Procédures modérées

Pour vérifier si le microbiote intestinal de patientes anorexiques oriente les préférences alimentaires, 252 souris reçoivent par gavage des selles humaines transplantées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour l'étude de leurs tissus. Chaque animal subit six prélèvements sanguins sur animal vigile, un régime riche en fibres qui fait perdre du poids, un hébergement individuel et huit tests comportementaux, les 126 femelles recevant en plus trente-six frottis vaginaux. Le porteur signale un risque de traumatisme de l'œsophage lié au gavage et un risque d'anémie lié aux prises de sang, et renvoie à des points limites dont il ne dit pas lesquels.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est un trouble des conduites alimentaires (TCA) qui touche jusqu’à 3.6% de la population féminine et dont le taux de mortalité est élevé. Il s’agit d’une maladie psychiatrique chronique qui se caractérise par une restriction alimentaire volontaire, une peur intense de devenir gros alors que le poids est faible et par une perturbation de l’image de son propre corps. La restriction alimentaire est qualitative et quantitative avec une aversion intense pour les lipides et les glucides et une alimentation très riche en fibre et pauvre en protide. Les causes exactes de l’anorexie mentale restent encore mal connues. Il a été mis en évidence la présence d’un déséquilibre du microbiote intestinal chez les patients AM. Ce déséquilibre pourrait être secondaire à la restriction alimentaire, mais aussi responsable de la préférence alimentaire et donc jouer un rôle majeur dans la persistance des symptômes chez les patientes souffrant d’une forme chronique de la maladie. Dans ce projet de recherche, nous émettons l’hypothèse que la préférence alimentaire particulière de l’anorexie mentale est déterminée par l’environnement microbiotique intestinal. L’objectif de l’étude est de mettre en évidence une différence de préférence alimentaire entre les groupes mimant l’anorexie mentale et les sujets sains pour répondre à la l’hypothèse que le microbiote dans patients atteints d’anorexie mentale les pousse à préférer manger des aliments végétaux. Cette étude permettra aussi de montrer le transfert de symptômes de l’anorexie mentale touchant de nombreux organes à travers le microbiote.

Bénéfices attendus

L’étude permettra la validation du modèle de l’anorexie mentale par transfert de microbiote fécal, d’améliorer la compréhension de la physiopathologie de l’anorexie mentale, de la compréhension des mécanismes d’influence microbiote/hôte.

Procédures

Tous les animaux vigiles seront gavés 4 fois soit au total. La contention et le gavage sont réalisés en moins de 10 secondes. Prélèvement de selles : 252 animaux 3 prélèvements par animal seront réalisés. Réalisé après émission naturelle. Durée 1 minute. Prélèvement sanguin : 252 animaux Les prélèvements seront réalisés sur animaux vigiles. Chaque prélèvement dure en moyenne 10 secondes, pour un nombre total de 6 prélèvements par animal soit au total 1 minute de prélèvement sanguin par animal. Prélèvement d’urine : 252 animaux Emis naturellement sur animal vigile. Durée du recueil : 10 secondes, 1 fois au cours du protocole. frottis vaginaux : 126 animaux Réalisation de frottis vaginaux chez les groupes d’animaux femelles. 36 prélèvements par animal durée du recueil 10 secondes. 252 animaux subiront 1 fois chaque test comportemental pour une durée totale de 40 min. Ceci porte le nombre de tests à 8 par animal. La durée cumulée d’épreuves comportementales sera de 145 min sur 6 semaines. Pour 252 souris. Injection sur animal vigil d’une durée de 5 secondes. Soit 1 injection par animal.

Impact sur les animaux

Gavage oral : Risque de traumatisme de l’œsophage lors de la manipulation. Hébergement individuel : Stress induit par l’isolement du fait des caractéristiques communautaires de l’espèce non satisfaites. Régime : perte de poids lié au régime riche en fibre. Prélèvements sanguins: douleurs et stress induit par la prise manuelle et la piqure et la coupure effectuée par la lancette. Les prélèvements seront tous espacés d’un minimum de 7 jours. Risque d’anémie lié aux prélèvements sanguins. Injections: Douleur liée à la piqure et l’injection de liquide Lavage vaginal : stress lié à la prise par la queue et le lavage. Tests comportementaux : induction d’un stress volontaire par la mise en conditions expérimentales. Mise a jeun une fois d’une durée de 4h et une fois d’une durée de 6h. Stress lié à la privation d’aliment dans l’environnement Prélèvement d’urine : émission naturelle, stress lié au placement en pot de recueil

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour l’étude scientifique des tissus

Remplacement

Notre projet nécessite l'utilisation d'animaux de laboratoire car il n'existe pas de techniques actuellement satisfaisantes et éthiques pour étudier le retentissement à un niveau physiologique du déséquilibre bactérien intestinal chez l’humain et ses effets sur la physiologie de l’intestin et le comportement alimentaire. Les techniques in vitro permettent des études à des échelles microscopiques (interactions au sein d’un tissu) mais non à l’échelle globale de l’organisme, ne permettent pas des études d’un point de vue comportemental. Les techniques d’études in silico ne sont pas applicables à l’échelles des interactions microbiote hôte d’un point de vue comportementale et physiologique car les connaissances ne sont actuellement pas assez développées pour créer des modèles informatiques prédictifs.

Réduction

Le nombre d’animaux destiné au projet a été estimé au regard d’une étude autorisée précédemment, et afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons.

Raffinement

Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue dans les suites de la transplantation de microbiote fécal sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Afin de limiter le stress associé à l’hébergement individuel les cages sont transparentes, permettant un contact visuel et olfactif avec les congénères, et enrichies (papier à déchiqueter, matériel de nidification et bâton à ronger). Les points limites déterminés seront appliqués par les expérimentateurs en cas de constatation de leurs manifestations.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris qui est une espèce de référence et un modèle très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. Les souris seront des jeunes adultes âgés de 6 semaines au début de l'expérience. Ceci est nécessaire pour être au plus proche des conditions de maladie chez l’homme qui débute au jeune âge adulte.

