Procédures modérées

1 300 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun hébergé seul en cage pour mesurer précisément ce qu'il mange, avec jusqu'à douze prises de sang hebdomadaires, une injection d'hormone et trois tests de comportement. La réduction des apports en protéines pendant deux à douze semaines doit déclencher une augmentation de la prise alimentaire de 20 à 30 % et un risque d'augmentation de la masse grasse, les tests s'accompagnant de mises à jeun de quinze heures et de privations d'eau de six heures. Tous sont tués à la fin pour prélever le sang, les tissus et les organes. Le porteur affirme qu'il est nécessaire d'étudier d'abord chez le rat les conséquences du rééquilibrage vers les protéines végétales, transition dont les motifs sont, chez l'humain, environnementaux et sanitaires.

Objectifs

La réduction de la consommation de protéines peut entraîner une appétence accrue pour les protéines et une hyperphagie de compensation (c’est-à-dire une augmentation de la consommation d’aliment de 20 à 30% par rapport à la consommation habituelle), observées chez l’animal et suggérée chez l’Humain. Ces conséquences traduisent une forme d’insatisfaction vis-à-vis de l’ingéré protéique qu’il est nécessaire de mieux caractériser pour définir le risque obésogène associé (risque d’augmentation des masses graisseuses dans l’organisme). Les précédentes études de l’équipe ont montré que le comportement alimentaire en réponse à la diminution des apports protéiques varie selon les individus, et que l’hyperphagie pourrait être modulée par les caractéristiques de la ration protéique, plus particulièrement par la qualité des sources protéiques et leur fréquence de consommation. Les objectifs du projet sont : 1) de mieux caractériser le risque d’hyperphagie en réponse à une réduction des apports en protéines, en fonction de la nature des apports en protéines (sources animales/alternatives) et des sensibilités individuelles. 2) de caractériser l’influence de la qualité des sources de protéines (composition en acides aminés indispensables, AAI et acides aminés non indispensables, AANI) et de leur fréquence de consommation (rythme d’apports protéiques sur une semaine) sur l’hyperphagie et le risque obésogène. Pour mieux comprendre ces effets sur la consommation alimentaire, nous étudierons les activités des neurones et des cellules gliales (autres cellules du cerveau) qui peuvent intervenir dans les régions du cerveau générant la faim et la satiété, pour déclencher cette adaptation à la réduction des apports en protéines. Les résultats contribueront 1) à la définition d’une teneur minimale en protéines dans le régime pour prévenir le risque hyperphagique et 2) à la définition du profil en AAI/AANI optimal pour les sources protéiques alternatives à la viande.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de faire progresser les connaissances scientifiques sur la physiologie et le comportement associés à la prise alimentaire chez le rat. Aujourd’hui, la réduction de la consommation de protéines animales et un rééquilibrage en faveur des protéines végétales sont des messages largement diffusés pour des raisons environnementales et de santé. Les sociétés occidentales sont ainsi au début d’une réorientation des préférences alimentaires. Toutes les conséquences de ces réorientations ne sont pas élucidées notamment d’un point de vue de la physiologie et du comportement alimentaire. Il est donc nécessaire de les étudier en amont sur un modèle d’étude, le rat, dont la physiologie et le comportement alimentaire en relation avec la consommation des protéines est proche de l’Humain. En étudiant l’impact des apports protéiques chez le rat, ce projet permettra de fournir des données expérimentales solides pour anticiper les conséquences d’une transition alimentaire chez l’Humain et contribuer à l’établissement des recommandations pour la santé humaine notamment en termes de qualité et quantité des protéines ingérées.

Procédures

Seuls 2 types d'interventions seront réalisés sur animal vigile (1300 rats au maximum) : les injections d’hormones (réalisées chacune en moins de 30 secondes, au maximum 1 par procédure et par rat) et les prises de sang (maximum 1 par semaine, durant 4 à 12 semaines, et par rat, d’une durée généralement inférieure à 2 minutes, et au maximum inférieure à 5 minutes) seront réalisées par un manipulateur expérimenté pour cet acte technique. Des tests comportementaux permettant d'évaluer l'activité locomotrice, l'état émotionnel et les capacités mnésiques et cognitives seront réalisés pour chaque rat (maximum 3 tests par rat, d’une durée maximale de 15 minutes par test).

Impact sur les animaux

L’hébergement en cages individuelles pour les mesures de consommation (aliments et boisson en libre accès) peut induire un stress modéré. La réduction des apports en protéines pendant 2 à 12 semaines induit une nuisance légère (induction d'une augmentation de la consommation d'aliments de 20 à 30% par rapport à la consommation habituelle pour compenser la baisse des apports en protéines, associée à un risque d'augmentation de la masse grasse de l'organisme). La mise à jeun (15h maximum) et la privation d’eau (6h maximum) lors de tests de préférence alimentaire et de choix de biberon, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux représentent un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les injections provoquent un stress modéré et une petite douleur mais de courte durée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte de sang et des différents tissus et organes.

Remplacement

Les mécanismes du contrôle de la prise alimentaire chez les mammifères reposent sur l'interaction entre circuits nerveux et hormonaux. La contribution du microbiote intestinal (les populations de microbes qui vivent en symbiose avec l’humain ou l’animal dans son intestin) à ces interactions neurones-hormones a été suggérée. A ce jour il n’existe pas de modèle in vitro (culture cellulaire, culture d’organe) ou in silico (modélisation par calculs à partir de données sur ordinateur) incluant l’ensemble des acteurs du contrôle de la prise alimentaire : les neurones, les hormones, les organes régulateurs (foie) et le microbiote. Chez l’animal vivant, le dialogue entre ces différents partenaires est présent, c’est pourquoi nous utilisons le modèle rat in vivo.

Réduction

Nous avons estimé l'effectif minimal requis pour observer un effet régime avec un test statistique. Pour cela, nous avons extrait la taille de l'effet régime sur différentes variables d'une précédente étude, puis nous avons estimé l'effectif minimal requis. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte.

