Procédures modérées

200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune hébergée seule et en cycle inversé pendant les neuf semaines du protocole. Pendant sept semaines, elles ont le choix entre une bouteille d'eau et une bouteille d'alcool, accès que le porteur qualifie de volontaire et non forcé. Suivent un examen IRM de 56 minutes sous anesthésie et un prélèvement de 300 microlitres de sang, soit 15 % du volume sanguin total, puis la mise à mort et le prélèvement des organes. Le porteur reconnaît que l'isolement peut stresser les souris et qu'une consommation excessive d'alcool peut les déshydrater, et attend de l'étude une vue globale du connectome susceptible de servir à de futurs travaux translationnels.

Objectifs

Le trouble de consommation de l’alcool induit des modifications cérébrales complexes, se caractérisant par plusieurs stades associés à des adaptations spécifiques. En effet, une exposition prolongée et répétée à l’alcool peut être à l’origine d'altérations dans la communication entre les différentes régions du cerveau. Par ailleurs, des différences dans la vulnérabilité à la dépendance et à la toxicité de l'alcool entre les sexes ont déjà été mises en évidence à la fois chez l'Homme et dans des modèles de rongeurs. Ainsi l'objectif de cette étude est d'identifier par IRM dans quelle mesure les altérations de la communication cérébrale dépendent du sexe lors d'une consommation excessive et à long terme d'alcool. C'est pourquoi, après une consommation chronique de 7 semaines, des souris mâles et femelles sous exposition volontaire à l'alcool seront caractérisées par IRM multimodale afin de detecter les modification de la communication cérébrale. Ce projet tend donc à répondre aux questions suivantes ; quelles modifications cérébrales sont induites par la consommation d'alcool à long terme, quelles sont les différences d'altérations entre les sexes, et comment ces modifications peuvent être liées ou même prédire un comportement addictif ?

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude devraient contribuer à mieux comprendre les conséquences au niveau de la connectivité cérébrale dans l'addiction à l'alcool à long terme;, et l'influence du sexe dans les modifications observées. Ce projet devrait apporter une vue globale de la réorganisation du connectome chez les souris exposées à l’alcool, tout en permettant de cibler les aires cérébrales présentant des altérations spécifiques, et pouvant servir de cibles pour de futurs études translationnelles.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) un protocole volontaire d'accès intermittent au choix entre 2 bouteilles : alcool versus eau pendant 7 semaines. 2) un examen IRM sous anesthésie incluant : un séquence d'IRM fonctionnel (16 minutes), une séquence d'IRM anatomique (10 minutes) et une séquence d'IRM de diffusion (30 minutes). 3) Un prélèvement sanguin de 300 µl maximum (15 % du volume sanguin total) réalisé sous anesthésie. Par ailleurs, les souris seront hébergées individuellement et en cycle inversé pour toute la durée du protocole, c'est-à-dire 9 semaines.

Impact sur les animaux

Le protocole de préférence de consommation de la solution d'alcool par rapport à l'eau par les souris est basée sur une action volontaire et non forcée. Des études précédentes chez la souris ont montré que le protocole induit une augmentation de la consommation après 2-3 semaines d’exposition. Cette consommation se stabilisent par la suite mais sa chronicité pendant 7 semaines reproduit le passage vers l’addiction à l’alcool, comme observées chez l’homme. Le protocole ne teste pas l’état de sevrage des souris car l’exposition à l’alcool n’est pas arrêté de manière prolongé, limitant ainsi les possibles nuisances. Les souris peuvent cependant présenter un état de déshydratation suite à la consommation excessive d’alcool. Ce protocole exige par ailleurs que les souris soient isolées ce qui peut induire un stress chez les animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements d’organes d’intérêts.

Remplacement

Le modèle animal est, pour le moment, le seul modèle qui permet d’étudier dans son ensemble les phénomènes complexes mis en oeuvre dans l'addiction à l'alcool au niveau cérébrales à l'échelle du connectome. En effet ces atteintes sont multifactorielles, nécessitant un grand nombre d’acteurs, et toutes les conditions ne sont pas reproductibles fidèlement dans un modèle de culture cellulaire. L'utilisation de modèles murins pour le dévéloppement du projet est crucial. L'alcoolisme est une pathologie hétérogène qui implique une grande variabilité des profils symptomatiques. L'étude chez l'animal permet un suivi au cours du temps (du développement du modèle à l'établissement du phénotype de consommation excessive d'alcool) et un contrôle de l'historique de consommation incluant les niveaux de consommation, ses caractéristiques temporelles, ainsi que de l'environnement de l'exposition. Ce suivi est crucial pour l'identification et la caractérisation des phénotypes de consommation d'alcool et pour identifier les facteurs déterminants dans le passage à la consommation compulsive. Ces informations phénotypiques seront corrélées aux informations sur la connectivité cérébrale, mais également aux analyses cellulaires et moléculaires du tissu cérébral, ce qui nous apportera des informations sur les mécanismes de pathologie liées à la consommation excessive d'alcool. Ces questions ne peuvent être évaluées de manière contrôlées que dans des études chez l'animal. Chez l'humain le suivi historique non biaisé est impossible, cette évaluation étant basée sur la consommation d'alcool auto-déclarée. De plus, les facteurs environnementaux (stress, début de la consommation, comorbidités) sont des facteurs difficilement intégrables dans les études chez l'homme. Il n'est pas non plus possible de réaliser des prélèvements tissulaires chez l'humain. Le lien, entre des variables spécifiques (comme la quantité de consommation d'alcool), les phénotypes (comme le comportement de consommation compulsive) et les caractéristiques de la connectivité, permet la découverte de médicaments pour cibler des caractéristiques temporelles et catégorielles spécifiques de l'alcoolisme, dans le but de diminuer la consommation et éviter le passage vers l'addiction. Les médicaments ciblant l'alcoolisme pourraient influencer les jours d'abstinence, les niveaux d'alcool ou les changements de profils, qui ne peuvent être évalués avec précision que dans un cadre longitudinal et contrôlé.

Réduction

Le nombre de souris est réduit au minimum d’animaux nécessaires afin d’assurer l’efficacité des tests et obtenir des résultats fiables en fonction des expériences réalisées. Le nombre d’animaux pour l’analyse des résultats a été calculé à l’aide de tests statistiques et notre expérience montrant une forte variabilité des phénotypes de consommation d’alcool, amenant à 50 souris par groupe nécessaires pour analyser les résultats d'expérience IRM, conduisant à un total de 200 animaux

Raffinement

Le stress potentiellement engendré par la pratique expérimentale sera limité au maximum. A leur arrivée à l’animalerie, les souris bénéficieront d’une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement de 2 semaines. Dans les cages d'hébergement, l'environnement sera enrichi par des carrés de coton pour l’édification du nid, des morceaux de bois pour que les animaux usent leurs dents, et des tubes pour fournir un abri. Pour limiter l’impact lié à l’isolement des animaux, les cages seront placées l’une à côté de l’autre pour maintenir les contacts olfactifs et visuels. Afin d’habituer les souris à la consommation d’alcool, le protocole d’accès intermittent au choix entre deux bouteilles comprend d’abord un accès pendant la première semaine à des bouteilles contenant un pourcentage croissant d’alcool. Durant l'examen IRM, le raffinement sera respecté par l'usage d'un anesthésie afin de réduire au maximum le stress de l'animal. Les yeux des animaux seront protégés du dessèchement grâce à l’application d’un gel de protection. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage. En cas de chute de la température et/ou de la respiration non gérable, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM. Il sera alors placé dans une cage mis sous une lumière chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.

Choix des espèces

Pour ce projet nous utiliserons des souris mâles et femelles. Cette souche de souris est la plus utilisée dans l'étude du comportement lié à l'alcool. Les souris seront âgées de 8 à 10 semaines, étant l'équivalent de l'âge adulte chez l'homme. A cet âge, les souris ont atteint leur taille et poids adulte, ce qui permet une meilleure reproductibilité des résultats.

