Procédures modérées

Tous tués au vingt-et-unième jour pour prélever la peau le long des lignes de suture, 15 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux incisions dans le dos sous une anesthésie de trente à quarante-cinq minutes, refermées l'une par du fil, l'autre par une colle mise au point par le laboratoire, puis quatre injections d'anti-inflammatoire. Un gilet de protection sur mesure les empêche de toucher leurs plaies, et les points limites prévoient la mise à mort en cas d'infection purulente, d'absence de selles pendant cinq jours ou de perte de poids supérieure à 15 % persistant après cinq jours. Trois animaux par formule, effectif que le porteur présente comme "le minimum acceptable pour pouvoir conclure statistiquement", sont utilisés pour préparer le marquage CE du produit.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité de différentes formules de suture nouvelle génération développées par notre laboratoire (comparativement à des techniques utilisées couramment) pour la suture d’incision chirurgicale. 1 – évaluer la qualité de la cicatrisation en fin du processus cicatriciel :un prélèvement histologique sera réalisé à J21 à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie. 2 – évaluer la durée de cicatrisation : un contrôle visuel 2 fois par semaine permettra d’évaluer le stade de cicatrisation de la plaie. Par ailleurs, les tests précliniques sont indispensables à l’évaluation d’un dispositif médical avant le passage aux tests cliniques chez l’Homme. La formule sélectionnée pourra alors passer à l’étape suivante du marquage CE : l’étude clinique.

Bénéfices attendus

La suture de plaie traumatique ou d’incisions chirurgicales est réalisée soit par colles chirurgicales, soit par un fil de suture, soit une agrafe. La suture par fil/agrafe créé des lésions du derme et implique la présence d’un corps étranger dans la suture, engendrant un risque d’apparition d’une infection cutanée post-opératoire. Ils ont également comme inconvénient de ne pas stabiliser parfaitement la plaie lorsque des tensions sont exercées dessus. Le bord à bord des berges cutanées est maintenu uniquement au niveau du point de suture. Ceci a pour conséquence de rouvrir la plaie, gênant la cicatrisation et laissant une cicatrice fibreuse voire des cicatrices hypertrophiques ou chéloïde. Des rapports montrent que l’incidence de la formation d’une cicatrice hypertrophique après une chirurgie se trouve entre 33% et 91% . En 2006, la prévalence des patients présentant une infection nosocomiale était de 4,97% (au niveau du site opératoire dans 14% des cas). Ainsi, l’utilisation d’une colle chirurgicale ayant une force d’adhésion équivalente à une suture permettrait de résoudre les limites détaillées ci-dessus (bord à bord parfait, pas de corps étranger, pas de lésion, une parfaite stabilisation des berges de la plaie…). Les seuls produits actuellement utilisées pour cette application sont les colles de cyanoacrylate (Leukosan). Elles ont pour avantage d’avoir un temps de prise rapide et une haute résistance au déchirement. Cependant leurs faibles propriétés adhésives à la peau font qu’elles ne sont indiquées que pour les sutures de petites plaies avec un taux de déhiscence de 20% . Elles ne peuvent ainsi pas être utilisées en alternative d’une suture par fil ou agrafe. L’étude des propriétés adhésives de colles chirurgicales innovantes montre que la faible adhérence de ces colles est due au fait qu’elles se fixent sur la surface desquamante des tissus biologiques. Or, il s’avère que l’adhésion à un tissu biologique repose sur un ancrage à son extrême surface. La colle testée dans cette étuderepose sur ce principe. Cet ancrage à la superficie du tissu permet d’atteindre des performances techniques inégalées (équivalente à une suture par fil et dix fois supérieures aux colles chirurgicales). Au travers de cette étude, nous espérons observer une diminution du temps de cicatrisation avec nos formulations comparativement aux techniques par colle de cyanoacrylate et fil de suture.

Procédures

Procédure chirurgicale d’incision et suture cutanée sous anesthésie générale. L’anesthésie durera 30-45 min. 1 injection d’anethésique 4 injections d’anti-inflammatoire 2 incisions cutanées Suture par fil Suture par collage

Impact sur les animaux

Hypothermie liée à l'anesthésie Douleur post opératoire Perte d’appétit, deshydratation

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort. A 21 jours, à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie, les animaux seront mis à mort et des prélèvements seront réalisés le long de la ligne de suture pour évaluer la qualité de la cicatrisation.

Remplacement

Les plaies traumatiques et les incisions chirurgicales sont des plaies complexes qui touchent les différentes structures de la peau (allant de l’hypoderme à l’épiderme) et qui subissent des forces mécaniques qui peuvent être importantes en fonction de la localisation de la plaie. Par ailleurs, nous souhaitons évaluer la qualité de la cicatrisation in vivo. Il n’existe donc pas de modèles in vitro permettant de prendre en compte tous ces paramètres. Par ailleurs dans le développement d’un nouveau dispositif médical, il est nécessaire de tester les formulations sélectionnées sur des modèles animaux afin d’appréhender la biocompatibilité des matériaux avant le passage chez l’Homme.

Réduction

Cette étude est une étude pilote qui nous permet principalement de faire de l’imagerie pour observer les différences sur le processus cicatriciel en fonction de la solution de suture utilisée. Pour chaque formule trois réplicas seront réalisés afin de pouvoir observer et comparer la cicatrisation sur 3 individus (lapins). Ces 3 réplicas nous permettrons également de comparer la différence de temps de cicatrisation entre différentes solutions de suture. 3 animaux par groupe est le minimum acceptable pour pouvoir conclure statistiquement sur l’étude. Le t test sera utilisé pour évaluer statistiquement les différences de temps de cicatrisation.