Raffinement

A leur arrivée dans l’animalerie, les rats ont une période d’habituation de 7 jours à leur nouvel environnement. Le bien-être animal sera pris en compte avec un hébergement enrichi et un suivi quotidien des rats par des agents qualifiés. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats sont placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Afin de limiter encore l’impact de l’isolement, les cages seront enrichies au moyen de tunnels (opaques ou transparents), d’une tasse renversée, de support de gamelle vide. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés par 2 dans des cages collectives durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’interaction sociale. Les rats seront également habitués progressivement aux changements de conditions expérimentales (lors des tests comportementaux notamment). Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. Des aiguilles spécifiques permettant un écoulement plus efficace du sang seront utilisées, ce qui permet de limiter la durée et le stress engendré par les prises de sang. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Le rat est un mammifère dont la physiologie et l’anatomie digestives et le comportement alimentaire (c’est un omnivore), notamment la prise quotidienne en plusieurs repas séparés, sont comparables à ceux de l'Humain. Le rat est un modèle reconnu et utilisé par les laboratoires étudiant les mécanismes régulateurs du comportement alimentaire. C’est chez le rat que l’effet des apports en protéines alimentaires sur la faim et la satiété ont été mis en évidence. Les mécanismes cellulaires cérébraux qui contrôlent les sensations de faim et de satiété ont également été mis en évidence d’abord chez le rongeur et en particulier chez le rat. Les animaux employés sont de jeunes rats de 4 à 6 semaines au début de l’expérience. Cela correspond au sevrage et au stade de prépuberté. A ce stade de développement, les besoins en protéines des rats sont les plus élevés pour assurer leur croissance. Cette période cruciale est donc idéale pour étudier l’impact des apports en protéines et le comportement alimentaire associé. De plus, les populations humaines auxquelles l’équipe s’intéresse, à travers ce modèle animal, sont les adultes jeunes, cible privilégiée en termes de transitions alimentaires et de risque obésogène.

Cathéter posé sous anesthésie générale, injections de sang ou d'un agent vasoconstricteur, séances d'imagerie par ultrasons : 198 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure. Le porteur annonce des douleurs et un mal-être liés à l'inflammation provoquée par ces injections, une gêne au point d'incision et une perte de masse corporelle. Il s'agit de mettre au point une échographie super-résolue capable de détecter tôt le vasospasme après une hémorragie sous-arachnoïdienne chez les patients. Sur l'effectif, il écrit qu'il est difficile de l'estimer avec exactitude et l'évalue à 10 animaux pour valider la technique, sans expliquer comment on arrive aux 198 souris déclarées.

Objectifs

L’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) correspond à une issue de sang dans les espaces sous-arachnoïdiens du cerveau et figure parmi les premières causes d’admission en réanimation. L’impact socio-économique de cette pathologie est majeur puisqu’elle touche des sujets jeunes dont un tiers des survivants conservent des séquelles neurologiques. Le principal facteur associé à l’importance du handicap post-HSA est la survenue d’une ischémie cérébrale retardée (ICR). Or, à ce jour, en dépit de plusieurs décennies de recherche, aucun diagnostic précoce testée chez l’homme a pu empêcher l’incidence de l’ICR. Nous souhaitons développer et utiliser l’échographie super-résolue pour diagnostiquer l’ICR chez l’homme après une phase de développement chez l’animal. La technique de Microscopie par Localisation Ultrasonore (ULM en anglais) a été inventée en 2010 et a fait l’objet d’une récente revue de la littérature. Cette technique consiste à tracer à l’échelle du micromètre le parcours d’un agent de contraste ultrasonore approuvé en clinique qui consiste en une solution de bulles injectables et restreintes au domaine vasculaire. L’ULM a ainsi pu cartographier la structure vasculaire à l’échelle des pré-capillaires chez l’animal et a aussi été utilisé depuis chez l’homme. L'objectif du projet est de développer un outil d'imagerie par échographie 3D ultra-résolu, qui permettrait d’identifier de manière précoce le vasospasme (un des facteurs impliqués dans l’IRC) ainsi que les troubles de perfusion intracrânienne post-hémorrhagie afin de pouvoir diagnostiquer l’ICR. Cette nouvelle technique sera évaluée dans quatre modèles précliniques différents de HSA (deux de vasospasme avec l’injection d'un agent vasoconstricteur) et deux modèles d'hémorragie sous-arachnoidienne. Le but serait de pouvoir rendre plus accessible et précoce le diagnostic de l’ICR ainsi que permettre la localisation précise de vasospasmes et les troubles de perfusion vasculaires cérébrales grâce à l'imagerie ultrasonore, couplée à une injection d'un agent de contraste non radioactif et biocompatible.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet étant de proposer un modèle de détection précoce de troubles de perfusion, vasospasme et ICR par une modalité d'imagerie plus accessible, les bénéfices attendus seraient : - De proposer un agent de contraste peu coûteux, biocompatible, non radioactif et donc avec moins de risques sanitaires et accessibles à plus de patients, qui pourraient être exclus des méthodes d'imagerie habituelles. - De proposer une technique d'imagerie novatrice, qui pourrait être mise à chevet du patient et nécessitant moins d'infrastructures spécifiques, qui pourrait être portable, en plus d'être moins coûteuse et accessible à plus de patients que les méthodes d'imagerie habituelles, comme l’imagerie à resonance magnétique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des inductions d'anesthésie gazeuse, à des poses de cathéter sous anesthésie générale, à des injections intraveineuses et des injections d’agent vasoconstricteur ou de sang.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient : - De mal supporter la concentration de microbulles nécessaires. - Une gêne possible au niveau de l'incision (démangeaison ou douleurs les premiers jours). - Une gêne possible au niveau du site d'insertion du cathéter. -Des douleurs et un mal-être des souris liés à l'inflammation provoqués par les injections d'agent vasoconstricteur ou sang. - Une perte de masse corporelle liée à l'anesthésie générale. - Des douleurs post-opératoires possibles au niveau du point d'incision.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. Cependant un degré de sévérité a été estimé pour chaque procédure au lieu de les classer toutes en "sans réveil" car les animaux seront amenés à être réveillés au sein des procédures. De plus, il a été choisi de classer les procédures selon un degré de sévérité afin d'adapter le raffinement (analgésie, conditions per-opératoires ...).

Remplacement

Dans ce projet, il n'est pas possible de remplacer le modèle animal, il s'agit d'étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires et tissulaires physiopathologiques associés, survenant lors d'une hémorragie sous-arachnoïdienne / vasospasme. L'imagerie de la perfusion vasculaire cérébrale ne peut être réalisée autrement que par un modèle in vivo.

