Procédures modérées

Trois séances de contention sous lumière vive par jour, trente minutes chacune, six jours de suite pendant la gestation, voilà ce que subissent une partie des 1 442 souris de ce projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent des pansements posés sur le dos sous anesthésie deux fois par semaine pendant trois semaines et des injections intrapéritonéales aux jours embryonnaires 7,5 et 10,5. Le porteur écrit que le modèle murin reste un "élément clé et incontournable" pour étudier l'effet du stress prénatal sur l'inflammation de la peau, faute de modèle cellulaire équivalent. Les mâles reproducteurs seront transférés à d'autres équipes, les femelles gestantes tuées à E18.5 ou après le sevrage, et les fœtus prélevés puis tués pour analyse.

Objectifs

Influencés par une variété de facteurs environnementaux, les maladies allergiques connaissent une augmentation constante de leur prévalence à l'échelle mondiale, tant dans les pays développés que dans les pays en voie de développement. D'une façon intéressante, ces maladies sont souvent déclenchées ou aggravées par le stress chronique, bien que les données biologiques expliquant ces phénomènes restent largement incomplètes. Notre projet a donc pour objectif d'examiner l'effet du stress sur la susceptibilité à développer une inflammation allergique, et le cas échéant, de dévoiler les mécanismes moléculaires responsables de cet effet. En effet, la période prénatale est une période critique durant laquelle tous les systèmes physiologiques, y compris les systèmes nerveux et immunitaire, développent leurs fonctions spécifiques et apprennent à s'adapter aux éventuels stimuli déclencheurs. Nous avons récemment mis en évidence l'existence de ce qu'on appelle 'unités sensorielles' dans la peau, formées par les mastocytes (cellules immunitaires spécialisées) et les neurones sensoriels (responsables de la détection de stimuli sensoriels), qui contribuent au développement de l'inflammation allergique de la peau. Nous éméttons donc l'hypothèse que le stress, plus particulièrement le stress prénatal, pourrait contribuer au développement de l'inflammation de la peau de la descendance in utero, en perturbant, au moins en partie, les phénotypes des mastocytes et des neurones sensoriels, et donc les unités fonctionnelles neuro-immunes cutanées associées.

Bénéfices attendus

Le présent projet aborde une question clé en explorant le rôle de l'exposition du fœtus au stress prénatal et ses conséquences sur la susceptibilité à développer une inflammation après la naissance. Il permettra de dévoiler, pour la première fois, les mécanismes biologiques sous-jacents activés par l'exposition au stress. Cela apportera des informations inestimables sur d'éventuels événements indésirables prénataux associés au développement des caractéristiques classiques de l'eczema pédiatrique, donnant lieu à des publications de haut niveau, protégées par des brevets découvertes et, surtout, de nouvelles options thérapeutiques/préventives potentielles pour les troubles allergiques.

Procédures

- Procédures 1/3: Les souris seront mises en stress de contention sous une lumière vive, 3 fois par jour durant 30 minutes, sur 6 jours consécutifs. Nombre de souris: 140 (P1)+162 (P3) = 302 - Procédure 2: Un pansement imbibé d'une solution physiologique sera déposé sur le dos des souris, sous anésthésie, 2 fois par semaine (lundi et mercredi, 3-5min par souris), pour une durée de 3 semaines (3 cycles au total). Nombre de souris: 504 - Procédure 4: Les souris seront injectées au jour embryonnaire 7.5 ou E10.5 en intra-péritonéal (~1min/souris). Nombre de souris: 360 - Procédure 5: Les souris seront injectées en intra-péritonéal avant chaque session de stress (~1min/souris), voir trois fois par jour, sur 6 jours consécutifs. La génération F1 sera patchée (3-5min par souris). Nombre de souris: 276

Impact sur les animaux

Dans le projet proposé, les souris subiront des procédures de classe modérée qui pourraient avoir des effets indésirables ou des nuisances. Les principales nuisances attendues sur les animaux incluent: (1) comportements anormaux liés au stress comme la prostration, isolement, absence de nettoyage (bien que nous n’ayons pas observé de nuisance qui perturberait le comportement soit de la souris stressée, soit de la descendance dans les expériences que nous avons déjà faites en accord avec le protocole éthique précédent utilisant ce modèle); (2) Irritation cutanée due à l'application du patch: l'application de patch peut causer une légère gêne cutanée, une irritation temporaire sur la zone d'application et une légère inflammation; (3) Les injections pourraient causer une douleur passagère au site d'injection et un stress modéré due à la manipulation répétée. Ces effets indésirables vont être soigneusement surveillés et gérés pour minimiser l'impact sur le bien-être des animaux, en appliquant les mesures de raffinement appropriées décrites dans la section 5.10.3.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure correspondante: - Les souris mâles utilisées pour les accouplements seront séparées et proposées à la communauté scientifique. - Les souris femelles utilisées pour les accouplements et subissant le stress seront euthanasiées ou bien au jour embryonnaire E18.5 ou bien après le sevrage (semaine 3). - Les souris de la descendance seront euthanasiées à E18.5 ou à la semaine 8 avant toute intervention ou après le patch.