Raffinement

La peau du dos de l’animal va être incisée à 2 endroits lors de la chirurgie. L’animal sera placé sous anesthésie générale pour la chirurgie. Les animaux recevront un traitement anti-inflammatoire et antalgique les 3 premiers jours post opératoire qui permettra de réduire la douleur ressentie. Le traitement pourra se poursuivre en fonction des signes cliniques observés quotidiennement les jours suivants. Les animaux seront suivis environ 21j le temps de la cicatrisation puis seront mis à mort. Au cours de l’anesthésie, l’animal pourrait se refroidir. Pour pallier cet inconfort qui pourrait engendrer une mauvaise récupération des suites de l’anesthésie, l’animal sera placé sur un tapis chauffant tout le long de la chirurgie, jusqu’à son réveil. Les animaux bénéficient de plateforme dans leurs cages, de jouets et de morceaux bois à ronger dans leur environnement de vie. Les points limites suivants son suivi tout au long de la durée de l’étude : • Apparition d’une inflammation au niveau du site opératoire : examen quotidien à la recherche d’une infection, désinfection de la plaie avec une solution de Bétadine dermique 10%, application d’un pansement si sécrétions non purulente • Apparition d’une infection purulente au niveau du site opératoire : mise à mort. • Anorexie et perte de poids supérieure à 15% : reprise de l’antalgie, mise à disposition de foin dans la cage, ou un gel de réhydratation par voie orale. Mise à mort si persistance après 5 jours. • Absence de selles après 5 jours : mise à mort. • Troubles respiratoires après 2 jours : mise à mort

Choix des espèces

Les modèles animaux préférentiellement utilisés dans la littérature dans ce type d’expérimentation sont les rongeurs, le lapin ou encore le porc. Les rongeurs ont tendance à retirer/arracher tout corps étranger présent sur leur peau, ce qui empêche toute chance de conclusion sur l’efficacité d’un système de suture de plaie. Chez le lapin, il est possible de protéger la zone lésée grâce à un gilet de protection conçu sur mesure. Ce gilet permet à la plaie de cicatriser sans que l’animal ne sollicite sa suture. Par ailleurs, chez un lapin adulte de 2.5kg, la surface (cm²) du dos adaptée à la réalisation des incisions prévues dans cette étude. Enfin, un animal mature dispose de structures anatomiques cutanée et système immunitaire adaptés aux besoins de l’étude.

Pour vérifier, dans une étude qualifiée de pilote, si un AVC provoque des altérations dans des régions du cerveau non connectées à la zone lésée, 432 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie d'environ quarante-cinq minutes pour déclencher l'infarctus cortical, puis une perfusion intracardiaque de vingt minutes sous anesthésie. Le porteur qualifie le modèle de peu invasif et annonce qu'il ne s'accompagne "typiquement" pas de symptômes majeurs, tout en prévoyant douleur et perte de poids après l'opération. La douleur est notée jusqu'au deuxième jour selon une grille à cinq critères, dont l'aspect de la plaie et les changements de poids, l'animal qui ne montre aucun signe passant ensuite à un suivi hebdomadaire.

Objectifs

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont une cause majeure de déficits moteurs à long-terme et de déficits cognitifs. Certains symptômes se manifestent tardivement et ne sont pas forcément liés à la région initialement lésée, suggérant qu’un AVC dans une région spécifique peut aussi causer des modifications dans d’autres régions du cerveau. Des altérations dans des régions directement connectées à la zone infarcie ont déjà été corrélées à l’apparition de troubles tardifs. Cependant, les régions associées aux fonctions impactées (les fonctions de mémoire par exemple) ne sont pas toujours directement connectées à la région lésée. Nous émettons donc l’hypothèse que des modifications pourraient donc ne pas se restreindre aux régions connectées à l’infarctus primaire mais s’étendre spatialement et temporellement dans le cerveau. Dans cette étude pilote, nous voulons induire un AVC limité à une région précise du cerveau d’un modèle murin afin d’étudier l’impact de la lésion dans d’autres régions du cerveau, pas directement connectées à la zone infarcie. Si notre hypothèse est confirmée, nous aurions identifié un des mécanismes qui pourraient sous-tendre la manifestation de symptômes fonctionnellement liés à des zones non connectées dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider notre observation préliminaire qui vise à mieux comprendre les mécanismes sous-tendant les troubles de mémoire qui se manifestent tardivement après un AVC, même quand la région initialement lésée n’est pas impliquée dans les fonctions mnésiques. Nous émettons l’hypothèse que l’altération d’un mécanisme cellulaire associé à la mémoire ainsi qu’un état inflammatoire pourraient être présents dans des régions non directement connectées à la zone infarcie. Si notre hypothèse est confirmée, nous effectuerons une étude complète qui pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux troubles cognitifs post-AVC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie peu invasive pour induire l’AVC sous anesthésie générale (environ 45 minutes). Ils seront enfin soumis à une perfusion intracardiaque toujours sous anesthésie générale (20 minutes). Tous les animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

La méthode utilisée induit un infarctus cortical limité et typiquement ne s’accompagne pas de symptômes majeurs, ce qui rend le modèle facilement utilisable et limite la souffrance animale. Cependant, suite à la procédure chirurgicale, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir. Les animaux seront observés quotidiennement pendant deux jours. La douleur sera évaluée jusqu’à J2 après chirurgie selon une grille d’évaluation, organisée selon 5 grands critères : apparence physique, comportement non provoqué, changements de poids corporel, la locomotion ou encore l’aspect de la plaie. Si après deux jours l’animal ne montre aucun signe de souffrance, il sera suivi ensuite une fois par semaine. En cas de détérioration ou de souffrance animale, l’animal sera pris en charge par l’utilisateur ou par la vétérinaire.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

L’AVC sera induit par la méthode la moins invasive disponible actuellement pour reproduire certain aspects de la pathologie humaine. Aujourd’hui ils n’existent pas des modèles in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) pour étudier des conséquences anatomiques et cellulaires induites par un AVC dans les régions non lésées initialement et donc pas de méthode alternative permettant de REMPLACER les animaux. En effet, cette étude nécessite la complexité et la connectivité du cerveau adulte.

Réduction

Le nombre de souris a été évalué sur la base de travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problèmes au cours de la chirurgie, la perfusion,des expériences d’électrophysiologie et d’immunohistochimie), ainsi que de la variabilité des résultats. Le déroulement des expériences est organisé afin de limiter au maximum le nombre d’animaux. Nous adapterons d’abord le protocole afin d’avoir une lésion initiale reproductible, de taille maximale limitée au cortex, et seulement ensuite les autres expériences seront réalisées.