Porteurs pour une partie d'entre eux de récepteurs à l'ocytocine génétiquement modifiés, 12 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une à trois neurochirurgies d'une journée sous anesthésie générale, pour l'injection de marqueurs intracrâniens, l'implantation d'électrodes puis leur retrait, ainsi que deux IRM, un scanner et quatre examens de tomographie par émission de positons, tous sous anesthésie. Ils reçoivent en plus une injection intramusculaire trois fois par semaine pendant dix semaines, avant des séances d'observation en volière portant sur des intrusions dans leur territoire. Le porteur prévoit des micro-lésions cérébrales dues à la présence des électrodes, annonce la mise à mort de 4 macaques à des fins scientifiques et présente les 8 autres comme candidats à la reproduction en centre de primatologie, ou à défaut au placement en sanctuaire, sous réserve de l'évaluation rétrospective.

Objectifs

L'espace est une ressource limitée pour de nombreuses espèces, les poussant à délimiter et à défendre leur territoire. L’objet de ce projet est de comprendre les mécanismes neuronaux qui régulent le comportement territorial. Ce comportement est à la source de nombreux conflits, chez l’humain comme chez l’animal, lorsqu’un individu franchit les frontières d'un territoire. Nous faisons l’hypothèse que l'ocytocine (OT), un neuropeptide hypothalamique connu pour son rôle de régulation sociale chez les mammifères, module l'activité neuronale dans les zones clés liées à la perception de l’espace dans le processus d'appropriation et de défense territoriale. Notre étude se concentre sur le macaque dont les systèmes neuronaux et comportementaux sont proches de ceux des humains. Des données préliminaires suggèrent que la distribution des récepteurs d'ocytocine diffère considérablement entre les rongeurs et les primates, ce qui justifie notre choix du macaque comme modèle. De plus, la régulation territoriale chez le macaque repose davantage sur des indices visuels et des règles sociales hiérarchiques que sur des indices olfactifs, comme c'est le cas chez les rongeurs. Nous analyserons comment les neurones spatiaux et émotionnels réagissent aux changements territoriaux tels que l’approche d’un intrus sous l'influence de l'ocytocine. Comprendre ces mécanismes pourrait éclairer les conflits territoriaux humains et les moyens de les résoudre.

Bénéfices attendus

1. Le projet apportera une connaissance approfondie de l'anatomie du système oxytocinergique chez le primate, de son effet sur l’activité neuronale au sein du complexe amygdalo-hippocampique, Ces données sont impossibles à obtenir chez l'humain du fait de l'impossibilité de faire des marquages pré mortem qui seront révélés dans l'anatomie post mortem. 2. Ce projet renseignera sur les systèmes neuronaux qui contrôlent les comportements sociaux et territoriaux ainsi que leur modulation par l’action de l'ocytocine. 3. Le projet permettra d'apporter des éléments sur la faisabilité et l'action potentielle des approches pharmaco-génétiques pour agir sur le comportement et l'activité neuronale chez le primate non humain. Cette étape est essentielle au développement d’outils pharmaco-génétiques dans une perspective translationnelle. De fait, le projet vise à ouvrir la voie à la possibilité de manipulation pharmacologique ciblant des zones spécifiques du cerveau humain afin de bénéficier à des patients ayant des troubles psychiatriques.

Procédures

Les animaux des deux premier lots seront soumis trois procédures chirurgicales sous anesthésie générale d’une journée : une première destinée à l’administration de marqueur intracrânien, une deuxième destinée à l'implantation d'électrode et la dernière à retirer les implants. Les animaux seront aussi soumis à 2 examens d'imagerie par résonnance magnétique et de CT scan d’une durée d’une ½ chacun, et 4 examens de tomographie par émission de positon, couplés à des prises de sang pour des dosages hormonaux (1/2 journée). Les animaux seront mis sous anesthésie générale pour ces 1examens. Les animaux recevront une injection intramusculaire par jour de ligands pharmacogénétiques 3x par semaine pendant 10 semaines avant des sessions de mesures comportementales en volière. Les animaux du deuxième lot seront soumis à un examen sous anesthésie générale d’une ½ journée et une chirurgie d’une journée.

Impact sur les animaux

Les animaux seront tous soumis à 1 ou 3 neuro-chirurgies (selon les lots) effectuées sous anesthésie générale. La chirurgie suscitera un inconfort post-opératoire passager. A terme, des micro-lésions cérébrales sont à prévoir, dûes à la présence d’électrodes dans le cerveau. Les aninaux recevront des injections intramusculaires qui peuvent génèrer une douleur localisée mais passagère. Nous nous attendons à ce que le produit injecté modifie le comportement territorial pour induire moins de compétition territoriale. Les animaux seront testés sans mise en conflit, mais plutôt en observant des intrusions dans leur territoire. Ces situations peuvent générer un stress passager, mais équivalent à un stress naturel. Les animaux seront aussi soumis à des examens d'imagerie par résonnance magnétique, radio (Tomographie à émission de positon) et les prises de sang capillaire à l’oreille pour des dosages, pour lesquels ils seront mis sous anesthésie générale, ce qui provoquera également un inconfort au réveil.

Devenir

A la fin du protocole, 8 des animaux subiront une chirurgie de dés-implantation et seront candidats à une réutilisation pour de la reproduction en centre de primatologie si l'évaluation rétrospective le permet. En cas contraire, ils seront candidats pour un replacement en sanctuaire. Par ailleurs, notre protocole nécessite l'euthanasie de 4 des animaux pour des fins scientifiques.

Remplacement

Dans notre cas, le remplacement des primates par d'autres espèces vertébrées ou non vertébrées, voire par d'autres espèces de primates n'est pas encore possible. Les humains ne peuvent pas être utilisés en raison de la nature invasive des méthodes expérimentales. Il est impossible d'injecter des marqueurs en prémortem pour effectuer du traceur anatomique et ni d’injecter des vecteurs viraux permettant de cibler les circuits anatomies précis chez l'homme et d'en vérifier les effets des manipulations sur le comportement. De même une approche in silico, ne permet pas d'appréhender ni la complexité des circuits anatomiques ni le comportement. Phylogénétiquement, le modèle d’étude pré-clinique (macaque) est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Aucun autre modèle animal ne présente ces caractéristiques.

Réduction

La taille de la cohorte a pour but d'utiliser le moins d'animaux possible permettant d’obtenir des résultats significatifs et généralisables. Nous déterminerons les effets de la manipulation du système ocytocynergiques en comparant les effets obtenus d’un agent activateur (ligand) chez des animaux porteurs de récepteurs modifiés de l’ocytocine (groupe test, n=6) et chez les animaux contrôle (n=4). L’utilisation du groupe contrôle permet de vérifier que notre effet est bien le fruit d’une activation des récepteurs modifiés et non, un simple effet du ligand. C’est pourquoi, la condition sans stimulation du groupe test ne peut être son propre contrôle. De plus, les résultats électrophysiologiques du groupe contrôle sont intéressants en soi car ils permettront d’établie une physiologie de base. Le nombre d’animaux a été déterminé selon une approche statistique conservatrice et, mais les expériences n’engageront pas 10 animaux simultanément. Nous procéderons au test d’une première cohorte, puis les données seront évaluées et complétées afin d’atteindre une significativité en procédant par étape, notamment en évaluant l’expression des récepteurs modifiés grâce à l’examen TEP (tomographie à émission de positon) chez le groupe test et la caractérisation de l’activité neuronale chez le groupe contrôle. Comme indiqué, les résultats du groupe contrôle seront traités même si le groupe test n’est pas continué, et complétés au fur et à mesure.

Raffinement

Plusieurs éléments de raffinement sont mis en œuvre : Recours à l’imagerie (IRM et TEP), qui se substitue pour la plupart des animaux à l’histologie post-mortem et permet d’envisager leur replacement en sanctuaire à l'issue des expériences. Utilisation de microélectrodes chroniques à contacts multiples de supprimer la phase de manipulation des électrodes et de réduire à minima les moments d’immobilisation de la tête. Les expériences seront conduites en conditions semi-éthologiques sans contrainte physique. Pré-entraînement par renforcement positif des animaux en salle de stabulation visant à réduire le temps et le stress induit par les prélèvements buccaux ou les injections. Nous utilisons des analgésiques, et anesthésiants pendant et après les chirurgies. La douleur et le comportement de l’animal sont scorés en post chirurgical, et le bien-être de l’animal est scoré de façon quotidienne. Enfin, les point limites stricts et spécifiques du projet sont déterminés et un score quotidien ou hebdomadaire est obtenu en fonction des étapes, et permet de mener les actions adéquates en fonction du score obtenu.