Réduction

Il est difficile d'estimer avec exactitude le nombre d'animaux nécessaires à ce projet. Il n'est pas possible d'avoir une idée de taille d'effet puisque l'on ne comparera pas des réponses à des traitements. Pour la mise au points des modèles de vasospasme, nous avons estimé des concentrations qui semblent être cohérentes avec ce qui est décrit dans la littérature. Pour la partie du projet ou on cherche le diagnostic d’ICR par ULM l'idée sera de valider la robustesse et la reproductibilité de l'agent de contraste et la méthode développé en le comparant à l’imagerie à résonance magnétique et le doppler. Nous estimons le nombre d'animaux nécessaires à 10, afin de valider cette technique malgré les différentes variations possibles liées à la physiologie des animaux.

Raffinement

Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux auront le temps de s'acclimater à la nouvelle animalerie après leur réception auprès du fournisseur pendant une semaine, puis seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole. Cela permettra de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et à apprendre aux souris à coopérer. Les souris vivront en groupe dans des cages enrichies (coton, kraft et maisonnette en papier) afin de respecter leur mode de vie. Après chaque anesthésie, les souris bénéficieront de croquettes humides dans une coupelle au sol afin de favoriser la prise de nourriture et l'hydratation. Durant chaque chirurgie, les souris seront analgésiées, et sous anesthésie locale au niveau de l'incision de la peau et de la zone d'insertion du cathéter. Une application d'anesthésiant est également prévue sur les sutures pour éviter les démangeaisons ou les douleurs post-opératoires éventuelles. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux lors de chaque anesthésie afin d'éviter le dessèchement oculaire. Le réveil postopératoire se fera dans une enceinte post opératoire dédiée à cet effet avec une température optimale pour les animaux ne régulant plus leur température corporelle avec de l'eau et de la nourriture, jusqu'à ce que les animaux retrouvent une bonne mobilité. Concernant l'application des points limites, les animaux seront mis à mort immédiatement dans l'une des situations suivantes : - Signes de douleurs indexés sur le Grimace-Scale Souris ; -Absence de réaction ; - Animal inactif dans sa cage ; - Complications chirurgicales inattendues; - Perte de poids; - Ré ouverture de l'incision de la peau.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies neurovasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour permettre la localisation précise de vasospasmes et les troubles de perfusion vasculaires cérébrales. Nous utiliserons des souris adultes en rapport avec l’âge des animaux utilisés dans les études précédentes. Les souris seront de jeunes adultes. Le projet est réalisé avec de jeunes adultes afin de rester cohérent avec l'âge des souris couramment employées lors de protocoles d'étude de hémorrhagie sous-arachnoidienne (qui touche des patients jeunes) et d'optimiser la reproductibilité du protocole. Enfin, les souris ne doivent pas être trop âgées afin de pouvoir réaliser les acquisitions en imagerie ultrasonore. En effet, le crâne s'épaississant avec l'âge, il serait difficile d'imager le tissu cérébral chez des souris trop âgées.

La mort d'une souris figure parmi les signes de toxicité qui conduiront à réduire la dose lors de l'expérimentation suivante. 2 440 souris et 60 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Les souris sont infectées par Leishmania par voie intraveineuse et les hamsters par injection intracardiaque, puis gavées ou injectées cinq jours consécutifs avant que leur foie soit prélevé pour compter les parasites. Le porteur qualifie le hamster d'animal de laboratoire "idéal" pour servir de réservoir, ces animaux étant tués pour récupérer dans leur rate de quoi infecter les lots de souris suivants.

Objectifs

La leishmaniose viscérale est une maladie parasitaire en pleine expansion du fait du réchauffement climatique et des mouvements de populations depuis les zones d’endémie. Cette maladie affecte des populations socialement vulnérables et souvent immunodéprimées. Différentes espèces de Leishmania peuvent mener à la leishmaniose viscérale, dont la Leishmania donovani, qui affecte uniquement l'homme et la Leishmania infantum, qui affecte l'homme et le chien, ce qui fait du chien un réservoir de ce parasite pour l'homme. Sa transmission aux mammifères, y compris aux humains, se fait par des insectes infectés, appelés phlébotomes. Une fois introduites chez l’homme, les leishmanies infectent les cellules du système immunitaire du patient, principalement les macrophages. Malgré le grand impact de cette maladie sur la santé publique, les thérapies actuellement existantes présentent des limites majeures, en termes de toxicité et de chimiorésistance. Dans ce contexte, la recherche et développement de nouveaux médicaments est urgente. Pour ce faire, dans le cadre de programmes de recherche, nous évaluerons l’activité de substances pures soit d’origine naturelle, soit de synthèse et qui sont des inhibiteurs de voies métaboliques spécifiques au parasite, ou bien encore des formulations. Après un premier criblage de cytotoxicité et d’activité in vitro, c’est-à-dire, sur les macrophages et sur les parasites en culture cellulaire, seules les substances les plus actives et les moins toxiques seront évaluées sur des modèles de leishmaniose expérimentale chez l’animal. L’objectif étant de découvrir de nouveaux candidats-médicaments contre les leishmanioses humaines et canines, avant de pouvoir accéder aux essais cliniques de phase 1 chez l'Homme, il est nécessaire de démontrer que les substances sélectionnées in vitro sont capables de réduire la charge parasitaire in vivo.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet: - l'identification de candidats – médicaments capables de surmonter les limites des traitements existants, en termes de toxicité et de chimiorésistance.

Procédures

Lors de l’étude de détermination de la dose maximale tolérée certains lots de souris sont soumises à une administration par gavage (voie orale) ou par voie parentérale (intrapéritonéale ou intraveineuse) avec des substances ou des formulations d'intérêt. Les administrations sont effectuées une fois par jour, sur cinq jours consécutifs. En outre, pour la détermination de l'activité antileishmanienne, une seule injection intraveineuse (pour les souris) ou intracardiaque (pour les hamsters) de moins de dix secondes est pratiquée pour l’infection des animaux. Concernant le traitement des souris infectées, les administrations sont effectuées sur cinq jours consécutifs soit par gavage soit par voie intrapéritonéale ou intraveineuse. Les administrations intraveineuses ou intracardiaques sont réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La leishmaniose n'est pas douloureuse pour les animaux, mais des effets indésirables, comme la perte de poids, l'apathie ou piloérection peuvent survenir lors de la détermination de la dose maximale tolérée, car certaines molécules peuvent s'avérer toxiques. Pendant le traitement, les animaux peuvent ressentir un inconfort lors de l'administration intraveineuse, qui sera minimisée grâce à l'anesthésie à l'isofurane. Quant à l’administration orale, elle est peu douloureuse par gavage.