Raffinement

Des mesures de RAFFINEMENT seront mises en place durant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être. Ils seront placés dans des cages enrichies, au nombre de 4-5 animaux par cage. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Dans une étude précédente, le nombre d’animaux qui ont montré des signes de souffrance dû à l’induction de l’AVC était très limité (moins de 3%). Nous nous attendons à ce que la lésion soit plus petite avec un temps d’illumination plus court et donc que ce pourcentage se rapproche de zéro. Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, l’animal sera pris en charge par l’expérimentateur. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable.

Choix des espèces

Le modèle envisagé a déjà été induit chez la souris et il a été démontré que les AVC s’accompagnaient de modifications dans des structures du cerveau pas initialement lésées, mais connecté à la région infarcie. Ce modèle permet de produire des tranches de cerveau pour réaliser des études d’électrophysiologie et d’immunohistochimie afin d’explorer des modifications dans d’autres régions du cerveau pas encore étudiées. Nous utiliserons des souris âgées de 16-24 semaines. Cette tranche d’âge permet d’étudier les conséquences d’un AVC chez un animal adulte et correspond à un jeune adulte chez l’homme.

La moitié des ratons sont retirés de la cage de leur mère trois heures par jour, du deuxième au douzième jour après la naissance. 160 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour le prélèvement de tissus nerveux. Le protocole cherche à reproduire chez le rat les effets de la prématurité humaine, puis à enregistrer l'activité des neurones de la moelle épinière et de l'hippocampe, le porteur décrivant lui-même ce stress comme installant une anxiété chronique et des troubles durables de l'adaptation au stress. Les mères ne retournent pas à la reproduction et sont tuées après le sevrage, parce que la séparation a altéré le fonctionnement de leur système nerveux.

Objectifs

Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés (nés avant la 35ème semaine de grossesse) dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN, 3h/jour du 2ème au 12ème jour post-natal) est un stress postnatal qui a été décrit comme un modèle reflétant la prématurité humaine. De nombreux travaux ont montré que les animaux exposés à ce stress postnatal présentaient des hypersensibilités douloureuses des troubles des comportements sociaux, une modification de la perception douloureuse au niveau de la moelle épinière ainsi que des déficits cognitifs. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner notre compréhension de l’impact de la séparation maternelle néonatale sur le codage de l’information nociceptive par les structures nerveuses spinales et supraspinales. L’objectif est de caractériser les modifications fonctionnelles au niveau neuronal qui rend compte des symptômes observés.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces travaux nous permettra de mieux comprendre les phénomènes de sensibilisation nociceptive ainsi que des déficits cognitifs qui semblent se mettre en place durablement suite à des épisodes de stress non douloureux durant la période néonatale en utilisant le modèle de séparation maternelle néonatale. Nous répondrons à la question d'une origine d'un dysfonctionnement de communication nerveuse expliquant les symptômes qui façonne l’expérience douloureuse et augmente le risque de développer une neuropathologie chronique selon les études épidémiologiques sur le sujet.

Procédures

La moitié des animaux sera soumis au protocole de séparation maternelle néonatale : séparation des ratons de la cage de leur mère 3h/j du 2ème au 12ème jour post-natal.

Impact sur les animaux

La séparation maternelle neonatale chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux (expression de symptomes d'anxiété chronique et troubles de l'adaptation au stress). Les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante avant d’éviter tout risque d’hypothermie. Le protocole de SMN est également connu pour augmenter les comportements maternels après retours de ratons dans la cage de la mère. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation maternelle altère le fonctionnement de son système nerveux, ce qui induit au niveau comportemental une anxiété accrue.

Devenir

Les enregistrements electrphysiologiques nécassitant le prélèvement de tissus nerveux, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet portant sur l’étude d’un système intégré et mature, il nous a été impossible de remplacer l’utilisation d’animaux par des tests in-vitro.

Réduction

Nous prévoyons un nombre d’animaux suffisant pour d’obtenir des résultats exploitables en termes statistiques. Le nombre d’animaux prend en compte les deux sites d’enregistrement nécessaires (moelle épinière et hippocampe) ainsi que les variabilités interindividuelles nécessitant un certain nombre d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests paramétriques.

Raffinement

Notre étude s'interesse à l'impact de l'environement sur les nouveaux-nés. Pour pouvoir comparer nos groupes d'animaux, il nous faut un environnement enrichi tout en étant le plus homogène possible. Ceci nous permets d'étudier uniquement l'impact de la séparation maternelle. Les animaux sont ainsi hébergés en cage collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à leur disposition de la frisure pour nid, un bâton à ronger et un tunnel. Ils sont placés en conditions de températures et hygrométrie contrôlées, en cycle jour/nuit de 12h/12h avec eau et nourriture ad libitum. Durant la séparation maternelle néonatale, les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante afin d'éviter toute hypothermie.

Choix des espèces

Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle qui est bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3e trimestre de gestation chez l’homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie post natales chez le rat. Nous utiliserons des rats agés de 30 et 50 jours postnataux, une période qui correspond à la phase de maturité du système nociceptif. Les précédentes études portant sur l’hypersensibilités nociceptives des animaux séparés maternels chez le rat jeune et adulte, le projet continuera sur cette ligne en faisant des enregistrements électrophysiologiques in vitro chez des animaux à un stade de développement équivalent

3 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules tumorales injectées sous la peau ou directement dans le pancréas par chirurgie, puis jusqu'à six prélèvements de sang sous anesthésie. Le porteur reconnaît une douleur modérée au réveil et pendant la croissance de l'adénocarcinome pancréatique, et justifie l'effectif par le "standard de la littérature internationale". Il écrit que les organoïdes remplaceront l'expérimentation animale "à moyen/long terme", tout en concluant que le recours aux animaux non-humains revêt ici "un caractère obligatoire".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier l’impact de l’hétérogénéité des macrophages sur le développement tumoral, la réponse immunitaire et l’efficacité anti-tumorale d’immunothérapies déjà existantes. Le but ultime est l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces que ceux existants. Il a été établi depuis des décennies que l’abondance des macrophages dans les tumeurs était un marqueur de pronostic pour les patients atteints de cancer et ce quel que soit le cancer considéré. En clair, plus la tumeur contient de macrophages, plus le pronostic est mauvais. Mais ces observations cliniques restent en grande partie inexpliquées en raison de notre méconnaissance des fonctions des macrophages associés aux tumeurs (TAM). Récemment, des approches moléculaires ont révélé une très grande plasticité des macrophages dans les tissus sains mais également dans les tumeurs avec la co-existence de diverses sous-populations de TAM. L’objectif principal de ce projet est la caractérisation des phénotypes et fonctions de tous les TAM dans différents modèles murins de cancer. La cartographie des TAM murins sera ensuite utilisée pour analyser les données humaines existantes afin d’identifier ces différentes sous-populations et mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’étudier l’impact de l’hétérogénéité des macrophages sur le développement tumoral, la réponse immunitaire et l’efficacité anti-tumorale d’immunothérapies déjà existantes. Le but ultime est l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces que ceux existants.