De l'alcool est injecté sous la peau de souris gestantes, neuf fois entre le douzième et le vingtième jour de gestation, pour reproduire une alcoolisation fœtale. 1 921 souris, mères et petits confondus, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur note que les souris vacillent après l'injection, l'alcoolémie étant mesurée trente minutes plus tard, et affirme qu'elles ne montrent pas de signe de souffrance au moment de l'injection. Toutes sont tuées, les mères anesthésiées puis mises à mort pour prélever les embryons, les souriceaux pour prélever leur cervelet à neuf stades de développement.

Objectifs

Les Troubles Causés par l’Alcoolisation Fœtale ou TCAF sont des troubles du neurodéveloppement liés à des consommations modérées ou discontinues d'alcool pendant la grossesse. Cette pathologie, dont la prévalence est évaluée à 1% des naissances, se traduit par l’apparition d’atteintes neurologiques chez l'enfant avec des répercussions fonctionnelles qui se révèlent progressivement avec l’âge. Dès lors, de nombreuses études visant à caractériser les anomalies du neurodéveloppement chez les enfants TCAF se sont portées sur des structures intégratives telles que le néocortex ou encore l’hippocampe. Celles-ci ont notamment révélées une tortuosité significative des vaisseaux sanguins induisant un mauvais positionnement des cellules nerveuses. Pour autant, plusieurs déficits observés chez ces enfants, tels que les troubles orthoptiques ou des défauts de motricité fine, suggèrent que le cervelet pourrait également participer aux déficits induits par une alcoolisation in utero. Les objectifs de ce projet seront donc (i) de caractériser la vascularisation et les interactions neurovasculaires au cours du développement du cervelet, puis ii) d’évaluer l’impact de l’alcoolisation in utero sur la mise en place vasculo-associée des cellules du cortex cérébelleux. A terme, nous pourrons ainsi déterminer si le cervelet participe aux déficits observés chez les enfants TCAF afin d'optimiser leur prise en charge.

Bénéfices attendus

Le présent projet permettra tout d'abord d’identifier pour la première fois le mécanisme de mise en place de la vascularisation dans le cervelet murin en développement. Ainsi, nous pourrons déterminer si une migration vasculo-associée participe à la mise en place du cervelet au cours de l'embryognenèse ou lors de la période postnatale et si celle-ci est altérée en condition d'alcoolisation foetale comme déjà démontré dans le cortex cérébral et la rétine. De plus, l’implication d'un service de pédiatrie néonatale dans ce projet nous permettra d’envisager une transposition de nos résultats immunohistochimiques à l’enfant. Dès lors, une corrélation entre les altérations histologiques du cervelet et les atteintes neurodéveloppementales observées chez les enfants atteints de TCAF pourra être envisagée et la prise en charge de ces enfants pourra alors prendre en compte les déficits neurologiques de manière plus intégrée, i) en orientant la thérapeutique vers la cible vasculaire et ii) en incluant la participation du cervelet lors des traitements symptomatiques.

Procédures

Afin de mimer une alcoolisation foetale, de l’alcool sera administré par voie sous cutanée à des souris gestantes du 12ème au 20ème jour embryonnaire soit 9 injections au total Avant la procédure d'injection, les souris gestantes seront préalablement légèrement anesthésiées afin de limiter le stress. La manipulation dure environ 1 minute pour chaque injection. Ce protocole d'alcoolisation répétée par injection est décrit dans des cas d’alcoolisation maternelle. Lors des prélèvements des embyrons, les mères seront soumises à une anesthésie dans une chambre d'induction avant leur euthanasie. Lors des prélèvements des cervelets chez les souriceaux postnataux, les animaux sont également anesthésiés avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

A la suite de l’injection d’alcool chez les mères gestantes, les souris vacillent reflétant l’alcoolémie mesurée après 30 minutes comme observé chez l’humain après alcoolisation. Au cours de l’injection, les souris ne montrent pas de signe de souffrance. Les études déjà réalisées sur ce modèle murin TCAF n'ont pas démontré d'augmentation de fausses couches ou de mortalité précoce chez les embryons/souriceaux.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans cette étude sera euthanasié à la fin de l'expérimentation soit du fait du prélèvement d'organes ou d'embryons, soit du fait qu'ils auront reçu des injections journalières pendant 9 jours (de NaCl 0.9% ou d'alcool) et qu'ils ne pourront donc pas être réutilisés pour d'autres expérimentations (mères gestantes).