Choix des espèces

Notre projet utilise des singes macaques car certaines parties de leur cerveau et certains comportements sociaux que nous étudions ne se trouvent pas chez les rongeurs. Par exemple, les macaques utilisent principalement la vue pour comprendre leur environnement et montrent leurs émotions à travers leurs expressions faciales. Contrairement aux rongeurs, les macaques ont un système cérébral plus développé pour reconnaître les visages, les expressions faciales et interpréter le regard, ce qui est important pour réguler leur territoire. En utilisant des singes, nous pouvons mieux comprendre comment le cerveau traite ces informations. De plus, notre projet se concentre sur l'impact de l'ocytocine sur le comportement territorial. Chez les primates, les récepteurs de l'ocytocine sont présents dans plusieurs parties du cerveau liées à la vision et à l'attention, ce qui n'est pas le cas chez les souris. Nous allons également utiliser des techniques génétiques et pharmacologiques qui ont été efficaces chez les souris, mais qui nécessitent encore des tests chez les singes avant d'être appliquées chez l'homme. Nous travaillons avec des singes adultes car c'est à cet âge qu'ils développent un comportement territorial. Chez les macaques, les deux sexes participent à la défense du territoire. Ils vivent en groupes où plusieurs femelles cohabitent avec un mâle dominant, qui tolère quelques autres mâles. Les disputes territoriales ne sont pas seulement une question de hiérarchie, mais aussi de rivalité entre les groupes. En laboratoire, nous pouvons recréer cette situation en délimitant des "territoires" différents pour chaque groupe dans les volières.

Chaque rat reçoit un cathéter dans la veine jugulaire au cours d'une chirurgie sous anesthésie gazeuse pouvant durer une heure, avant onze prélèvements de sang étalés sur huit heures, un toutes les trente minutes. 48 rats Wistar mâles vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour le prélèvement de leurs organes. Ils sont hébergés seuls jusqu'à cinq jours, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress. Il annonce qu'entre l'administration de la dose unique et la mise à mort aucun effet indésirable n'est attendu, tout en indiquant qu'un des deux pesticides testés est classé cancérogène, tératogène et susceptible de nuire à la fertilité.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans un projet plus large qui consistera à étudier les effets de l’exposition périnatale à un cocktail de 2 pesticides administrés par voie alimentaire. En effet, les études de toxicologie sur les pesticides sont le plus souvent réalisées sur chaque substance séparément. Or combinées, même à faible dose, certaines molécules peuvent conduire à l’apparition ou à l’amplification d’effets toxiques. De plus, ces études sont très largement menées en utilisant la voie orale en gavant l’animal. Le gavage pouvant être traumatique pour l’animal mais aussi pour l’expérimentateur, de plus en plus, les études de toxicologie sont réalisées en utilisant un vecteur alimentaire pour exposer les animaux (eau, croquette, pâte, gelée, etc). Nous souhaitons ainsi étudier la toxicité lors d’une administration par voie alimentaire d’un cocktail de 2 pesticides. Pour pouvoir valider notre méthode d’administration et déterminer les quantités de pesticides distribués dans différents organes, il est nécessaire de pouvoir comparer les concentrations sanguines à différents temps de chacune des 2 substances après leur entrée dans l'organisme, seules ou en association via l’alimentation avec les profils obtenus par gavage. Pour cela, 9 groupes de 5 rats mâles adultes Wistar seront répartis ainsi: un groupe contrôle sans exposition sans huile et sans pâte, un groupe contrôle gavage (gavé seulement à l'huile), un groupe contrôle alimentation (seulement la pâte), un groupe exposé au cocktail de pesticides par alimentation, un groupe exposé au cocktail par gavage, un groupe exposé au pesticide 1 par alimentation, un groupe exposé au pesticide 1 par gavage, un groupe exposé au pesticide 2 par alimentation et un groupe exposé au pesticide 2 par gavage. Une procédure préliminaire sera réalisée pour mettre au point la technique de prélèvement de sang sur deux rats qui pourront selon les résultats être intégrés au groupe contrôle sans exposition sans huile et sans pâte.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra faire progresser les connaissances scientifiques sur le comportement des substances étudiées dans l'organisme afin d’améliorer les modèles de modélisation basés sur la physiologie liée à une exposition aux mélanges de pesticides et l’évaluation des risques sanitaires associés. Il permettra aussi d’avoir des informations essentielles pour la mise en place de méthodes d’exposition plus représentatives de l’exposition humaine et tout aussi efficace que le gavage. Les résultats de ce projet pourront ainsi, être une base intéressante pour d’autres expérimentations réalisées sur des animaux plus sensibles au gavage comme les rates gestantes.

Procédures

Chaque animal sera tondu une fois au niveau de la nuque et une fois au niveau de la gorge (durée inférieure à 5 minutes). Des prélèvements de sang seront réalisés en utilisant un cathéter. Celui-ci sera installé dans la veine jugulaire dans le cadre d’une chirurgie (une fois par animal) effectuée sur les animaux anesthésiés par un gaz. Cette chirurgie durera au maximum 1h. Au maximum, 11 prélèvements de sang seront réalisés sur 8h (toutes les 30 minutes). Chaque prélèvement durera moins d'une minute. Les animaux exposés par gavage, recevront une seule fois de l'huile de colza avec ou sans pesticides directement dans l'oesophage. Le gavage durera moins d'une minute. Les animaux exposés par voie alimentaire, mangeront volontairement une seule pâte avec ou sans pesticides. L'ingestion durera au maximum 30 minutes (si l'animal mange une partie puis pose la pâte avant de la reprendre). Les animaux seront isolés à partir de l'installation du cathéter jusqu'à la fin de chaque procédure soit au maximum 5 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à une dose unique de pesticides inférieure à la dose induisant la mort. De plus, un pesticide est de catégorie 2 pour la reproduction et le système nerveux et c'est un cancérogène/tératogène dû à la susceptibilité de nuire à la fertilité. Le deuxième pesticides de catégorie 3 est toxique en cas d'ingestion à de forte dose (supérieur à la dose induisant la mort). Les autres mentions de toxicité concerne les organismes aquatiques exposés chroniquement. Ainsi, entre le moment où les animaux recevront cette dose unique et leur mise à mort, aucun effet indésirable n'est attendu. Toutefois, les manipulations, comme la contention, et les manipulations lors des prélèvements sanguins peuvent provoquer du stress chez le rat. L’hébergement individuel des rats pourrait également être une nuisance causant du stress chez les animaux.

Devenir

Tous les rats seront mis à mort à la fin des prélèvements sanguins dans le but de prélever post mortem différents organes cibles pour effectuer des dosages afin de déterminer la pharmacocinétique.

Remplacement

Pour évaluer les temps de rétention de certaines substances chimiques dans l’organisme, des modèles mathématiques ont été mis en place à partir d'exposition chez l'animal (principalement chez le rat). Cependant, ces modèles n'existent pas pour les molécules étudiés dans ce projet, ni pour des mélanges de substances avec pour méthode d’exposition, le gavage et l'ingestion d'une alimentation contenant des pesticides. Une approche par des modèles physiologiques ne permettra pas de prendre en compte tous les organes impliqués dans la métabolisation y compris les compartiments éventuels de stockage tels que les tissus adipeux. L'espèce choisi sera le rat car les organes seront suffisamment gros pour effectuer tous les dosages nécessaires (il faudrait le double d'animaux si l'étude était réalisée chez la souris). La souche Wistar est une espèce docile et facile à apprivoiser ce qui facilitera les manipulations notamment lors du gavage et des prélèvements sanguins. Cette étude nécessite donc une approche in vivo.

Réduction

Pour ce type de test, au minimum 4 animaux sont nécessaires pour évaluer les différents temps de présence et l’imprégnation des organes à des substances chimiques (cf essai n° 417 de l'Organisation de coopération et de développement économiques). Dans ce projet, nous étudierons 4 animaux par groupe plus un animal supplémentaire afin de pallier au risque qu’un animal présenterait des effets pouvant impacter les résultats et devant alors être exclu de l’étude, soit 5 animaux par groupe pour l'étude la cinétique. Ainsi, le projet sera composé de 4 groupes exposés par gavage, un groupe contrôle non gavé et 4 groupes exposés par voie alimentaire. Trois animaux maximum permettront de mettre au point la méthode de prélèvement et pourront être inclus dans le groupe contrôle non gavé.

