. - Prélèvements sanguins : procédure réalisée sur animal vigile non anesthésié, ce qui peut constituer un stress et une douleur légère.
Devenir
L'analyse de la cardioprotection nécessite de prélever le coeur en fin de protocole expérimental et donc de mettre à mort chaque souris incluse dans ce projet.
Remplacement
Il n’y a pas d’alternatives non-animales disponibles pour ce projet. Dans le cadre du développement d’un médicament, la cardioprotection par les peptides thérapeutiques doit se mesurer à la fois en terme d’effets vasculaires et musculaires et par conséquent sur cœur entier. Les expériences in vivo à court terme permettent d’évaluer s’il y a bien un ciblage des outils pharmacologiques développés dans le tissu cardiaque après une injection intraveineuse en aigu. Les expériences in vivo avec suivi à long terme, permettent de mimer ce qui se passe dans la condition clinique chez les patients et donc d’évaluer l’effet de la molécule à long terme sur le tissu cardiaque tout en considérant la métabolisation et l’élimination des molécules mimant la situation clinique.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, et dans la mesure du possible, plusieurs mesures seront faites sur chaque individu : échographie, dosage marqueurs sériques, analyse de la cicatrice d’infarctus par histologie. Ensuite concernant les tests statistiques : prévision à priori du nombre de souris afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les nombres de souris à inclure dans les groupes de traitement ont été définis à priori afin de garantir des résultats statistiquement significatifs avec un nombre minimal d’animaux. Pour les expériences comprenant une ligature de coronaire, un groupe Sham d'animaux (protocole complet sauf ligature) sera inclus en réduisant à n=6 souris pour chaque contingent. Ensuite, l’analyse statistique permettra de faire les comparaisons statistiques. Elle se fera au fur et à mesure des expériences afin d’arrêter d’inclure des animaux dès que la différence est significative.
Raffinement
- Conditions d’hébergement : les cages de stabulation sont enrichies (maisons en cartons) pour limiter le stress. - Chirurgie cardiaque : les protocoles ont été optimisés de manière à ce qu’ils soient le moins invasifs possible. Il est important de noter que l'utilisation de substances anesthésiques permet de limiter la souffrance des animaux pendant les procédures. - La phase de réveil permettra une récupération optimale de l’animal : réchauffement, oxygénothérapie et hydratation (poche sous-cutanée de sérum physiologique injectée dès la dernière phase de la chirurgie) et hygrométrie contrôlée. Une feuille de suivi avec grille de scores et points limites sera mise en place. - L’échographie transthoracique et l’injection d’implants sous- cutanés sont réalisées sous anesthésie gazeuse. - Pour l’ovariectomie, l’anesthésie gazeuse est complétée par l’injection d’analgésique.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus a été choisie pour développer les modèles d’étude de l’équipe. Les raisons sont : - Les résultats obtenus par l’équipe montrent que ce modèle est proche de l’Homme : par exemple, le Post- conditionnement ischémique est une technique cardioprotectrice qui fonctionne aussi bien chez la souris que chez l’Homme (ce n’est pas le cas pour le rat). - De plus, l’Homme et la souris possèdent 99% de gènes homologues donc le choix de la souris est très avantageux pour une étude qui permet d’étudier les effets d’une molécule qui sera développée en thérapeutique ; - Petite taille et faible prix des animaux ; - Les conditions d’hébergement compatibles avec celles proposées par l’Institut où seront réalisées les expériences. Les animaux femelles : les femelles jeunes qui seront ovariectomisées seront commandées à 7 semaines et subiront un infarctus entre 12 et 14 semaines. Pour les femelles jeunes non ovariectomisées : elles seront commandées à 11 semaines et subiront un infarctus entre 12 et 14 semaines. Les animaux mâles : seront commandés chez le fournisseur à 11 semaines pour être utilisés entre 12 et 14 semaines pour les animaux mâles jeunes.