Remplacement

Certains déficits observés chez les enfants TCAF, tels que les troubles cognitifs, orthoptiques ou des défauts de contrôle de la motricité fine laissent penser que le cervelet pourrait participer aux déficits induits par une alcoolisation foetale. A l'appui de cette hypothèse, les images d'IRM montrent que ces enfants présentent un volume cérébelleux plus faible. De plus, plusieurs études réalisées sur des modèles animaux ont montré que les populations nerveuses du cervelet présentent une sensibilité importante à l'alcool. Cependant, au regard de ces travaux, il reste difficile d'évaluer l'impact d'une exposition prénatale à l'alcool sur le développement du cervelet. En effet, les modèles utilisés jusqu'alors sont soit des cultures cellulaires, ce qui ne permet pas d'obtenir un système intégré, soit des souris entre le 4ème et le 10ème jour postnatal, ce qui correspond au 3ème trimestre de gestation chez l'Homme, alors que les différents types cellulaires sont déjà présents au sein du cervelet, et ce qui implique d'étudier les effets directs de l'alcool et non l'effet d'une alcoolisation de la mère sur le développement du petit. De plus, il n'existe que peu voire pas de données sur la mise en place de la vascularisation et sur l'existence d'une migration vasculo-associée au cours du développement embryonnaire du cervelet, et, par voie de conséquence, l'impact de l'alcoolisation foetale sur ces événements précoces n'a jamais été étudié. Notre étude vise donc tout d'abord à décrire la vascularisation du cervelet chez des embryons de souris à différents âges pour déterminer si les cellules cérébelleuses utilisent les vaisseaux sanguins en tant que support de migration au cours de l'embyrogenèse. Puis, en utilisant un modèle animal TCAF, nous pourrons identifier les mécanismes impactés par une alcoolisation foetale afin de mieux appréhender la participation du cervelet aux déficits TCAF et d'adapter la prise en charge thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet et obtenir des résultats statistiquement interprétables à l'aide du test non paramétrique Mann-Whitney. 1. Pour la caractérisation de la vascularisation et de la migration vasculo-associée dans le cervelet au cours du développement, les âges d’intérêt ont été identifiés en s’appuyant sur la littérature afin qu'ils soient en corrélation avec les étapes clefs du neurodéveloppement cérébelleux humain. Ainsi 4 stades embryonnaires et 5 stades postnataux seront étudiés à raison de 4 animaux par stade pour obtenir une moyenne statistiquement interprétable des paramètres vasculaires et vasculo-associés. Ces 4 animaux devront être de portées différentes pour prendre en compte la variabilité inter-portée dans l'interprétation des résultats. Pour les marquages immunohistochimiques, 10 anticorps différents sont requis pour identifier l'ensemble des vaisseaux sanguins et des populations cellulaires cérébelleuses. En transparisation, les marquages immunohistochimiques sont obligatoirement réalisés sur des embryons ou cervelets postnataux entiers, ce qui nécessitera 4 animaux de portée différente par stade et par marquage. En revanche, pour l'immunohistochimie sur coupe, la taille du cervelet permettra de réaliser plusieurs marquages différents sur le même échantillon, permettant de réduire le nombre d'animaux. 2. Pour étudier l'impact d'une alcoolisation foetale sur la vascularisation et la migration vasculo-associée, il sera nécessaire de réitérer l'ensemble des marquages précédents sur des embryons « contrôle sham » dont la mère a reçu des injections de NaCl pour confronter les résultats obtenus avec les animaux « alcoolisés in utero » et éviter les biais expérimentaux liés à l'injection en elle-même. Pour les études de PCR et western blot, la taille du cervelet nécessitera un animal par condition et par technique jusqu'à l'âge de la naissance inclus. En revanche, pour les stades plus tardifs, ces 2 techniques pourront être réalisées en parallèle sur un même animal en divisant le cervelet en deux au moment du prélèvement. Enfin, pour la zymographie, un animal par condition sera nécessaire du fait de la préparation de l'échantillon.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. Ils seront maintenus dans un environnement stabilisé (température 21 ± 1 °C, hygrométrie 55%, luminosité 100 lux avec photopériode régulée (cycle jour/nuit 12h/12h)). Ils auront libre accès à l’eau et à la nourriture, et un enrichissement sera mis en place (tunnel en carton, demi-sphère de cellulose et lanières de papier kraft). Ils seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et leur bien-être sera surveillé après les injections d’alcool/NaCl. En cas de dépassement des points limites identifiés (signe de douleurs extérieurs indexés sur Mouse Grimace Scale, manifestations de signe de détresse ou d’infection) ou de défauts significatifs de développement, les animaux seront mis à mort comme décrit précédemment. Lors de la procédure d'alcoolisation foetale, les mères seront conservées dans leur cage d’hébergement et amenées dans la pièce d’expérimentation 1h avant les injections pour limiter tout stress de l’animal. Cette pièce est calme et isolée d'autres animaux. Les mères ayant reçu l'injection seront surveillées en temps réel pendant 45 min avant leur retour dans leur hébergement. Lors des prélèvements, les animaux en attente de l'euthanasie sont placés à l'écart de la table d'expérimentation pour éviter tout stress environnant.

Choix des espèces

La Souris est un modèle de choix pour l’étude de nombreux systèmes physiologiques complexes dont les mécanismes sont similaires aux mammifères. C'est le cas du développement cérébral par exemple. Or le cervelet suit les mêmes étapes de développement que le reste du cerveau avec des séquences de prolifération, migraion, différenciation et apoptose. L'utilisation de ce modèle est donc tout à fait pertinent dans cette étude. De plus, la majorité des publications antérieures relatives aux TCAF a été réalisée chez la souris. Par souci de cohérence et de vision intégrée de l'effet de l'alcoolisation foetale sur le développement nerveux, il est donc nécessaire de poursuivre avec ce modèle murin avant la transposition clinique. Les stades de développement d’intérêt ont été déterminés sur la base des événements clefs de la neurogenèse du cervelet qui sont également bien identifiés chez l'Homme. Ainsi les stades embryonnaires choisis correspondent respectivement à la naissance des cellules de Purkinje, à l’émergence des précurseurs des cellules en grains puis des cellules de Golgi, et enfin à la mise en place de la couche granulaire externe. Puis, pour les études postnatales, les trois premières semaines postnatales représentent successivement une phase de prolifération des cellules en grains dans la couche granulaire externe, le développement de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje, la mise en place du circuit cortical cérébelleux et enfin la fin du développement du cervelet chez le jeune adulte. L'alcoolisation sera réalisée uniquement chez la mère gestante mais pas directement sur le souriceau postnatal.

Des traitements administrés jusqu'à quatre fois par jour pendant six mois attendent 5 370 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélèvements post mortem. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'une suspension bactérienne déposée dans les narines sous anesthésie, geste que le porteur décrit comme non invasif tout en signalant qu'il peut entraîner une détresse respiratoire. Les souris non traitées développent la maladie et peuvent perdre du poids, l'objectif affiché étant de raccourcir un traitement humain de six mois et de contourner les résistances aux antibiotiques. Trois lignées sont utilisées, dont des souris nude, immunodéficientes, choisies pour mimer la co-infection par le VIH et présentées comme porteuses d'un "phénotype dommageable".