Procédures

Les animaux seront soumis à des chirurgies sous anesthésie générale pour l'injection orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas. Cette injection durera moins de 15 minutes et sera faite une seule fois. Les injections sous la peau de cellules tumorales seront faites sous anesthésie, une seule fois et dureront moins de 5 minutes. Les animaux pourront avoir des prélèvements de sang sous anesthésie, durée moins d'une minute, nombre maximum: 6.

Impact sur les animaux

L'injection en sous-cutanée de tumeur entraînera une gêne légère et transitoire à l'injection puis modérée après croissance. L'injection dans le pancréas pourra entraîner une douleur modérée au réveil et lors de la croissance des tumeurs. Etant donné que la tumeur croit en orthotopique dans le pancréas, les conséquences seront modérées pour les animaux (adénocarcinome pancréatique), légère perte d'appétit possible avec perte de poids. Les prélèvements de sang entraîneront un inconfort léger et transitoire dû à la préhension et à l'anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses des tumeurs et organes post-mortem.

Remplacement

Ce projet nécessite l’établissement de tumeurs dans des conditions réelles pour la mise en évidence de sous-populations d’intérêt. Nous travaillons d’ailleurs en parallèle sur une approche de type « organoïdes » avec laquelle des tumeurs sont re-créées en 3 dimensions dans des boites de Pétri pour créer des avatars de patients. Bien que ces approches soient très clairement vouéés à un développement exponentiel et remplaceront à n’en pas douter l’expérimentation animale à moyen/long terme, elles ne peuvent à l’heure actuelle s’y substituer et il est très difficile de résumer le microenvironnement tumoral naturel qui engendre la diversité de phénotypes cellulaires observés chez les patients. De plus, notre stratégie de suivi temporel de la différentiation de monocytes naïfs en macrophages associés aux tumeurs nécessite l’interaction de ces cellules avec les cellules tumorales tout au long du développement de la maladie. L’utilisation de modèles animaux pour ce projet revêt donc un caractère obligatoire.

Réduction

Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expériementaux est réduit à son minimum pour pouvoir tirer des conclusions solides des expériences proposées. Il est conforme au standard de la littérature internationale. Même si cela nécessite l'utilisation de nombreux animaux, cela garantit la validité scientifique des résultats obtenus et justifie ce nombre. Les nombres minimuax ont été déterminés gra^ce à des tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans un environnement enrichi (sizzlenests + maisons en carton). Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe de recherche pour une évaluation clinique adaptée. Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale ou générale . Les souris auront un examen clinique et seront pesées quotidiennement. Les points limite seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme - Modèles de devenir des types cellulaires impliqués dans le cancer performants et originaux - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité et l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines du fait de la population de patients.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant cinq injections intrapéritonéales en cinq jours, deux échocardiographies de trente minutes sous sédation et une ligature de l'artère coronaire gauche sous intubation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La chirurgie provoque un infarctus du myocarde, dont le projet veut suivre la réparation en inactivant un gène chez l'animal adulte. Les retombées annoncées pour les cœurs humains endommagés sont renvoyées au long terme. Le porteur écrit s'attendre à "une légère douleur en raison de l'incision de la peau et de la dissection d'un seul petit muscle intercostal".

Objectifs

La cardiopathie ischémique et l’infarctus du myocarde sont des causes majeures de mortalité dans nos sociétés. Nous proposons d’étudier l' impact du gène de notre intéret dans le processus de réparation tissulaire post infarctus du myocarde. La létalité embryonnaire des animaux deficients du gène a empêché la vérification de cette hypothèse. Nous allons développer plusieurs modèles de souris transgéniques permettant l’induction d’une inactivation spécifique du gène de notre interet chez les souris adultes, permettant ainsi de répondre à ces objectifs et de mener les études par: - un suivi clinique et échographique des animaux, - une étude des processus de régénération cellulaire, de néovascularisation, de régulation de l’inflammation par la définition des types cellulaires et des voies de signalisation moléculaires impliqués. Notre projet représente une analyse approfondie de la signalisation médiée par ce gène dans le processus de l’homéostasie du myocarde et la réparation du coeur. Nous étudierons le rôle du gène au cours de l’infarctus du myocarde par une multitude d’approches génétiques: en induisant une délétion conditionnelle du gène de notre interet dans 1) les cellules progénitrices myéloïdes et vasculaires, 2) les cellules vasculaires uniquement, et 3) les cardiomyocytes, en utilisant un système inductible pour le knock-out chez les animaux sains et adultes.

Bénéfices attendus

Dans l’ensemble, ces expériences permettront de déterminer les voies de signalisation dépendant du gène de notre interet après un infarctus du myocarde et impliquées dans la régénération et la réparation du coeur et d’identifier les processus moléculaires activés par ces voies de signalisation. A long terme, ces données permettront de développer de nouvelles approches pour le traitement des coeurs endommagés suite à un infarctus du myocarde.en

Procédures

Pour chaque souris: 1) 5 injections intra-péritonéales (30 secondes) pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. 2) 2 mesures échocardiographiques (30 minutes), realisées sous sédation (Isoflurane 2%) et en ventilation spontanée pour chaque souris. 3) 1 chirurgie de l'artère coronaire gauche sous anesthésié avec l’isoflurane et intubation (30min).