Devenir

Les souris infectées sont euthanasiées afin de déterminer la charge parasitaire au niveau de leur foie après un traitement sur cinq jours consécutifs qui démarre une semaine après leur infection. Les hamsters infectés sont euthanasiés afin de récupérer les parasites qui serviront à l’infection des lots de souris et d’autres hamsters.

Remplacement

Les substances d'intérêt sont, dans un premier temps, soumises à un test in vitro de cytotoxicité sur les cellules hôtes des parasites, c'est à dire les macrophages. L'absence de cytotoxicité à la concentration de 100 μM justifie de continuer les expérimentations d'évaluation antileishmanienne sur les modèles de Leishmania donovani ou Leishmania infantum chez la souris. Compte tenu des barrières pharmacologiques rencontrées, ainsi que la métabolisation auxquelles sont soumises les substances à évaluer, il n’existe actuellement pas d’alternative à l’évaluation sur un modèle animal avant de lancer des essais cliniques de phase 1 chez l'Homme.

Réduction

Pour réduire l'utilisation des animaux, nous allons réaliser une étude de la dose maximale tolérée (DMT). Elle sera réalisée sur des lots de 7 souris par dose. Nos études antérieures ont par ailleurs montré que 7 souris est un nombre suffisant pour mettre en évidence des troubles liés aux substances testées. En l’absence de données sur la toxicité, une première évaluation de la DMT sera faite à 100 mg/kg par voie orale ou par voie intrapéritonéale ou intraveineuse sur 5 jours consécutifs. Si des signes de toxicité apparaissent, tels que la mort d'une souris ou des symptômes majeurs, nous réduirons la dose lors d'une nouvelle expérimentation. A chaque expérimentation, une seule dose sera utilisée afin de limiter au maximum le nombre de souris utilisé. Des groupes de 3 hamsters seront utilisés comme réservoir de parasites pour infecter les souris pour les études d'efficacité. Pour l'évaluation de l'activité antileishmanienne, nous utiliserons 8 animaux par groupe, la variabilité des taux d'infection nécessitant ce nombre pour obtenir des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Le bien-être des animaux est un point pour lequel nous attachons une attention particulière pour toutes les études prévues. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages enrichies de coton, et de rouleaux de carton afin de pouvoir constituer de refuges. Un suivi journalier sera également effectué afin de s'assurer de leur état général. En plus, pour minimiser l'inconfort qui peut survenir lors d’une injection intraveineuse, une anesthésie à l’isoflurane sera faite au préalable. Des points limites seront mis en place et strictement appliqués.

Choix des espèces

Pour déterminer la dose maximale tolérée et pour l’étude d’efficacité antileishmanienne les souris seront utilisées, car le modèle souris s'avère un modèle pertinent et reconnu dans la littérature. En autre, le hamster est largement reconnu comme l'animal de laboratoire idéal pour servir de réservoir de parasites. Son utilisation comme réservoir pour infecter les souris est préférable en raison de la grande quantité de parasites obtenue à partir de la rate des hamsters, permettant ainsi d'infecter un nombre important de souris avec une grande efficacité. Les hamsters ont un poids de 80 à 100 grammes et sont âgés de 8 semaines. Les souris ont un poids de 18-20 grammes et sont âgées de 6 à 8 semaines au moment de l’infection.

Privés de matériel de nidification du deuxième au neuvième jour après leur naissance, des souriceaux sont soumis à un stress juvénile fabriqué pour l'occasion. 2 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec biopsie de la queue à dix jours, une chirurgie crânienne de deux heures trente à l'âge adulte, quatre semaines de récupération, puis jusqu'à sept tests de comportement. Le porteur décrit un hébergement en cages collectives enrichies d'un nid cotonné pour éviter l'angoisse de l'isolement social, alors que le protocole consiste précisément à priver les portées de ce matériel pendant huit jours. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes, les femelles et les mâles reproducteurs étant auparavant réutilisés pour d'autres lots.

Objectifs

Les troubles cognitifs et émotionnels peuvent résulter de l'interaction entre les prédispositions génétiques et les influences environnementales pendant des périodes critiques du développement. À l'échelle mondiale, l'anxiété a une prévalence de 12% par an, soulignant l'importance d'étudier ses mécanismes pour restaurer les altérations des circuits neuronaux contrôlant la peur physiologique. La période postnatale chez les rongeurs et les humains est particulièrement sensible aux effets des facteurs environnementaux, notamment le stress, en raison de la maturation continue du cerveau. Le stress juvénile peut avoir des effets profonds et durables sur la structure et la fonction cérébrales, influençant ainsi le comportement et la susceptibilité aux stress ultérieurs. L'activité anormale de l'insula, une zone du cerveau, est associée à plusieurs troubles anxieux. Des altérations de sa structure et de sa connectivité sont observées chez les personnes souffrant de ces troubles, suggérant son rôle dans leur physiopathologie. Une étude récente a montré que l’insula est impliquée dans l’expression de phénotypes anxieux chez la souris, mais les mécanismes sous-jacents restent à élucider. Ce projet vise à : 1. Établir un modèle animal de stress juvénile en limitant le matériel de nidification pendant la période post-natale. 2. Enregistrer et moduler l'activité neuronale de l’insula lors de tâches comportementales. 3. Enregistrer l’activité électrique des neurones de l'insula. 4. Identifier les modifications moléculaires des circuits neuronaux de l’insula en réponse au stress.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet comprennent : 1. Compréhension accrue des mécanismes neurobiologiques : Le projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents aux effets du stress juvénile sur le cerveau et le comportement, ce qui pourrait contribuer à l'élaboration de thérapies plus efficaces pour traiter les troubles cognitifs et émotionnels. 2. Développement de nouvelles stratégies thérapeutiques : En identifiant les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la réponse au stress juvénile, le projet pourrait ouvrir la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement ces mécanismes. 3. Amélioration des interventions préventives : En comprenant comment le stress juvénile affecte le cerveau et le comportement, le projet pourrait également contribuer au développement d'interventions préventives visant à réduire les effets néfastes du stress juvénile sur la santé mentale. 4. Avancées dans les techniques de recherche : Le projet utilisera des techniques de pointe telles que l’imagerie par photométrie, la chémogénétique, l'optogénétique, et le séquençage à haut débit du transcriptome ce qui pourrait également contribuer à l'avancement des méthodes de recherche en neurobiologie et en psychiatrie. En résumé, les bénéfices attendus du projet incluent une meilleure compréhension des troubles cognitifs et émotionnels liés au stress juvénile, le développement de nouvelles thérapies et interventions préventives, ainsi que des avancées dans les techniques de recherche en neurobiologie.