Remplacement

Ce projet vise à identifier les mécanismes biologiques, induits par l'exposition au stress durant la gestation. Il n'existe à ce jour aucun modèle cellulaire qui peut substituer l'usage d'animaux pour investiguer cela. La substitution également par l'humain n'est pas évidente, étant donné que le niveau de stress est relatif à chaque personne (ce qui sera source de variabilité pour notre étude), et l'accès à des échantillons de foetus ou de mamans durant la gestation/ou atteints d'éczema n'est pas toujours possible. Le modèle murin est donc un élément clé et incontournable pour étudier l'effet du stress prénatal sur le dialogue entre neurone sensoriel et mastocyte dans le cadre de l'inflammation de la peau.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans le modèle de stress prénatal et de patch de peau (protocoles éthiques obtenus précedemment) et la présence de data préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne (12 femelles par groupe, par génotype, réparties entre controle et stress). Ce nombre pourra éventuellement varier à la hausse ou à la baisse (+/- 3 animaux par groupe) en fonction des résultats expérimentaux obtenus avec chaque génotype analysé pour chacun des modèles étudiés. Ces femelles seront accouplées avec 8 mâles aux génotypes correspondants, pour un rapport 2mâles x 3femelles. Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées.

Raffinement

Jusqu'à présent, le taux de mortalité issu des expériences proposées n'atteint pas les 0.1%. Quant au modèle de patch ou de stress, aucun taux de mortalité n'a été détecté jusqu'à présent. D'autre part, lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera monitoré régulièrement. Nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels que le comportement de prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si nécessaire, des antalgiques seront administrés (surtout si des effets indésirables liés au patch surviendront bien qu'aucune manipulation précédente n'a impliqué cela). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien des signes de baisse de température (isolement, mouvement moindre, confirmée par la prise de la tempéraure corporelle et détéction d'une baisse de 3° par rapport à la température d’origine), les animaux seront euthanasiés. Ces cas de figure n’ont encore pas été présentés lors des procédures employées dans d’autres protocoles éthiques déjà validés. Enfin, nous utiliserons des techniques de préhension adaptée (main en coupe ou igloo) aux souriceaux afin d'éviter un stress supplémentaire et maintenir le bien-être des souris. Les injections seront aussi réalisées par un personnel compétent pour éviter la douleur des souris. Les souris mâles mis en accouplement seront réutilisés par d’autres expérimentateurs.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines, surtout l'inflammation de la peau (taux de similarité important). En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués transgéniques, qui dans notre cas, permettront l'étude du rôle des mastocytes et des neurones sensoriels, et l'effet du stress sur ces cellules. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sont déjà disponibles dans le laboratoire. L'utilisation de méthodes alternatives (ex. avoir recours à des biopsies humaines, etc. sera d'un grand intêret mais cependant limite le projet, étant donné que les niveaux de stress sont relatifs à la personne en question, ce qui apportera une variabilité dans nos analyses. Trois stades/périodes de développement seront d'intêret durant notre projet: 1- Jour embryonnaire E13 à E18: cette période de gestation sera la période durant laquelle les sessions de stress seront conduites. Non seulement cette période est celle décrite pour le modèle, mais elle correspond également à la période de développement des cellules d'intêret, y compris les neurones et les mastocytes. 2-Jour embryonnaire E18.5: les souris gestantes seront euthanasiées et les foetus prélévés, euthanasiés et analysés pour les études à l'état basal. Ce stade représente le dernier jour du protocole de stress ainsi qu'un time-point où les neurones et les cellules immunitaires sont déjà présents dans la peau des souris. 3- Semaine 8: les souris de la génération F1 seront patchées à l'âge de 8 à 12 semaines car elles présentent un système immunitaire mature à ce stade. Le modèle de patch dure 3 semaines, les souris seront euthanasiées à la fin du modèle.

Pour savoir si des composés anti-inflammatoires limitent la mort des neurones après une lésion du cerveau, 240 poissons zèbres jeunes adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est anesthésié, son télencéphale droit est lésé sous binoculaire et le composé testé est injecté directement au site de la lésion. Le porteur relève parmi les nuisances possibles un stress, une locomotion altérée, une difficulté à s'alimenter et la mort de l'animal. Ils sont tués à 24 heures pour les groupes où l'on cherche un effet protecteur, à 72 heures pour ceux où l'on cherche un effet régénérateur.