Impact sur les animaux

Pour chaque souris: 1) 5 injections intra-péritonéales (30 secondes) pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. Les injections intra-péritonéales sont des gestes n'impliquant qu'une contention de courte durée (30 secondes) et une douleur légère. 2) 2 mesures échocardiographiques (30 minutes), realisées sous sédation (Isoflurane 2%) et en ventilation spontanée pour chaque souris. Nous n'avons jamais constaté aucune nuisance grave du à ce examen. 3) 1 chirurgie de l'artère coronaire gauche sous anesthésié avec l’isoflurane et intubation (30min). Apparition possible de angoisse, du stress, et des douleurs suite à l'intervention chirurgicale. On peut s'attendre à une légère douleur en raison de l'incision de la peau et de la dissection d'un seul petit muscle intercostal.

Devenir

Au terme de l'examen final, les souris sont mises à mort , le coeur est prelevé, pésé puis conservé pour analyses (immuno)histochimiques et moleculaires ulterieures.

Remplacement

L’homéostasie et le remodelage cardiaque sont des processus complexes. Bien qu’il existe des modèles in vitro, l’interaction entre différentes populations cellulaires (cardiomyocytes, cellules endothéliales, cellules immunitaires) ne peut être mimée par une approche in vitro. Après avoir déclenché un infarctus, il est important de suivre le coeur dans son environnement, ses échanges avec d’autres organes. En outre, les lignées transgéniques utilisées nous permettent d’observer, après l’infarctus, l’activation immédiate de voies de signalisation, d’identifier les cellules répondant à ces voies de signalisation. L'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant la physiopathologie du coeur chez le mammifère est donc essentiel, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. En effet, nous essayons de comprendre la fonction de gènes spécifiques dans la réparation du coeur. Notre projet s'appuie fortement sur des organismes génétiquement modifiés. La communauté scientifique a déjà généré un grand nombre de souches génétiquement modifiées qui peuvent être utilisées en combinaison avec des lignées générées dans notre laboratoire pour répondre à ces questions scientifiques (analyse de tissus-spécifiques de la fonction des gènes par l'intermédiaire du système Cre-lox). Notre stratégie est bien conçue pour une prise en compte des objectifs de remplacement, car nous avons déjà validé toutes les analyses moléculaires dans des systèmes de culture cellulaire ou purement biochimiques.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d'animaux utilisés, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Les mêmes animaux seront utilisés à la fois pour les études echocardiographiques et la réalisation des analyses histologiques et moléculaires.

Raffinement

Dans le sens du raffinement, l’anesthésie et l’analgésie seront utilisées comme premières méthodes pour limiter autant que possible la souffrance potentielle des animaux. Des points limites (PL) précises et adaptés seront évalués quotidiennement. Ils permettent l’arrêt de la procédure (mise à mort) dans tous les cas d’aggravation ou d’anomalies cités.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées comme modèle car leur physiologie et leurs mécanismes de réparation correspondent étroitement à ceux de l'homme. Les animaux adultes seront utilisés (25g, âgés de 24 à 30 semaines). Le choix de animaux adultes est justifie par le fait que les maladies cardiovasculaires concernent en majorité des adultes. L'autre raison pour le choix de souris adultes concerne la chirurgie d'un IDM laquelle est possible que avec des animaux adultes pour raison de leur plus grande taille.

Porteuses d'une mutation qui reproduit le syndrome NARP, ces souris présentent un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et un défaut musculaire attendus. 313 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux de sang et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang et d'urine à un, deux, quatre et six mois, des tests de force musculaire, de coordination et d'endurance sur tapis de course, rotarod et grip test, ainsi que des IRM et des échocardiographies sous anesthésie. Une grille de score commande la suite : entre 6 et 7, un antidouleur puis la mise à mort si rien ne s'améliore en vingt-quatre heures, entre 8 et 9, la mise à mort immédiate.

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

Mis à jeun douze heures, gavés une fois par voie orale, saignés à l'extrémité de la queue deux minutes plus tard : 640 souris et 320 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans anesthésie jusqu'à la mise à mort. Le protocole vérifie si des peptides vecteurs franchissent la paroi intestinale pour passer dans le sang, une technologie que la société veut étendre du cerveau à l'intestin. Le porteur reconnaît un risque de fausse route et de complication respiratoire si le gavage est mal exécuté, et présente le recours aux animaux non-humains comme le "principal désavantage" de sa demande. Tous reçoivent une dose létale d'anesthésique, puis leurs tissus sont prélevés.

Objectifs

Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et développer une stratégie de vectorisation innovante, afin de proposer de l’adressage spécifique de médicaments au niveau du système nerveux central après administration parentérale. Ce transport est réalisé à l’aide de protéines ou peptides cargos qui ciblent spécifiquement les récepteurs membranaires situés aux niveaux des barrières cellulaires de l’organisme, dans notre cas, la barrière Hématoencéphalique (BHE) du cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières collaborations internationales ont démontré tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements contre certaines neuropathies. Cet engouement a permis de développer de nouveaux axes de recherches, notamment sur certaines maladies chroniques liées à l’hygiène de vie (Cancers, Diabètes, obésités), devenues le fléau de ces 20 dernières années. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et utiliser notre technologie pour franchir de nouvelles barrières cellulaires de l’organisme, cette fois-ci au niveau intestinal, en améliorant l’adressage de médicaments administrés par voie orale. Il s’agira dans cette demande de démontrer qu’après administration orale chez le rongeur, nos protéines et peptides vecteurs seront capables de résister aux contraintes et attaques du tube digestif (Enzymes, pH), puis de valider leur passage spécifique à travers la barrière épithéliale, de l’intestin vers le sang.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons tester le potentiel d’action de nos vecteurs sur de la délivrance systémique par voir orale. Notre objectif sera donc de relever ce nouveau challenge et de transposer notre savoir-faire et technologique sur de l’application « Drug-Delivery » par voie orale. Ainsi, nous pourrions proposer de nouveaux concepts et alternatives thérapeutiques facilitant le quotidien des soignants et des patients par un meilleure accessibilité (traitements devenus trop coûteux ou trop contraignants), conservation et praticité. L’application de notre stratégie de vectorisation pourrait également servir de levier dans bon nombre de pathologies à enjeux de santé publique.