Caractérisation et comparaison de deux modèles d’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Fabriquer chez la souris deux versions d'une insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée, puis comparer laquelle ressemble le plus à la maladie humaine : 60 souris vont être utilisées pour cela dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement du cœur. 22 reçoivent par chirurgie un réservoir sous la peau diffusant un produit en continu, 22 autres suivent cinq à neuf semaines de régime gras avec un produit pharmacologique dans l'eau de boisson. Toutes sont immobilisées deux à trois fois pendant un quart d'heure pour la mesure de pression artérielle, et endormies pour l'échocardiographie. Une grille de score portant sur l'apparence, le comportement et les signes cliniques déclenche selon le résultat une analgésie supplémentaire ou la mise à mort.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Parmi elles, l’insuffisance cardiaque a un pronostic grave, avec plus de 75% des hommes et plus de 50% des femmes décédant 5 ans après le diagnostic. L’insuffisance cardiaque est une incapacité du cœur à fournir suffisamment de sang à l’organisme, tout d’abord en condition d’exercice physique, puis avec l’évolution de la pathologie également au repos. Ce mauvais fonctionnement du cœur peut venir de défauts pendant sa contraction ou pendant son relâchement. Jusqu’à maintenant, une majorité d’études se sont intéressées au défaut dans la contraction cardiaque (insuffisance cardiaque à facteur d’éjection réduite). Cependant, depuis quelques années, des études cliniques ont démontré que chez les patients avec un défaut principalement dans la relaxation cardiaque (insuffisance cardiaque à facteur d’éjection préservée) la mortalité est similaire ; il s’avère que les traitements actuels, développés pour les défauts de contraction, ne sont pas adaptés. De plus, un effet lié au sexe est possible car il y a plus de femmes que d’hommes souffrant de cette maladie. Une limite majeure pour étudier les mécanismes de la maladie et développer de nouveaux traitements est le manque de modèles expérimentaux. Cette maladie étant fréquemment associée à plusieurs facteurs de risque tels l’obésité et l’hypertension, nous allons tester deux modèles qui combinent l’insuffisance cardiaque avec une obésité (génétique ou par régime gras) et une hypertension (par traitement pharmacologique). Le but de ce projet est de comparer deux modèles expérimentaux qui présentent des caractéristiques similaires à la condition clinique, et de réaliser les premières études sur les défauts au niveau des cellules.
Bénéfices attendus
L'insuffisance cardiaque est une maladie affectant plus d’1 million de personnes en France dont environ la moitié souffrent d’insuffisance cardiaque à facteur d’éjection préservée. Cela représente un coût socio-économique et humain majeur pour le système de santé en France. La fonction cardiaque et la qualité de vie chez les patients souffrant de cette maladie sont gravement altérées. En effet, le cœur de ces patients n’arrive pas à éjecter suffisamment de sang vers les organes car il n’arrive pas à se relâcher suffisamment durant la phase de relaxation. Ce dysfonctionnement conduit à une intolérance à l’exercice physique et à des effets néfastes sur d’autres organes comme les poumons (hypertension pulmonaire) et les muscles du reste du corps. Les traitements contre l’IC à fraction d’éjection réduite ne sont pas ou peu efficaces pour les patients souffrant d’IC à fraction d’éjection préservée. Il est donc essentiel de poursuivre la recherche pour mieux comprendre la maladie et trouver des traitements. Le bénéfice principal attendu de ce projet est d’établir un modèle expérimental que reproduit bien l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. Ce modèle pourra ensuite être utilisé par différentes équipes au niveau de notre laboratoire et au niveau national et international afin de déterminer les mécanismes et tester des thérapies adaptées.
Procédures
22 animaux seront soumis à une intervention chirurgicale légère sous anesthésie et sous analgésie : implantation sous la peau d'un petit réservoir qui diffuse un médicament en continu ; durée de la chirurgie, environ 10 minutes. 22 animaux seront soumis à un régime alimentaire particulier (riche en gras) et un produit pharmacologique dans leur eau de boisson ; 5 à 9 semaines. Tous les animaux auront une mesure de la pression artérielle : mesure non invasive mais qui nécessite l'immobilisation des animaux ; durée environ 15 minutes, 2 à 3 fois. Tous les animaux auront une exploration de la structure et fonction cardiaque : mesure non invasive par échocardiographie, sous anesthésie.