Procédures

La moitié des animaux seront soumis à un stress juvénile (stress par limitation de matériel de nidification) du jour post-natal 2 au jour post-natal 9. Au jour post-natal 10, un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé pour génotypage. A l’âge adulte (semaine 9), ils subiront une chirurgie d’un maximum de 2h30 suivie d’une période de 4 semaines de récupération. La moitié des animaux seront ensuite soumis à un stress léger de courte durée (semaine 13) puis à une batterie de tests comportementaux (7 au maximum d’une durée comprise entre 10 et 30 minutes) étalés sur 2 semaines à raison d’un test par jour au maximum.

Impact sur les animaux

1. Les manipulations des animaux et les tests comportementaux peuvent induire du stress et de la détresse chez les animaux d’un degré de gravité léger. 2. Les procédures chirurgicales, comme l'implantation de dispositifs pour l'enregistrement neuronal, comportent un risque de complications telles que des infections ou des réactions inflammatoires. Elles peuvent également générer de la détresse et du stress ainsi que de la douleur post-opératoire minorée par les antalgiques d’un degré de gravité modéré. 3. L'utilisation d'agents chimiques pour la manipulation de l'activité neuronale peut potentiellement entraîner des effets secondaires non désirés, tels que des altérations du comportement ou des réactions toxiques ainsi que de l’inconfort et du stress lié aux injections de ces agents chimiques. Ces effets secondaires sont d’un degré de gravité léger. 4. La biopsie de queue des animaux issus de parents transgéniques peuvent occasionner du stress, de l’inconfort et une douleur d’un degré de gravité léger à modéré.

Devenir

A l’issu du projet, les souris seront euthanasiées pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connectivité des neurones et de leurs propriétés de codage d’informations au cours de comportements complexes. Par conséquent, cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. Des méthodes telles que la culture cellulaire ne permettent pas la quantification des connexions neuronales ou de la mesure de l’activité en réponse à une simulation sensorielle in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir la puissance statistique requise a été calculé afin d'obtenir des résultats robustes tout en minimisant le nombre d'animaux utilisé. De plus, les femelles utilisés pour la génération de nos souris expérimentales seront réutilisés pour des expériences de cartographie anatomique des différents circuits étudiés ainsi que de leurs collatérales. Les mâles seront réutilisés pour plusieurs lots de reproductions. Nous utiliserons aussi des techniques de neurosciences computationnelles pour maximiser les données comportementales que nous allons extraire de nos souris. En effet, nous utiliserons des logiciels tels que Deep Lab Cut pour extraire les données comportementales et constituer une base de données. Les souris non transgéniques générées par les croisements de souris hétérozygotes des différentes lignées transgéniques requises seront utilisées comme souris sauvages pour les autres expériences.

Raffinement

Pour réduire la souffrance imposée par le protocole, les règles suivantes seront appliquées pour le bien-être des animaux: 1- Les animaux seront hébergés en cages collectives, regroupés par fratrie afin d’éviter l’angoisse d’un isolement social. Les cages seront enrichies ave un nid cotonné. 2- Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée par les animaliers. Avant le début de l’expérience, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par l’expérimentateur, puis quotidienne au cours de l’expérience. Lors de ces observations, on vérifiera la capacité de l’animal à s’alimenter, son poids, son comportement, sa vivacité et l’état du pelage. 3- Un analgésique sera administré en sous-cutané, à titre préventif afin d’éviter la souffrance post-opératoire. 4- Les chirurgies se feront sous anesthésie générale. Durant la chirurgie, la température de l’animal sera contrôlée par une sonde durant la chirurgie, et maintenue grâce à un tapis chauffant. Un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux pour prévenir la déshydratation oculaire. 5- Après la chirurgie, du sérum physiologique stérile sera administré pour éviter la déshydratation, et de la nourriture humidifiée sera mise à disposition au sol de la cage. 6- L’état de l’animal et la bonne cicatrisation de l’incision dans la peau de la tête seront contrôlés quotidiennement pendant la semaine suivant la chirurgie.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle largement utilisé pour l’étude des circuits impliqués dans la peur et les troubles anxieux. De plus, nos études font appel à l’utilisation de marqueurs génétiques n’existant que chez la souris. Nous utiliserons également des lignées de souris transgéniques bien caractérisées préexistantes. Les animaux destinés à la reproduction contrôlée seront utilisés au stade adulte en plein période reproductive afin de maximiser les portées et le bien-être des parents et des petits, soit à partir de 10 semaines. Les animaux produits seront soumis au protocole de stress juvénile du jour post-natal 2 au jour post-natal 9 inclut puis seront utilisés au stade adulte, soit à partir de 9 semaines, un âge qui correspond à la maturité des circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées. De plus, les souris adultes sont plus résistantes et récupèrent plus rapidement après la chirurgie.

Tués en fin de protocole pour que la prothèse valvulaire soit prélevée et examinée, 70 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit un remplacement de valve aortique sous circulation extracorporelle, six heures d'anesthésie puis une dizaine d'heures sous sédation et ventilation, quarante-huit à soixante-douze heures de soins intensifs, et des échographies à un, trois et six mois. Le porteur cite parmi les effets attendus l'infection du site chirurgical et un mauvais fonctionnement cardiaque pouvant aller jusqu'à l'insuffisance cardiaque. Il calcule ses effectifs en intégrant une perte "classiquement attendue" de 50 % faute de redémarrage du cœur, chiffre qui dit ce que ce modèle chirurgical inflige.