Objectifs

La tuberculose est une infection due aux bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis. Elle touche encore annuellement 10 millions de personnes dans le monde et provoque 1,5 millions de décès. Le traitement repose actuellement sur l’association de 4 antibiotiques sur une durée de 6 mois. La longueur et la complexité du traitement ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques sont des causes d’échec. Dans ce contexte, le but de nos travaux de recherche est 1) de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques antibiotiques permettant de simplifier le traitement et d’être actif contre les souches ayant développé une résistance aux antituberculeux existants et 2) de mieux comprendre les mécanismes in vivo de virulence et d’émergence de résistance aux traitements. Ces types d’études sont longues voire impossibles à conduire chez l’homme. Le modèle murin permet donc de tester différentes hypothèses qui peuvent ensuite être confirmées chez l’homme voir même utilisées directement. Notre projet recouvre ainsi l’ensemble des expérimentations à réaliser in vivo dans le modèle murin pour étudier les mécanismes de virulence, d’émergence de résistance et évaluer l’activité des traitements.

Bénéfices attendus

La tuberculose touche encore annuellement 10 millions de personnes dans le monde et provoque 1,5 millions de décès. Le traitement repose actuellement sur l’association de 4 antibiotiques sur une durée de 6 mois. La longueur et la complexité du traitement ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques sont des causes d’échec. Ce projet vise à évaluer de nouvelles molécules qui pourraient diminuer la durée du traitement ainsi que la fréquence de prise des antibiotiques et élaborer des stratégies pour réduire le risque d’échec due aux mutants résistants aux antibiotiques.

Procédures

Les animaux seront infectés par instillation intranasale (1 instillation par animal) afin de créer une infection bactérienne. Les animaux seront anesthésiés 1 fois avant instillation. La suspension bactérienne sera ensuite déposée au niveau des narines de l'animal anesthésié pour que la suspension soit inhalée lors de la respiration (geste d'une minute). Pour les traitements, les animaux vigiles seront maintenus en contention manuelle puis traités par voie orale ou sous cutanée (fréquence de 1 à 4 fois par jour sur 1 à 7 jours pour une durée de 1 à 6 mois) (geste de 30 secondes) . Pour les prélèvements sanguins qui ne concernera pas tous les animaux, les souris vigiles seront tenues en contention manuelle et un petit volume de sang sera prélevé (geste de 15 secondes). A la fin du prélèvement, une pression sera effectuée pour arrêter le saignement (geste de 30 secondes). Les animaux ne subiront qu’un seul prélèvement au cours de la cinétique. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de suivi conformément au protocole ou en anticipé en cas d’atteinte de point limite.

Impact sur les animaux

Lors de l’instillation intranasale, les animaux seront anesthésiés ce qui pourrait engendrer un stress thermique. Une douleur de courte durée liée à la piqûre de l’aiguille peut être ressentie par l’animal. La suspension à inoculer sera ensuite déposée au niveau des narines de l’animal anesthésié, sans geste invasif mais pouvant entraîner une détresse respiratoire. Les souris non traitées vont par la suite développer une tuberculose. L’évolution de la maladie peut engendrer une perte de poids et seules les souris des groupes non traités pourront donc présenter une perte de poids. L’administration des traitements se fera par administration orale sur animaux vigiles maintenus par une contention. Ces administrations pourront induire un stress en raison de la contention nécessaire. Enfin, les prélèvements de sang pourraient aussi être générateurs de stress et de douleur de courte durée due à la piqûre lors du prélèvement et entrainer un hématome. Les souris nude présentent un phénotype dommageable, elles sont immunodéficientes et peuvent donc être plus sensibles aux infections.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux à la fin de la procédure.

Remplacement

L’ensemble du projet vise à mesurer l’activité de nouvelles molécules afin d’améliorer le traitement de la tuberculose chez l’homme. En effet, les tests in vitro de mesure de l’activité d’antibiotiques contre le bacille tuberculeux menés en amont de notre projet ne prennent en compte que la bactérie et pas la réponse de l’hôte dans son ensemble. Il est donc nécessaire d’avoir recours au modèle murin avant de débuter un essai clinique chez l’homme.

Réduction

Le projet impliquera au plus un total de 5370 animaux. Les hypothèses testées dans le modèle murin seront uniquement celles qui ont franchi les étapes de sélection dans les modèles in vitro réalisés en amont. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum par groupe permettant de conserver une puissance statistique suffisante pour répondre aux problématiques. Notre projet utilisant une voie d’instillation en intranasal celle-ci permet de réduire la variabilité inter animale et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires dans les expériences.

Raffinement

Les procédures ont été établies dans le respect du bien-être animal en limitant la douleur (utilisation d’une analgésie et anesthésie quand cela est nécessaire) et le stress (période d’acclimatation, gestes réalisés par des personnes formées). Les animaux seront hébergés dans un niveau de confinement 3 et leurs conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation. Une période d’acclimatation d’une semaine est observée avant le début des expériences. Les animaux seront hébergés par 5 et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; un enrichissement sera proposé sous forme de lanières de kraft ou de coton (en fonction des procédures de l’animalerie dont dépend ce projet). L’animalerie dispose d’un cycle nycthéméral, d’une hygrométrie et de température surveillées. Les animaux sont suivis quotidiennement et des points limites ont été définis pour garantir le bien-être des animaux pendant toute la durée du projet.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé depuis plus de 50 ans pour l’évaluation des antituberculeux. Il permet une prédiction de l’efficacité des antituberculeux chez l’homme car la pharmacocinétique choisie chez l’animal est équivalente à celle obtenue chez l’homme aux doses habituelles des antituberculeux. La variété des profils de résistance limite la reproductibilité d’études cliniques et la longueur des essais (supérieur ou égal à 10 ans) est aussi une limite à l’étude chez l’homme. En parallèle, les études in vitro ne renseignent que sur le versant de la bactérie mais pas sur celui l’hôte. Le modèle murin permet donc une évaluation plus courte et reproductible in vivo. Afin réduire la variabilité et donc mieux mettre en évidence les différences dans les études les souris consanguines balbc sont utilisées (3R : réduction et raffinement). Dans les étapes pré-cliniques et pour permettre de mimer la variabilité observée chez l’humain, les souris swiss non consanguines sont utilisées. Enfin, la co-infection tuberculose et VIH étant une problématique majeure de santé publique avec des enjeux spécifiques, pour mimer l’immunodépression, les souris nude sont utilisées. Tous les animaux auront 4 semaines à leur arrivée et entreront en procédure après une semaine d'acclimatation soit à 5 semaines.