Impact sur les animaux
L'implantation sous la peau du réservoir peut causer une douleur liée à l'ouverture et la suture de la peau.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux sont euthanasiés car nous avons besoin de prélever les cœurs ainsi que d'autres organes pour faire d'autres analyses pour caractériser les modèles.
Remplacement
Le cœur est un organe complexe, composé de plusieurs compartiments et de plusieurs tissus spécialisés. Il comporte plusieurs sortes de cellules au rôle et au propriétés spécialisées. Il n’existe actuellement aucun système cellulaire (lignées, organoïdes, organes bio-artificiels ou organs-on-a-chip) qui permette d’analyser la fonction et les défauts cardiaques. Ainsi le recours à des modèles animaux reste impératif. De plus, notre étude vise à comparer des modèles pathologiques, il est donc indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme ; les modélisations par ordinateur ne sont pas suffisantes pour mimer une telle complexité. Il est donc nécessaire pour l’évaluation de la fonction cardiaque d’utiliser un mammifère entier adulte afin de s’approcher le plus possible des mécanismes physiopathologiques humains. La souris est un bon modèle car les gènes impliqués sont largement conservés.
Réduction
Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaires pour obtenir des résultats fiables. De plus, nous allons obtenir les données de la fonction cardiaque par des méthodes non invasives, ce qui permet de mesurer plusieurs fois sur le même animal et donc de réduire le nombre d’animaux. Le groupe de souris contrôle (sans pathologie) est commun aux deux modèles.
Raffinement
Les animaux hébergés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés pendant toute la durée de leur présence. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants : apparence, comportement naturel et provoqué, signes cliniques. Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie. Toutes les procédures impliquant une chirurgie sur l'animal seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et analgésiques.
Choix des espèces
La souris est un des modèles les plus utilisés en recherche biomédicale. La structure des tissus musculaires et cardiaques de la souris sont très proches de celle de l’homme et la plupart des gènes conservés. De plus les souris se reproduisent rapidement et de nombreuses études sur l’insuffisance cardiaque ont été réalisées chez la souris ce qui nous permettra plus tard de discuter nos résultats par rapport aux autres études publiées. Des souris adultes âgées de 3 mois (adulte) seront utilisées car les maladies cardiaques se déclarent essentiellement à l’âge adulte.
Cibles cellulaires thérapeutiques dans une maladie du système immunitaire : le lupus
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Attrapées et immobilisées à la main pour recevoir jusqu'à cinq injections dans le ventre en quinze jours, certaines souris subissent en plus un prélèvement de sang sous anesthésie générale dont la cicatrisation prend vingt-quatre heures. 1 380 souris, dont une lignée génétiquement modifiée qui développe une pathologie lupique, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 900. Le porteur écrit que ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus, et qualifie lui-même de "dommageable" le génotype qu'il utilise. Toutes sont tuées en fin de procédure pour analyse des organes, ceux des souris témoins servant en plus à des cultures cellulaires.
Objectifs
Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles et les éosinophiles) dans le contrôle des facteurs immunitaires responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs médiateurs (des molécules qu'elles libèrent) dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de l'élimination de ces cellules ou de leur injection dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les éosinophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.
Procédures
Un génotype (gène absent dans une lignée de souris) dit dommageable (souris LynKO) est utilisé dans le présent projet. Ces souris développent une pathologie lupique légère mais cependant quantifiable. Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : 1- des injections dans le ventre (« intrapéritonéales ») qui induiront une douleur brève de piqûre. Ces injections sont aussi efficaces que des intraveineuses pour disperser le composé injecté dans tous le corps mais moins contraignantes pour les souris. 2- des contentions (souris attrapées et immobilisées dans une main) : cet acte induit un stress bref pour les souris, mais sont indispensables pour réaliser les injections. 3- certaines souris seront soumises à un prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Ce geste peut induire un léger inconfort pour la souris le temps que la cicatrisation de la veine soit complète (24 heures). Ce prélèvement permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant le traitement et à la fin de la procédure. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois au maximum sur une période de 15 jours. Ces interventions seront réalisées dans l’attention et la bienveillance au bien-être animal autant que faire se peut.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables induits sur les animaux seront un stress bref et des douleurs brèves. La contention des animaux induira un stress bref passager chez les animaux. Les injections induiront une légère douleur de piqûre brève. Les prélèvements sanguins (une seule fois) peuvent induire un léger inconfort pour la souris le temps que la cicatrisation de la veine soit complète (24 heures).