Raffinement

Les animaux seront quotidiennement observés selon différents critères établis dans une grille. Cette grille prendra en compte l’apparence, le comportement et certains signes cliniques permettant de déterminer un score. Selon le score obtenu, une action sera mise en place pour soulager au mieux l’animal. Les animaux seront hébergés plusieurs par cage et leur environnement sera enrichi (cylindres en carton, lanières de papier krafts, bâtons de bois à ronger) pour limiter le stress de l’animal tout le long de chaque procédure. Puis après la pose du cathéter, les animaux seront hébergés individuellement afin d'éviter toute blessure liée au cathéter entre congénères qui pourrait induire une infection et compromettre les résultats. Lors de la pose du cathéter, du sérum physiologique contenant de l’héparine sera injecté pour s'assurer du bon fonctionnement du cathéter et éviter la formation d'un caillot sanguin puis un bouchon sera placé pour éviter des possibles "fuites" de liquide biologique. L'extrémité du cathéter sera extériorisé pour réaliser des prélèvements de sang 3 jours plus tard. Pendant la période de récupération post-chirurgicale (3 jours), les animaux seront étroitement surveillés afin d'écarter toute douleur liée à l'installation du cathéter. Pour cela, en début et fin de journée, un examen clinique sera réalisé (selon les critères de la grille). En parallèle, afin de s'assurer du bon fonctionnement du cathéter, du sérum physiologique hépariné sera injecté dans le cathéter par un expérimentateur pendant que l'animal sera maintenu par un autre expérimentateur (contention classique). Une partie des animaux sera gavé avec une canule spécifique pour cette technique afin d'éviter tout dommage sur l'animal. Les prélèvements sanguins seront réalisés par le cathéter préalablement installé. Si l'animal est docile et apprivoisé, il sera seulement maintenu par un expérimentateur pendant d'un autre expérimentateur réalise le prélèvement.

Choix des espèces

Le modèle rat est une espèce de référence en toxicologie. En effet, il est un bon indicateur pour prédire les effets toxicologiques et le temps de présence dans le sang afin de définir des valeurs de référence pour éviter d’éventuels effets chez l’Homme. Les animaux étudiés seront des adultes (environ 2 mois pour un poids compris entre 300 et 400g) pour garantir un poids suffisant des organes d’intérêt et pouvoir comparer les résultats de l’étude avec les données disponibles dans la littérature qui sont majoritairement obtenues sur des adultes.

Dépilées sur le dos sous anesthésie puis exposées vingt minutes aux ultraviolets, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer une inflammation de la peau du dos, une perte de poids et des modifications de comportement. L'objectif est de caractériser des candidats analgésiques non-opioïdes en suivant l'action des cellules immunitaires de la peau et des neurones sensoriels. Les 30 souris ajoutées aux 270 calculées le sont pour parer à une éventuelle mauvaise qualité des ARN extraits, et les tests de sensibilité mécanique pratiqués sur animaux vigiles ne sont pas nommés.

Objectifs

Les solutions actuelles pour soulager la douleur des patients ont une efficacité limitée (effet de tolérance) et des effets secondaires graves. Actuellement les traitements disponibles pour les douleurs modérées et sévères/persistantes comme les opioïdes présentent de nombreux inconvénients. Ainsi, le développement de nouveaux médicaments pouvant traiter les douleurs aiguës est donc très important et s'avère d'une utilité publique majeure. C’est dans ce contexte que nous développons plusieurs nouveaux composés pharmaceutiques qui combleraient une lacune sur le marché de la douleur. Le rôle de ces composés ont déjà été démontré dans la gestion de la douleur, ainsi que dans la réparation des tissus. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les mécanismes moléculaires mis en jeu par ces composés pour moduler l’action des cellules immunitaires dans la régulation des voies de la douleur. La peau représente la première barrière physique contre les menaces extérieures et son intégrité est orchestrée par des cellules immunitaires résidentes spécialisées réparties dans les différentes couches qui la composent. La peau contient également un réseau dense de neurones sensoriels impliqués dans la perception du touché léger et de la douleur. De récentes études montrent également que le système nerveux sensoriel peut influencer l’activité des cellules immunitaires et ainsi optimiser les défenses contre une agression extérieure. Ainsi, pour répondre a ces questions nous avons choisis le modèle de lésions cutanés induite par une exposition aux ultraviolets (UV). Nous étudierons l’activité des cellules immunitaires de la peau et des neurones du système sensoriel (DRG) dans ces souris après exposition aux UV, traités ou non avec les différents composés pour déterminer l’impact du traitement sur la réponse immunitaire et la sensibilité mécanique.

Bénéfices attendus

La douleur est un problème majeur de santé public. Mieux comprendre comment TAFA4 module le système immunitaire dans les processus de mise en place de la douleur est primordial pour améliorer à terme le confort des patients atteints de douleurs chroniques et approfondir la compréhension de son mécanisme d’action. A terme, cette étude permettra de développer de nouveaux médicaments pour le traitement de la douleur inflammatoire sans effet secondaire. Des études précliniques réglementaires de toxicologie et de sécurité ont déjà été réalisées avec un composé utilisant le même mode d’action sans mettre en évidence d’effets secondaires, ni de phénomène d’accoutumance : problèmes majeurs des analgésiques actuellement sur le marché (opioïdes, paracétamol, etc...).

Procédures

Toutes les souris subiront une anesthésie générale afin de subir une dépilation sur la peau du dos puis une exposition aux UV pendant 20 minutes de la zone dépilée, toujours sous anesthésie. Nous réaliserons également des études de comportement pour tester la sensibilité mécanique induite par l’exposition aux UV sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à subir une irradiation aux UV qui pourraient induire une perte de poids, des modifications de comportement en plus d'une inflammation de la peau du dos. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en œuvre pour minimiser la nuisance provoquée. De plus une observation approfondie est effectuée quotidiennement à l’aide de la grille d’observation (Annexe) après la mise en place du modèle inflammatoire afin de prévenir toute complication.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des différents tissus est indispensable pour étudier le recrutement cellulaire de la réponse inflammatoire au niveau des tissus étudiés.

Remplacement

TAFA4 a déjà été testé pour son activité analgésique dans différents modèles de douleurs. Le recours à l’utilisation d’animaux est nécessaire pour appréhender l’effet analgésique sur ce modèle post-ultraviolets dans son contexte physiologique mettant en jeu le système immunitaire et le système nerveux sensoriel. De plus la douleur ne peut être dissociée du système biologique global de l’animal, ainsi l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Pour répondre convenablement aux réponses scientifiques soulevées, nous estimons le nombre minimal de souris nécessaires à 270 animaux, auquel nous ajoutons une marge de 30 animaux au cas où il serait nécessaire d’ajouter des animaux pour compléter l’étude (par exemple, si certains ARNs purifiés à partir des tissus prélevés n’étaient pas d’assez bonne qualité pour pouvoir réaliser l’analyse transcriptionnelle). Un total de 300 animaux est prévu pour cette étude. Ce chiffre a été déterminé après l’utilisation d’outils statistiques (logiciel GraphPad) permettant d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires avec une différence significative (p

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements complexes pour leur permettre de se comporter normalement. Les animaux sont élevés en présence d’objets permettant le raffinement de l’environnement dans des cages standards à toit ouvert (couvercle à filtre) avec de la sciure de bois utilisée comme litière et un accès ad libitum à un bidon d’eau et à un régime alimentaire standard. Nous utilisons alternativement des carrés de ouates pour que les animaux puissent faire un nid, des dômes en cellulose ou des tunnels en carton, qui sont changés chaque semaine. Les élevages sont effectués au sein d’un établissement agréé où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages et ainsi tous les jours l’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé. De plus, le week-end, la personne en charge du projet sera d’astreinte pour le suivi des animaux. D’autre part, le recours aux analgésiques est prévu dans le cas où l’état sanitaire des animaux le demandera (annexe grille de suivi). Nous avons recours à l’anesthésie/analgésie lors de l’exposition aux UV et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Une planification fine des procédures expérimentale sera effectuée (disponibilité des locaux d’expérimentation, du matériel, période d’acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation et dans l’animalerie) permettant de diminuer le stress des animaux et favoriser la validité des expériences. Notamment lors du test de la sensibilité mécanique, les animaux seront acclimatés à l’enceinte 30 minutes avant d’effectuer les mesures afin de diminuer leur niveau de stress. Enfin l’établissement des points limites selon la grille en annexe avec un suivi quotidien consistera en une vérification du poids, de la vivacité et de l’état du pelage des animaux avant de continuer l’expérience ou non en fonction des signes vitaux des animaux. Une souris ayant perdu 20% de son poids initial sera systématiquement euthanasiée. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.