Objectifs

Les accidents vasculaires cérébraux et lésions cérébrales (ex : traumatismes crâniens) se positionnent parmi les premières causes de mortalité et handicap acquis. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement thérapeutique permettant d’améliorer les mécanismes de récupération cérébrale et ainsi de diminuer la mortalité et le handicap. Lors d'un dommage cérébral, une neuroinflammation et un stress oxydant se mettent en place. Des molécules (lipides, acides phénoliques, protéines, complexes macromoléculaires) aux propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes sont connues pour exercer des actions neuroprotectrices en limitant l'inflammation et le stress oxydant. De plus, ces molécules peuvent aussi favoriser la plasticité cérébrale en favorisant la création de nouveaux neurones qui pourraient ainsi participer à limiter les dommages cérébraux et les handicaps qui en découlent. Le projet vise à étudier les effets d'une injection cérébrale locale de composés aux propriétés d'intérêts afin de déterminer s'ils sont en mesure de limiter la mort neuronale à la suite d'une lésion, de limiter l'inflammation, et de favoriser la neurogenèse (création de nouveaux neurones) et l'angiogenèse (création de vaisseaux sanguins). Dans, ce contexte, nous souhaitons utiliser le poisson zèbre qui est un modèle reconnu de plasticité cérébrale et de régénération du cerveau pour réaliser une lésion et injecter nos composés d'intérêts au moment de la lésion. Les sous-objectifs du projet sont de déterminer si 1) les composés limitent la mort cellulaire induite par la lésion, 2) les composés limitent la neuroinflammation, 3) les composés favorisent la régénération du cerveau en activant la neurogenèse. En résumé, le projet vise à tester le potentiel thérapeutique de différents composés lors de lésions cérébrales chez le poisson zèbre. Les connaissances qui en découlent pourraient permettre de trouver des voies thérapeutiques pour favoriser la réparation cérébrale chez le mammifère et donc chez l’Homme ayant subi un dommage cérébral (traumatismes crâniens/cérébraux, accidents vasculaires cérébraux, neurodégénérescence…).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’investiguer si ces composés à viser thérapeutiques permettent effectivement de limiter la mort neuronale et de modulet l’inflammation (recrutement des microglies) et de favoriser les processus régénératifs (angiogenèse et neurogenèse). Cela permettra à termes d'envisager le déploiement de modèles précliniques de récupération cérébrale à la suite de lésions cérébrales sur des modèles précliniques d'AVC chez le rongeur (pour les molécules les plus prometteuses) avant d’envisager des thérapies chez l’Homme qui pourrait s’appliquer aux traumatismes crâniens, désordres neurodégénératifs, accidents vasculaires cérébraux.

Procédures

L'ensemble des animaux sera anesthésié et placé sous une binoculaire pour réaliser une lésion de l'hémisphère droit du télencéphale (partie du cerveau). Les animaux seront ensuite immédiatement microinjectés avec la solution contrôle ou avec les molécules au site de lésion. Les molécules que nous injectons sont suspectées avoir une activité thérapeutique, c'est à dire diminuer la taille de la lésion et favoriser la régénération du cerveau.

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par l'animal sont - l'anesthésie - la lésion du télencéphale - l'injection concomittante à la lésion du composé ou de la solution contrôle (véhicule) sous aneshtésie. La procédure (lésion + injection) dure moins d'une minute. Le temps total d'anesthésie avant la phase de réveil est de moins de 5 minutes. Les nuisances possibles sont un stress, une locomotion altérée, une difficulté d'alimentation et éventuellement la mort de l'animal.

Devenir

A l'issue de la procédure de lésion et microinjection au niveau de la lésion, les animaux seront mis à mort à 24h ou 72h post-lésion/injection selon les groupes. Cela permettra d'étayer le possible rôle neuroprotecteur des molécules injectées (groupes 24h post-lésion/injection) et le rôle régénératif de ces dernières (groupes 72h post-lésion/injection).

Remplacement

La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de la réparation cérébrale ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de réparation impliquent plusieurs types cellulaires: microglies, cellules immunitaires, cellules endothéliales (vaisseaux sanguins) et cellules souches neurales. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de la réparation : hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation. Néanmoins, l'ensemble des composés tester ont montré des propriétés d'intérêts in vitro (ex: anti-inflammatoires, antioxydantes, ou neuroprotectrices)

Réduction

Chaque expérimentation sera scindée en deux expériences indépendantes (2 x 5 animaux par groupe voire 4 X 5 pour les contrôles). Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le deuxième groupe d'animaux. Les doses utilisées sont connues pour avoir des effets bénéfiques in vitro. D'après notre expérience et connaissance du modèle, le nombre de 5 à 10 animaux par groupe permet de pallier à l'hétérogénéité de réponses des animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés plusieurs fois par jour dans leur aquarium. Après lésion, ils seront observés de façon intensive dans les premières 30 minutes suivant la lésion/injection, puis une fois toutes les heures. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal sera assuré. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Différents points limites spécifiques tels qu'un comportement anormal (mouvements circulaires), nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), flottabilité anormale, couleur anormale seront analysés (Les animaux seront observés plusieurs fois par jour dans leur aquarium. Si un de ces paramètres ou points limites est atteint, nous en ferons part au vétérinaire pour arrêt de l’expérimentation et par conséquent euthanasie pour limiter les souffrances de l’animal (sédation profonde puis euthanasie). A noter, que les données bibliographiques et notre expérience du modèle ne rapporte pas de comportements de souffrance anormale, de modification de la prise alimentaire, du comportement locomoteur notable à la suite d'une lésion

Choix des espèces

Le poisson zèbre partage de 70 à 85 % de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement. C’est également un modèle de réparation cérébrale reconnu avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères. Stades choisis: jeunes adultes de 3 à 9 mois. A ces stades les processus régénératifs sont similaires. Cependant, nous utiliserons au sein de chaque expérience des animaux du même âge pour pallier à toute hétérogénéite.