Objectifs

Aucun traitement médical n’est à l’heure actuelle disponible pour traiter les pathologies valvulaires cardiaques. La seule option offerte aux patients est le remplacement valvulaire par une nouvelle prothèse lors d’une chirurgie à cœur ouvert. Ces dernières années, l’utilisation de prothèses biologiques a pris le pas sur les prothèses mécaniques, principalement à cause de leur meilleure performence hémodynamique et du développment de techniques moins invasives (remplacement par transcatherter des valves). Par contre, ces prothèses ont une durabilité réduite : en effet, la dégénerescence de ces bioprothèses est observée 10 à 15 ans post implantation. Cette dégénrescence a une implication importante d’un point de vue clinique, pouvant entraîner des symptomes chez les patients, un besoin d’une ré-intervention valvulaire et peut aussi entrainer le décès. Cependant, à ce jour, les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ce processus dégénératif sont inconnus. L’objectif de notre projet de recherche est d’étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la survenue de cette dégénérescence des bioprothèses. Ce projet s’appuie sur un modèle de chirurgie de remplacement valvulaire cardique chez le cochon. L’étude portera sur le rôle de l’hypercholestérolémie et de la thrombose dans le processus de dégénérescence des bioprothèses. Des cochons contrôles (Yucatan WT) et modifiés génétiquement (Yucatan avec gain de fonction de PCSK9), recevant ou non un traitement anticoagulant seront étudiés dans cette étude, qui permettra donc d’étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la dégénrescence des bioprothèse et l’effet synergique de l’hypercholestérolémie et/ou de la thrombose prosthétique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le processus de dégénérescence des bioprothèses, et ainsi aboutir à des modifications de prise en charge des patients subissant un remplacement valvulaire avec une bioprothèse, mais aussi modifier la préparation des bioprothèses (préparation et confection des matrices utilisées par exemple). L’un des avantages majeurs de l’étude est que nous pourrons identifier les processus précoces impliqués dans le dévelopement de la pathologie, dès l’implantation de la prothèse et donc proposer des interventions chez l’homme tôt, en per ou post chirurgie.

Procédures

Chirurgie de prothèse valvulaire avec circulation extracorporelle sous anesthésie générale (anesthésie durant 6 heures puis maintien sous sédation et ventilation pendant une dizaine d'heures), Soins intensifs post-opératoires sur 48 à 72 heures, Prélèvements sanguins intra et post-opératoires pendant la semaine de soins intensifs par aspiration de sang au niveau du cathéter veineux central (aucune contention de l'animal et aucune douleur), Prélèvement sanguin et échographie transthoracique à un mois, 3 mois et 6 mois jusu'à la fin du protocole sur animal vigile ou sous sédation selon la tolérance de l'animal (utilisation d'une contention physique minimale et si échec, utilisation d'une contention chimique anxiolytique à base de benzodiazépines), Anesthésie générale finale avant euthanasie

Impact sur les animaux

Douleur modérée pendant l'acte chirurgical sous anesthésie générale et suite au trauma chirurgical en phase postopératoire : traitement analgésique multimodal pendant l'anesthésie et le post-opératoire immédiat et plan d'analgésie de secours si traitement multimodal de première intention insuffisant. Infection du site chirurgical (douleur légère à modérée, hyperthermie, manque d'appétit) : technique chirurgicale aspetique et antibiothérapie adaptée selon les analyses hématologiques, Protection des plaies avec des bandages souples. Malfonctionnement cardiaque suite à l'intervention pouvant entrainer une insuffisance cardiaque (douleur légère à modérée, fatigue, anorexie). Manipulation de l'animal pour l'administration des traitements et des prises de sang (stress, douleur légère) : instrumentation avec un cathéter long-terme jugulaire permettant le prélèvement sanguin sans contention et l'administration de médicaments par voie intraveineuse sans inconfort. Stabulation isolée le temps de la phase post-opératoire immédiate (enrichissement avec jouet et nourriture) et remise en contact d'un congénère dès que la convalescence est suffisante (alimentation normale, arrêt des soins et traitements post-opératoires)

Devenir

Euthanasie en fin de protocole pour prélèvement et étude histologique de la prothèse valvulaire

Remplacement

II n’existe pas de méthode in vitro ou in silico permettant de reproduire les phénomènes physiologiques et pathophysiologiques liés au fonctionnement et à la dégénérescence de la prothèse valvulaire. Les prothèses sont testées pour leur tolérance tissulaire sur des animaux de laboratoire plus petits (rats) avec une mise en place du tissue en sous-cutané. Cette méthode n’est pas adaptée à l’étude de la dégénérecence du tissu valvulaire, qui est implanté chez l’homme dans la circulation et fait face a des contrainte liées au flux sanguin et au pressions/tensions observées au niveau du système circulatoire central.

Réduction

Compte-tenu des connaissances sur les modèles de chirurgie intracardiaque avec circulation extracorporelle chez le porc et de la nécessité d’avoir un nombre d’animaux minimum pour avoir une significativité statistique, le nombre d’animaux comprend des animaux pour la mise au point et la standardisation du modèle chirugical de remplacement valvulaire aortique ainsi que 8 à 15 animaux par groupe pour chaque condition d’évaluation de la dégénérescence prosthétique (perte maximale classiquement attendue pour des protocoles de chirurgie cardiaque chez le porc de 50% par défaut de redémarrage du coeur). Au vu des résultats préliminaires obtenus, le nombre d’animaux pourra être réduit pour chaque groupe d’expérimentation et conditions.

Raffinement

En plus du raffinement des conditions d’hébergement et de manipulation des animaux, les procédures de préparation, d’induction de l’anesthésie, de mise en place de l’analgésie répondent aux exigences de l’analgésie multimodale pré-emptive et sont confiées à des anesthésistes/réanimateurs spécialistes. Une attention identique est portée au suivi des animaux pendant les interventions chirurgicales et le suivi postopératoire grâce à l’ensemble des moyens de monitorage du plateau technique. Les données de monitorage sont enregistrées fréquemment afin de relever à posteriori d’éventuelles réponses physiologiques chez les différents animaux. Des échantillons sanguins sont prélevés avant la chirurgie (après anesthésie), pendant la chirurgie et après la chirurgie (pendant le suivi post-opératoire) afin de collecter le maximum de données. Les besoins en données sont anticipés et ouverts aux analyses exploratoires afin de pouvoir effectuer des analyses sur des paramètres qui n’auraient pas été anticipés. Les chirurgies cardiaques avec CEC sont réalisées par des chirurgiens cardiaques humains, avec le support d’un perfusionniste, permettant de rafiner le protocole chirurgical selon les standards cliniques.