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés en fin de procédure afin d'en analyser les organes d'intérêts.
Remplacement
Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.
Réduction
L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des approches in vivo (dans l’organisme vivant) verront leurs organes utilisés pour des cultures cellulaires et des expériences in vitro et les organes des souris malades traitées ou non serviront de contrôles positifs ou négatifs pour des expériences ultérieures. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé en fonction des besoins du projet afin de pouvoir conclure scientifiquement. Le nombre d’individus à analyser par groupe d’animaux sera gardé au minimum autant que faire se peut.
Raffinement
Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'ils soient contaminés par des agents infectieux, avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et avec un contrôle de la température, du cycle jour/nuit et de l’humidité. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales pour atténuer tout stress, ne sont jamais isolés et sont toujours hébergés avec des accessoires d’enrichissements (cotons pour nidifier, jouets type maisonnette pour pouvoir se cacher). Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans le présent projet. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. La contention des animaux reste nécessaire aux injections par voie intrapéritonéale (dans le ventre) prévues ce qui engendrera un stress bref chez les animaux. Ces pratiques seront réalisées dans l’attention et la bienveillance au bien-être animal autant que faire se peut. Les souris seront observées quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être.
Choix des espèces
Les études d’une approche thérapeutique innovante sur un modèle de pathologie humaine doivent être réalisées sur des modèles animaux afin de justifier le passage aux tests chez l’Homme. Notre projet s’inscrit dans cet objectif et toutes les mesures permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés ainsi que les éventuelles souffrances subies par ces animaux seront entreprises. L’espèce Mus musculus domesticus est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 8 semaines (stade adulte). Tous les animaux seront utilisés avant 41 semaines d’âge pour éviter tout risque de souffrance des individus.
Mesure de la biodisponibilité et de la pharmacocinétique de produits pharmacologiques chez la souris – Prélèvements répétés
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Jusqu'à vingt et une administrations espacées de huit heures et dix micro-prélèvements de sang à l'extrémité de la queue, sur quarante-huit heures au minimum : 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour recueillir les échantillons. Le projet mesure la concentration sanguine de quatre-vingts candidats médicaments par an pendant cinq ans, à raison de trois souris par condition testée. Le porteur écrit renoncer à toute grille de score parce qu'un score obligerait à maintenir la souffrance de l'animal pour en suivre l'évolution, et prévoit la mise à mort dès 2 à 5 % d'écart de poids. Le choix de la souris tient à ce qu'elle est l'espèce la plus utilisée pour cette mesure et à ce que sa petite taille consomme moins de composé, certains candidats médicaments étant difficiles à synthétiser.
Objectifs
Pour le développement de nouveaux médicaments, il est nécessaire d'étudier le devenir de la substance active dans l'organisme, dans le but de déterminer : l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé (ADME), des propriétés qui vont influencer la posologie du candidat-médicament (dose administrée et fréquence d'administration). L’objectif scientifique est de suivre la concentration sanguine de produits pharmacologiques en cours de développement chez la souris. Les produits pourront être de différentes natures (chimique, peptidique, oligo-nucléotidique) et/ou pour diverses applications : analgésie, anti-inflammatoire, antibiotique, immunodépresseur, anticancéreux, cardio-protecteur, anti-arthrosique, antidépresseurs, neuro-protecteur…
Bénéfices attendus
La mesure de la concentration sanguine au court du temps des candidats-médicaments permettra de sélectionner les plus adaptés et d’en affiner la posologie (dose et fréquence d’administration) selon les résultats de l’ADME. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Il permet de réduire drastiquement le nombre de candidat-médicament à tester dans les études d’activité et le nombre d'études nécessaires pour mesurer ensuite l’activité des candidats-médicaments sélectionnés, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections pour l'administrer les candidat-médicaments étudiés. Les candidat-médicaments et médicaments étudiés seront administrés 1 à 21 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et pour les administrations ID, IN, IT. Afin de suivre la concentration sanguine du candidat médicament au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue et sur une durée minimum de 48h.
