Procédures modérées

Pour déterminer quel anesthésique tue le plus vite les poissons zèbres selon leur stade de développement, 945 individus vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun passe une heure dans un bain d'anesthésique, puis vingt-quatre heures de suivi pendant lesquelles les expérimentateurs observent ses battements de cœur et ses réflexes à trois, six et vingt-quatre heures. Ceux qui survivent peuvent présenter des signes d'intoxication, des difficultés respiratoires ou des troubles de la nage, avant d'être tués au terme des vingt-quatre heures pour cause de détérioration jugée irréversible. Le porteur range ce travail sous le principe de raffinement : neuf méthodes de mise à mort testées sur trois stades de développement, à trente-cinq individus par méthode.

Objectifs

La Directive européenne 2010/63/CE autorise l'euthanasie des poissons par surdose d'anesthésiques ou l'étourdissement électrique. Chez le poisson zèbre, la directive prend effet à partir de 5 jours post-fécondation. Dès lors, la méthode d'euthanasie la plus utilisée dans les laboratoires est la surdose de tricaine (MS-222). Bien que l'efficacité de cet anesthésique soit démontrée chez les poissons zèbres adultes, peu d'informations sont disponibles sur son efficacité pour les stades larvaires, juvéniles. Toutefois, il a été montré que le MS222 est inefficace pour l'euthanasie des poissons zèbres aux stades embryonnaires. La différence d'efficacité du MS222 par rapport aux adultes peut être expliquée par les transitions importantes lors du développement du poisson, liées aux changements métaboliques et au développement des organes, qui peuvent affecter la sensibilité des poissons aux anesthésiants en fonction de leur stade de développement. L'objectif de l'étude est d'identifier des protocoles d'euthanasie respectueux du bien-être animal pour parvenir à l'euthanasie des poissons zèbres, pendant leurs premiers stades de vie, notamment pour les stades larvaires, juvéniles. L'accent est mis sur la réduction de la durée de la procédure et l'amélioration du confort des animaux lors de l'euthanasie. Cette étude s'inscrit dans le cadre du principe de « Raffinement » en expérimentation animale, visant à minimiser la douleur et la détresse des animaux de laboratoire lors de l'euthanasie. Dans cette optique, l'étude vise à déterminer le meilleur choix d'anesthésiant pour garantir une euthanasie rapide et sans souffrance à différentes étapes du développement du poisson zèbre, couvrant les stades larvaires, juvéniles.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer la méthode d'euthanasie la plus efficace et rapide à différents stades de vie des poissons zèbres, tout en minimisant la douleur et la détresse de l'animal. Les résultats de ce projet serviront de base à des recommandations qui seront bénéfiques à la communauté des chercheurs qui travaillent sur le modèle du poisson zèbre en France et en Europe.

Procédures

Les animaux seront soumis à une exposition aux anesthésiques pendant 1 heure par balnéation (dans l’eau de nage), suivie d'une période de suivi de 24 heures. Les battements du cœur et les réflexes des animaux sont observés pendant 1 heure en présence d'anesthésiants, puis pendant 1 heure de récupération. Ensuite, les poissons sont surveillés, pour les mêmes paramètres, trois fois post-récupération : à 3 heures, à 6 heures et à 24 heures. A l’issue de cette période, les animaux seront euthanasiés (24h post-exposition).

Impact sur les animaux

Lors de la phase de récupération, les animaux peuvent présenter des signes d'inconfort ou des effets indésirables, notamment des signes d'intoxication, tels que des difficultés respiratoires ou des troubles de la nage.

Devenir

Étant donné que l'exposition aux surdoses d'anesthésiants pendant une heure pourrait entraîner une détérioration irréversible et un inconfort prolongés des animaux, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

L'étude dont il est question vise à trouver des méthodes d'euthanasie qui soient rapides, efficaces et qui minimisent la souffrance des animaux. Le remplacement des animaux par des modèles in vitro ou in silico n'est pas possible dans ce cas. En effet, ces modèles ne permettent pas de reproduire l'expérience de l'euthanasie chez les animaux. Ils ne peuvent donc pas être utilisés pour évaluer l'efficacité et la sécurité des protocoles d'euthanasie.

Réduction

La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Nous aurons ainsi besoin de 35 individus pour chaque méthode d'euthanasie, totalisant ainsi 315 individus pour les neuf méthodes. En testant ces méthodes sur les trois stades de développement, nous utiliserons un total de 945 animaux sur une période de 5 ans. Cette approche nous permettra d’obtenir des données statistiquement valides et une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergements des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont enlevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères (nourriture vivante), ce qui leur permet de chasser. Les poissons sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Un suivi des animaux rigoureux sera effectué avec attribution de note qui dicteront des actions (point limites). Les poissons zèbres sont maintenus à une température de 26 degrés Celsius. Les poissons sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est largement utilisé dans la recherche scientifique, notamment en raison de la transparence de ses larves et de sa génétique similaire à celle des humains. L'euthanasie par immersion de surdose d'anesthésiants est une pratique courante pour ces poissons. Bien qu'elle soit efficace chez les adultes, aucune étude n'a encore évalué son efficacité aux premiers stades du développement du poisson zèbre. Notre objectif est de déterminer l'efficacité de différents agents anesthésiques pour l'euthanasie des poissons zèbres à trois moments clés de leur développement : la formation des organes (embryons), l'acquisition des comportements sociaux (larves) et la transition de la larve au stade juvénile. En étudiant l'euthanasie par immersion de surdose d'anesthésiants à ces moments critiques du développement du poisson zèbre, nous pourrons mieux comprendre leur efficacité et garantir une euthanasie sans douleur pour ces animaux. Cette étude contribuera à améliorer les pratiques d'euthanasie des poissons zèbres dans les laboratoires de recherche.

96 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour exploration anatomique et histologique. Chacune reçoit quinze gavages quotidiens de tamoxifène ou d'huile de maïs à partir de la sixième semaine de vie, puis cinq injections intrapéritonéales étalées sur deux mois. Elles portent une mutation qui provoque des lésions vasculaires vers quatre à six mois et des saignements vers douze, le porteur prévoyant de les tuer avant huit mois pour rester en deçà du phénotype dommageable. Il qualifie pourtant ce protocole de "peu invasif" et écrit que le gavage "ne devrait pas induire de douleur", tout en reconnaissant un risque de fausse route.

Objectifs

1)Meilleur compréhension de la fonction d'un gène et de de l'arrêt de la croissance cellulaire irreversible dans les cellules graisseuses dans un contexte de la maladie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieuse. 2)Tester l’efficacité d'une thérapie génique en surexprimant une molécule d'interrêt.

Bénéfices attendus

Trouver une nouvelle cible thérapeutique dans ce syndrome.

Procédures

Un gavage au tamoxifene ou à l'huile de maïs sera réalisé à 6 semaines de vie. Des injections intra-péritonéales seront effectuées par un technicien expérimenté. Les injections débuteront à la semaine 6 de vie toutes les 2 semaines pendant 2 mois. Les animaux seront injectés soit par le véhicule (AAV9-GFP) soit par AAV9-G3PP. Un gavage oral sur souris vigiles sera réalisé à 6 semaines de vie et répété quotidiennement pendant 2 semaines soit au total 15 gavage par souris (1 minute par gavage). Des injections intrapéritonéales sur souris vigiles seront effectuées à la semaine 6 de vie toutes les 2 semaines pendant 2 mois soit 5 injections/souris d'une durée de 30 secondes par souris/injection

Impact sur les animaux

Une injection intra-péritonéale peut engendrer des irritations. Elles nécessitent une contention et induisent une douleur légère de courte durée peu invasives. Le gavage quotidien peut engendrer des risques de fausse route. Le geste ne devrait pas induire de douleur car le geste est parfaitement maîtrisé et les sondes de gavage utilisées sont flexibles et adaptées à la morphologie de l'animal. Les souris développent des lésions vasculaires non dommageables à 4-6 mois puis un phénotype métabolique à 12 mois avec l'apparition de saignements, cependant nous étudierons les souris jusqu'à 8 mois maximum avant l'apparition du phénotype dommageable.

Devenir

Procédure 1: animaux mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur les syndromes d'hypercroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus in vitro nous ont permis d'identifier un gène d'interrêt que nous allons tester in vivo.

Réduction

La taille des groupes utilisés (n=16), minimum nécessaire et suffisante pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés dans ce projet.

Raffinement

Ce protocole est peu invasif puisque les injections intra-péritonéales seront réalisées sur des souris mises dans des conditons de calme, par un technicien expérimenté. Les injections débuteront à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront injectés soit par le véhicule soit par un outil moléculaire. Aucun prélevement ne sera effectué chez les souris. A priori la surexpression de notre molécule devrait améliorer le phénotype des souris qui seront surveillées quotidiennement.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de faciliter d’élevage et de reproduction. Ces souris sont particulièrement intéressantes pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines d'interrêt). La souris est le seul animal pour lequel la protéine d'interrêt a été mutée. Les jeunes souris de 6 semaines sont utilisées car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.

Fabriquer un réactif de diagnostic sérologique : 3 900 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour récolter les parasites de leur cavité abdominale. Elles reçoivent une inoculation intrapéritonéale de toxoplasmes et une inoculation de cellules tumorales qui déclenche une ascite. L'infection se manifeste par des poils hérissés et un dos courbé, signes que le porteur décrit comme la preuve que l'inoculation a fonctionné. La culture cellulaire est écartée au motif du rendement : il faut environ 80 milliards de parasites par production, quantité que le porteur affirme ne pas pouvoir obtenir in vitro.

Objectifs

En France, la surveillance sérologique mensuelle (recherche d’anticorps dans le sang) de la toxoplasmose durant toute la durée de la grossesse chez les femmes enceintes séronégatives pour la toxoplasmose, est nécessaire en vue du dépistage de séroconversion en cours de grossesse pour la mise en place précoce d’un traitement adapté et limiter les complications pour le foetus. Le diagnostic sérologique est également utile pour les immunodéprimés, les patients susceptibles d'être greffés, les donneurs d'organes. L’utilisation d’antigènes est nécessaire pour la recherche d’anticorps. En l'absence d'antigène de toxoplasme seul commercialisé, la fabrication de l'antigènes de toxoplasma est donc une activité nécessaire pour les contrôles sérologiques faits en dehors de tests commerciaux.

Bénéfices attendus

Le projet est d’avoir des tests fiables permettant le diagnostic de la toxoplasmose, pathologie potentiellement grave puisque, elle peut entraîner des malformations congénitales mais aussi le décès de patients immunodéprimés chez l'Homme.

Procédures

Inoculation intrapéritonéale de parasites et de cellules effectuées pour créer une infection parasitaire qui se traduit par l'apparition de signes cliniques, preuve de l’infection.: 1 inoculation/souris, 1 minute. Inoculation intrapéritonéale de cellules TG180 induisant une ascite: 1 injection, 1 minute. Anesthésie flash à l'isoflurane: 1 seule, 1 min

Impact sur les animaux

L’inoculation intrapéritonéale de parasites chez la souris provoque une infection parasitaire. Les souris présentent des symptômes cliniques d'infection (poils hérissées, dos coubés), rentrant dans la grille de score et nous permettant de déterminer les points limites.

Devenir

Pour chaque procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour le recueil des parasites de la cavité abdominale.

Remplacement

L’alternative à l’utilisation d’animaux serait de produire l’antigène par culture cellulaire. Cependant plusieurs problèmes se posent et nous empêchent de basculer sur une technique de culture : - la reproductibilité de la méthode qui n'est pas fiable. En effet, nous savons par expérience que la multiplication des parasites in vitro est incertaine, avec un nombre de parasites variables d’une boîte de culture à l'autre ne permettant pas d'assurer un antigène reproductible entre les différents lots contrairement à la multiplication in vivo. - la qualité de l'antigène est différente entre une production d'antigène in vivo et une production in vitro. Les deux préparations de parasites sont différentes jouant sur la sensibilité de chaque méthode. - la quantité de parasites. Il faut pour la fabrication de cet antigène, la production d'un nombre très élevé de toxoplasmes. Cette énorme quantité de parasites (environ 80 milliards de parasites) ne peut pas être obtenue en culture cellulaire. La production en cultures cellulaires nécessiterait une grande quantité de boîte de culture pour obtenir la même quantité de parasites. A notre connaissance, aucune autre alternative n’a été développée pour obtenir une si grande quantité de parasites. Il y a quelques années, nous avons travaillé (pour la multiplication parasitaire) avec des cellules en suspension qui ne permettaient pas d’avoir un nombre suffisant de parasites. Nous avons donc changé de type cellulaire pour travailler avec des cellules adhérentes. Nous avons ainsi amélioré notre rendement de parasites en le multipliant par 5. Cependant, ce type cellulaire bien que facilitant l’invasion et la multiplication cellulaire n’est pas suffisant pour obtenir la grande quantité de parasites exigée pour la production d’antigène. Les approches in silico ne peuvent pas être envisagées car le diagnostic de la toxoplasmose se fait biologiquement avec les sérums des patients mis au contact de l’antigène.

Réduction

La standardisation de cette technique (concentration de parasites, cellules, réactifs, …) réalisée par notre laboratoire depuis plus de 30 ans permet de prévoir un nombre minimum de souris nécessaire à la fabrication d'antigène. Pour la fabrication de cet antigène, un nombre d'animaux a été estimé : en dessous de ce nombre de souris, le rendement pour l’obtention du nombre de parasites est trop faible pour assurer la fabrication d’un volume d’antigène suffisant. De plus, le protocole de fabrication a été optimisé pour minimiser le nombre de souris au maximum. Ainsi, historiquement la souche de parasite et la lignée cellulaire (nécessaire pour la multiplication des parasites) étaient entretenues sur souris (passages successifs) toute l’année de façon continue consommant un nombre important de souris. Actuellement, les parasites et la lignée cellulaire sont stockés congelés et décongelés en prévision de la production de l’antigène. C’est donc une approche expérimentale validée au cours du temps qui nous a permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaire avec une variabilité du volume obtenu. Nous ne pouvons prévoir la quantité d’antigène que par les volumes antérieurs utilisés annuellement.

Raffinement

Une surveillance accrue des souris (2 fois/ jour) est effectuée dans les 72 heures après leur inoculation par des personnels formés et expérimentés afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. Après l’inoculation parasitaire, une attention particulière est portée sur 5 critères : l’apparence physique de l’animal (aspect du poil), son comportement (réponse aux stimuli externes, mobilité) et la présence de signes cliniques (respiration). L’utilisation d’un analgésique permettra de prévenir toute douleur éventuelle. Il sera administré aux souris (5mg/kg) per os (dans un biberon) après inoculation de la souche parasitaire. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne).

Choix des espèces

Le modèle souris décrit dans les publications sont des souris (femelles) âgées de 8 semaines (20g) qui présentent un système immunitaire fonctionnel.

3 892 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir jusqu'à treize tests de force, treize mesures de motricité et treize échocardiographies sous anesthésie gazeuse. Un quart d'entre elles, celles dont le gène est aboli, développent une cardiomyopathie vers huit semaines et meurent vers douze, en perdant du poids et en adoptant une posture anormale à partir de la onzième. Les nouveau-nés reçoivent une injection intraveineuse après immobilisation par hypothermie sur de la glace humide, et les animaux circulent entre trois établissements. Toutes sont tuées pour prélèvements terminaux, le porteur écrivant espérer restaurer la protéine défectueuse avant d'envisager un essai chez l'humain.