Jusqu'à 36 tests comportementaux, 336 administrations et 44 prélèvements sanguins peuvent être infligés au même animal sur 84 jours. 9 400 souris et 7 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le porteur mesure ainsi l'anxiété et la dépression des rongeurs pour tester des molécules, en les mouillant, en leur injectant un produit qui provoque une apathie de 24 heures, ou un composé panicogène qui déclenche selon ses propres termes un sentiment désagréable d'anxiété dans l'heure. Il annonce 255 études sur cinq ans et présente le bien-être des animaux non-humains comme "primordial".

Objectifs

L’anxiété et la dépression sont des troubles psychiatriques principalement responsables d'invalidité et de mortalité prématurée. Au niveau mondial, on estime qu’environ 300 millions de personnes souffrent de troubles anxieux, soit ~4 % de la population mondiale. Un nombre similaire de personnes souffrent de dépression. On estime que la perte de productivité due à la dépression et à l’anxiété coûtera à l’économie mondiale 1 000 milliards de dollars par an et devrait atteindre 16 000 milliards de dollars d’ici 2030. L’anxiété et la dépression se différencient par les sensations et les sentiments qu’elles provoquent : la peur en particulier pour la première (sentiment général d’insécurité et par une sensation d’inquiétude démesurée), et la tristesse pour la seconde (tristesse profonde, perte de plaisir et d’envie, perte d’énergie et repli sur soi). Ainsi, l’anxiété et la dépression sont des pathologies différentes mais elles sont imbriquées à différents points de vue Les médicaments existants et approuvés présentent des effets secondaires notoires et peuvent être inefficaces chez certains patients. On parle ainsi de forme de résistance aux médicaments. Les comportements d’anxiété et de dépression ne sont pas le propre de l’Homme, on les retrouve également chez les animaux et notamment chez les rongeurs. Ainsi l’utilisation des rongeurs, souris comme rat, sont des modèles couramment utilisés pour évaluer de nouvelles molécules thérapeutiques. Dans ce projet nous allons mettre en œuvre plusieurs procédures permettant de mesurer le niveau d’anxiété et de dépression des rongeurs et ainsi d’évaluer l’effet de nouvelles molécules thérapeutiques. Les procédures seront au nombre de 4 : -La première étudie chez la souris le niveau naturel d’anxiété et de dépression des animaux dans les conditions d’hébergement de notre laboratoire. -La seconde étudie chez le rat le niveau naturel d’anxiété et de dépression des animaux dans les conditions d’hébergement de notre laboratoire. -La troisième étudie chez la souris l’état d’inconfort induit par une inflammation par un traitement. -La quatrième étudie une forme particulière d’anxiété, le phénomène de panique. Il est induit chez le rat par une administration d’un composé panicogénique connu chez l’homme.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter l’anxiété et la dépression. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles.

Procédures

Les animaux qui réaliseront la procédure 1 ou la procédure 2 pourront être amener à réaliser 36 tests comportementaux anxio-dépressif et/ou de motricité (10-30 min), recevoir un maximum de 336 administrations et de 1 à 44 prélèvements sanguins sur la période de 84j en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les administrations durent moins de 30 seconds en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Les animaux qui seront en procédure 3 subiront au maximum 4 tests de comportement de dépression et/ou d’activité locomotrice (10-30 min) dans les 48h, de plus les animaux subiront une injection d’une substance induisant un état inflammatoire léger et transitoire et bien entendu le traitement avec la molécule à étudier (le schéma de traitement sera fixé en fonction des données pharmacologiques disponible sur cette molécule). Pour les animaux de la procédure 4, chaque individu sera manipulé quotidiennement de 30sec à 1 min pendant une semaine. Une injection d’un composé panicogénique sera réalisée. Ils subiront au maximum 2 tests de comportement de dépression et/ou l’activité locomotrice (environ 10min). De plus les animaux seront sujet à un traitement avec la molécule à étudier (le schéma de traitement sera fixé en fonction des données pharmacologiques disponible sur cette molécule).

Impact sur les animaux

Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (

Devenir

Une partie des animaux est mis à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des comportements d’anxiété et de dépression nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Des analyses statistiques finales sont réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 255 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures. De plus dans nos modèles, quand c’est possible, l’environnement des animaux est enrichi. Pour les souris, l’enrichissement du milieu comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu pour augmenter la superficie de la cage. Pour les rats, l’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Si des animaux se retrouvent mouiller pendant un test de comportement alors ils seront séchés avant leur retour dans leur cage d’hébergement. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en œuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. Une partie des animaux sont habitués à l’Homme par une manipulation quotidienne (30sec-1min/jour, handling).

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat dans les études des phénomènes d’anxiété et de dépression. De plus tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Etant donné que nous n’étudions pas une pathologie liée au vieillissement, qui affecte les jeunes adultes et que nous avons une longue expertise dans ce modèle en utilisant des souris de 4 à 5 semaines au début du projet et des rats de 6-7 semaines au début du projet, nous allons continuer avec ce stade de développement.

768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune isolée une heure par jour pendant vingt-huit jours de tests. Un agent inflammatoire est injecté dans le coussinet plantaire, puis une source de chaleur infrarouge et une force mécanique croissante sont appliquées quatre fois sur chaque patte arrière, à deux minutes d'intervalle, pour mesurer le seuil à partir duquel l'animal retire sa patte. Ces souris portent une mutation qui reproduit un syndrome humain rare associant épilepsie, déficience intellectuelle et dysmorphie faciale, et le projet cherche à voir si elles en présentent les symptômes. Le bénéfice avancé, la mise au point d'antidouleurs activant le canal TRAAK, reste une hypothèse, quand la douleur infligée aux souris est le cœur du protocole.