Impact sur les animaux
Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses
Remplacement
Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l’ADME d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la pharmacocinétique sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.
Réduction
La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 souris par condition testée. La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour suivre la concentration sanguine des candidats médicaments. Les résultats sont exploités sous la forme de courbes cinétiques et aucune comparaison statistique n’est requise. Il est prévu de mesurer la pharmacocinétique de 80 composés chaque année sur une période de 5 ans soit un maximum de 1200 souris.
Raffinement
La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contraintes temporelles (délai de livraison, délai trop court avant une période de travaux ou avant le vide sanitaire suivant…). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations (intranasale, intratrachéale, intradermique, intramusculaire). Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments ou des sondes, pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement
Choix des espèces
La mesure de la pharmacocinétique est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments. Certain candidat-médicament sont très difficile à synthétiser et la petite taille de la souris nécessite beaucoup moins de composé. Enfin, ce choix permet aussi de mesurer l’ADME d’un composé chez la même espèce que pour les futures études d’activités, elles-mêmes nécessitant le plus souvent le recourt à des animaux génétiquement modifiés, plus facile à trouver ou générer chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique et de la pathologie visée. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.
Création et maintien d’une lignée transgénique de poisson zèbre pour étudier une nouvelle mutation génétique impliquée dans une pathologie osseuse
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Amputés d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, baignés deux nuits dans un colorant sans nourriture, anesthésiés chaque semaine pendant trois semaines pour des séances d'imagerie, 1 832 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Tous seront tués à la fin du projet. Les poissons porteurs de la mutation étudiée développeront des malformations du crâne et de la colonne, que le porteur annonce sans en faire un critère d'exclusion, l'objectif étant de vérifier qu'une mutation repérée chez des enfants de petite taille cause bien la maladie. Il présente pourtant le poisson comme permettant des approches "largement non-invasives", tout en indiquant que le prélèvement de nageoire à trois jours entraîne aujourd'hui une importante létalité.
Objectifs
En étudiant 400 enfants de petite taille, il a été identifié une nouvelle mutation génétique responsable d'une maladie caractérisée par une petite taille et des malformations du squelette de la tête. Si le rôle de ce gène dans le développement squelettique a déjà été décrit, il n'a jamais été associé à une maladie humaine. Le développement d'un modèle animal est indispensable à la fois pour confirmer la pathogénicité de cette mutation et pour déterminer les mécanismes responsable de cette maladie. Par conséquent l’objectif de ce projet consiste à l’établissement et à la caractérisation d’un modèle de poisson-zèbre exprimant cette mutation afin d’étudier l’impact de la mutation sur le développement du squelette de la tête.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux définir le rôle d'une protéine au cours du développement squelettique. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies entrainant des défaut de la croissance osseuse . La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des pathologies osseuses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Un prélèvement d'un bout de nageoire, sera réalisé sous anesthésie (1 minute) sera effectué sur certains poissons. Certains poissons seront baignés 2 fois dans un colorant pendant une nuit à chaque fois hors flux sans nourrissage Certains poissons seront imagés 1fois/semaine pendant 3 semaines (3 minutes environs). Certains poissons subiront une injection intrapéritonéale sous anesthesie (5 minutes maximum).
Impact sur les animaux
Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d'intérêt, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. D'autre part, les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs 1/ aux anesthésies répétées lors de l’acquisition d’images hebdomadaires, 2/ aux colorations in vivo, 3/ aux isolements nécessaires pour les acquisitions d’images et pour le génotypage des poissons, 4/au prélèvement d’un fragment de 1mm de la nageoire caudale sous anesthésie générale et 5/ à une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale.
Devenir
L'ensemble des poissons de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été réalisées soit au court des procédures soit seront réalysees en post mortem.