Une perte de poids supérieure à 20 %, une hyperventilation, une perte de poils, un isolement social ou une baisse d'activité en cage font sortir la souris du protocole. 1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 840 d'entre elles subissent une trachéotomie d'une vingtaine de minutes pour mesurer leur fonction pulmonaire et prélever un lavage broncho-alvéolaire, 320 des prises de sang à la queue ou à la joue, après deux à quatre semaines d'instillations nasales d'extrait d'acarien. Le porteur cherche à décrire le comportement de certaines cellules immunitaires dans le poumon asthmatique et ne situe qu'à long terme d'éventuelles retombées thérapeutiques.

Objectifs

Ce projet se focalise sur le rôle des populations immunitaires localisées aux interfaces épithéliales des bronches en conditions physiologiques et en conditions inflammatoires. L’inflammation asthmatique se caractérise par l’activation et le recrutement (local et périphérique) de cellules immunitaires connues pour provoquer des altérations physiologiques au niveau des parois bronchiques suite à une stimulation par des allergènes inhalés. Afin de comprendre la régulation de la réponse immunitaire médiée par ces cellules dans un contexte inflammatoire, les souris sont mises dans des conditions d’induction d’asthme allergique via une exposition à différents extraits d’allergènes comme la papaïne et l’extrait d’acarien (House Dust Mite, HDM), et des molécules stimulantes (IL-33). Ainsi nous étudierons les modifications à court-terme (induites par la papaïne et IL-33) et à long-terme (induites par le HDM) du comportement des cellules immunitaires. Nous effectuerons plus particulièrement des études sur l’activation, la prolifération, la motilité, et les altérations morphologique de ces cellules immunitaires au cours de l’inflammation. Ces études permettront de déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires orchestrés par ces cellules immunitaires, en plus des modifications physiologiques observées.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au cours de l’inflammation du poumon dans un contexte d’asthme allergique. À court terme, ce projet permettra d’établir les différences de comportement des cellules immunitaires en inflammation dans différentes lignées de souris génétiquement modifiées, engendrées par les différents modèles d’induction d’asthme. Les résultats de ce projet devraient communiquer la nature des mécanismes moléculaires et cellulaires entre certaines protéine et cellules immunitaires dans le poumon asthmatique. Cela permettra de déterminer si ces mécanismes contribuent à la progression vers une pathologie chronique, ou à un rétablissement à l’homéostasie. À long terme, ces résultats pourraient participer à de futures recherches sur des stratégies thérapeutiques ciblées contre ces mécanismes moléculaires, afin de lutter contre l’exacerbation de l’inflammation et d’atténuer les dommages physiologiques, au vu de l’impact important de cette maladie en santé publique.

Procédures

Les interventions prévues sont les suivantes : 320 animaux subiront des prélèvements sanguins venant de la veine caudale latérale ou de la veine submandibulaire. 840 animaux subiront une procédure chirurgicale (maximum 20 minutes) permettant d’accéder à la trachée afin d’effectuer des trachéotomies pour les mesures de fonctions pulmonaires et ensuite prélèvements de lavage broncho-alvéolaires.

Impact sur les animaux

La stimulation par certaines molécules en 3 jours consécutifs peut induire une inflammation des poumons à court-terme. Le modèle d'instillations intranasales d’extrait d’acarien sera appliqué pour une plus longue durée allant à 2 semaines dans certaines expériences pour simuler une inflammation asthmatique aigüe, et à 4 semaines dans d’autres expériences afin d’induire une chronicité. Ces inflammations des voies respiratoires peuvent provoquer les nuisances suivantes : des irritations et constrictions aux niveau des bronches, et possiblement une augmentation du rythme respiratoire. Nous nous attendons donc à ce que les animaux utilisés dans ce projet présentent un rythme respiratoire augmenté à l’œil nu. Mis à part cette nuisance, la littérature ne décrit pas d’autres signe de nuisance apparente, Il n’y aucune difficulté d’alimentation/d’abreuvement, ni de mortalité causée par l’inflammation pulmonaire induite par ces modèles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés à pour un accès à leurs organes et à l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.

Remplacement

La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossibles à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront néanmoins entreprises en culture 2 dimensions afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique d’inflammation car les effets des modèles d’asthme allergique sont déjà décrits dans la littérature. Par exemple, nous savons que les changements de comportement des cellules immunitaires ne sont à tester qu’à partir de 24 heures après la dernière instillation de la molécule testée. Les mécanismes moléculaires et cellulaires, ainsi que leurs modulations ne seront analysés qu’à des points de temps précis où des différences significatives des populations immunitaires sont détectées. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire, ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement après la validation des altérations de mécanismes moléculaires impliqués dans les changements de comportement des cellules immunitaires (prolifération, activation, motilité) chez les souris génétiquement modifiées, une étude du blocage des molécules concernées se fera par l’injection de molécules inhibitrices. Ainsi, nous vérifierons dans les organes cibles si les molécules bloquées avaient un effet favorisant ces changements de comportement. L’application de ces molécules bloquantes uniquement dans le cas d’une prolifération/ activation/ motilité statistiquement significative permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste. Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’analyser les différents organes pour les populations immunitaires.