Choix des espèces

Le choix du mini-porc est fondé sur plusieurs critères : - Modèle animal bien décrit et largement utilisé pour la chirurgie intracardiaque avec CEC avec des aspects anatomiques et un fonctionnement physiologique proche de l’homme ; des paramètres hémato-biochimiques comparables et dont les variations sont accessibles par des techniques de dosages similaires à celle utilisées en médecine humaine, afin d’assurer la prédictivité des résultats. - Existence d’une lignée modifiée génétique (gain de fonction de PCSK9) présentant une hypercholestérolémie. - Réponse du mini-pig à l'induction d'une diète HC en 4 semaines (doublement du taux de cholestérol) permettant de générer un modèle hypercholestérolémique, représentatif de l'Homme. - Taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie, ainsi que l’utilisation d’instruments et de matériels identiques à ceux utilisés chez l’Homme. - Le mini-porc à l’âge adulte atteint un poids minimum de 40 kg et reste maitrisé par le rationnement (environ 50-60 kg) ce qui représente un avantage comparativement au porc charcutier. Animaux adultes afin d’avoir une taille de thorax et d’aorte compatible avec l’intervention chirurgicale

Immunisés cinq à plus de seize fois par an, puis saignés jusqu'à vingt et une fois par an pour produire du sérum, 1 500 lapins, 1 000 cobayes, 30 chèvres et 30 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués une fois le titre d'anticorps et le volume de sérum jugés suffisants, après un dernier prélèvement plus important. Les anticorps polyclonaux obtenus alimentent des tests de diagnostic vendus dans le monde entier, le porteur mentionnant jusqu'à un test utilisé par seconde et un nombre d'animaux fixé par le "Donneur d'ordre". Il indique que la réaction inflammatoire au point d'injection disparaît en quelques jours et qu'aucune conséquence néfaste n'est observée ensuite, description difficile à tenir pour des animaux immunisés et ponctionnés pendant deux ans avant d'être tués.

Objectifs

L’objectif de ce projet est l'immunisation des animaux afin d’obtenir des anticorps polyclonaux. Après immunisation et prélèvement du sang, le sérum obtenu contient les anticorps polyclonaux spécifiques de l’antigène utilisé. Après purification, les anticorps servent à produire différents tests par exemple : hémostase, thrombose, infections inflammatoires, détermination des groupes sanguins (utilisés pour les transfusions et les transplantations…). Ces tests de laboratoire permettent de doser les facteurs concernés dont le déficit est responsable des troubles cliniques dans le suivi des patients en thérapie ou en postopératoire. Les tests peuvent aussi permettre de confirmer des résultats sérologiques faibles ou peu clairs avant une transfusion ou une transplantation… Les tests immunologiques produits à l’aide des anticorps polyclonaux purifiés à partir des sérums des animaux hyperimmunisés sont marqués CE, ou enregistrés IVDR pour l’Europe, ou FDA (510(k)) pour les USA, ainsi que dans les systèmes règlementaires de la majorité des pays, afin de pouvoir les utiliser dans les hôpitaux pour le diagnostic et le suivi des pathologies. Le projet est principalement à visée humaine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la production d’anticorps polyclonaux, sont la mise à disposition des laboratoires hospitaliers et cliniques de tests diagnostiques performants et précis, utilisant directement ou indirectement la technologie immunologique. L’utilisation du processus d’immunisation sur animaux permet d’obtenir des anticorps polyclonaux, d’isotype IgG, reconnaissant l’ensemble de la structure de la protéine (utilisée comme antigène), avec une grande affinité, c’est-à-dire une réaction spécifique et très forte avec cette protéine. Cela permet de l’identifier, de la quantifier ou de l’extraire dans un milieu très complexe, comme le sang, tout liquide biologique (ascites, liquide céphalo-rachidien, urines, etc…), ou un lysat cellulaire. Deux applications importantes sont mises en œuvre dans le projet : a) test l’utilisation des anticorps pour la production de tests de diagnostic médical, permettant de quantifier précisément une protéine ou un anticorps dans un liquide provenant du corps humain, à des fins de diagnostic, de pronostic, ou de suivi de traitement thérapeutique. b) Extraction spécifique d’une protéine d’un milieu complexe, comme le plasma humain, afin de produire un plasma déficient en cette protéine. Ce plasma est ensuite utilisé dans des trousses de diagnostic, pour doser l’activité de la protéine concernée, apportée par le plasma à tester. Le bénéfice est très important car une faible quantité de sérum permet de fournir une très grande quantité de tests, ils sont utilisés au niveau mondial à très grande échelle (jusqu’à un test utilisé par seconde dans le monde).

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur une durée de 2 ans maximum : Prélèvements sur animaux vigiles : 1 prélèvement de sang sain. Immunisations sur animaux vigiles : 5 à plus 16 par an. Prélèvements sur animaux vigiles : 1 à plus 21 prélèvements sanguins par an pour la production sérum. Lorsque le titre des anticorps et le volume de sérum seront jugés suffisants, le protocole d’immunisation sera arrêté et les animaux euthanasiés après prélèvement d’un volume sanguin plus important.

Impact sur les animaux

L’expérience acquise avec ces protocoles permet de dire que la principale nuisance sur les animaux concerne la réponse au processus d’immunisation, qui peut induire une réaction inflammatoire au point d’injection. Cette réaction inflammatoire disparait généralement en quelques jours, et aucune conséquence néfaste n’est observée ensuite. Les autres nuisances possibles concernent la contention et l’introduction de l’aiguille sous la peau des animaux pendant le prélèvement, pouvant provoquer de l’inconfort, une sensibilité légère limitée à la durée du prélèvement. L'anesthesie a répétition chez le cobaye. Cette étape n’a pas d’autre conséquence particulière sur les animaux.

Devenir

Tout animal ayant étaient immunisés sera mis à mort car l'immunisation ne permet pas de les utiliser dans d'autre procédures.