Remplacement
Le développement du squelette est un mécanisme complexe impliquant différent types cellulaires interconnectés. Son développement est une suite d’évènements influencé par de multiples paramètres physiologiques et environnementaux. De ce fait, il est pour le moment impossible de modéliser parfaitement son développement in vitro, et le recours à l’expérimentation in vivo reste incontournable. Néanmoins l'utilisation du poisson comme espèce modèle permet cependant des approches largement non-invasives sans nécessité d’intervention chirurgicale.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour chaque manipulation est basé sur notre expérience au laboratoire. Ce nombre a été pour chaque protocole déterminé afin d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour l’obtention de résultats significatifs en prenant compte de la variabilité de la croissance des poissons observé au cours de précédents projets du laboratoire. Selon l'expérience, les tests d'ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Au cours de la procédure 3 afin d’une part d’augmenter la puissance statistique et d’autre part de réduire le nombre d’animaux utilisé, les acquisitions d’image seront réalisées sur le même animal à différents temps. Nous mettons en place actuellement le prélèvement de la nageoire des poissons pour génotypage à 3 jours post fécondation au sein de l'animalerie. A l'heure actuelle ce geste entraine une importante léthalité et nécessite une amélioration. Néanmoins au cours de ces 5 prochaines années, la mise en place de cette technique permettra de réduire le nombre d'animaux par procédure.
Raffinement
Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d’interet, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. Dans le cas d’un défaut mandibulaire trop important, l’analyse des poissons se limitera à l’analyse des premières étapes du développement crâniofacial jusqu’à 5 jours post fecondation). Dans le cas d’un défaut mandibulaire modéré à faible, Les bacs à surveiller seront indiqués, le comportement des animaux face à la nourriture sera analysé quotidiennement lors du nourrissage par les animaliers. D’autre part l’apparition de symptômes morphologiques ou comportementaux sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Seuls les poissons nécessaires à la création, au maintien des lignées et à l’analyse du squelette post mortem aux stades adultes seront génotypés à 3mois post fécondation sous anesthésie générale en présence d’un analgésique. A la suite du génotypage, les poissons sont mis sous analgésiques pendant 48h. L’acquisition d'image nécessaire au cours des procédures d'imagerie in vivo sera réalisée avec un microscope permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie. Le milieu aqueux utilisé pour maintenir les poissons dans la bonne position pendant l’acquisition permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations.
Choix des espèces
Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette dela tête. Le squelette de la tête présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués au cours de son développement. De plus, l'existence de poissons exprimant des protéines fluorescences dans les cellules participant à la formation osseuse permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. L’analyse du squelette se fera du stade larvaire (7jours post fécondation (jpf) ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 1 semaines, 2 semaines, 3 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois).
Etude de la pharmacocinétique et de la biodistribution de différentes nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétiques (SPIONs) chez le rat sain
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
33 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacun subissant soit huit prélèvements sanguins sous anesthésie après une injection intraveineuse, soit deux séances d'IRM d'une heure. Tous seront tués en fin de procédure pour prélever leurs organes. Le porteur justifie le choix du rat plutôt que de la souris par la possibilité de prélever davantage de sang sur un même individu, ce qui divise par huit le nombre d'animaux utilisés. Le bénéfice annoncé se limite à mieux comprendre comment influencer le comportement de nanoparticules d'oxyde de fer dans le sang, un usage en médecine humaine étant renvoyé au long terme.
Objectifs
Les nanoparticules à base de fer sont en plein développement et possèdent de nombreuses propriétés pour des applications en médecine : en effet, 1/ elles pourraient aider au diagnostic par imagerie IRM (imagerie par résonance magnétique) car le fer est visible en IRM mais aussi 2/ elles pourraient servir pour traiter des pathologies: i) sous un champ magnétique le fer peut dégager de la chaleur et détruire les cellules à proximité, ii) le fer peut également aider à augmenter les effets de radiothérapie (traitement par rayons) et enfin, iii) les nanoparticules peuvent jouer le rôle de transporteur de médicaments. Un élément indispensable avant de développer des nanoparticules est de contrôler leur comportement dans l’organisme afin de les amener sur leur lieu d’action. Le principal problème de la plupart des nanoparticules est qu’elles sont vite éliminées de la circulation sans avoir le temps de rejoindre leur cible et qu’elles s’accumulent dans le foie qui est l’organe qui permet leur élimination. Dans de précédents travaux nous avons identifié que certaines protéines présentes dans la circulation sanguine pouvaient influencer le comportement biologique de nanoparticules d’oxyde de fer aussi appelées Spions (Superparamagnetic iron oxide nanoparticles). Dans ce projet, nous souhaitons maintenant greffer ces protéines sur les Spions et évaluer leur comportement biologique : temps de circulation sanguine et élimination.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre comment influencer le comportement biologique de nanoparticules d’oxyde de fer pour à terme permettre leur utilisation en médecine humaine.