Procédures

Au cours de cette procédure, nous n'aurons pas d'anesthésie, ni d'étape chirurgicale. Les animaux seront uniquement manipulés éveillés et de manière délicate. L'absence de stress est ici un garant du succès et bon déroulement de la procédure. En point final, les animaux seront d'abord mis à mort avant le prélèvement tissulaire final. -Constitution des cohortes d'animaux : Manipulation douce et unique pour la pesée et l'annotation codale des animaux, pour une durée de 2 minutes. -Administration par voie orale : Gestes et manipulations ultra-précis pour réaliser correctement cette étape. Administration simple et unique sans intervention parentérale, pour une durée de 1 minutes. -Prélèvements sanguins intermédiaires : A l'extrêmité de la queue afin d'y collecter quelques gouttes de sang. Geste contentionné expert et précis qui réduit considérablement le stress. Durée Approximative 2 minutes. -Mise à mort pour prélèvements (sédatoin à dose létale + contastation du décès) : Contention manuelle rapide et précise pour réaliser l'injection intrapéritonéale du mélange d'anesthésique à dose létale.

Impact sur les animaux

Les possibles effets ou effets indésirables sont ici listés pour chacunes des manipulations/expérimentations. -Transport et adaptation : Le transport est une source de stress non négligeable dont il faudra tenir compte avant d'envisager les tests. -La stabulation peut engendrer un temps d'adaptation, du stress, ayant un impact sur l’alimentation et le comportement, donc la prise de poids. -Mise à jeun des animaux : Nécessaire à la bonne réalisation de l'étude, les animaux seront mis à jeun 12h avant le début des administrations. Cette phase relativement courte, induira un léger stress transitoire, mais n’aura pas de réel impact sur la santé des animaux. En effet, les données de la littérature démontrent une absence d’effets significatifs sur le poids et l’activité métabolique en cas de mise à jeun inférieure à 18h. -Administration per os (Gavage par voie orale) : Réalisée sur animal éveillé et contentionné manuellement, il est ainsi immobilisé, ce qui génère un certain stress. L'acte de gavage est une gêne évidente mais très brève. Si le geste n’est pas bien réalisé, il y a cependant un risque notable de fausse route et de complication respiratoire. -La manipulation pour la réalisation des prélèvements sanguins intermédiaires : De même que pour le gavage, cette étape sera réalisée sur animal éveillé, après immobilisation en contention spécialisée. L'animal n'aimant pas être coincé, c'est une source de stress (≤2 min). -La manipulation pour l’administration d’une dose létale d’un mélange d’anesthésique : Source de stress au moment de l'injection intrapéritonéale, le geste rapide sera totalement maîtrisé par le manipulateur.

Devenir

L'issue de l'étude étant le prélèvement de tissus, tous les animaux seront mis à mort en point final, par administration d'un anesthésique à dose létale.

Remplacement

Afin de mener à bien notre projet, nous n’utiliserons que nos vecteurs préalablement investigués sur des études in vitro (cellules) ainsi qu’in vivo sur des récents suivis pharmacocinétiques et de biodistributions. Ces premières séries de tests amonts ont notamment permis de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires cibles (cultures cellulaires, mesure d'affinité pour le réceptuer cible), mais restaient insuffisantes pour prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations). Afin de transposer notre modèle de pharmacologie pour de la voie orale nous devrons absolument envisager de réaliser notre administration orale sur le petit animal de laboratoire, ici le rongeur (rat et souris). En effet, la physiologie complexe du tube digestif nous impose l’utilisation de modèle vivo. Des modèles prédictifs ex vivo existent mais nécessitent également le sacrifice d’animaux, sans pour autant intégrer l’ensemble des mécanismes physiologiques périphériques précédemment cités. Afin d’éviter une utilisation encore plus importante d’animaux, notre procédure simple, sur de courtes cinétiques, avec des prélèvements optimisés (intermédiaires et finaux), restera la plus avantageuse en termes de résultats scientifiques pour un nombre d’individus utilisé. Le choix du modèle rongeur se justifie comme étant pour l’heure le 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques, sans trop de contraintes d’hébergement, ni de manipulations. Son utilisation sous forme de faibles cohortes permet d’exploiter au maximum les résultats par l’obtention de données statistiques significatives. Malheureusement, il n’existe pour le moment aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes ces réponses ou suffisamment complexe et informel tel que les organoïdes ou sphéroïdes. Dans notre cas, le principal désavantage de cette demande reste donc le recours indispensable à l’utilisation d’animaux. Il s’agit maintenant de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus à utiliser.

Réduction

Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 5 groupes par test et 8 études par an, ce qui représente 160 individus/an (80 mâles + 80 femelles) pour chacun des fonds et espèces utilisées. Tel que largement décrit dans la littérature pour un modèle « oral delivery », nous utiliserons dans un premier temps le modèle souris sur fond albinos, à raison de 160 individus par an. En parallèle nous voudrons vérifier nos données obtenues sur un autre modèle souris, de fond consanguin, pour un nombre équivalent d’animaux (maximum 160/an). En effet ce modèle utilisé dans nos précédentes études Pharmacologiques sera précieux pour de futurs essais sur récepteurs humanisés en vue d’une transposition à l’homme. Enfin, le modèle souris présentant certaines divergences fonctionnelles et un modèle plus développé, sera indispensable dans nos investigations. Nous travaillerons à la suite des deux précédents, sur rats de fond albinos standard, pour un gros maximum de 160 individus/an. Il est important de noter que pour chaque espèce, ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus), sera suffisant et nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile d’animaux et permettra d’optimiser la procédure sur plusieurs types de post-expérimentations. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (Maximum 1 prélèvement caudal/individu ≤50 μl) en cours de cinétique, permet d'obtenir des données précieuses sur le passage systémique de nos candidats, en plus du prélèvement en point final, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal (Annexe 2 : grille scores et points limites). Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 14 jours dès réception. 7 jours avant les administrations, les animaux seront sortis de l’hébergement conventionnel pour aller dans une pièce cyclée spécifique rats ou souris (cyclée12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle à filtre), un maximum de 2 individus par cage (car groupes n=4 mixtes de 2 mâles + 2 femelles), litières (copeaux de bois) et double raffinement (maison en plastique + cartons déchirés). Les animaux y seront visités régulièrement afin d’être sensibiliser à l’expérimentateur. A J0, les manipulations et administrations se feront sur animaux éveillés, il n’y aura pas d’anesthésie en cours d’étude jusqu’à la mise à mort en point final. En cours d’étude, les pesées, administrations et prélèvements intermédiaires de sang seront précis et rapides (≤ 2min). Des points limites seront malgré tout établis, afin de pouvoir répondre à une situation d’urgence. En point final, une injection létale d’anesthésiques en intrapéritonéale permettra une mise à mort rapide des animaux sans stress ni douleur. Nous n’utiliserons ici que des animaux couramment utilisés en recherche pour des études de pharmacocinétiques, sur fonds albinos ou consanguins et non génétiquement modifiés.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études de pharmacocinétiques (groupes de 4 individus). A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur (souris et rat), reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Les animaux seront utilisés pour réaliser des cinétiques pharmacologiques périphériques et des échantillonnages de sang et tissus. Pour notre procédure et les trois lignées d’animaux (rat x1 et souris x2) nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 10 semaines pour les souris et 6 à 8 semaines pour les rats. A cet âge, nous limitons les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Cet âge présente un poids moyen de 25-27g environ chez la souris et 120-140g chez le rat, ce qui s’avère plus économique et mois risqué en termes de posologies par rapport à des animaux plus âgés (réduction des doses).