Choix des espèces

Le niveau de similarité entre la souris et l’homme justifie son utilisation. L’état des connaissances actuelles, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaires et nerveux. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la souris et l’Homme. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires et une maturité développementale du système nerveux. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie pendant au moins une semaine

Capturés au piège dans leur milieu, 150 mulots sylvestres et mulots à collier sauvages sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés. Chacun subit sous anesthésie gazeuse une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire, geste que le porteur chiffre à trois minutes entre la sortie du piège et la fin du prélèvement. Le projet poursuit deux objectifs déclarés, former des étudiants de master aux métiers de la conservation et suivre les pathogènes des rongeurs sauvages. Le porteur admet un taux de mortalité de l'ordre de 3 % lié au piégeage, par arrêt cardiaque, rupture des cervicales ou refroidissement, et justifie le choix de ces deux espèces par leur abondance et leur "facilité de capture".

Objectifs

Le présent projet s’inscrit dans des objectifs de formation pédagogique et scientifique des étudiants de niveau Master ayant pour projet professionnel de travailler dans les métiers de l’environnement appliqués à la conservation d’animaux sauvages. Les objectifs sont i) de fournir un niveau de connaissance adapté à l’utilisation d’animaux de la faune sauvage à travers une approche éthique (présentation des comités d’étiques en expérimentation animale, règle des 3R,…) ; ii) initier les étudiants à la capture de Micromammifères (essentiellement le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus), le Mulot à collier (Apodemus flavicollis) et le Campagnol roussâtre (Myodes glareolus), potentiellement d’autres espèces sauvages moins abondantes ; le présent projet portera cependant uniquement sur les 2 espèces de Mulots, les autres espèces seront relâchées immédiatement, cf ci-dessous) ; iii) présenter les risques liés à la contention et les bonnes pratiques de terrain ; et iv) intégrer le bien-être animal en condition de captivité. Les échantillons récoltés avec les étudiants permettront ensuite de réaliser un suivi à long terme de l’état de santé des populations de rongeurs à l’échelle régionale et de maintenir une surveillance des pathogènes présents chez les rongeurs.

Bénéfices attendus

L’apport de connaissances nouvelles à des étudiants pouvant être amenés à manipuler des animaux sauvages dans leur cursus professionnel, et l’obtention de données nouvelles, remplissent un objectif à la fois pédagogique et scientifique à travers une approche non-létale. La formation à l’éthique et au bien-être animal répond ainsi aux enjeux sociétaux et de perfectionnement personnel d’une pratique encadrée par un context légal et qui s’inscrit directement dans les plans de carrière de certains étudiants. De plus, la formation à une démarche non létale sur des mesures hématologiques, immunologiques et hormonales est innovante et offrira un panel de compétences attractives auprès de leurs futurs employeurs. Sur le plan scientifique, le suivi de l’état de santé de rongeurs sauvages sur les sites d’études permettrait une meilleure compréhension des enjeux sociétaux actuels, mais aussi de définir des risques épidémioloques pour la présence de zoonoses dans l’environnement.

Procédures

Les animaux subiront une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie. Cette procédure sera réalisée par un personnel formé et expérimenté. Le temps estimé d’une prise de sang (avec identification spécifique, sexage et mesures morphométriques) est de l’ordre de 3 minutes de la sortie du piège à la fin du prélèvement.

Impact sur les animaux

Au cours de la manipulation, les animaux peuvent ressentir un stress lié à la capture, la contention, et la manipulation. Les parties potentiellement douloureuses ou particulièrement stressantes (prise de sang notamment) se font cependant sous anesthéise gazeuse. L’anesthésie gazeuse évite une injection (intrapéritonéale), l’induction de l’anesthésie est rapide (de l’ordre de 30 secondes) et l’anesthésie elle-même est brève (de l’ordre de 3 min, permettant l’identification spécifique, le sexage, les mesures morphométriques et la prise de sang), évitant une hypothermie. A l’issue de la prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, un lubrifiant oculaire et un anesthéisant local seront appliqués sur l’œil des individus. Par la suite, les animaux seront placés dans des boîtes dortoirs pour être remis en liberté après un temps de repos (minimum 1 heure) et la vérification préalable de leur bon état de santé (œil en bon état, comportement normal, cf § relatif aux points-limites ci-dessous). Cette méthode de prise de sang n’est pas substituable à un prélèvement dans la queue qui donne un volume trop faible ou dans le sillon mandibulaire . De précédents tests de prise de sang dans le sinus mandibulaire ont été effectués par des personnes qualifiées à ce type de prélèvement sur souris de laboratoire mais n’ont pas permis de réaliser des prises de sang. L’absence de ce sinus chez les Mulots est suspectée.

Devenir

Les animaux seront relâchés à l’issue de chaque procèdure en considérant qu’aucun traitement pouvant moduler leur réponse immunitaire ou affecter leur comportement ou fonction écologique ne pourrait affecter le devenir de ces animaux en condition naturelle. Cette remise à l’état sauvage prend en compte l’expérience des responsables du projet et le travail de la SBEA ayant statué à l’unhanimité sur la possibilité de réaliser un prélèvement sanguin comme indiqué dans chaque procédure suivi du relâcher des animaux.

Remplacement

Le double objectif du projet est (i) de former des étudiants aux méthodes éthiques et réglementaires d’utilisation d’animaux de la faune sauvage à des fins scientifiques et (ii) d’acquérir des données de long terme sur l’état de santé et les pathogènes de micromammifères sauvages. L’utilisation d’animaux est requise car, à notre connaissance, aucune approche de modélisation ne permettrait d’obtenir de telles données. Des études comparatives sur le système immunitaire de rongeurs ayant montré que la réponse immunitaire d’individus sauvages et d’animaux de laboratoire différait significativement (Abolins et al., 2017; Viney and Riley, 2017),l’utilisation d’animaux sauvages est également requise. L’étude pathogènes potentiellement zoonotiques ne peut par ailleurs se faire que sur animaux capturés dans l’environnement et non sur animaux-modèles de laboratoire.

Réduction

La variabilité inter-individuelle des réponses immunitaires est très forte en conditions naturelles et la reproduction de ces mêmes conditions n’est pas possible en laboratoire. De nombreuses études scientifiques commencent à intégrer les conditions environnementales comme effets modulateurs de la réponse immunitaire face aux infections (Flies and wild comparative immunology consortium, 2020). Parmi les agents infectieux susceptibles d’étre identifié, Borrelia burgdorferi, l’agent responsable de la maladie de Lyme présente des prévalences parfois très faibles au sein de populations de Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus) et de Mulot à collier (Apodemus flavicollis). Sur la base de ces informations, les effectifs prévus pour les procédures 1 and 2 ne peuvent être inférieurs à 30 rongeurs (Procédure 1) et 30 rongeurs (Procédure 2) par site d’étude et par an pour garantir une puissance statistique suffisante et la valorisation scientifique des résultats.

Raffinement

En ce qui concerne les captures, les pièges sont relevés au moins une fois par jour. Cependant, la littérature ainsi que l’expérience des personnels impliqués dans ce programme laissent envisager un taux de mortalité de l’ordre de 3%. Les causes de décès peuvent être un stress conduisant à un arrêt cardiaque, une rupture des cervicales ou un refroidissement en période froide (peu probable au printemps) et/ou pluvieuse dans les pièges). En dehors de l’arrêt des captures en cas de conditions météorologiques défavorables, ces mortalités indésirables sont difficilement totalement évitables. Les conditions de captivité des animaux seront conformes aux conditions des Rongeurs de laboratoires (Cages normalisées, nourriture et eau fournis ad libitum), sauf en ce qui concerne la captivité individuelle, mais avec un enrichissement aussi élaboré que possible (Dortoir et coton permettant la confection d’un nid, structures de carton, roue et balle pour le jeu). Les animaux seront hébergés sous tente avec un contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie) et les anesthésies, mesures et prélèvements seront effectués dans le véhicule agréé pour expérimentation animale, donc en des lieux séparés. Les mesures et prélèvements seront effectués sous anesthésie par du personnel qualifié.