Raffinement

Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences. Certains seront évalués pour leurs capacités respiratoires et leurs sérologies à des points de temps spécifiques. Une fiche d’observation tout au long des conditions permettra de vérifier leur état (pelage, poids, interactions, mobilité) et des scores seront tenus afin de vérifier que les modèles décrits n’induisent pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis : perte de poids importante (>20%), hyperventilation, modification d’état du pelage/alopécie, isolement social, et diminution de l’activité dans les cages. Le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de diminuer la dose des stimulants et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Dans le cas des anesthésies par voie gazeuse, nous veillerons à chauffer les animaux anesthésiés à l’aide d’un tapis chauffant lors des inoculations intranasales. Nous appliquerons également du gel hydratant sur les yeux des animaux anesthésiés afin d’éviter les dessèchements. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.

Choix des espèces

La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. En outre, il existe un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiés dont l’utilisation permettra la réalisation d’études sur les dynamiques et mécanistiques des cellules immunitaires impliquées dans l’asthme allergique. Le détail du nombre de souris dans chaque procédure est décrit dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte, et la mise en place des modèles d’induction de l’inflammation asthmatique débutera à 6 semaines. Dans une de nos procédures, nous analyserons l’effet de l’inflammation asthmatique à partir de 14 jours (2 semaines). Ces âges ont été retenus comme les plus significatifs pour observer la mise en place et le suivi de l’inflammation allergique des voies respiratoires chez la souris. De plus, comme le modèle HDM se pratique sur 4 semaines dans certaines expériences, les souris doivent être analysées à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après les inoculations intranasales et que l’on ne se situe pas sur l’interprétation d’un facteur de vieillissement.

Chaque rat reçoit une seule molécule par une seule voie, soit dix injections sous la conjonctive en un mois, soit six injections dans le vitré étalées sur six mois, soit une injection unique sous la rétine. 3 000 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'électrorétinogramme final dure quarante minutes, avec des électrodes plantées sous la peau des joues et du bas du dos et des lentilles posées sur l'œil, après une nuit passée dans le noir. Le porteur estime que dix rats traités et dix témoins suffisent par molécule, et retient le rat parce que la taille de son cristallin rend l'abord chirurgical de l'œil plus commode.

Objectifs

La dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) est une maladie neurodégénérative de la macula, zone centrale de la rétine où sont concentrés les photorécepteurs à cônes. Ces derniers sont indispensables à la vision fine, des couleurs et du contraste. S’ils dégénèrent, le sujet perd l’information visuelle centrale. La DMLA est la première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays développés. Il existe deux formes de DMLA : sèche et humide. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement curatif efficace pour la forme sèche, qui représente 80 pourcents des cas de DMLA. De nouveaux traitements sont actuellement en essai clinique. Ces traitements sont des antioxydants (vitamine E) ou agissant sur le système immunitaire, mais aucun de ces traitements ne cible spécifiquement le mécanisme de mort cellulaire des photorécepteurs. Ainsi, le but de ce projet est de trouver des molécules protégeant les photorécepteurs à cônes de la dégénérescence. Avant de passer sur un modèle vivant, des tests préalables in vitro (photorécepteurs en culture et explants de tissu rétinien) ont été réalisés pour évaluer les effets neuroprotecteurs potentiels de certaines molécules. Les molécules qui ont démontré un sauvetage des photorécepteurs à cônes ont été sélectionnées. Ces molécules seront testées in vivo sur différents modèles de rat présentant une dégénérescence de la rétine, et seront administrées selon différents modes d’injections oculaires déjà pratiqués en clinique. En fin de traitement, un examen électrorétinographique sera réalisé afin de mesurer l’activité des photorécepteurs à cônes après un stimulus lumineux. La réponse obtenue à cet examen permet une première évaluation de l’éventuel effet neuroprotecteur sur les cônes in vivo. Suite à cet examen, les animaux seront euthanasiés et les yeux prélevés afin de corréler les résultats du premier examen avec une analyse histologique des photorécepteurs à cône ex vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’identifier des molécules qui préviennent la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Si une ou plusieurs molécule(s) sont identifiée(s), un traitement pourra ensuite être envisagé pour soigner les millions de patients atteints de dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), de rétinopathie pigmentaire autres dystrophies rétiniennes.