Procédures
Procédure 1 : Une injection intraveineuse (1minute) puis 8 prélèvements sanguins (2 minutes chacun) sous anesthésie. Procédure 2 : deux sessions d’imagerie par IRM (1h maximum chacune) seront réalisées ainsi qu’une injection intraveineuse (1 minute) sous anesthésie.
Impact sur les animaux
L’injection intraveineuse et les prélèvements sanguins répétés sous anesthésie pourraient présenter un léger inconfort et des lésions locales si le geste est mal maîtrisé. Un stress associé à la mise sous anesthésie peut également intervenir. Les composés administrés ne devraient avoir aucun effet.
Devenir
Des analyses complémentaires sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de l’étude. La totalité des animaux seront euthanasiés en fin de procédure
Remplacement
L’étude du devenir d’une molécule dans l’organisme rend la règle de remplacement difficilement applicable puisqu’il est nécessaire de l’étudier dans son contexte global avec une interaction entre les différents organes préservée.
Réduction
Une sélection de 6 Spions, préalablement testés in vitro pour l’étude de leur pharmacocinétique puis par la suite des 3 meilleurs Spions pour l’étude de biodistribution permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires en éliminant ceux avec les moins bonnes propriétés physiologiques. L’effectif de chaque groupe expérimental a été réduit à son minimum dans chaque procédure afin d’obtenir des résultats scientifiquement pertinents sur la base des études menées précédemment. L’utilisation du rat permet également de réduire les effectifs car il est possible de réaliser des prélèvements sanguins répétés compatibles avec nos analyses biologiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes sociaux de 2 ou 3 avec accès illimité à l’eau et la nourriture. L’enrichissement des cages sera composé de 2 pad de sizzle-dri (frisottis de carton). Un temps d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respecté avant le début de la procédure. La réalisation d’une imagerie IRM dans cette étude, qui est une méthode non invasive, permet de réduire la douleur et l’inconfort à son niveau minimum. La totalité des procédures est réalisée sous anesthésie et sur plaque/lit chauffant afin de réduire l’inconfort de l’animal. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance et également à la bonne réalisation des gestes techniques.
Choix des espèces
Pour les besoins de l’étude, nous devons prélever de façon répétée des volumes de sang pour nos analyses qui demanderaient l’utilisation de nombreuses souris. Dans un but de réduction du nombre d’animaux nous utiliserons le rat qui permet de diminuer le nombre d’animaux par 8 mais également l’imagerie par IRM. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (250g) afin qu’ils aient atteints leur maturité physiologique
Evaluation de candidats médicaments dans des modèles de greffes tumorales issues de patients (PDX, Patient Derived Xenograft).
- Recherche appliquée
- Cancers
Les souris utilisées ici sont immunodéficientes, choisies pour ne pas rejeter les fragments de tumeurs prélevés sur des patients, certaines portant en plus un système immunitaire humain reconstitué. 13 340 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de tissus. Elles subissent une chirurgie de greffe de cinq à vingt minutes, jusqu'à deux mois de traitements par des molécules dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires, et jusqu'à dix prélèvements sanguins. Le nombre d'animaux par groupe, treize, ne repose sur aucun test statistique : le porteur le fixe à partir de son expérience et de la littérature.