Choix des espèces

Les espèces choisies sont le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus) et le Mulot à collier (Apodemus flavicollis). Le Mulot sylvestre et le Mulot à collier sont des Micromammifères abondants, ubiquistes, opportunistes avec un régime alimentaire varié. Leur positionnement trophique intermédiaire les place comme une source de nourriture de premier choix pour un grand nombre de prédateurs (Rapaces et Mammifères) incluant des espèces patrimoniales (Milan royal par exemple). Leur utilisation dans des travaux scientifiques en écologie, écotoxicologie, ou écoépidemiologie est fréquente, permettant une relation des résultats obtenus ici avec la littérature internationale, tant par les étudiants concernés que par l’équipe de recherche (Chrono-environnement). Leur facilité de capture et leur capacité à être maintenus en captivité en font un modèle biologique idéal par rapport aux objectifs scientifiques de cette étude. Seuls les Rongeurs d’âge adulte et les femelles non gestantes seront utilisés pour cette étude.

Incision de deux à trois centimètres dans l'abdomen sous anesthésie, insertion d'un fragment de tumeur dans le foie, suture : 16 lapins subissent d'abord une chirurgie d'une trentaine de minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sept et quatorze jours plus tard, chacun est anesthésié quarante minutes pour recevoir le traitement dans la veine de l'oreille et passer une échographie abdominale, puis vingt minutes de plus le lendemain pour une prise de sang. Au bout de trois semaines, tous sont tués et leurs tumeurs prélevées pour analyse histologique. Le porteur écrit n'attendre aucun effet indésirable de la molécule testée, et annonce que la confirmation de la réduction tumorale permettra de consolider le dossier pour le passage en clinique.

Objectifs

Les immunothérapies ont permis de grandes avancées dans le traitement des cancers. Malheureusement, les taux de réponse aux immunothérapies restent encore limités. Un défi urgent est donc de développer de nouvelles molécules permettant d’améliorer l'efficacité des immunothérapies actuelles. Grâce à leur capacité à activer le système immunitaire, les immunostimulants ont le potentiel d'améliorer l'efficacité de ces immunothérapies, tout en minimisant leur toxicité. Un candidat médicament a ainsi été développé. Des études préliminaires ont démontré qu’il s’agit d’un puissant stimulateur des cellules immunitaires avec un meilleur profil de sécurité que les autres molécules existantes. Afin de poursuivre le développement de ce produit, il est à présent nécessaire d’évaluer son efficacité dans un modèle tumoral chez le lapin. L’objectif de ce projet est donc de valider l’activité et l’efficacité du candidat médicament dans un modèle animal non rongeur pertinent, le lapin. Ceci permettra d’ apporter la preuve de concept de l’efficacité de cette nouvelle thérapie innovante dans le cadre du traitement du cancer avant son passage chez l’Homme.

Bénéfices attendus

La confirmation de la réduction tumorale grâce au traitement par le LipoLPS permettra de consolider le dossier pour le passage en clinique. .

Procédures

La chirurgie sous anesthésie générale et antidouleur va s’étendre sur environ 30 minutes pendant lesquelles l’animal, après préparation (tonte, désinfection, mise en place du monitoring) va subir une incision d’environ 2-3 cm. Un fragment tumoral sera inséré dans le foie puis la plaie sera suturée. 7 jours et 14 jours après la chirurgie, l’animal sera anesthésié pendant 40 min pour la réalisation de l’injection du traitement à la veine de l’oreille, de l’administration du traitement par voie intraveineuse et une échographie abdominale pour observer la croissance de la tumeur. 8 jours et 15 jours après la chirurgie l’animal sera anesthésié pendant 20 min pour la réalisation d’un prélèvement de sang à la veine de l’oreille. Les lapins seront sortis de leur cage pour être pesés 2 fois par semaine. Au bout de 3 semaines, l’animal sera sédaté pour une prise de sang (5 min) et sera mis à mort.

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables sur l’animal sont principalement : * nuisances liées à la chirurgie : - douleur possible au niveau de la zone chirurgicale * nuisances liées au traitement : - stress et inconfort lié aux anesthésies/traitement - Aucun effet indésirable de la molécule testée n’est atendu - pesée deux fois par semaine (stress).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever les tumeurs et d’effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont permis de valider l’effet antitumoral de la molécule à tester. Cependant, le lapin est le seul modèle animal non rongeur pour lequel un modèle tumoral est disponible et parfaitement maitrisé. Le projet nécessite le système immunitaire fonctionnel et ne peut donc pas être réalisé avec des méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

Réduction

L’effectif de chaque groupe a été calculé grâce à des outils statistiques. L’utilisation d’un suivi longitudinal des animaux grace à l’échographie permet également une réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des études chez le rongeur ont permis de valider l’innocuité du traitement et une étude de pharmacocinétique a été menée chez le lapin au préalable pour déterminer la dose à utiliser. La procédure d’implantation du modèle tumoral est parfaitement maitrisée par l’équipe. La connaissance du modèle permet de mettre en place des points limites précoces minimisant ainsi la souffrance potentielle. L’état des animaux est évalué par l’observation de leur état physique (ouverture des yeux, orientation des oreilles) et la quantité d’aliment consommée.

Choix des espèces

Le lapin est le seul modèle animal non rongeur disposant d’un modèle tumoral fiable et reproductible. De plus, ce modèle tumoral est un modèle proche de l’Homme en terme de sensibilité à ce type d’immunostimulant et donc pertinent au niveau immunitaire. Des animaux au stade adulte (environ 12 semaines) seront utilisés. Ce stade permet d’avoir des animaux avec un système immunitaire mature (3-3,3kg)

Anesthésiés, pesés, mesurés, sexés, puis micropucés sous la peau en moins d'une minute de contention, 500 crapauds communs sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cent d'entre eux reçoivent en plus une peinture fluorescente sur le ventre, et trente un écouvillonnage du mucus. L'objectif déclaré est d'évaluer si les tunnels et les parois de guidage installés le long d'une route départementale permettent aux crapauds d'atteindre leurs mares de reproduction sans se faire écraser. Tous sont relâchés, mais le porteur prévoit la mise à mort des individus capturés trop blessés ou trop maigres, ainsi que de ceux qui ne retrouvent pas un comportement normal après deux heures d'observation.

Objectifs

Les amphibiens ont un cycle de vie complexe, composé d’une phase aquatique (reproduction et stade larvaire) mais aussi d’une importante phase terrestre généralement forestière qui constitue la plus grande partie du cycle de vie. Si la première phase est très étudiée, les connaissances sur la phase terrestre sont en revanche plus limitées, du fait de la difficulté de suivre des individus en déplacement. L’étude portera sur une population de crapaud commun dont les habitats terrestres et aquatiques se situent de part et d’autre d’une route départementale. Cette route a été récemment équipée de paroi de guidage et de tunnels de manière à faciliter l’accès des crapauds aux mares et limiter les risques d’écrasements routiers. Le projet a pour but la conservation de cette population en agissant sur l’amélioration de la connectivité des habitats occupés par l’espèce. L’objectif est d’évaluer le comportement des crapauds communs au voisinage de la route : fonctionnalité des dispositifs de guidage, attractivité et franchissabilité des tunnels. La méthodologie proposée implique l’implantation de micropuces sous la peau des crapauds, ainsi que l’installation de systèmes de détection des puces au niveau de 2 tunnels afin de caractériser le comportement des crapauds et mettre en œuvre le cas échéant des mesures complémentaires pour améliorer leur efficacité (attractivité et franchissabilité). Le suivi sera réalisé sur deux années minimum et jusqu’à 5 ans pour prendre en compte la variabilité des conditions environnementales et tester d’éventuelles mesures correctives. Si le quota d’animaux marqué n’est pas atteint, le projet prévoit le report des marquages l’année suivante.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de mieux connaître le comportement des crapauds communs au niveau des tunnels lors de la migration de reproduction ainsi que les déplacements retour après reproduction, encore peu décrits. Les résultats permettront de mettre en évidence les blocages éventuels des animaux, les risques d’écrasements routiers ou encore la mauvaise efficacité des tunnels. Des aménagements seront alors envisagés pour améliorer ces dispositifs et leur efficacité sera évaluée en appliquant le même protocole de marquage et de suivi.