Procédures

Etape 1 : administration des molécules Nous allons administrer des molécules aux rats, par différentes voies oculaires selon leur pharmacologie. Chaque animal se verra administrer 1 seule molécule par 1 seule voie d’administration au cours de la procédure. -Collyres (sans anesthésie, animal vigile) : 1 goutte 1 à 3 fois par jour en fonction des molécules, pendant 3 mois -Injection sous-rétinienne : sous anesthésie générale, 1 seule injection par animal (durée de la procédure chirurgicale : 15 minutes) -Injection supra-choroïdienne : sous anesthésie générale, 1 seule injection par animal (durée de la procédure chirurgicale : 10 minutes) -Injections intravitréennes : sous anesthésie générale, 1 injection mensuelle pendant 6 mois (soit 6 injections au total par animal) (durée de la procédure chirurgicale : 10 minutes) -Injections sous-conjonctivales : sous anesthésie générale, 1 injection tous les 3 jours pendant 1 mois (soit 10 injections au total par animal) (durée de la procédure chirurgicale : 5 minutes). Suite aux administrations, un examen électrorétinographique (fonctionnement de la rétine sur animal vivant) sera réalisé, sous anesthésie générale, après mise en chambre noire pendant 1 nuit. Etape 2 : électrorétinogramme Des électrodes seront placées lors de l’électrorétinogramme en sous-cutané dans les joues et dans le bas du dos du rat comme prise de terre. Des lentilles cornéennes placées sur l’œil de l’animal enregistreront les réponses rétiniennes. Les électrodes sous cutanées se retirent comme une aiguille. La durée d’un examen électrorétinographique est de 40 minutes par animal. Suite à cet examen, l’animal sera directement euthanasié par une méthode règlementaire, puis des prélèvements oculaires seront réalisés.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir de la peur/détresse au moment des injections intra-péritonéales d’anesthésiants. Les animaux subiront un stress physique/thermique au moment des interventions chirurgicales. Dans les suites post-opératoires, une douleur oculaire du côté de l’intervention pourra survenir et la vision pourra être altérée, pendant quelques jours au maximum.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, par une méthode réglementaire, puis les yeux seront prélevés pour permettre des analyses histologiques complémentaires.

Remplacement

Les molécules qui seront administrées in vivo ont préalablement été sélectionnées in vitro sur cultures cellulaires et explants de rétines de porc. Ces modèles présentent une dégénérescence des photorécepteurs à cône. Grâce à ces modèles, nous avons sélectionné des molécules ayant une double action : 1) de protection contre la mort cellulaire et 2) de préservation de la structure des photorécepteurs à cône. La fonctionnalité des photorécepteurs ne peut quant à elle être évaluée uniquement sur un modèle vivant permettant un abord thérapeutique local facilement accessible et contrôlable (œil de rat). Dans le cas présent, les tests seront effectués sur un modèle de rat présentant des signes de dégénérescence similaires à celui de l’homme, induite ou congénitale.

Réduction

Dans un souci de réduction, nous avons établi préalablement à l’étude la taille des effectifs utilisés grâce à un calcul de puissance. Nous estimons ainsi que 10 rats traités et 10 rats contrôles seront suffisants. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet. Toujours dans un esprit de réduction, nous regrouperons les témoins pour les molécules ayant le même véhicule si les expérimentations ne sont pas trop asynchrones. Au total, 3000 animaux seront nécessaires à notre étude sur 5 ans.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton pour le nid, rouleaux en carton), alimentation et abreuvement à volonté. Pour la réalisation des injections oculaires et des électrorétinogrammes, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale associée à une anesthésie locale appliquée directement sur le site opératoire (œil). Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant la procédure. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les rats seront placés sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’intervention et en chambre thermostatée de 32 degrés Celsius jusqu’à leur réveil complet. Une nouvelle aiguille stérile sera utilisée pour chaque animal afin de limiter la douleur induite lors des injections. Les animaux seront réveillés de l’anesthésie par administration d’un antidote en fin d’intervention. Nous appliquerons une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne suite aux injections intra et péri-oculaires et à l’électrorétinogramme. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les rats resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (coton pour le nid, rouleaux en carton), ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière pour les animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale.

Choix des espèces

L’anatomie oculaire chez le rat (notamment taille et volume du cristallin) est beaucoup plus favorable à un abord chirurgical pour délivrance intra- et péri-oculaire des molécules testées, permettant de réduire le nombre d’animaux et d’expérimentations étant donné une diminution du nombre d’échecs. Nous utiliserons des rats chez qui nous induirons une dégénérescence rétinienne et d’autres présentant une dégénérescence congénitale. Les administrations oculaires seront réalisées entre le 6ème et la 8ème semaine de vie pour les rats chez qui nous induisons la dégénérescence. Les administrations oculaires chez les rats avec dégénérescence congénitale auront lieu entre P21 et P45 ou entre 1 et 8 mois de vie en fonction de la lignée (âges respectifs correspondant à la dégénérescence des cônes dans ces modèles).

Tous tués sous anesthésie à la fin du projet pour une autopsie des reins, 20 cochons d'environ 3 mois vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent, une ou deux fois selon les groupes et sous anesthésie générale de 1 h 30 à 2 heures, un vecteur viral de thérapie génique injecté dans un ou deux reins par un urétéroscope souple passé par les voies urinaires. S'y ajoutent quatre à cinq prises de sang sous sédation, une injection intramusculaire par semaine et des comprimés quotidiens d'un traitement immunorégulateur, pendant trois à quatre semaines. Le porteur juge cette validation "indispensable" à un futur dossier d'essai clinique, présente le porc comme "la seule espèce" adaptée et décrit l'étude comme "qualitative", sans analyse statistique. Il choisit l'urétéroscopie parce que "cette voie n'est pas invasive", pour un acte mené sous anesthésie générale jusqu'à deux heures.