Certains poissons subissent une montée de la température de l'eau jusqu'à perdre l'équilibre, pendant deux heures au maximum, pour déterminer leur température critique. 2 000 chevaines et spirlins pêchés dans le Rhône vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 800 tués pour l'analyse de leurs cellules et 200 relâchés sur leur lieu de capture. Chaque individu est anesthésié pour être marqué, puis à chaque transfert entre bassins, et reste isolé jusqu'à vingt-quatre heures dans un tunnel de nage. Le porteur inscrit ce travail dans un objectif de conservation des espèces du Rhône, et mentionne 800 poissons supplémentaires tués sans expérimentation préalable, qu'il choisit de ne pas comptabiliser dans le tableau récapitulatif.

Objectifs

Une augmentation de la température environnementale peut entraîner des conséquences dramatiques sur les organismes, notamment chez les animaux ectothermes, dont la température corporelle dépend directement de la température ambiante. Ce projet vise à comprendre comment les poissons d’eau douce vont réagir face au réchauffement global. En effet, une augmentation de la température de l’eau entraine une augmentation des dépenses énergétiques des organismes, ayant pour conséquences directes une diminution de la croissance et de la reproduction. Depuis plusieurs années, le réchauffement de la planète est un phénomène qui s’accélère et donc les organismes doivent mettre en place des mécanismes adaptifs plus rapidement s’ils veulent survivre. Pour ce qui est des réponses à la contrainte thermique, 2 principales hypothèses se dégagent : (1) les individus vivant dans des milieux relativement chauds pourraient être plus résistants et mieux adaptés au réchauffement et aux périodes de stress thermique par rapport aux individus vivant dans des milieux plus frais ou (2) le fait de vivre dans des conditions thermiques suboptimales pourrait rendre les organismes ectothermes plus sensibles aux stress subséquents. Cette étude a pour but de définir des températures de tolérance pour les espèces du Rhône et de mettre en lumière les mécanismes d’adaptation à long terme et/ou d’acclimatation plus rapide face à une augmentation des températures. Afin de pouvoir étudier ces réponses physiologiques, deux espèces de poissons seront utilisées comme modèles expérimentaux : le Chevaine, espèce eurytherme présente partout dans le Rhône et le Spirlin, espèce plus abondante en aval des centrales nucléaires productrices d’énergie (CNPE), là où l’eau est plus chaude. Cette zone plus chaude pourrait être considérée comme une condition future étant donné le réchauffement actuel. Donc, étudier les différences d'adaptation entre les populations en amont et en aval s’avère pertinent. Le projet se fera le long du Rhône selon un gradient nord sud et donc les échantillonnages se feront sur 5 sites ; Brégnier-Cordon (nord), en amont et en aval de la CNPE du Bugey, et en amont et en aval de la CNPE du Tricastin (sud) afin de pouvoir comparer les capacités d’acclimatation et les préférences thermiques des différentes populations selon leur lieu d’origine.

Bénéfices attendus

L’étude des conséquences du réchauffement climatique sur la physiologie des poissons d’eau douce est au centre des préoccupations du grand public, des instances gouvernementales et des chercheurs. Ce projet s’inscrit directement dans cet axe d’intérêt, et les résultats obtenus permettront notamment de donner des réponses concrètes sur les effets d’une augmentation de température de l’eau afin de réfléchir à des directives de conservations des écosystèmes basées sur des données physiologiques. Cette étude va définir des températures de tolérance pour les espèces du Rhône et potentiellement permettre de mettre en lumière les mécanismes d’adaptation et d’acclimatation face à une augmentation des températures. De plus, comme nous travaillons sur une espèce eurytherme (chevaine) et une que l’on retrouve de plus en plus en aval des centrales thermiques (spirlin), si ces poissons ont du mal à s’adapter au réchauffement des températures alors nous pouvons supposer que cet échauffement entraînera des conséquences d’autant plus délétères pour des poissons qui supportent moins bien le réchauffement et les variations de température. Donc, ce projet a non seulement un but de caractérisation des adaptations à la température, mais aussi un but de conservation d’espèces plutôt endémiques du Rhône. Le protocole de CTmax permet de définir la température maximale de tolérance thermique, qui n’a jamais été documentée pour les deux espèces étudiées ici. Les protocoles de mesures croisées (répétition de 3 performances de nage à 3 différentes températures) sont indispensables pour élucider les mécanismes d’acclimatation et les réponses aigues aux différentes températures, et le métabolisme énergétique pourra être ainsi abordé selon une double approche in vitro et in vivo. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes adaptatifs mis en place chez différentes populations de poissons distribuées selon le gradient naturel « haut-Rhône » froid et « bas-Rhône » plus chaud d’une part et selon l’amont ou l’aval des deux CNPE d’autre part, mettant en exergue des variations environnementales provenant directement d’activités anthropiques. Ainsi, ce projet a pour but de participer aux efforts de conservation de la biodiversité et via une connaissance accrue des capacités d’adaptation de ces espèces, permettant de mieux appréhender comment ils pourraient réagir face au changement climatique.