Objectifs

Les canaux TRAAK sont des canaux potassiques exprimés dans le système nerveux. Chez la souris, ils ont été impliqués dans la perception de la chaleur et du froid. Chez l'homme, des mutations sur TRAAK sont liées à un syndrome neuro-développemental appelé FHEIG (pour F=dysmorphisme facial, H=hypertrichose, E=épilepsie, I=déficience intellectuelle/retard de développement et G=croissance gingivale). Deux mutations ont été identifiées dans ce syndrome qui causent une augmentation de l'activité du canal TRAAK. La mutation A173E chez la souris, équivalente à A172E chez l’homme, entraine également une forte augmentation du courant. Nous avons donc choisi cette mutation pour créer un modèle de souris de la maladie FHEIG. Deux types de souris seront produites dans cette étude, une souris TRAAK FHEIG dont le gène TRAAK est muté dans toutes les cellules et une souris dont le gène TRAAK est muté seulement dans les nocicepteurs (TRAAK FHEIG TRPV1). Le comportement général de ces souris sera étudié dans le but d'évaluer dans quelle mesure ces modèles animaux peuvent récapituler la pathologie humaine. Nous évaluerons aussi leur sensibilité à différents stimuli en conditions standards et en conditions inflammatoires. Cette étude devrait permettre de mieux comprendre le phénotype des patients atteints du syndrome FHEIG. Elle permettra aussi de déterminer si l’activation des canaux TRAAK dans les neurones sensoriels peut réguler le niveau de perception de la douleur dans le but d’envisager le développement d’activateurs de TRAAK comme traitement possible de la douleur.

Bénéfices attendus

Cette étude a un double intérêt à la fois pour la recherche fondamentale et translationnelle. En effet, il s’agit du premier modèle de souris de la pathologie humaine FHEIG. Cette pathologie est rare mais sévère et les symptomes sont très invalidants (F=dysmorphisme facial, H=hypertrichose, E=épilepsie, I=déficience intellectuelle/retard de développement et G=croissance gingivale). L’étude du phénotype de cette souris devrait nous permettre de savoir si le modèle animal récapitule tout ou une partie des symptomes humains. Si c’est le cas, il devrait permettre de mieux comprendre la maladie et d’envisager de tester des traitements potentiels. L’autre bénéfice concerne la compréhension des voies de la sensibilité à la douleur. En effet, s’il s’avère que l’activation du canal TRAAK au niveau des nocicepteurs peut diminuer la perception douloureuse chez la souris, la recherche d’activateurs pharmacologiques de TRAAK pourra être envisagée pour le traitement de la douleur.

Procédures

Pour une partie des animaux : isolement pour habituation dans la cage d'observation (45 min, aucun geste), puis injection intra plantaire unique puis remise en cage isolée pour observation (dure totale de la procédure : 1h45). Pour une autre partie des animaux : 2 testes réalisées en alternance séparés de 24h (durée totale de la procédure 28 jours) 1er test : injection intra plantaire unique d'agent inflammatoire puis application de chaleur infra rouge avec possibilité d'échappement/libre de ses mouvements, 4 fois sur chaque coussinet des 2 pattes arrière. Chaque mesure est espacée de 2 minutes minimum. 2e test : injection intra plantaire unique d'agent inflammatoire puis application de force mécanique avec possibilité d'échappement/libre de ses mouvements, 4 fois sur chaque coussinet des 2 pattes arrière. Chaque mesure est espacée de 2 minutes minimum. Les injections unique intraplantaires seront réalisées en quelques secondes dans le coussinet de la patte de chaque animal. Chaque jour les animaux seront placés dans cages en plaxiglass et seront donc isolés 1h par jour, tous les jours, durant les tests mécaniques et thermiques.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter des signes de douleur spontanée notamment au niveau de la patte enflammée après injection des produits irritants. Dans certaines situations d'hébergement individuel ou d'isolement expérimental les animaux pourront également présenter des signes de stress, une mobilité réduite ou des stéréotypies, mais ils ne présenteront pas de comportements douloureux spontanés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort dans le but de récupérer leurs organes pour des analyses histologiques, biochimiques et génomiques.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans la continuité des recherches déjà menées au laboratoire et vise à identifier de nouveaux acteurs importants dans les voies de la douleur. Il permettra également de mieux comprendre certains syndromes neurodéveloppementaux liés à un dysfonctionnement des canaux potassiques. Il n’existe pas d’alternative à l’expérimentation animale pour déterminer la sensibilité douloureuse. C’est un phénomène physiologique complexe impliquant plusieurs types de fibres sensorielles et fait intervenir très certainement plusieurs types cellulaires en interaction. Des études histologiques ont déjà été réalisées pour montrer l’expression des protéines d’intérêts dans les structures impliquées dans le contrôle de la douleur et des tests génétiques chez l’homme ont identifié des mutations spécifiques sur ces protéines dans une pathologie. Des expériences ex-vivo seront réalisées à partir des tissus et des cellules prélevées chez ces souris mais qui viendront compléter notre étude et en aucun cas se substituer aux tests sur animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques pour développer de nouveaux analgésiques.

Réduction

Nous avons pris plusieurs mesures de réduction du nombre d'animaux. Tout d’abord, le nombre d'animaux maximum a été défini par une analyse données statistiques. Puis, tous les animaux mis à mort à la fin de chaque procédure serviront également au prélèvements de leurs organes pour analyse, nous nous limitons à analyser les organes des animaux testés et nous n'utiliserons donc pas d'autres animaux pour ces analyses. Nous avons également conçu nos procédures de manière à utiliser le moins d'animaux possibles, nous utiliserons notamment les mêmes animaux pour différentes procédures divisant ainsi par 2 le nombre d'animaux.