Objectifs

--- La cystinurie est une maladie rénale qui aboutit à l’insuffisance rénale suivies de dialyse/transplantation. Bien que l'incidence de la cystinurie soit faible (≈1/7000), les calculs de cystine sont très récurrents et entraînent une morbidité importante : interventions chirurgicales fréquentes et lésions rénales dans près de 80% des cas. La précipitation de cystine est la seule manifestation de cette maladie rare, qui se traite par des mesures diététiques visant à obtenir des urines non sursaturées en cystine. Une information du patient et un suivi diététique pour réduire les aliments riches en méthionine, à boire >3L/j. Malheureusement, malgré un régime diététique efficace, plus de 85% des patients récidivent. Il existe des traitements médicamenteux qui visent à modifier la cystine urinaire pour la rendre incapable de former des cristaux mais, ces médicaments sont associés à des effets secondaires. --- Dans le contexte du développement thérapeutique de maladies rares, et notamment rénales, nous avons identifié un vecteur viral de thérapie génique qui permet le transfert de gène dans les parties malades du rein grâce à une injection dans les voies urinaires, en direction des reins. Dans le cadre d’une preuve de concept, le mode opératoire pour une telle administration a été réalisé chirurgicalement. Nous souhaitons dès lors, nous pencher sur des indications thérapeutiques et commencer par explorer l’usage atraumatique de la voie endourologique, c’est-à-dire en passant par les voies naturelles. Ceci est rendu possible par l’utilisation d’un urétéroscope flexible (endoscope souple, fin, équipé d’une microcaméra et d’instruments à son extrêmité) ammené jusqu’au centre des reins pour délivrer le vecteur de thérapie génique. Cette méthode est cliniquement pertinente et peut-être réalisée en ambulatoire – couramment utilisée en clinique pour détruire des calculs ou retirer des tumeurs rénales. Cette validation préclinique est indispensable pour la constitution à terme d’un dossier d’essai clinique de thérapie génique et nécessitera donc l’utilisation du modèle porc étant donné la similitude anatomique des voies urinaires avec l’Homme. En conclusion, notre projet repose sur l’usage du porc pour la validation du protocole d’administration en vue de la constitution d’un dossier d’essai clinique de thérapie génique dans une indication en néphrologie.

Bénéfices attendus

****Opportunités thérapeutiques : La confirmation que l’emploi d’un urétéroscope flexible permet d’atteindre ces résultats ouvrirait de multiples opportunités pour traiter un ensemble important de maladies rénales originaires du néphron, tels que la cystinurie ou encore la polykystose rénale. ****Sécurité thérapeutique : éviter les effets secondaires : La validation de la méthode d’administration par urétéroscope permet de concentrer le vecteur de thérapie génique dans l’organe cible (ici les reins) limitant ainsi la circulation sanguine et les effets secondaires comme ont pu en être observés dans le cas de thérapies géniques contre la myoptahie de Duchenne par exemple. ****Mode d’administration raffiné : une fois validée l’administration par les voies naturelles offrira aux patients un traitement rapide, non invasif, précis et ne nécessitant pas d’hospitalisation.

Procédures

Sur la durée du projet, les animaux subiront les interventions suivantes : -4 à 5 prises de sang (selon les groupes d’animaux) sous sédation ce qui représente une injection intramusculaire du sédatif d’une durée de moins d’une minute. La prise de sang dure environ 2 minutes. La sédation complète dure environ une demi-heure. -Un traitement immunorégulateur (pour éviter le rejet de la thérapie génique) qui se présentera sous la forme d’une injection intramusculaire par semaine (durée moins d’une minute) et de la prise de comprimés quotidienne qui seront mélangés à un aliment ou une boisson appétente. -1 à 2 procédures d’administration de vecteur de thérapie génique (selon les groupes d’animaux) qui se déroulent sous anesthésie générale. L’anesthésie inclut une injection intramusculaire pour la sédation (durée de moins d’une minute). L’animal est ensuite inconscient pour le reste de la procédure. La procédure totale sous anesthésie dure entre 1h30 et 2h, selon qu’un seul rein ou deux sont traités. -A la fin du projet (au bout de 3 à semaines selon les groupes) : les animaux feront l’objet d’une dernière anesthésie générale (injection intramusculaire de moins d’une minute), la suite de la procédure se déroule sous anesthésie générale. Au cours de celle-ci une chirurgie sera réalisée afin de réaliser des prélèvements d’organes. L’animal sera ensuite mis à mort, toujours lors de cette anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La plupart des actes se dérouleront sous sédation ou sous anesthésie générale. Ainsi, les cochons vont recevoir une injection de sédatif en intramusculaire. Nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible. Lorsqu’une anesthésie est prévue, sous sédation, un cathéter intraveineux sera posé sur une veine de l’oreille, l’animal étant profondément sédaté, il n’y a que peu de réaction à cet acte qui dure environ une minute. La suite de la procédure se déroule sous anesthésie générale maintenue par un respirateur fiable permettant de nous assurer de l’absence de toute souffrance. Pour les injections intramusculaires du traitement immunomodulateur, là aussi, nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible. La prise de comprimés ne présente pas de contrainte pour les animaux grâce au mélange dans un aliment ou une boisson appétente.