Procédures

Après anesthésie et analgésie et un temps d’attente de 5 minutes, les animaux seront mesurés pesés, et sexés puis une micropuce sera injectée sous la peau de 500 crapauds. Un marquage temporaire à l’aide d’une peinture fluorescente sera appliqué sur le ventre de 100 crapauds et un écouvillons permettra de recueillir un peu de mucus sur 30 individus. Ces interventions nécessiteront de maintenir les crapauds pendant 1 minute.

Impact sur les animaux

La probabilité d’apparition d’effets indésirables voire de mortalité des individus à la suite d’un stress dû à la capture, à la manipulation lors de la biométrie et au marquage ne peut être réduite à zéro. Cependant ces risques restent faibles : l’espèce cicatrise bien et la bonne formation des opérateurs mène à un risque quasi-nul de complication post-marquage.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront relâchés pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du comportement d’amphibiens sauvages doit obligatoirement être réalisée in situ sur les espèces cibles. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants au niveau de la zone de capture. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes. Peu de données existent quant aux comportements des crapauds communs entre leurs habitats terrestres et aquatiques. On ne peut donc pas se référer à la littérature ni avoir recours à des avis d’expert pour évaluer des comportements théoriques attendus pour cette espèce : une expérimentation in situ reste indispensable.

Réduction

Les captures et marquages sont prévus sur deux ans (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus tiennent compte de la densité d’individus lors des derniers comptages en 2022 et sont un minimum (250 individus / an ; règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des comportements. L’effectif a été déterminé en prenant en compte les risques de mortalité post-opératoire (très limités en respectant les préconisations de tailles minimales), la possibilité de perte de la puce (peu probable mais possible dans les semaines / mois suivant l'implantation), la possibilité que les crapauds ne rentrent pas dans les tunnels ou traversent au niveau d’un tunnel non équipé d’antennes de détection. En outre, les risques de mortalité naturelle (prédation, maladie, écrasement routiers) ne sont pas à exlure. L’effectif prévu tient compte de ces phénomènes, pour garantir un minimum d’enregistrements au niveau des dispositif de détection fixes (a minima 50 individus détectés par tunnel). Il n'est pas prévu d'analyses statistiques dans le cadre de cette étude comportementale in natura, en-dehors des statistiques descriptives (taux d’entrée, taux de franchissement, refus, durée moyenne de déplacement, taux de survie apparent) et des statistiques sur le temps d’induction moyen de l’anesthésiant et le temps de réveil moyen des animaux.

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Les animaux seront capturés dans des seaux percés enrichis de litière humide et seront stockés dans un bac sombre jusqu’au marquage également enrichi de terre/litière humide/abris. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, d’infections visibles ou de troubles du comportement) seront marqués, les autres seront soit relâchés sans marquage, après stabulation, soit mis à mort si les signes cliniques observés (blessures profondes, signes marqués d’infection, maigreur excessive) nécessitent une mise à mort compassionnelle. La taille des micropuces sera adaptée à la taille de l’animal et seuls les crapauds de taille suffisante seront marqués pour supporter la micropuce. Le matériel d’injection sera désinfecté et les opérateurs porteront des gants non poudrés. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre un anesthésiant-analgésique sera appliqué au niveau du point d’injection 5 minutes avant injection. L’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage, l’expérience du personnel permet de réduire le temps global de manipulation à moins d’une minute. Le comportement après marquage sera contrôlé pendant 20 à 30 minutes, avant remise en liberté, de manière à déterminer l’atteinte de points limites : léthargie ou réticence à se déplacer, changement dans la démarche. En cas de difficulté à recouvrer un comportement normal ou en cas de changement significatif de comportement, la phase d’observation sera prolongée pendant 2 heures maximum avant mise à mort.

Choix des espèces

Le but est d’étudier le comportement du crapaud commun au cours de sa migration entre son habitat forestier et ses habitats de reproduction (mares), de manière à assurer sa conservation ; ainsi le remplacer par une autre espèce n’est pas envisageable. Seuls les crapauds adultes seront étudiés, car ils correspondent aux individus en migration de reproduction.

Pour mesurer ce qui arrive réellement dans le sang quand un antibiotique est dilué dans l'eau de boisson, 612 porcelets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en trois groupes de 204, ils reçoivent de l'amoxicilline, de la tilmicosine ou de la tylosine pendant 72 heures, puis subissent jusqu'à quatre prises de sang sous contention, une par jour pendant quatre jours. Le porteur ramène les nuisances à la contention et à la ponction. Aucun animal n'est tué au titre du projet, les 612 porcelets étant rendus à la filière d'élevage pour y poursuivre ce que le porteur appelle leur cycle.

Objectifs

La diminution d'efficacité des antibiotiques, du fait des résistances bacteriennes qui se développent, oblige à mieux utiliser les antibiotiques, notamment en administrant des doses optimales, c'est à dire suffisantes pour permettre la guérison sans contribuer à une surconsommation abusive des antibiotiques en médecine vétérinaire. Pour ajuster les doses, il faut connaitre les concentrations qui arrivent sur le site infectieux après administration par voie orale (voie utilisée en élevage, notamment via l'eau de boisson) et donc réaliser des pharmacocinétiques. Au cours d'un précédent projet une étude réalisée en station expérimentale avait montré qu'une administration en continu d'amoxicilline dans l'eau de boisson conduisait à une sous exposition des animaux. Un des leviers d'action pour augmenter l'exposition des animaux à l'antibiotique pourrait être de distribuer la même dose journalière mais sur un temps restreint au moment des pics de consommation d'eau. Deux autres antibiotiques utilisés en post sevrage seront également évalués. Il s'agit de la tilmicosine et de la tylosine. Selon une étude sur les consommations en antibiotiques en élevage de porcs, ces trois antibiotiques (amoxicilline, tilmicosine et tylosine) sont les plus utilisés en post sevrage, ce qui explique notre choix de se porter sur ces trois molécules. Les données préliminaires sur les consommations d'eau obtenues lors d'un précédent projet et les données de la littérature suggèrent qu'il y aurait des pics de consommation d'eau en fin de matinée, début d'après midi et/ou en fin de journée/fin de nuit. Nous comparerons donc les concentrations plasmatiques en amoxicilline, tilmicosine et tylosine retrouvées chez les porcelets après une administration de ces antibiotiques en continu, sur plusieurs temps restreints 10h-16h ou 8h-17h ou 17h-8h. L'objectif de cette étude est de déterminer, en conditions d'élevage, les concentrations plasmatiques en amoxicilline, tilmicosine et tylosine, observables chez le porcelet en post sevrage lorsque l'antibiotique est administré via le circuit d'eau de boisson en continu ou sur un temps restreint.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre d'optimiser l'utilisation de traitements antibiotiques via l'eau de boisson et de mieux soigner les animaux malades pour lesquels une des trois molécules étudiées ici serait la solution thérapeutique de première intention.

Procédures

Le projet sera mené sur trois groupes de porcelets à des temps différents, chaque groupe comportant 204 porcelets, soient 612 sur la totalité du projet. Les trois groupes seront traités avec un antibiotique différent administré via l'eau de boisson toutes les 12h ou 24 h, pendant 72h, en fonction des recommandations données dans le RCP (Résumé des Caractéristiques du Produit) de chaque antibiotique. Pour les trois groupes, les 204 porcelets seront hébergés dans 12 cases comportant chacune 17 animaux. Dans toutes les cases, les consommations d'eau individuelles et par case de tous les animaux seront relevées quotidiennement par des compteurs d’eau connectés équipés de lecteur de boucles individuelles de chaque porc. La concentration en antibiotique dans l'eau de boisson sera mesurée au laboratoire suite à un prélèvement d’eau à l’abreuvoir. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur tous les porcelets pour déterminer les concentrations plasmatiques en antibiotiques (au maximum 4 prises de sang par animal, 1 prise de sang par jour pendant 4 jours) car une grande variabilité interindividuelle est attendue compte-tenu du fait que les animaux n'ont pas tous le même poids, ne consomment pas tous les mêmes quantités d'eau au même moment, n'ont pas tous le même statut sanitaire, etc.

Impact sur les animaux

LLa contention et la prise de sang constituent une nuisance pour les animaux. La contention et les prises de sang seront réalisées par des personnes agueries au geste pour que leurs durée soit la plus courte possible.

Devenir

Les animaux sont tous gardés en vie à la fin des procédures et continueront leur cycle dans l'élevage.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer totalement l’utilisation des animaux dans ce projet. En effet, il n’est tout d’abord pas possible de déterminer par d’autres moyens les consommations d’eau des animaux dans des conditions d’élevage. De plus, le devenir d’un médicament dans un organisme (pharmacocinétique) n’est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes (absorption, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale,...).

Réduction

Pour chaque traitement antibiotique (3 au total) et périodicité de traitement, 51 porcs seront utilisés. A chaque temps de prélèvement nous prélèverons 24 ou 27 porcs car une grande variabilité interindividuelle est attendue compte-tenu du fait que les animaux n'ont pas tous le même poids, ne consomment pas tous les mêmes quantités d'eau au même moment, n'ont pas tous le même statut sanitaire, etc. Des expérimentations menées précedemment en atelier porcin et en engraissement ovin ont montré que ce nombre d'animaux était suffisant mais nécessaire pour bien caractériser la variabilité interindividuelle des concentrations plasmatiques liée à la variabilité de comportement d'abreuvement des animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon des conditions délevage de production classique, afin de rester proche des conditions d’élevage. Cependant, pour éviter tout stress ou douleur à l'animal, la contention des animaux ainsi que les prélèvements seront réalisés par du personnel formé plus particulièrement à la manipulation des porcelets et habitués à la manipulation d'animaux d'élevage (moins d'habituation possible aux manipulations répétées que pour les animaux d'expérimentation). Les animaux ne seront jamais isolés pour éviter tout stress de séparation du groupe.

Choix des espèces

L'objectif du projet est de déterminer les concentrations plasmatiques en antibiotiques atteintes chez le porc après un traitement via l'eau de boisson ainsi que la variabilité interindividuelle existante en terme de consommation d'eau et donc en terme de concentrations plasmatiques en antibiotiques. Pour cela, il est nécessaire d'avoir recours à des animaux dans des conditions d'élevage classiques. Les animaux utilisés seront en post sevrage, période à laquelle les traitements antibiotiques étudiés sont habituellement utilisés en élevage. L'étude sera réalisée 2 à 3 semaines après le sevrage sur des porcs de 15-22 kg.

Un lapin par groupe sera tué pour analyse des tissus, soit 8 sur 32, le porteur écrivant qu'il tentera de replacer les 24 autres dans la mesure du possible. Les 32 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit jusqu'à quatre anesthésies générales de deux heures et huit prélèvements sanguins de 3 à 5 ml, effectués sur animal vigile dans une cage de contention, pour tester si des comprimés d'ARN messager placés sous la langue déclenchent une réponse en anticorps. Le porteur affirme avoir mené les tests possibles sur cellules avant d'en venir aux lapins, mais conclut qu'un essai sur "organisme entier" reste "nécessaire" puisque des cellules ne produisent pas de réponse immunitaire.

Objectifs

La vaccination génétique par ARN messager administré par voie intramusculaire a récemment fait preuve de son efficacité clinique dans le contexte de l'épidémie de COVID-19. Néanmoins, les formulations actuellement utilisées nécessitent une conservation au froid, à -20°C au mieux, voire -80°C. Nous avons développé une formulation sous forme de comprimés muco-adhésifs stables à température ambiante, ou à 4°C, et destinée à une administration mucosale par voie buccale (sous la langue ou contre les joues). Le projet d'expérimentation animale décrit ici concerne une étude de l'efficacité éventuelle de ces comprimés d'ARN messagers pour induire une réponse immunitaire chez le lapin, par administration buccale. Cela permettra de déterminer si ces comprimés peuvent poursuivre un développement vaccinal pré-clinique, puis clinique plus poussé.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre de la mise au point d'une nouvelle formulation vaccinale par ARNm. Il permettra de déterminer si les formulations étudiées (dont l'activité est démontrée) peuvent être administrés par voie buccale sans toxicité particulière, et permettre l'induction d'une réponse immunitaire de type anticorps. En cas de réponse positive, cela permettrait ultérieurement de poursuivre le développement de ces formulations dans un but vaccinal. Ces formulations seraient particulièrement avantageuses du fait de leur stabilité à température ambiante, permettant un stockage plus facile, et donc un accès à des vaccins pour une population plus large.

Procédures

Les animaux seront soumis à quatre anesthésies générales au maximum de 2h environ, et à 8 prélèvements sanguins de 3 à 5ml sur animaux vigiles placés dans une cage de contention. La durée d'un prélèvement est de l'ordre de deux minutes

Impact sur les animaux

Il s'agit ici d'une administration muscosale par voie buccale (placement sous la langue et contre les joues) de comprimés muco-adhésifs. Les comprimés seront réalisés avec des excipients déjà utilisés en clinique humaine, et n'ayant pas de toxicité particulière connue. Néanmoins, les animaux seront soumis à 4 anesthésies générales au maximum, et au stress induit par cette procédure, ainsi qu'à celui dû aux différentes prises de sang (et à l'utilisation de la cage de contention pendant quelques minutes).

Devenir

Pour analyse de tissus, un animal par groupe sera mis à mort. Nous tenterons de replacer les 24 autres dans la mesure du possible

Remplacement

Avant de recourir à l'expérimentation animale, les tests alternatifs réalisables ont été faits : évaluation de la fonctionnalité des ARN messager comprimés et efficacité d'expression de l'antigène par des tests sur culture cellulaire, tests de toxicité sur culture cellulaire également. Néanmoins, un test sur organisme entier est nécessaire, les tests sur cellules ne pouvant induire une réponse immunitaire.

Réduction

Nous avons décidé de n'étudier qu'une partie des formulations sous forme de comprimés réalisées. Il s'agit ici d'examiner si les formulations étudiées peuvent, ou non, engendrer une réponse immunitaire importante. Nous avons prévu des groupes de 4 animaux par formulation, la variation interindividuelle dans le domaine de la vaccination pouvant être importante. La réponse que nous attendons est de type "tout ou rien", et chaque animal est son propre contrôle. En conséquence, aucune analyse statistique n'est nécessaire dans ce projet. Si les résultats (réponse immunitaire chez un ou plusieurs animaux) permettent d'envisager un développement plus poussé des produits, cela sera l'objet d'un projet ultérieur. Par ailleurs, pour chaque formulation, nous commencerons par immuniser 2 animaux. Si la réponse en anticorps est analysable, nous n'incluerons pas les 2 autres animaux prévus dans le groupe.

Raffinement

Le protocole expérimental n'induit pas de souffrance particulière autre que celle due à des anesthésies générales. Le projet nécessite des prises de sang régulières. La première prise de sang sera effectuée une semaine avant le début des immunisations pour permettre une récupération totale. Les prises de sang seront limitées à quelques millilitres, 5ml au maximum. Par ailleurs, les animaux seront surveillés jusqu'au réveil de leur anesthésie. Ils seront ensuite suivis quodiennement lors d'une veille sanitaire, et suivis par le porteur de projet deux fois par semaine en regard de points limites pré-établis.

Choix des espèces

Le lapin est adapté pour ce type d'expérience car les rongeurs habituellement utilisés (rats, souris) ont une cavité buccale dont les propriétés de perméabilité sont non représentatives de celle de l'humain. Le lapin a, lui, une cavité buccale dont la structure mucosale est très semblable à l'humain, et donc beaucoup plus représentative. Les animaux utilisés devront avoir un système immunitaire fonctionnel : Ce seront des lapins de 2 à 3 mois, âge à partir duquel ils sont habituellement vaccinés (en tant qu'animaux domestiques), et avec lesquels nous avons toujours obtenu de bons résultats.