Raffinement

Nous avons défini et mettrons en place de points limites précis précoces et adaptés pour chaque procédure afin de garantir une prise en charge adéquate des animaux en cas de souffrance/douleur ou inconfort. Plusieurs facteurs sont susceptibles de moduler la sensibilité, c’est pourquoi une attention particulière sera apportée à l’hébergement et au bien-être des animaux tout au long de leur vie. Les animaux sont hébergés à cinq par cage, dans des cages mis sur portoirs ventilés avec enrichissement adéquat, nourriture et boisson ad libitum et seront suivi tous les jours. Un des principaux enjeux sera de diminuer le niveau de stress des animaux, afin d’améliorer les conditions de vie des animaux et de maitriser les acteurs pouvant influencer la sensibilité. En cela, les animaux seront habitués plusieurs fois aux environnement des tests pour diminuer le stress des animaux aux nouveaux environnements. Nous avons également concu des procédures les plus courtes possibles pour étudier la douleur inflammatoire.

Choix des espèces

Le choix de cette espèce constitue le meilleur modèle pour notre étude car les caractéristiques des souris de la souche utilisée sont largement documentées. La souris possède également une reproductibilité rapide et fiable, constituant un atout pour développer efficacement notre projet. Les tests de sensibilité sont bien adaptés pour les souris et suffisamment documentés. Nous possédons déjà les souris génétiquement modifiées indispensables à notre étude. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 12 semaines. Ce choix est motivé par la volonté de nous soustraire des variations dues aux processus développementaux ou liés au vieillissement.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord rendues obèses et diabétiques par douze semaines de régime gras, puis soumises à un jeûne de seize heures, à un jeûne intermittent de six semaines ou à un régime cétogène, avec des tests de tolérance au glucose comprenant six heures de jeûne et sept piqûres de la queue en deux heures. Il s'agit de savoir si une protéine du foie explique les effets bénéfiques de ces régimes, déjà observés au laboratoire dans une étude non publiée. Le porteur écrit qu'il est "impossible" de reproduire par des méthodes alternatives le jeu combiné du foie, des tissus adipeux, de l'intestin, du cerveau et du muscle.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie (stéatose hépatique non alcoolique, ou NAFLD pour non-alcoholic fatty liver disease) sont en expansion dans les pays industrialisés, parallèlement à la prévalence croissante de l’obésité. Le premier stade de la maladie correspond à une accumulation de graisses dans le foie et est bénin mais peut évoluer chez certains patients vers une forme inflammatoire, puis vers une cirrhose, à l’origine d’autres complications sévères telles que le cancer du foie. Les mécanismes de progression de ces maladies sont encore mal compris et aucun traitement médicamenteux efficace n’est disponible à ce jour. Dans une étude non publiée du laboratoire, nous avons récemment démontré que plusieurs stratégies alimentaires sont capables de diminuer l’obésité, le diabète et la stéatose hépatique chez la souris. Nous souhaitons à présent déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets bénéfiques. Nous émettons l’hypothèse que la protéine PPARa pourrait être impliquée dans ces effets. PPARa est principalement exprimée dans le foie où elle contrôle la dégradation des graisses, faisant d'elle une bonne cible thérapeutique pour traiter les maladies métaboliques. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles chez qui le gène PPARa est non fonctionnel dans le foie. Dans ce projet, nous utiliserons des souris mâles et femelles qui n'expriment pas PPARa dans le foie et comme contrôle, des souris chez qui PPARa s’exprime. Elles seront nourries par un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l’Homme. Une fois la pathologie installée, les animaux seront soumis à différentes stratégies alimentaires : un retour à un régime contrôle, un jeûne aigu ou intermittent, un régime cétogène (presque exclusivement constitué de graisses et contenant très peu de sucre). Les effets de ces différentes stratégies alimentaires seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes (foie, tissus adipeux brun et blanc).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir l’importance de PPARa spécifiquement dans le foie dans les effets bénéfiques des différentes interventions sur la progression de l’obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. En conséquence, ce projet pourrait identifier un des mécanismes hépatiques pouvant être impliqué dans les effets de ces différentes interventions. En effet, aucun traitement de référence n’est disponible à ce jour pour les patients atteints de ces maladies chroniques du foie qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie du monde.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 12 semaines. A l'issue de ces 12 semaines, les animaux subiront l'une des interventions nutritionnelles suivantes : une mise à jeun pendant 16h, un jeûne intermittent de 16 h par jour pendant 6 semaines, un régime cétogène riche en gras et pauvre en sucre pendant 6 semaines, un régime standard pendant 6 semaines, un groupe contrôle qui restera nourri avec le régime obésogène pendant 6 semaines. Les animaux seront aussi soumis à des tests de tolérance au glucose (OGTT) ou à l’insuline (ITT) au début et à la fin de chaque intervention. Ces tests consistent en : 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie puis un gavage avec du glucose pour les OGTT ou une injection d'insuline pour les ITT, puis des mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2h. Pour les OGTT, le glucose est administré par gavage une fois et pour les ITT, l'insuline est administrée par injection une fois. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes. Pour les mesures de glycémie, le prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Les régimes obésogènes vont induire une obésité et des perturbations du métabolisme associées tels qu'un diabète et une stéatose, sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement. La mise à jeun peut entraîner une hypoglycémie et une hypothermie. Le prélèvement sanguin et le gavage oral de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car la pathologie étudiée (stéatose non alcoolique) est complexe et fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible de mimer la pathologie étudiée grâce à l’utilisation du régime gras.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Ainsi, les souris seront en hébergement collectif et dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, l’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (régime standard et aucune procédure réalisée).

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Un rat qui perd plus de 20 % de son poids ou atteint 15 points sur 27 à la grille de la maladie, qui note diarrhée, gonflement des articulations, lésions de la peau, inflammation des testicules ou de l'œil, est mis à mort. 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont des individus porteurs d'un gène humain qui développent d'eux-mêmes une spondylarthrite, avec douleur, perte de poids et parfois mobilité réduite. Pour tester des molécules, une partie reçoit une injection dans l'abdomen chaque jour pendant six à douze semaines, et les rats sont tués à l'issue de chaque procédure pour le prélèvement de leurs organes, hors élevage, dont le sort n'est pas précisé. Le porteur présente ce rat comme "le modèle animal le plus pertinent" de la maladie humaine, et note que des souris portant le même gène ne développent aucun signe de la maladie.