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort en fin de projet car une autopsie doit être réalisée afin d’étudier l’effet de la thérapie génique sur les reins post mortem.

Remplacement

Compte tenu que le but du projet est de démontrer l’emploi d’un urétéroscope flexible pour délivrer un vecteur viral de thérapie génique par les voies naturelles, il ne peut y avoir d’alternative à l’usage d’un modèle animal. Après administration intra-rénale du vecteur de thérapie génique, il sera nécessaire de maintenir l’animal en vie afin de pouvoir évaluer le niveau et la distribution de l’expression du gène transféré. Ainsi, nous ne pourrions substituer l’utilisation d’un animal vivant.

Réduction

****Stratégie de réduction: Ce projet se découpe en une Phase pilote incluant 6 porcs suivie d’une Phase de Consolidation incluant 14 porcs. La Phase Pilote aura la particularité d’injecter les 2 reins d’un même animal permettant ainsi de diviser le nombre d’animaux par 2. En fonction des résulats obtenus à l’issue de la Phase Pilote, la Phase de Consolidation n’injectera qu’un seul rein sur les deux afin de disposer d’un rein contrôle non exposé au vecteur de thérapie génique. Cependant, compte tenu qu’au cours de la Phase Pilote, les injections seront restreintes soit à la partie supérieure soit inférieure du rein, il est possible que le pôle rénal non directement exposé puisse servir de tissu contrôl interne. Auquel cas, là également, nous pourrons exploiter les 2 reins chez un même animal et ainsi diviser le nombre total d’animaux par 2. Il faudra donc attendre l’issue de la Phase Pilote avant de pouvoir décider la meilleure option pour promouvoir la Réduction du nombre d’animaux. ****Statistiques: cette étude ne prévoit pas d'analyse statistique des résultats. Il s'agit d'une étude qualitative qui est destinée à tester quelques paramètres d’injection car nous sommes en mode exploratoire. Une fois nous aurons identifiés les paramètres et conditions clés, une seconde session incluera des ‘n’ plus conséquent pour confirmer et valider les conditions optimales d’injection.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les porcs sont réceptionnés au sein de l’animalerie où ils sont acclimatés et hébergés en groupe sociaux dans de larges box enrichis de jeux à mâcher et de balles, avec des conditions d’ambiances contrôlées. Ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses facilite les interactions avec les soigneurs et réduit leur stress lors des manipulations. Un programme musical apaisant est diffusé pour couvrir les bruits d’ambiance aversifs. Conditions expérimentales : L’urétéroscopie par les voies naturelles est justement choisie comme méthode d’administration des vecteurs de thérapie génique car cette voie n’est pas invasive. En effet, en clinique humaine, l’urétéroscopie ne nécessite pas de prise en charge particulière après l’examen. De plus, cet examen mobilisera l’intervention d’un urologue spécialisé dans cette pratique chez des patients humains mais également lors d’enseignements sur des porcs pour former des chirurgiens à cette abord chirugical non-invasive. Les animaux sont anesthésiés et recevront des analgésiques pour toutes les procédures et ils font l’objet d’un suivi au réveil afin de s’assurer qu’ils ont bien récupéré de leur anesthésie. Nous travaillerons de manière aseptique (matériel stérile, à usage unique ou stérilisable, champs stériles, tenue stérile de l'opérateur et du chirurgien, désinfection cutanée et des muqueuses) afin de pouvoir éviter les risques infectieux et garder en vie pendant 3 à 4 semaines l’animal injecté sans que sa fonction rénale et son état général n’en soit affectés. L'usage d'une antibiothérapie de couverture en peropératoire et posopératoire immédiat permettra également d'éviter les risques infectieux. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance.

Choix des espèces

Afin que l’étude que nous proposons ait une pertinence forte pour ensuite déposer un dossier de demande d’essai clinique aux agences réglementaires ad hoc, l’espèce animale doit permettre d’évaluer précisément la procédure d’administration du traitement avec un équipement identique et un protocol adapté à celui déjà utilisé chez les patients humains. Il faut également que l’anatomie de l’espèce animale et de l’organe ciblé soient similaires à l’homme. Le porc est donc la seule espèce qui nous permettra une validation préclinique de la procédure d’injection. Des porcs de 3 mois environ (soit 40-50 kg) seront utilisés. A ce stade de développement, le système urinaire du porc est très proche de celui de l’humain tant du point de vue anatomique que du point de vue de sa taille, permettant ainsi de se positionner dans les mêmes conditions que celles de la thérapie chez l’Homme.