Objectifs
Ce projet a déjà obtenu une autorisation de projet qui doit être renouvelée au bout des 5 ans échus. Les cancers sont en progression constante de nos jours et touchent plusieurs organes. Aux stades avancés, ils sont réfractaires à toute thérapie malgré le développement des thérapies ciblées. De nouvelles options thérapeutiques doivent donc être impérativement développées. Depuis plusieurs années, nous avons mis en place une importante plateforme de xénogreffes tumorales issues de patients (PDX Patient-derived xenograft) pour les cancers urologiques dans un premier temps du fait de notre thématique de recherche (mais d’autres domaines pourraient être testés) et de proposer ces modèles pour une évaluation fiable de candidats médicaments. L’objectif du projet est d’évaluer l’effets de candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes de tumeurs issues de patients chez la souris immunodéficiente et/ou humanisée.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de cancer.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse ou par voie fixe pour subir une chirurgie pour l’implantation de la tumeur. Ces chirurgies sont courtes et durent environ 5-20 min selon la voie choisie. Des antalgiques seront administrés aux animaux en sous-cutané pour limiter la douleur. Les animaux recevront également des traitements avec des candidats médicaments à tester (traitements pendant 2 mois maximum). Les voies et fréquences sont dépendantes de chaque protocole expérimental. Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront très rapides (environ 1 min) pour diminuer au maximum la contention des animaux et un stress possible. Les animaux pourront avoir des prélèvements sanguins sur animal vigile ou anesthésié (geste qui dure environ 1 min et 5-10 prélèvements maximum). La mesure des tumeurs se fera par palpation de la tumeur et évaluation de sa taille. Ce geste est très rapide (1 minute maximum) et ne provoque pas un grand stress à l’animal.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies et chirurgie sur les animaux peuvent provoquer du stress, une douleur, des lésions. De plus, nous greffons une tumeur cancéreuse aux animaux qui croit plus ou moins doucement selon les modèles pouvant entraîner une perte de poids des animaux, une gène…
Devenir
Les animaux seront euthanasiés car des prélèvements de tissus seront réalisés
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de certains cancers. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Les modèles expérimentaux en oncologie préclinique sont: - les lignées cellulaires in vitro et in vivo ; - les tumeurs induites chimiquement ; - les souris transgéniques ; - les xénogreffes tumorales issues de patient (PDX). Ce dernier modèle est reconnu comme le plus pertinent car il reflète l’hétérogénéité tumorale et est décrit dans la littérature. Cette approche est encore peu répandue pour la sphère urologique et la communauté scientifique manque de modèles de PDX pour évaluer les candidats médicaments. De plus, l’approche immunothérapeutique prend une grande ampleur en oncologie, ainsi il est important de développer des modèles de double humanisation (PDX implantés sur des souris humanisées) pour tester ces nouvelles immunothérapies (non réalisé à ce jour dans notre laboratoire mais en forte perspective pour les prochains mois). Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer une valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). La mesure de la croissance tumorale se fera via une méthode non invasive de palpation ou à l’aide d’un caliper pour des volumes plus importants. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. De plus, le fait de pouvoir congeler/décongeler des tumeurs issues de la biobanque et de pouvoir l’incrémenter avec des nouvelles tumeurs évite d’avoir toujours les tumeurs à amplifier dans les animaux pour les conserver, diminuant à terme le nombre d’animaux. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et principalement dans ces modèles, les publications scientifiques, 13 animaux seront utilisés par groupe expérimental car c’est le minimum requis pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence entre plusieurs groupes (tests paramétriques ou non-paramétriques selon la normalité des groupes).
Raffinement
En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée et administration d’antalgiques avant et après toute chirurgie. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type igloo, morceau de bois, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes pouvant aller jusqu’à un point limite (définition de points limites adaptés). Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Du fait de la perte de poids des animaux possible en fonction de certaines tumeurs, une alimentation humide type Diet gel sera ajoutée dans la cage de ces animaux si nécessaire. Si un animal présentait un symptôme pouvant amener à un point limite, il serait hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin, soigné et pris en charge en fonction de son état (isolement en dernier recours mais possible selon l’agressivité de ses congénères). Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
Le modèle expérimental décrit dans ce projet est très bien décrit dans la littérature et nécessite l’utilisation d’animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d’un tissu étranger. L’espèce de référence pour les études en oncologie préclinique est la souris du fait de sa facilité d’utilisation et des nombreux modèles de souris immunodéprimées et humanisées produits. Nous utiliserons des souris jeunes (4-6 semaines à la livraison) pour faciliter la prise de greffe pour les primo-implantations et les tests d’efficacité de candidats médicaments. Pour les études d’immunothérapie, nous utiliserons des souris d’environ 14 semaines, lorsque le système immunitaire humain est bien reconstitué.