Objectifs

l’objectif majeur de notre projet est de comprendre le rôle pathogène du HLA (Antigènes des Leucocytes Humains)-B27 au cours de la spondyloarthrite (SPA) utilisant le modèle expérimental de SPA : le rat transgénique HLA-B27 afin de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Au cours de ces dernières années, nous avons cherché à comprendre pourquoi nous observons une proliferation anormale des lymphocytes T pro-inflammatoires producteurs de la cytokine inflammatoire (IL-17) chez le rat B27, le modèle animal le plus pertinent et le plus proche de la SpA humaine. Nos résultats ont mis en évidence que l’IL-27 (une cytokine anti-inflammatoire) et ICOS (une molécule de costimulation) étaient deux nouvelles cibles thérapeutiques prometteuses pour le traitement de la SpA. En ce qui concerne l’IL-27, elle a eu un effet protecteur en réduisant la sévérité des manifestations inflammatoires chez le rat B27, tout en inhibant les réponses des lymphocytes inflammaoires et la production d'IL-17. Nos résultats ouvrent des nouvelles perspectives même pour des patients qui ne repondent pas aux traitements actuellement disponibles.

Procédures

Post-mortem, des organes lymphoides des animaux seront prélévés en quelques minutes (environ 2-3) pour une analyse cellulaire ou histologique. Durant les essais pré-cliniques, les animaux seront injectés (durée de l'injection quelques secondes) intraperitoneal tous les jours pendant 6-12 semaines. Pour les experiences ex-vivo un minimun de 2 animaux non transgéniques et 2 animaux transgéniques seront utilisés et les experiences seront répétées 5 à 6 fois. Pour les essais pré-cliniques, nous utiliserons des groupes de 6 à 8 animaux par groupe.

Impact sur les animaux

Le rat transgénique pour HLA-B27 est à l’heure actuelle le modèle animal le plus percutant de cette pathologie. Dans ce modèle surviennent spontanément, sous le seul effet du transgène et probablement en association avec le fond génétique du rat, toutes ou une partie des manifestations de la spondylarthrite ankylosante. Ainsi, ces animaux développent des manifestations comme des arthrites et une colite. Certains animaux développent aussi une l’inflammation de la peau ou de l’œil. Ces manisfestations peuvent engendrer chez ces animaux de la douleur, perte de poids et parfois une mobilité reduite.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, à l'exception de l'elevage, les animaux seront mise à mort pour les prélèvements d'organes nous permettant d'etudier les céllules, les organes et les méchanismes impliqués dans la pathogénèse de la maladie. Dans d'autres cas, les animaux seront utilisés pour étudier le potentiel thérapeutique des certaines molécules à partir du prélèvements d'organes et analyse cellulaire.

Remplacement

Toutes les molécules avec un potentiel thérapeutique seront d’abord testées in vitro en utilisant des lignées cellulaires à la place des animaux par exemple. Seulement après validation in vitro, ces molécules seront téstées chez les animaux afin d'étudier leur potentiel thérapeutique dans le traitement contre les spondyloarthrites.

Réduction

Comme prévu, dans les essais pré-cliniques, le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe de traitement sera de 6 et 8. Ce nombre d’animaux par groupe nous permet de réaliser des analyses statistiques robustes permettant d’établir quelques conclusions pertinentes sur des paramètres abordés dans notre projet. Il ne nous paraît pas envisageable de réduire ce nombre d’animaux par groupe dans de futurs projets, si l’on souhaite garder des analyses statistiques pertinentes.

Raffinement

Nous envisageons, en cas de présence d’arthrites causant une difficulté de la mobilité des rats, de mettre de l’alimentation dans la cage afin que les rats puissent s’alimenter correctement. Du change de cages, deux fois par semaine , seront prévus pour les cages où il y aura des animaux très malades avec diarrhées. Nous mettrons en place l'ajout de fromage aux femelles gestantes et aux petits pour améliorer leur croissance. A partir de 7 semaines d’âge l'etat de santé des animaux sera observé et nous utiliserons un tableau de scoring de la maladie (voir tableau ci-dessous). Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 20% ou atteignant le score total de 15 (= point limite) seront sacrifiés. Score maximal total = 27 Semaine 7……Semaine X Poids (g) Diarrhée Absente=0 Modérée = 1 Importante= 2 Profuse=3 Anite=+1 Articulations Normale=0 Gonflée = 1 à 4 Patte AV gauche Patte AV droite Patte AR gauche Lésions cutanées 1 à 4 Ongles= +1 Orchite Absence=0 Présence=1 Uvéite Absence=0 Présence=1

Choix des espèces

Le rat transgénique pour HLA-B27 est à l’heure actuelle le modèle animal le plus relevant de cette pathologie. Dans ce modèle surviennent spontanément, sous le seul effet du transgène et probablement en association avec le fond génétique du rat, toutes les manifestations de la spondylarthrite ankylosante. Notre objectif est donc de comprendre le rôle pathogène du HLA-B27 au cours de la pathologie en utilisant ce modèle. Il est important de souligner que des souris portant le même transgène ne développent aucun signe de la maladie. Nous utiliserons des animaux à un état précoce du développement de la maladie (environ 3 semaines) ne présentant pas encore des signes cliniques, par exemple pour les expériences nécessitant d’utiliser des cellules en absence d’inflammation ou dans le cas de traitement in vivo précoce. Dans ce cas, les animaux seront marqués à l’encre et génotypés avant leur utilisation. Pour toutes les autres expériences, en utilisant de rats adultes qui presentent des signes cliniques (la maladie est etablie) nous utiliserons un protocole classique de marquage à l’oreille et génotypage à partir d’échantillons de l'oreille marquée. Des rats adults (entre 3 mois et 6 mois d'âge) seront utilisés pour certaines expériences.