Procédures

Suite à leur prélèvement en milieu naturel, tous les poissons seront acclimatés à l’animalerie et stabulés dans des conditions adaptées à leur espèce. Les poissons seront soumis à une anesthésie / analgésie afin de les implanter avec des marques pour les individualiser. Cette intervention dure au maximum 15 minutes par poisson. Les poissons seront ensuite soumis à une période de pré-conditionnement thermique (2 jours à 6 semaines selon la procédure). A chaque manipulation (lors des transferts entre les aquariums de stabulation et les enceintes expérimentales), les poissons seront légèrement anesthésiés afin de limiter le stress du déplacement. Cette anesthésie ne fera pas effet pendant plus d’une minute sur le poisson. Certains poissons subiront une augmentation de la température de l’eau jusqu’à perte d’équilibre (3h). Certains poissons seront mis à mort après une stabulation courte à l’animalerie. Certains poissons subiront des tests de préférence thermique (12h) puis 3 tests de performance de nage (

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de ces protocoles pourrait être un niveau de stress accru faisant suite à la pêche, à la stabulation dans un nouveau milieu, et/ou aux expérimentations. Cette augmentation du stress peut s’exprimer via l’apparition d’infections chez les poissons. En effet, les risques d’infections sont plus hauts que la normale car comme les poissons viennent de milieux naturels, on ne connaît pas leur histoire et ce qu’ils auraient pu rencontrer dans leur habitat. Un autre point de surveillance sera lié à la période d’isolement des poissons (entre 2h et

Devenir

200 individus seront replacés en liberté sur leur lieu de capture. 800 poissons seront euthanasiés sans expérimentation préalable et seront utilisés post-mortem pour la caractérisation des mécanismes cellulaires in vitro. 1800 individus seront euthanasiés pour la caractérisation des mécanismes cellulaires in vitro.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques, surtout lorsqu’il s’agit d’animaux sauvages. Cela permet notamment de caractériser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour étudier de façon complète, les réponses métaboliques de l’animal face à son environnement.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans cette étude. En effet, une forte variabilité interindividuelle est attendue du fait du brassage génétique et de l’impact des différents facteurs environnementaux du milieu naturel. La taille des échantillons a été ainsi définie pour permettre une analyse statistique fiable. Pour ce qui est de la procédure expérimentale pour obtenir la température critique maximale (CTmax), minimum 20 poissons par endroit d’échantillonnage sont nécessaires car comme expliqué ci-dessus, une forte variabilité interindividuelle peut entrer en jeu. Donc 5 endroits x 2 espèces x 20 individus = 200 poissons pour la CTmax au total. Pour les mesures de bioénergétique sur populations naturelles, il y a 5 endroits x 4 saisons x 2 pêches /an x 1 espèce (uniquement les spirlins) x 20 individus = 800 individus. Mais au vu de la courte durée de stabulation au sein de l’EU, ces individus utilisés uniquement post-mortem ne seront pas comptabilisés dans le tableau récapitulatif. Pour ce qui est de la procédure d’acclimatation à la température, 1800 poissons seront utilisés, soit 1200 spirlins (5 endroits x 2 pêches/an x 2 ans x 20 individus x 3 groupes) et 600 chevaines (5 endroits x 1 pêche/an x 2ans x 20 individus x 3 groupes) ; 200 poissons supplémentaires sont prévus afin de palier d’éventuelles morts spontanées.

Raffinement

Lors des protocoles non invasifs in vivo (mesure de la consommation d’oxygène associée aux performances de nage et tests comportementaux), un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesure et placement des poissons dans les tunnels de nage) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h dans le tunnel de nage, avant le protocole de nage (Ucrit) ou de 2h dans les arènes de choix. Après chaque expérience, les poissons seront replacés dans leur aquarium de stabulation et toutes les précautions seront prises pour leur éviter toutes nuisances visuelles et sonores. Les poissons sont maintenus dans des aquariums de 60L ou 90L en densité adaptée à leur espèce. Les spirlins et les chevaines juvéniles sont des poissons vivant en banc. Ils seront donc maintenus à plusieurs dans les aquariums (environ 30 par bac) afin d’optimiser les conditions de stabulation. Des cachettes adaptées (tubes de gros diamètres leur permettant de se cacher en banc), des plantes artificielles et du gravier sont disposés dans chaque aquarium. Un système de pompe filtrante assurera également une circulation d’eau bullée continue dans les aquariums. Les poissons seront nourris une fois par jour, avec des cubes de moules hachées avec du mix (différentes larves de moustiques, daphnies et de la verdure (épinards, spiruline)) et lors du nourrissage, leur comportement est observé. En effet, si un poisson ne se nourrit pas, des mesures seront prises à son égard. Une observation biquotidienne sera réalisée par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de veiller au bien-être des animaux depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à l’euthanasie. Les états de santé et de bien-être des animaux seront ainsi évalués en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d’évaluation afin de définir des points limites adaptés. Dès l’apparition de signes cliniques de mal-être, les animaux seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage. Dans le cas où des signes de douleur ou de mal-être devaient persister au-delà de 24 heures après la mise en stabulation, les animaux seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le chevaine est une espèce plutôt ubiquiste du Rhône, généraliste et eurytherme avec un panel de tolérance thermique large. Le spirlin est une espèce que l’on retrouve de plus en plus en aval des centrales thermiques ce qui laisse supposer une bonne adaptation à des variations de températures. L’étude de cette espèce dans des environnements thermiques élevés permettra d’évaluer précisément ses capacités d’acclimatation et d’anticiper l’impact délétère du réchauffement sur des espèces moins adaptatives. De plus, ces espèces sont en statut préoccupation mineure, sur la liste rouge UICN (Union internationale pour la conservation de la nature), donc les pêcher n’aura pas de grand effet sur les populations naturelles. Enfin, les organismes avec qui nous allons pêcher font des suivis de populations et sont donc au courant des statuts des différentes espèces dans le Rhône. Aucun prélèvement n’aura d’impact négatif sur les populations naturelles. Les spirlins utilisés sont des spirlins adultes. Leur petite taille (30 cm) étant incompatible pour une telle étude, seuls des chevaines juvéniles seront employés.