Remplacement

A chaque fois que cela est possible, des anticorps monoclonaux produits par culture cellulaire, ou des anticorps recombinants, sont utilisés, ce qui limite le nombre d’animaux utilisés pour la production d’anticorps polyclonaux. Toutefois, les anticorps polyclonaux présentent des caractéristiques uniques par leur grande affinité vis-à-vis de la protéine utilisée pour leur immunisation, et par la reconnaissance globale des structures de cette protéine. A l’inverse, les anticorps monoclonaux ou recombinants, ne reconnaissent qu’une seule structure de la protéine, et si cette structure est affectée par une mutation génétique, la reconnaissance et perdue, et le variant n’est pas détecté. Les anticorps obtenus par immunisation des animaux permettent ainsi d’obtenir des caractéristiques uniques pour les besoins du laboratoire et la mise à disposition d’outils de diagnostic performants. Le client s'engage à faire la production in vitro lorsque cela est possible et respecte les normes réglementaires de diagnostic.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu résulte de 2 contraintes : a) Utiliser un nombre suffisant d’animaux pour réduire la variabilité inter-animaux de la réponse immunitaire. b) Utiliser le nombre requis pour obtenir la quantité de sérum suffisante pour la quantité d’immunoglobulines IgG purifiées nécessaires pour répondre aux besoins. Le nombre d'animaux utilisés correspond au minimum en fonction des volumes souhaités, définis par le Donneur d'ordre. La ré-immunisation des animaux au long terme permet de limiter le nombre d’animaux utilisés. En moyenne, nous pouvons produire 26 litres de sérum par an avec 6 moutons ou 6 caprins, 130 litres de sérum par an avec 300 lapins et 13 litres de sérum par an avec 200 cobayes.

Raffinement

Les animaux sont tous contrôlés de façon journalière, ils ont à disposition des enrichissements adaptés et variés avec des roulements périodiques si possible (Lapin: bloc de cellulose à ronger, bout de bois.../Ovins, caprins:balai, un gros ballon, sapin perchoir(tronc d'arbre).../Cobayes: petite balle, bloc de cellulose...).- Pour les lapins, les cages disposent de mezzanines et de petits trous sur les parois leurs permettant de voir et de sentir les lapins dans les cages voisines . Les prélèvements se font dans une pièce séparée des hébergements. Après chaque prélèvement les lapins sont placés dans une piscine remplie de copeaux et de balles en plastique le temps du prélèvement d’un autre lapin.- Les ovins et caprins,sont dans une bergerie qui leurs est dédiée avec accès sur 2 hectares de prairie. Ils sont hébergés dans un box recouvert de paille. L'alimentation est composée de foin, pierre à sel, graines d'orge et d'avoine. Les prélèvements se font dans une partie dédiée, séparée de l'enclos. -Les cobayes sont hébergés dans une unité indépendante dans des cages par groupes sociaux harmonieux (2ou 3) avec mise à disposition d'une maison . Après chaque prélèvement ou immunisation ils reçoivent une récompense .Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être provoqué lors des procédures avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Des isolements de quelques minutes seront appliqués le temps des immunisations. Les volumes prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations du Gircor. Un tableau d’évaluation des points limites est mis à disposition pour suivre l’évolution d’un animal qui présente des signes cliniques. (voir arbre décisionnel et critères d'arrêt des souffrances en pièces jointes). Les administrations ou les prélèvements s’arrêteront si un animal atteint un score de 3 sur la grille d’évaluation. Le dernier prélèvement est réalisé sous anesthésie générale , (excepté s' il y a contre-indication scientifique). Dans ce cas, l’animal ne se réveille pas, il est mis à mort dans la foulée du prélèvement .

Choix des espèces

Les lapins, les ovins, caprins et cobayes font partis des espèces les mieux documentées et les plus appropriées pour la production d’anticorps polyclonaux selon les recherches des donneurs d’ordres L'un des facteurs qui influence la production d'anticorps est la nature de l'immunogène utilisé (spécifique à chaque espèce). Le lapin est facile à manipuler et à prélever, il produit des volumes suffisants d'antisérum à titre élevé et à forte affinité. Les ovins et caprins ont une longue durée de vie, sont facile à manipuler et le prélèvement sanguin est facile à réaliser (veine jugulaire). La grande taille des animaux apporte un volume important d'immunsérum et réduit par la même occasion le nombre d'animaux. Les lapins ont au minimum deux mois et demi à la première immunisation et 5 mois aux premiers prélèvements. Les ovins et caprins ont au minimum trois mois à la première immunisation et 5 mois et demi aux premiers prélèvements. Les cobayes ont au minimum trois mois à la première immunisation et de 4 mois et demi aux premiers prélèvements. Cet âge à l’avantage de permettre une bonne acceptation des administrations par les animaux avec le développement d’une réaction immunitaire correcte et de permettre prélever une quantité intéressante de sang.

212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau une injection de cellules cancéreuses de la tête et du cou, puis pour certaines un anticorps trois fois par semaine pendant six semaines sur animal vigile, la croissance de la tumeur pouvant provoquer une ulcération de la peau. Le porteur écrit que le traitement administré a le potentiel d'améliorer le bien-être des animaux non-humains en réduisant la charge tumorale, tumeurs qu'il a lui-même greffées. Sur le remplacement, il indique que des études sur lignées cellulaires précèdent les expériences, mais qu'une validation sur "animal entier" reste requise pour reproduire la complexité du système immunitaire.

Objectifs

Les cancers de la tête et du cou sont la 8ème causes de mortalité attribuable au cancer dans le monde. De nouveaux types de traitements faisant appel à des anticorps ciblant le système immunitaire se sont montrés efficaces dans d’autres types de cancers mais n’ont pas encore fait leur preuve pour les cancers de la tête et du cou. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré dans le cancer du foie que notre anticorps pouvait réduire la taille des tumeurs, influencer le système immunitaire et améliorer les thérapies ciblant ce dernier à la fois chez l’homme et la souris. L’objectif de notre projet est d’étendre nos recherches aux cancers de la tête et du cou afin d’évaluer l’efficacité de notre anticorps dans ces cancers.

Bénéfices attendus

Les cancers de la tête et du cou sont un grave problème de santé public. Dans les cas les plus avancés, ils répondent très mal au traitements traditionnels et l’immunothérapie n’est efficace que chez un groupe restreint de patients. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et potentiellement la survie de très nombreux malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres maladies.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 3 fois par semaine pendant 6 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute. Les animaux anesthésiés subiront un prélèvement de sang unique, d'une durée de 1 minutes.

Impact sur les animaux

Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection, ou de l’inflammation. La contention des animaux peut engendrer un stress. Par ailleurs, le traitement administré a le potentiel d’améliorer le bien-être des animaux en réduisant la charge tumorale.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons prévu de procéder à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation sur animal entier permettant de reproduire la complexité du système immunitaire avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement