Procédures modérées

Greffées d'une tumeur sous la peau ou par voie intraveineuse, puis injectées jusqu'à une fois par jour pendant dix-huit semaines et saignées jusqu'à deux fois par jour à la veine caudale, 20 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent jusqu'à quatre prélèvements rétro-orbitaires sous anesthésie et un prélèvement terminal. L'objet du projet reste en amont de tout traitement : mesurer la concentration plasmatique de composés et calibrer les doses des études d'efficacité à venir, à raison de cent études sur cinq ans. Le porteur qualifie de "légères" les douleurs liées aux injections et aux prélèvements, tout en listant comme possibles la nécrose, l'ulcération de la tumeur et la paralysie.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet consiste à évaluer la concentration plasmatique de composés thérapeutiques, caractériser les niveaux et la durée de saturation de la cible à différentes doses et permettre l’identification de cellules immunitaires ou de facteurs solubles impliqués dans la réponse induite par ces composés. Les études menées sur des modèles de souris porteuses de tumeur permettront, également, d’analyser la corrélation entre ces paramètres et la croissance tumorale. L’ensemble des données recueillies dans ce projet serviront à affiner les doses et fréquences utilisées dans les études ultérieures d’efficacité.

Bénéfices attendus

Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra de caractériser des composés thérapeutiques à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente, et ainsi sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études d'efficacité dans le cadre d'autres projets.

Procédures

• Sur animal vigile : Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injection, 15 s) ; Greffe de cellules tumorales en intraveineuse (1 injection, 15 s) ; Administration de composé thérapeutique en intra-péritonéal, sous-cutané, per os ou intra-tumoral (maximum 1 fois /jour pendant 18 semaines maximum, 15 s) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante en intra-péritonéal, sous-cutané ou per os (maximum 1 jour sur 2 pendant 18 semaines, 15 s) ; Microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale (maximum 2 fois /jour, 30 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (4 fois maximum, 30 s) ; Administration de composé thérapeutique en intraveineuse (maximum 2 fois /semaine pendant 18 semaines maximum, 15 s) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante en intraveineuse (maximum 2 fois /semaine pendant 18 semaines maximum, 15 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire ou en intracardiaque.

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales. Stress et douleur légère lors de l’administration du composé thérapeutique. Stress et douleur légère lors de l’administration de la molécule déplétante/neutralisante. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée), paralysie (tumeur en intraveineux). Possibilité d’effets indésirables sévères liés au composé thérapeutique : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Prélèvement sanguin terminal ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.

Remplacement

Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.

Réduction

Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester sont également déterminés dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires dans les procédures impliquant une greffe tumorale. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, un minimum de 4 prélèvements par point temporel est nécessaire pour obtenir des paramètres pharmacocinétiques et/ou pharmacodynamiques statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. 20 animaux maximum par groupe sont donc requis pour l’étude d’un composé dans une procédure. Dans le cas où l’étude permet le développement de méthodes de dosage adaptées à des micro-volumes de sang, le nombre d’animaux utilisés est considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées car l’ensemble des valeurs peuvent être obtenues sur un même animal. Dans ce cas, le nombre d’animaux par groupe peut être diminué à 4 minimum pour les études sans greffe tumorale et 10-15 pour celles avec greffe pour tenir compte de la variabilité du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Un maximum de 100 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou les tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal, à l’aspect et au volume de la tumeur ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé administré et/ou les cellules tumorales greffées pourront induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (minimum 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.

Une puce de radiofréquence de douze millimètres de long injectée dans la cavité abdominale : trois poissons clowns nés en captivité subissent cette procédure, déclarée de souffrance modérée, et sont ensuite gardés vivants dans une structure d'aquariologie. Ils sont anesthésiés par balnéation, marqués, puis placés une semaine dans un bassin de 100 litres pour vérifier que les antennes détectent bien la puce. Le porteur reconnaît un risque de complications inférieur à 5 %, comprenant inflammation de l'abdomen, infection, ulcération et perforation d'un organe interne. Ce test doit préparer le marquage de trente poissons clowns sauvages en Polynésie française, dont l'étude en milieu naturel rend selon lui l'usage d'animaux "incontournable".

Objectifs

L'objectif du projet de doctorat est de travailler sur la structure sociale des poissons clowns, qui vivent en symbiose mutualiste avec les anémones de mer. Parmi les traits biologiques généraux communs aux 28 espèces d'anémones, une caractéristique particulière est l'organisation de leur hiérarchie de taille à l'intérieur d'une colonie "classique" composée d'une anémone de mer, d'un couple monogame reproducteur et de zéro à quatre juvéniles immatures non reproducteurs. Néanmoins, d'autres types d'assemblages ont été décrits dans la littérature comme de "grandes colonies", composées de manière atypique d'agrégations de plusieurs anémones de mer dans lesquelles 2 couples au moins et des juvéniles vivent ensemble, que l'on peut trouver principalement au Japon et en Polynésie française. Le terme de "mégacolonie" a été récemment introduit pour décrire toutes les colonies à l'exception des colonies "classiques". L'organisation des mégacolonies remet en cause ce que l'on sait de celle des colonies classiques notamment en ce qui concerne la sexualité et la reproduction, la hiérarchie, les territoires et toutes les interactions entre les individus. Ce projet de thèse vise à étudier l'organisation sociale et spatiale des poissons clowns vivant en mégacolonies en Polynésie française et au Japon, en analysant le statut écophysiologique des populations de poissons clowns et les conséquences sur leur système neuroendocrinien. Dans l'objectif de répondre à la première problématique concernant l'organisation spatiale des poissons clowns, il est nécessaire de pouvoir établir un suivi de leurs déplacements au sein d'un champs d'anémones. Cette problématique sera étudiée sur les mégacolonies de Polynésie française. La turbidité élevée de l'eau à ces endroits et la surface des zones étudiées ne permettent pas un simple suivi de leurs déplacements par l'utilisation de caméras. Afin de récolter des données précises quant à leurs mouvements au sein des territoires, ce projet vise à utiliser un dispositif de télémétrie d'Identification par Radio Fréquence (RFID) avec l'implantation de puces (2,12x12mm) par injection dans la cavité abdominale des poissons clowns adultes. Les mouvements des poissons équipés de puces pourront ainsi être précisément détectés et enregistrés par des antennes reliées à des lecteurs placées au sein du champs d'anémones de mer.

Bénéfices attendus

Acquérir des mesures précises quant aux déplacements des adultes au sein des territoires du champ d'anémones de mer nous permettrait de mieux comprendre la gestion des territoires par les individus, et de mieux comprendre la hiérarchie sociale au sein des mégacolonies de poissons clowns.

Procédures

Une première phase de test est prévue en laboratoire, afin de vérifier la détection de la puce RFID (identification par radio-fréquence) par les antennes. Trois individus poisson clowns (A. frenatus) reproduits et élevés en captivité, seront anesthésiés par balnéation (MS222) et équipés d'une puce RFID et placés dans un bassin de 100L d'eau de mer artificielle en présence des antennes afin d'enregistrer leurs mouvements. Cette expérimentation est prévue sur un intervalle d'une semaine. La deuxième phase du projet consiste à utiliser ce dispositif en milieu naturel sur les mégacolonies en Polynésie française.

Impact sur les animaux

La survie liée à l'injection intra-coelomique de puces RFID est jugée optimale pour des poissons de taille supérieure à 6cm selon plusieurs études scientifiques. Ainsi, aucun individu adulte ou juvénile de taille inférieure à 6cm ne sera considéré dans cette étude. L'emplacement de l'injection dans la cavité intra-coelomique ne gêne pas les mouvements natatoires du poisson. Enfin, l'enveloppe en verre de la puce est conçue pour ne pas se dégrader, il n'est pas nécessaire de retirer par chirurgie la puce à l'issue de l'expérimentation. Même si elles sont rares, des complications post-injection, de l'ordre inférieur à 5%, peuvent survenir avec des degrés de gravités différents (inflammation de l'abdomen, infection, ulcération, perforation d'un organe interne). Tous les actes pré- et post-opératoires sont réalisés de sorte à minimiser les risques de survenue de ces complications. L'absence de ces effets, et plus généralement l'absence de toute indication d'inconfort, seront systématiquement vérifiés par un examen à un et deux jours après l'injection des animaux ayant subi cette procédure, vérification d'absence d'anomalie de l'abdomen (gonflement, infection), vérification que les comportements natatoires sont normaux.

Devenir

Phase 1 : Les 3 individus seront gardés en captivité au sein de la structure d'Aquariologie de Banyuls-sur-mer. Phase 2 : Les 30 individus ayant subi successivement les deux procédures resteront dans leur milieu naturel.

Remplacement

Les mégacolonies représentent une structure particulière ne pouvant pas être reproduites en laboratoire ou modélisées. Afin d'étudier les déplacements des poissons clowns au sein de ce type de structure (deuxième phase), il est indispensable de suivre directement et précisément leurs déplacements en milieu naturel à l'aide d'un système de télémétrie. Ainsi, le modèle animal et en particulier l'utilisation des poissons clowns en milieu naturel est donc le plus prédictif et le plus pertinent pour espérer comprendre ce processus d'organisation sociale. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux vivants par des méthodes alternatives. De fait, l'utilisation du modèle animal est incontournable.

Réduction

Toutes les procédures expérimentales qui seront mises en oeuvre ont été optimisées statistiquement, de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés et prélevés dans la nature tout en obtenant des résultats significatifs (3 individus pour la première phase de test, et 15 couples (soit 30 adultes) pour la mégacolonie durant la deuxième phase en Polynésie Française. L'approche expérimentale choisie est la plus optimale pour enregistrer les mouvements des poissons clowns tout en minimisant l'impact sur leur état physiologique.

Raffinement

Durant la première phase de test, une attention particulière sera accordée au bien être des individus via la présence de personnel compétent 7j/7j pour l'observation et le soin des animaux. Concernant la deuxième phase, pour minimiser tout stress avant anesthésie des poissons en milieu naturel, les animaux ne seront pas sortis de l'eau et seront directement anesthésiés sous l'eau à l'aide d'eugénol. Les deux marquages se feront rapidement en simultané après la capture de l'animal et celui-ci sera relâché près de son anémone de mer et surveillé pendant plusieurs minutes jusqu'à récupération complète de ses fonctions natatoires. Afin de réaliser une intervention rapide et la plus précise possible, la personne compétente réalisera plusieurs injections intra-coelomiques de puces RFID et d'injections sous cutanées d'élastomères en entraînement sur des poissons non vivants récupérés dans le commerce. De plus, la survie liée à l'injection intra-coelomique de puces RFID a été étudiée et jugée optimale pour des poissons de taille supérieure à 6cm. Ainsi, aucun individu adulte ou juvénile de taille inférieure à 6cm ne sera considéré dans cette étude. L'emplacement de l'injection dans la cavité abdominale ne gêne pas les mouvements natatoires du poisson. Enfin, l'enveloppe en verre de la puce est conçue pour ne pas se dégrader, il n'est pas nécessaire de retirer par chirurgie la puce à l'issue de l'expérimentation.

Choix des espèces

Depuis plusieurs années, les poissons clowns sont un excellent modèle d'étude dans les domaines de l'écologie, de l'évolution et du développement. La symbiose établie entre les poissons clowns et leur anémone de mer et en particulier l’organisation hiérarchique de ces poissons représentent un intérêt majeur pour ce projet. La structure particulière en mégacolonie n'ayant été observée jusqu'à présent uniquement chez cette famille, les poissons clowns représentent un modèle de choix pour comprendre l'organisation sociale. Afin de réduire au maximum les effets indésirables mais non délétères de l'implantation d'une puce dans la cavité abdominale d'un individu, seulement des individus juvéniles et adultes de plus de 6cm sont sélectionnés.

Un gavage par jour pendant quatre semaines, soit vingt-huit gavages chacune : 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Elles reçoivent d'abord un adénovirus injecté dans le coin de l'œil sous anesthésie, puis subissent des jeûnes de six heures avant chaque mesure de glycémie, six prélèvements sanguins à la queue après une incision au scalpel, une injection de glucose, et un jeûne de douze heures avant la chirurgie terminale. Le porteur décrit une prostration et une gêne oculaire après l'injection, une gêne dans l'œsophage lors des gavages, une sensation de faim et une hypoglycémie avant la mise à mort. Il précise que le gavage d'un des composés est maintenu parce qu'il s'agit d'"un protocole demandé dans le cadre de la révision d'un article", alors qu'un autre composé a pu être simplement incorporé à la nourriture.

Objectifs

Le foie gras, qui se caractérise par l’accumulation de graisse dans les cellules du foie, touche un quart de la population française. Dans 20 % des cas, ce foie gras génère une inflammation et un durcissement du foie qui peut être à l’origine de cirrhose et de cancer du foie. Les personnes diabétiques, en surpoids ou souffrant d’affections liées au syndrome métabolique sont particulièrement à risque. Néanmoins, il n’existe pas à ce jour de moyens de diagnostic et de traitement pharmacologique du foie gras. Par conséquent, identifier les mécanismes à l’origine du foie gras est cruciale pour prévenir les stades plus avancés chez les patients à risque. Un nouveau mécanisme, avec une perte de communication entre différents constituants intracellulaires induite par des métabolites circulants, est associé au développement du foie gras et il convient de valider chez la souris le rôle causal de ce mécanisme dans l’accumulation de gras. L’objectif de ce projet est donc de valider ce mécanisme en surexprimant une molécule de liaison qui rapproche ces constituants intracellulaires dans le foie des souris, afin de démontrer que cela prévient le foie gras induit par des métabolites administrés chez la souris pendant 4 semaines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet de recherche sont de valider une nouvelle hypothèse mécanistique impliquée dans l’accumulation de gras dans le foie et de mettre en évidence de futurs moyens de prévention et/ou traitement du foie gras. Si nos hypothèses sont validées chez la souris, nous initierons ensuite des tests chez l’homme et tenterons d’identifier des molécules capables de réguler ce mécanisme dans la cellule.

Procédures

Au cours de ce projet, toutes les souris seront soumises à : - une injection unique d’adénovirus dans le coin de l’œil sous anesthésie gazeuse (durée : 30 secondes). - un gavage quotidien pendant 4 semaines sur animal vigile (durée : 30 secondes). - une mise à jeun de 6 heures avant les mesures de glycémie - 6 prélèvements sanguins de petits volumes (5µl, n=6, 30 secondes) à la queue des souris pour les mesures de glycémie, associés à une incision unique de la queue. - une injection de glucose sur animal vigile lors du test de tolérance au glucose (durée : 30 secondes). - une mise à jeun de 12 heures avant chirurgie sous anesthésie profonde et sans réveil.

Impact sur les animaux

- une prostration et une gêne oculaire suite à l’injection d’adénovirus dans le coin de l’oeil - une prostration et gêne dans l'oesophage lors du gavage. - une douleur transitoire au point d’injection lors des injections dans la cavité abdominale et de l’incision au scalpel de la queue. - Une hyperglycémie transitoire au cours des test métaboliques. Ces variations de glycémie sont des réponses physiologiques transitoires qui n’affectent pas l’état général des souris. L’hyperglycémie provoquée lors des tests revient à la normale au bout de 90 minutes. - une sensation de faim et une hypoglycémie suite à la mise à jeun sur la nuit avant mise à mort. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsable d’un stress chez l’animal et d’une baisse d’activité les conduisant à nicher dans leur nid.

Devenir

A la fin des procédures, toutes les souris précédemment anesthésiées seront mises à mort pour le prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Ce projet vient compléter des données déjà obtenues dans des cellules en culture, où la surexpression d’une molécule de liaison rapprochant des constituants intracellulaires prévient l’accumulation de lipides induite par des métabolites. Ces observations doivent être validées chez la souris (organisme entier) pour attester de ce nouveau mécanisme dans la physiologie du foie gras. Il s’agit d’un projet de physiologie où aucune alternative non animale n’est disponible puisqu’il s’agit ici de valider le rôle de l’axe intestin-foie dans la pathologie du foie gras.

Réduction

Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, nous allons comparer différents traitements en même temps afin de n’avoir qu’un groupe de souris contrôle. Le nombre de souris est calculé au plus juste tout en offrant la puissance statistique nécessaire pour l’interprétation des résultats scientifiques. La modulation des contacts entre différents constituants intracellulaires par la surexpression d’une molécule de liaison étant très variable d’une souris à l’autre, un nombre de 18 souris par groupe est nécessaire. Néanmoins, un premier protocole avec n=12 souris/groupe sera d’abord réalisé, et complété avec n=6 souris/groupe si nécessaire.

Raffinement

Les souris sont surveillées individuellement 3 fois/semaine et nous utilisons des points limites adaptés. Les injections d’adénovirus seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Les gavages seront réalisés par une personne expérimentée à l’aide d’une sonde de gavage adaptée à la taille des souris. Le gavage pour un des métabolites d’intérêt est nécessaire, car il s’agit ici d’un protocole demandé dans le cadre de la révision d’un article et il est préférable de procéder de manière identique afin de ne pas induire de biais expérimentaux. Par contre, dans un souci de raffinement, un autre métabolite a été testé incorporé dans la nourriture, et il a bien induit un foie gras sur 4 semaines de traitements. Par conséquent, les autres métabolites seront incorporés dans la diète des souris. Pour les prélèvements terminaux de sang qui nécessitent une chirurgie, les animaux sont analgésiés 30 minutes avant d’être anesthésiées.

Choix des espèces

La physiologie des souris est « proche » de l’homme pour la régulation du métabolisme lipidique. Les souris seront âgées de 5 semaines, elles ont un poids compatible pour la contention, les injections, les gavages et prélèvements sanguins.

Opérées du fémur droit sous anesthésie générale, puis passées deux fois au scanner sous anesthésie gazeuse pendant trente-cinq minutes, 32 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi deux injections intrapéritonéales, cinq jours puis un jour avant leur mise à mort, et toutes sont tuées pour récupérer leurs fémurs et les analyser par histomorphométrie. Le fémur gauche de chaque animal sert de contrôle, ce que le porteur compte comme une réduction du nombre de souris utilisées. Il écrit par ailleurs que la procédure n'entraîne "ni douleur ni problème pour se déplacer" à long terme, à propos d'une chirurgie osseuse suivie d'une surveillance post-opératoire par grille de score.

Objectifs

L'ostéogénèse imparfaite de type VI est une maladie génétique dûe à des mutations sur le gène codant pour une protéine anti-angiogénique. Des études précédentes ont montré que l'injection d'un traitement ayant un effet anabolique sur la formation osseuse conduit à une surexpression de cette protéine. Notre équipe a donc cherché à trouver le lien entre l'effet de celle-ci sur la microvascularisation osseuse et la formation osseuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication de cette protéine anti-angiogénique dans la formation osseuse et particulièrement sur le processus d'ossification primaire qui conditionne le devenir de l'os adulte. Sur le long terme, cela nous permettra de mieux comprendre les processus pathologique impliqués dans l'ostéogénèse imparfaite de type VI et de proposer des traitements adaptés.

Procédures

Injection d'une substance (200ul) en intra-péritonéale x2 (5j et 1j avant mise à mort) et scanner x2 (48h après chirurgie et 1j avant mise à mort) sous anesthésie gazeuse (35min). Chirurgie au niveau du fémur droit sous anesthésie générale (10min).

Impact sur les animaux

L'injection d'une substance (200ul) en intra-péritonéale et le scanner s'effectue sous anesthésie gazeuse. On s’attend à un léger stress après les manipulations. La chirurgie se fait sous anesthésie générale. La procédure n'entraîne pas de douleur ni de problème pour se déplacer chez l'animal sur le long terme. Ces procédures sont donc de classe modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les fémurs afin de faire des analyses par histomorphométrie.

Remplacement

Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Compte tenu du fait que la moelle osseuse est un tissu complexe constitué de très nombreux types cellulaires, il est impossible de modéliser ces expérimentations in vitro.

Réduction

En accord avec le pourcentage des variations observées dans les mesures des paramètres biologiques et pour réaliser une étude statistique solide, nous utiliserons 8 souris/groupe. Les génotypes seront séparés en 2 groupes, eux-même divisés en 2 sous-groupes mis à mort à J14 ou J21. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés nous utiliserons le fémur gauche de chaque souris comme contrôle.

Raffinement

Les animaux seront manipulés en limitant le stress au maximum, par des personnes compétentes en expérimentation animale, un temps d’acclimatation sera prévu avant toute manipulation et une définition précise des points limites conduisant à l’arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des souris sera mise en place. Une surveillance adaptée (observation régulière des animaux et grille de scoring) sera mise en place post-chirurgie et permettra de limiter au maximum la souffrance. La chirurgie se fait sous anesthésie générale. Cette technique a déjà été utilisée dans notre laboratoire et elle est maîtrisée par un personnel compétent. La procédure n'entraîne pas de douleur ni de problème pour se déplacer chez l'animal sur le long terme. L'injection d'une substance (200ul) en intra-péritonéale et le scanner s'effectue sous anesthésie gazeuse. On s’attend à un léger stress après les manipulations. Ces procédures sont donc de classe modérée.

Choix des espèces

Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ce qui est impossible à faire in vitro. Nous avons, de plus, validé toutes nos mesures chez des souris et le travail sera effectué chez des souris dont le gène codant pour notre molécule d'intérêt a été invalidé. Ce mutant chez la souris est une souche robuste sur laquelle des études ont déjà été faites, c’est donc actuellement le meilleur modèle. Nous souhaitons étudier un processus d'ossification primaire, il est donc plus simple et plus rapide de le reproduire chez un animal adulte avec un os mature plutôt que de l'étudier chez un souriceau. La procédure se fait donc chez des souris de 2 mois. Des souris mâles et femelles seront utilisées car on ne s'attends pas à de différence entre les sexes au niveau de l'étude de ce processus.

Déjà utilisés dans d'autres projets et pour cette raison présentés comme habitués aux manipulations, trois macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin du protocole. Ils subissent quatre anesthésies, dont une chirurgie de quatre heures avec ouverture des vertèbres pour poser un cathéter dans l'espace sous-arachnoïdien, des ponctions de liquide céphalorachidien et des prises de sang. L'injection d'un virus adéno-associé vise à provoquer une atteinte des ganglions de la racine dorsale, que l'équipe cherche à détecter par IRM, et du bleu de méthylène est injecté en fin de procédure pour vérifier le trajet du cathéter. Le porteur affirme que cette étude est "nécessairement réalisée chez l'animal", au motif qu'elle a "pour but ultime le raffinement de protocoles en expérimentation animale".

Objectifs

Ce projet a pour but d’investiguer la possibilité d'un suivi en IRM (imagerie par résonance magnétique) de la neurotoxicité induite par l'injection intrathécale d'un AAV (Virus adéno-associé) au niveau des ganglions spinaux de la racine dorsale (GRD), chez le primate non humain. Les AAVs sont des vecteurs viraux dont le plasmide a été modifié de manière à en diminuer la pathogénicité, supprimer la capacité de réplication, et surtout permettre au vecteur d'exprimer un gène d'intérêt dans les cellules de l'hôte. Dans le cadre de thérapie génique visant le système nerveux central, les AAVs peuvent être injectés directement en intrathécale (=dans l’espace sous-arachnoïdien). Cependant, de récentes recherches ont montré une toxicité au niveau des GRD, lors du passage en clinique de certains médicaments, mais aussi chez le primate non humain. Cette toxicité a pris la forme de dégénérescence neuronale ou axonale, et elle ne peut être investiguée que par enregistrement électrophysiologique invasif ou par une inspection microscopique des GRD post-mortem. Le but de ce projet est d’investiguer la possibilité d’observer cette toxicité par IRM chez le primate non humain. Il est en effet possible que de nouvelles séquences d'IRM permettent de mettre à jour une désorganisation des fibres nerveuses au niveau spinal liée à cette toxicité, comme cela a déjà été montré dans le cas d'Alzheimer. Une telle méthode non-invasive permettrait un meilleur suivi de la toxicité potentielle de nouveaux AAV. Cela représentera une meilleure maitrise scientifique du suivi des thérapie génique, et une limitation du recours à des méthodes invasives pour les animaux. Enfin, ce projet va permettre de comparer deux méthodes de cathétérisations intrathécale en région lombaire : une méthode chirurgicale invasive, et une méthode moins décrite dans la littérature mais ne nécessitant pas de chirurgie. En effet, des méthodes de cathétérisations peuvent être nécessaire afin d’injecter de manière lente un AAV dans le système nerveux centrale. La deuxième méthode étant moins décrite, elle doit être comparée à la première méthode et ne sera testée qu'au moment de la mise à mort de l'animal. Une fois maitrisée, cette méthode produira un net gain en termes de bien-être animal, en supprimant le recours à la chirurgie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’investiguer l’observation de la dégénérescence des GRD par IRM suite à l’injection d’un AAV. L’IRM est une méthode non-invasive et pourra être utilisée dans des études précliniques pour détecter la neurotoxicité d’un AAV sans avoir besoin d’euthanasier l’animal en fin de procédure ou de le soumettre à des examens électrophysiologiques invasifs. Plus réalistement, l'IRM agirait comme une première sélection permettant d’objectiver une suspicion de toxicité pour certains candidats AAV. De plus, cette méthode permettrait d'enrichir les études d'efficacités sur l'expression des transgènes chez les animaux, en permettant un suivi longitudinal de la toxicité neuronale des AAV. Une telle méthode diagnostique permettrait de faire la différence entre une lésion temporaire et une lésion définitive, ce qui permettrait de raccourcir la durée d'investigation nécessaire et d'enrichir la qualité scientifique des données. Les séquences d’IRM utilisées se feront avec un système 1.5T. Ce système permet, par rapport à un système 3T d’obtenir des images de diffusion de meilleure qualité du fait de l’homogénéité du champ magnétique . De plus, nous ajouterons au protocole une qualification de la graisse, qui nous donnera un taux de graisse avant et après injection des AAVs dans les muscles pour pouvoir observer les conséquences indirectes de l’atteinte des DRG. A la vue de la taille relativement fine des structures analysées, un focus sera mis sur l’acquisition d’images avec une résolution spatiale importante. L’injection de l’AAV sera réalisée par une cathétérisation intrathécale suite à une laminectomie. Cette méthode permet d’assurer que tout le produit est bien injecté dans l’espace sous-dural. Cependant, cette méthode étant assez invasive (nécessitant une chirurgie longue), une seconde méthode de cathétérisation sera évaluée (collecte de LCS propre, injection de marqueur coloré). Cette deuxième méthode est moins documentée et moins connue, et sera donc réalisée juste avant l’euthanasie de l’animal. Si cette deuxième méthode fonctionne, elle pourra permettre dans le futur de réaliser des injections intrathécales longues et répétées, en réduisant l'invasivité pour l’animal.

Procédures

Les animaux subieront des anésthésies. Deux d'entre elles dureront environ 1h (pour l'imagerie IRM), la chirurgie lourde sera d'une durée de 4h environs et la dernère anesthésie sera réalisé avant l'euthanasiedes animaux. Les prélèvements sanguins se feront sur animaux anesthésiés. Les prélèvements de liquide cerebrospinale se feront pendant la chirurgie et avant l'euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux seront anesthésiés pour chacun des actes qu’ils subiront (IRM et injection de l’AAV), ce qui représente un total de 4 fois sur la totalité du projet. Ceci nécessitera une mise à jeun (diète hydrique). Lors des IRM, l’animal présentera un risque d’hypothermie dans la machine ou lors du transport de son hébergement à la salle d’IRM . L’injection intrathécale de l’AAV et la collecte de LCS présentent un risque de douleur ou de réactions locales au site de la chirurgie. Éventuellement, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivants les administrations. De plus, les animaux pourraient présenter des signes cliniques neurologiques dus à la méthode d’injection, ainsi qu’au potentiel dommage provoqué par l’AAV au niveau des ganglions dorsaux (même si les travaux publiés jusqu'alors chez le primate ne font pas état de troubles visibles). Un suivi neurologique sera réalisé tout au long de l’étude afin de surveiller de près ce paramètre. Lors de l’évaluation neurologique quotidienne, les animaux devront être isolés de leurs congénères le temps d’évaluer leur vision et motricité faciale. Les prises de sang peuvent provoquer un hématome au site de prélèvement. Les animaux seront sous anesthésie lors de celle-ci.

Devenir

Afin de pouvoir corréler les résultats observés à l’IRM, les animaux seront mis à mort à la fin du projet. Les ganglions dorsaux seront récoltés ainsi que le cerveau, d’une part pour investiguer sur la présence du transgène injecté (afin de valider que l’AAV est bien présent dans les tissus nerveux) et d’autre part afin de réaliser de l’histologie pour observer et corréler la dégénérescence neuronal et axonal, avec les résultats d’imagerie IRM. De plus, pour valider la deuxième méthode de cathétérisation, du bleu de méthylène sera injecté dans le cathéter à la fin de la procédure. L’observation de la présence de bleu de méthylène au niveau des tissus nerveux, ainsi que le prélèvement de LCS propre, permettra de valider la méthode d’injection.

Remplacement

Cette étude permet de développer une méthode de détection de la neurotoxicité de manière non invasive grâce à l’IRM. Cette étude est nécessairement réalisée chez l'animal, car elle a pour but ultime le raffinement de protocoles en expérimentation animale. La ressemblance physiologique du système nerveux et immunitaire du primate avec celui de l’homme permettra ensuite de transférer les méthodes développées aux essais cliniques chez l'humain.

Réduction

Dans cette étude, 3 animaux seront utilisés lors de cette étude afin de pouvoir répondre à des objectifs scientifiques. Cela permettra de rapprocher différents possibles niveaux de toxicité neuronale avec leur valeur en signal IRM correspondante et permettra d'établir des corrélations. Étant donné qu'un seul type d'AAV sera utilisé, Il n'est pas nécessaire d'utiliser plus d'animaux que cela. Enfin, une méthode de cathétérisation moins invasive, mais moins documenté, sera réalisé sur ces animaux avant leurs euthanasies, afin de pouvoir confirmer que cette méthode fonctionne par l’injection de bleu de méthylène. L’observation des tissus nerveux sera une étape clef de la validation de ce protocole. Ce projet permet donc de ne pas mettre à mort des animaux dans le seul but de valider cette méthode de cathétérisation.

Raffinement

Les animaux utilisé dans ce projet ont déjà été utilisé pour d’autres projets et sont donc habitués au contact ainsi qu’aux manipulations avec les techniciens d’animalerie. Ils seront hébergés et socialisés dans des volières conformes à la réglementation. Un fond musical sera diffusé en journée. L’entretien sanitaire des hébergements et le contrôle des paramètres environnementaux seront réalisés quotidiennement. Les animaux disposeront d’eau de boisson à volonté. Un aliment adapté à l’espèce et au poids de l’animal, ainsi que des fruits et légumes frais, seront distribués quotidiennement. Des jouets seront mis à disposition et renouvelés une fois par semaine. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse et de le prendre en charge. Un score neurologique sera mis en place en place à cet effet. Il permet d’évaluer précisément les fonctions suivantes : l’état de conscience de l’animal, sa posture, la coordination motrice et équilibre de l’animal, la motricité des membres et enfin un examen rapproché permet d’évaluer la neuro-ophtalmologie (oscillation des yeux, tailles des pupilles etc..). Ce score prend aussi en compte des signes cliniques plus classique tel que des fèces liquides ou des vomissements. Les mises à jeûn hydrique n’excèderont pas les 16h. Si nécessaire, du sirop et/ou des fruits pourront être distribués tôt le matin pour les animaux dont l'anesthésie est en fin de matiné ou dans l'après-midi. Un minimum de 3 jours de repos sera accordé suite aux anesthésies. Le jour des prélèvements de LCS, de sang ainsi que le jour de la chirurgie, les animaux recevrons de la buprénorphine afin de limiter toute douleurs potentiel. L’analgésie pourra être prolongé jusqu’à trois jour suivant la chirurgie afin de prévenir de toute douleur. Les volumes de prélèvement de LCS ainsi que de sang respecteront des normes et des volumes précis. Des points limites spécifiques seront définis et si nécessaire pourront amener une euthanasie des animaux. Lors des anesthésies, il sera suivi au minimum la fréquence cardiaque, la saturation en oxygène ainsi que la température rectale des animaux. Des coussins chauffants, ainsi que des couvertures pourront être mise en place. Enfin, un relais d’oxygène sera mis en place si nécessaire.

Choix des espèces

Le but de ce projet est d’investiguer l’observation d’une neurotoxicité par IRM suite à l’injection d’AAV chez le primate on humain. La proximité phylogénétique de l’homme et du primate non humain permet d’obtenir des résultats prédictibles au niveau neurologiques et immunitaires. Les animaux utilisé seront des jeunes adultes ou adultes, afin que le système nerveux central et immunitaire soient suffisamment développés.

Injectées dans l'abdomen avec Plasmodium berghei, piquées à la queue tous les deux jours pour un frottis, contenues à la main deux à trois minutes par jour pendant cinq jours pour recevoir un traitement, 160 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À partir du onzième jour, elles peuvent présenter des signes neurologiques comme une paralysie, et sont alors tuées afin de prélever leurs organes. Quatre d'entre elles servent uniquement à entretenir la souche parasitaire par prélèvement sanguin derrière l'œil, avant d'être tuées elles aussi. Le porteur écrit que les points limites ont été fixés de façon à prendre en compte les signes neurologiques "sans compromettre le suivi et l'acquisition des données de recherche", et toutes les souris finissent tuées pour l'analyse de leur cerveau, de leur cœur, de leur foie, de leur rate, de leurs poumons et de leurs reins.

Objectifs

L’objectif du présent projet est d’utiliser, pour la première fois, l’approche innovante du MALDI-IMS pour améliorer nos connaissances sur les mécanismes physiopathologiques d’infections/évolutions palustres en utilisant un modèle murin avec atteinte neurologique. Il est nécessaire de présenter l’approche par MALDI IMS. La spectrométrie de masse par imagerie (IMS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) permet l'analyse de molécules directement à partir de coupes de tissus, permettant l'étude de la distribution spatiale des composés, qui peuvent être des molécules biologiques telles que des protéines et des peptides, lipides, éléments chimiques, métabolites. Ainsi, la spectrométrie de masse par imagerie (IMS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est capable de déterminer la distribution de centaines de molécules à la fois directement à partir de coupes de tissus. Puisque les tissus sont analysés intacts sans homogénéisation, les relations spatiales des molécules sont préservées. L’objectif du présent projet est donc d’ouvrir de nouvelles pistes sur la compréhension des infections palustres dans un modèle animal en utilisant pour la première fois l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI ou MALDI-IMS, mais également de faire la preuve du concept de l’intérêt de cette technologie pour évaluer la distribution d’un traitement anti-palustre et notamment déterminer si la molécule thérapeutique co-localise avec la cible parasitaire, et connaitre les conséquences de ce traitement au niveau des lésions neuronales. Enfin, savoir si la molécule thérapeutique est dégradée au niveau central avec la détection de changements métaboliques. Il est également envisagé d’étudier les effets indésirables du traitement tels qu’une activité hors cible et son effet toxique (eg, altération du fonctionnement d’un organe sain). Outre une analyse sur des coupes de cerveaux, le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins seront prélevés pour les analyses en MALDI IMS

Bénéfices attendus

Ce projet améliorera notre compréhension des partenaires protéiques participant à la formation des obstructions capillaires et il permettra d’identifier des marqueurs protéiques pour le diagnostic précoce d’une atteinte cérébrale. Par ailleurs, il améliorera notre connaissance sur les mécanismes neurodégénératifs de cette atteinte centrale, une analyse spatiale et temporelle de ces marqueurs protéiques semble indispensable. L’imagerie MALDI ou MALDI-IMS est un outil de choix pour répondre à ces attentes. Cette technologie a déjà fait ses preuves pour d’autres pathologies avec atteinte centrale offrant la possibilité d’identifier rapidement et facilement des zones cibles du cerveau ainsi que la bio distribution d’un médicament. La visualisation de la distribution des médicaments dans les tissus a permis d’orienter les chercheurs sur le développement de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de mieux comprendre les mécanismes physio-pathologiques.

Procédures

Il faudra injecter aux souris avec une souche donnant des atteintes neurologiques (injection intrapéritonéale dure moins d'une minute). Les souris seront piquées pour administrer les traitements par voie intrapéritonéale avec contention (prise manuelle) pendant 3 jours consécutifs après détection des premiers parasites sanguins (la contention et la piqure dure entre 2 à 3 minutes). Les souris subiront également des piqures sans contention au niveau de la queue pour les frottis tous les 2 jours (la piqure à la queue dure moins d'une minute). 4 souris subiront un prélèvement sanguin rétro orbitaire afin d'entretenir la souche mais également assurer l'infection des lots expérimentaux (l'ensemble du rétro orbitaire dure environ 5 minutes). Une pesée sera également réalisée en alternance avec les frottis tous les 2 jours (la pesée dure 2 minutes). Les souris pourront avoir des signes neurologiques à partir de J11 (paralysie par exemple) dès l’apparition des symptômes les souris seront euthanasiées afin de prélever les organes. L’apparition des symptômes est importante pour avoir une chronologie des mécanismes cérébraux impliqués.

Impact sur les animaux

L'infection des groupes « infectés » et « infectés traités » entrainera des atteintes neurologiques, et la mort pour les souris concernées. L'administration des médicaments et les infections obligeront les souris à être manipulées, contentionnées - les souris concernées ne seront pas libre de leur mouvement pendant 1 à 2 minutes (pendant 5 jours consécutifs). Le recueil de la goutte de sang pour les frottis entrainera une piqure et une douleur au niveau de la queue pendant 1 minutes tous les 2 jours. La réalisation des lots expérimentaux grâce aux 4 souris entrainera consécutivement l'anesthésie, le prélèvement rétro orbitaire (5 minutes environ) et l'euthanasie de ces 4 souris. La pesée entrainera une manipulation de moins de deux minutes. Les souris pourront avoir des signes neurologiques à partir de J11 (paralysie par exemple) dès l’apparition des symptômes les souris seront euthanasiées afin de prélever les organes. L'infection des souris entrainera également une perte de poids modérée 1 à 2 grammes pendant 2 jours (3 jours après l'infection).

Devenir

L'étude se portant sur la recherche de marqueurs protéiques et tissulaires propre au paludisme, l'ensemble des souris seront euthanasiées

Remplacement

Les objectifs généraux sont de réaliser pour la première fois, des cartes protéiques permettant de visualiser les variations d’expression et d’abondance protéique en fonction de leur localisation in situ mais également suite à l’atteinte cérébrale par une infection palustre, et enfin étudier les conséquences d’un traitement anti-palustre sur ces répertoires protéiques. Afin de mener à bien ce projet, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable. Plasmodium berghei, qui est la souche spécifique du paludisme murin, peut léser, en plus du système nerveux central, un certain nombre d’organes simultanément. La complexité de son cycle ainsi que notre intérêt pour l’analyse de répertoires protéiques, pour une méthode inédite, obligent à l’utilisation d’un modèle animal. Les modèles de cultures cellulaires ne permettront pas de répondre aux objectifs fixés dans le présent projet. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier. Par ailleurs il n’existe pas pour le moment de modèle alternatif complet ou même partiel d’organoïdes, sphéroïdes ou organe sur puce reproduisant la complexité du système nerveux et sa réponse immunitaire face à une infection

Réduction

En accord avec le principe de réduction des effectifs, le nombre de souris par groupe sera calculé par rapport au nombre statistique d’échantillon nécessaire à une analyse en MALDI-MSI (triplicate) tout en tenant compte de la prévalence de la forme neurologique dans ce modèle et de la contribution des deux sexes. Nous avons trouvé un effectif minimum de 6 souris par groupe. Nous prenons 8 individus par groupe infecté pour les deux expériences car si n< 6 l’analyse des données sur les souris restantes ne sera pas possible et demanderait de recommencer la manipulation. Ces nombres ne compromettent pas les objectifs du projet en permettant l’utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

En accord avec le principe de raffinement, les signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement des rongeurs, de manière à limiter l’anxiété des animaux. Des abris, des morceaux de cartons et des éléments à ronger seront placés dans les cages et les souris seront habituées à la manipulation. N’ayant pas trouvé de donnée contraire dans la littérature scientifique sur l’utilisation d’anesthésiant dans le cadre du MALDI MIS toutes les mesures correctives possibles nécessitant une analgésie ou une anesthésie seront utilisée afin de soulager les signes de douleurs. Les animaux sont hébergés en groupe afin de maintenir les interactions sociales. Des points de soin (point of care) et des points limites ont été mis en place afin de prendre en compte les signes neurologiques sans compromettre le suivi et l'acquisition des données de recherche.

Choix des espèces

Afin d’atteindre les objectifs de cette étude, une modèle animal comprenant un parasite du genre Plasmodium et un hôte permissif pour ce parasite afin de développer des atteintes centrales proches du paludisme cérébral humain est indispensable. Ce modèle doit permettre de mettre en évidence les molécules protéiques impliquées dans l’initiation et maintien d’une atteinte parasitaire centrale mais également de l’effet « recovery » du traitement anit-palustre. Le système « souris + P. berghei » est un modèle reconnu pour l’analyse de l’invasion centrale par le parasite ainsi que pour évaluer un composé à activité antipaludique. Nous choisirons des souris C57BL6J pour leur aptitude à développer aussi bien les formes cérébrales que de fortes parasitémies. Les souris C57BL6 seront des individus adultes âgés de 6 à 7 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 8 à 10 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond à l’âge de maturité sexuelle (adulte).

980 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, certaines recevant une injection sous la peau chaque jour pendant un mois. Elles subissent une irradiation myéloablative suivie d'une greffe de moelle osseuse injectée dans le sinus rétro-orbitaire, une transplantation de macrophages dans les poumons par voie intratrachéale ou nasale, puis une infection virale ou une chimiothérapie, les prélèvements sanguins étant eux aussi pratiqués derrière l'œil. Le porteur décrit une douleur légère à modérée aux poumons, à l'œsophage ou à l'œil, ainsi qu'une fatigue, un inconfort respiratoire et une perte de poids pendant quinze jours. Les retombées annoncées, améliorer la réponse immunitaire des personnes âgées, restent au conditionnel, et l'effectif justifié dans le texte, 960 souris, ne correspond pas aux 980 déclarées.

Objectifs

L'objectif de notre recherche est d'étudier les mécanismes qui influencent la multiplication et le maintien des macrophages résidant dans les poumons. Ces cellules jouent un rôle essentiel dans la défense immunitaire, en éliminant les toxines et en contribuant à l'immunité et à la régénération pulmonaire. La capacité proliférative des macrophages alvéolaires diminue au cours du vieillissement. Le projet vise à étudier les effets d'une induction de la prolifération des macrophages pulmonaires de souris âgées sur la défense immunitaire et la régénération pulmonaire en réponse à des traitements chimiothérapeutiques ou des infections virales affectant les poumons.

Bénéfices attendus

D'un point de vue recherche fondamentale, le projet permettra une avancée dans la compréhension de la perte de fonction des macrophages alvéolaires lors du vieillissement et notamment lors de réactions inflammatoires dans les poumons induites par certains traitements chimiothérapeutiques ou infections virales. Ces résultats pourraient conduire à des stratégies thérapeutiques visant à améliorer la réponse des personnes âgées lors de ces réactions. Cela pourrait être réalisé en stimulant la prolifération des macrophages alvéolaires ou en effectuant des transplantations de ces cellules prolifératives.

Procédures

Les procédures utilisées sont : injection de molécules permettant l'expression de gènes (injection en sous cutanées quotidiennement pour une durée de 1 mois ou une unique ingestion par gavage), transplantation de macrophages dans les poumons par injection intratrachéale ou intranasale (unique), transplantation de moelle osseuse par unique injection en intraveineuse dans le sinus retro-orbital après traitements myéloablatifs (une unique dose d'irradiation et une unique injection en intrapéritonéale d’une molécule), traitement chimiothérapeutique ou infection virale par injection intratrachéale ou nasale (unique), prélèvement sanguin dans le sinus retro-orbital.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur capture lors des expérimentations. Les procédures sont classées modérées de par la répétition des gestes expérimentaux sur une durée maximale de 1 mois et la douleur que peut ressentir l’animal. Les souris peuvent présenter : -une sensibilité de la peau au niveau des zones d’injection pendant une durée de 1 mois. - une douleur de légère à modérée au niveau des poumons, de l’œsophage ou de l’œil pour une durée de 5 min minimisée par antalgique et anesthésique. - une fatigue, un inconfort respiratoire et perte de poids pendant 15 jours. Le phénotype des lignées génétiquement modifiées n’induit pas de douleur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure en vue d'analyses.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons déterminer si l'induction de la prolifération des AM peut permettre d'améliorer la réponse immunitaire à un traitement chimiothérapeutique ou une infection pulmonaire virale. L’inflammation pulmonaire induite est une réponse immunitaire intégrant des systèmes de communications cellulaires complexes (endothélium, système lymphatique et vasculaire, système neuronal) que l’on ne peut actuellement pas reproduire in silico, ni in vitro, ni ex vivo. Il n’existe pas de méthodes in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) permettant d’étudier une réponse immunitaire globale comme possible sur animal entier. L’induction de la prolifération des macrophages alvéolaire n’est à ce jour possible que par l’utilisation de modification génétique. Des alternatives ex vivo à l’expérimentation à l’utilisation animale ont été réalisées afin de montrer que l’expression des macrophages alvéolaires augmentent leur prolifération avec notre modèle et une première série d’expérience a pu démontrer que ces macrophages sont plus fonctionnels. Cependant, afin d’analyser leurs capacités de régénération à une inflammation pulmonaire, il est nécessaire d’avoir une approche globale. Dans ce sens, le modèle murin est particulièrement bien adapté à ces différentes problématiques. Il n’y a donc pas d’alternative actuellement à l’utilisation des souris pour atteindre l’objectif de ce projet.

Réduction

le nombre minimum de souris nécessaires (n=960) a été évalué afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les expérimentations seront réalisées en veillant à réduire, supprimer ou soulager tout inconfort, douleur ou angoisse subis par les souris afin d'améliorer leur bien-être. Pour cela, les procédures seront effectuées sous anesthésie générale, dans des conditions stériles, et si nécessaire, un analgésique sera administré. L'état de santé des souris sera surveillé quotidiennement à l'aide d'une grille d'évaluation de la douleur, permettant de déterminer les niveaux de douleur afin de prendre les mesures nécessaires pour la limiter. Tout au long de l'étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur. Cela inclut un environnement contrôlé avec une température et une ventilation régulées, une lumière suivant un cycle de 12 heures, et une hygrométrie adaptée. Les souris auront un accès constant à la nourriture et à l'eau. Elles seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. Leur environnement sera enrichi avec des dômes en carton ou du coton.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. De nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiés permettant de poser les questions biologiques qui nous intéressent existent déjà. Nous utiliserons dans ce projet : - des souris adultes jeunes (entre 6 semaines et 3 mois) et âgées (entre 12 et 27 mois) car nous étudions le vieillissement - des souris nouveaux nés (moins de 1 semaine) car leur niche alvéolaire est vide permettant ainsi de faire des transplantations de macrophages alvéolaires.

Les souris dont le poids passe sous un seuil de référence, qui présentent des difficultés respiratoires ou une fibrose avancée au scanner sont mises à mort. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Une partie reçoit une irradiation du thorax à 13 ou 15 grays, qui provoque une inflammation pulmonaire pendant un à trois mois puis, en cas de forte toxicité, une fibrose des poumons à quatre ou cinq mois. Les autres reçoivent des cellules tumorales sous la peau de la patte, avec des risques de dermite, d'ulcération et de nécrose cutanée, pour comparer un nouveau faisceau d'électrons de haute énergie à un faisceau témoin en vue de son intégration dans de futures machines de radiothérapie.

Objectifs

La radiothérapie induit des effets secondaires qui affectent la qualité de vie des patients atteints de cancers. Pour améliorer les traitements de la radiothérapie et limiter ses effets secondaires, nous explorons de nouvelles méthodes d’irradiation comme la radiothérapie utilisant des particules de haute énergie. Afin de pouvoir explorer son potentiel clinique, nous caractériserons dans ce projet les effets biologiques de cette nouvelle méthode de radiothérapie en étudiant d’une part, les toxicités qu’elle pourrait induire, et d’autre part, son pouvoir à éliminer les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

A l’issue de ce projet, nous aurons déterminé le potentiel clinique d’une nouvelle méthode de radiothérapie utilisant des particules de haute énergie. En cas de résultats positifs, cette nouvelle méthode pourrait être intégrée, aux futures machines de radiothérapie et permettre une amélioration des traitements par radiothérapie (i.e. moins d’effets secondaires) pour les patients atteints de cancer.

Procédures

Dans une première procédure, 3 lots d’animaux seront irradiés avec une nouvelle méthode de radiothérapie et ils seront ensuite suivis par scanner pour petit animal. Ils seront anesthésies pendant 5 à 10 minutes pendant l’irradiation et environ 5 minutes pour chaque scanner mensuel. Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée aux animaux vigiles constituant 3 lots d’animaux : - 1 premier lot ne subira aucun autre geste technique - 1 second lot sera anesthésié en vue d’être irradié avec le faisceau contrôle sur les tumeurs implantées en sous cutanées. La durée de l’anesthésie sera de 2 minutes par animal - 1 troisième lot sera irradié avec le faisceau d’intérêt sur les tumeurs implantées en sous cutanées. L’anesthésie durera entre 5 et 10 minutes.

Impact sur les animaux

Pour l’étude de la toxicité sur tissu sain, les animaux, ayant reçu une irradiation thoracique, développeront une phase d’inflammation pulmonaire(1 à 3 mois post-irradiation) qui évoluera après 4 ou 5 mois vers une fibrose pulmonaire en cas de forte toxicité radio-induite (dose de 13 et 15 Gy). Suite au développement de la fibrose, une perte de poids des animaux pourra être observée. Pour l’analyse de l’efficacité antitumorale, les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée au niveau de la patte développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. L’injection de cellules tumorales provoquera une douleur et gêne de courte durée. Les potentielles toxicités cutanées (dermites, ulcération, nécrose) à court terme induites par le traitement seront évaluées par une grille de score adaptée

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Des modèles in vitro (i.e lignée de cellules en culture) existent et sont utilisés dans le cadre d’études préliminaires des effets radiobiologiques d’un faisceau d’irradiation. Des études préliminaires ont été réalisé avec certains de ces modèles au laboratoire et nos résultats préliminaires sont encourageants (lignée de cellules tumorales/modèle ex vivo de coupes d’organe mis en culture. Cependant, ces modèles restent simples et ne permettent pas de prendre en compte la complexité du développement des toxicités induites par la radiothérapie chez le patient, ce qui nécessite le recours à l’animal

Réduction

Plusieurs mesures ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser tout au long du projet : 1-Des études pilotes ont été réalisées sur un autre faisceau d’irradiation (faisceau contrôle) au laboratoire afin de déterminer les doses optimales pour évaluer les effets radiobiologiques du nouveau faisceau. De la même manière, des études pilotes utilisant des tumeurs greffées sous la peau nous ont permis d’évaluer les temps optimaux d’irradiation post-greffe ainsi que les doses de traitements adaptées 2-Dans le cadre de l’étude des effets secondaires de la radiothérapie dans le poumon, le bras contrôle avec notre faisceau se base sur des données déjà acquises par le laboratoire ce qui nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. 3-Du fait d’études pilotes antérieures, le nombre d’animaux par groupe est optimisé pour avoir une puissance statistique suffisante lors de la comparaison des différentes modalités de radiothérapie. 4-L’optimisation et l’utilisation d’un suivi du développement des complications pulmonaires par imagerie scanner permet de suivre les animaux tout en évitant de multiplier les prélèvements ainsi que le nombres d’animaux utilisés pour cette étude. Les tests statistiques adaptés seront utilisés pour étudier la « survie sans complication » des animaux dans le cadre de l’étude sur le tissu sain. Pour la partie tumorale, des tests seront réalisés pour l’étude de la survie avant qu’un point de limite éthique soit atteint.

Raffinement

Pour la procédure d’évaluation des effets secondaires de la radiothérapie, plusieurs critères seront pris en compte : 1-Le poids des animaux sera suivi de manière hebdomadaire dans la période de 1 à 4 mois post-irradiation (i.e. pendant la phase de pneumopathie). Ensuite, de 5 à 7 mois post-irradiation, le poids des animaux sera suivi de manière bi-hebdomadaire (en début et fin de semaine) afin de surveiller les potentielles pertes de poids. Les animaux pour lesquels le poids sera inférieur au poids limite de référence seront mis à mort pour éviter toutes souffrances. 2-Si des difficultés respiratoires et/ou un isolement sont observés, l’animal sera mis à mort pour éviter toutes souffrances. 3-Le suivi scanner sera également un point majeur de notre évaluation du développement de effets secondaires. Si un animal présente des signes de fibrose avancée sur les images scanner, l’animal sera mis à mort pour éviter toutes souffrances. Pour la procédure d’évaluation de la réponse antitumorale sur un modèle de tumeurs sous cutanée, plusieurs critères seront pris en compte : 1-La taille de la tumeur sera un élément important et déterminant pour assurer le bien-être de l’animal. Le poids des animaux et la taille de leurs tumeurs seront évalués de manière bi-hebdomadaire. 2-De potentielles lésions cutanées peuvent survenir dans la zone d’irradiation de la tumeur. Une grille de score spécifique mise en place lors d’études pilotes et antérieures permettront d’évaluer le grade de ces lésions et limiter les douleurs chez l’animal (mise en place de traitements antalgiques ou mise à mort de l’animal si stade trop avancé) Pour les deux procédures, une anesthésie générale ainsi qu’une contention physique sur un support adaptée sera réalisée au moment de l’irradiation pour éviter tout inconfort et douleurs des animaux. Aucune douleur n’est attendue au moment de l’irradiation dans ces conditions. Les animaux seront hébergés dans des conditions standards

Choix des espèces

La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique pertinent pour la radiothérapie car les réponses moléculaires et cellulaires (e.g. fibrose radique) des tissus murins à l’irradiation sont comparables à celles observées chez l’Homme ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines à 10 semaines Les organes étudiés sont alors matures, limitant les potentiels biais expérimentaux induits par l’irradiation d’organes à des stades de maturation différents. De plus, les animaux adultes supportent également mieux l’anesthésie et l’irradiation.