Objectifs

Les mutations du gène d’intérêt provoquent une maladie rare affectant le cerveau, le cœur et le foie. Ce type de maladie se manifeste dans les premiers mois de la vie et la majorité des enfants meurent vers l'âge de deux ans. À ce jour, il n'existe aucun traitement pour cette maladie. Le gène d’intérêt code pour une protéine essentielle pour la production d'énergie dans nos cellules. L’objectif général de ce projet est de développer un traitement pour la maladie causée par des mutations du gène d’intérêt par thérapie génique chez les souris. En particulier, nous allons développer des vecteurs thérapeutiques pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. L’expression de la version normale du gène d'intérêt peut réparer les dommages causés par la mutation du gène d'intérêt. En injectant ces vecteurs thérapeutiques dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés. Ce projet est multi-site et sera réalisé sur 3 établissements.

Bénéfices attendus

À ce jour, les maladies causées par des mutations du gènes d’intérêt ne disposent toujours pas de traitement curatif permettant de les guérir ou de contrôler leur évolution. Le projet permettra de développer et d'évaluer l'efficacité thérapeutique de notre approche chez la souris. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques.

Procédures

L'élevage des animaux transgéniques se fera dans l'établissement 1 avec biospsie de la queue sur animaux vigiles (1 fois par souris). Dans l'établissement 2 seront réalisées les -Injection par voie intraveineuse dans la veine caudale (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris ), -les tests destinés à évaluer le force (5 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -Injection par voie intraveineuse dans la veine temporale (30 secondes par souris; 1 fois maximum par souris) - injection en IV sur souriceaux immobilisés par hypothermie (en contact avec de la glace humide) (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris). Les études par imagerie non invasive et test comportementauxseront réalisées dans l'établissement 3 : -mesure de la motricité dans un milieu ouvert (10 min par souris ; 13 fois maximum par souris), échographie non invasive sous anesthésie gazeuse (20 min par souris; 13 fois maximum par souris).

Impact sur les animaux

Les souris où l’expression du gène d’intérêt est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée) développeront une cardiomyopathie autour 8 semaines, et mourront à 12 semaines. À partir de 11 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant la contention dans un tube en plastique spécial et l’injection, le stress pendant les tests comportementaux, l’échocardiographie et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort, pour prélèvements terminaux.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire et indispensable dans notre étude car nous devons tester l'efficacité des vecteurs thérapeutiques dans la prévention de la maladie. De plus, en testant l'efficacité thérapeutique chez les souris, qui développent normalement la maladie, nous avons la possibilité de voir si la maladie est prévenue ou si elle est retardée. En outre, l'utilisation de modèles de souris est nécessaire parce que les vecteurs thérapeutiques peuvent exprimer la version normale du gène d’intérêt de différentes manières dans les tissus et les cellules en culture..

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies neurologique et sur des méthodes et analyses statistiques. Pour réduire le nombre total de souris, nous testerons d'abord l'efficacité de 4 vecteurs thérapeutiques sur une partie des souris. Seul le meilleur vecteur sera utilisé après dans les études suivantes. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.

Raffinement

Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante et l'aiguille pour l'injection sera la plus fine possible. Concernant l'injection chez les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress : l'éloignement temporaire de la mère et la préservation de la litière de la cage maternelle. En outre les injections des nouveau-nés seront effectuées sous anesthésie par hypothermie induite par la stimulation du petit sur de la glace humide pendant 30-60 secondes. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiés tout en réduisant les vibrations et le bruit. En plus l'échographie et les tests comportementaux ne sont effectués que 7 jours après l'arrivée des souris pour permettre leur acclimatation.

Choix des espèces

Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement plus proches des humains. De plus, afin de tester l'efficacité du traitement pour le développement de la thérapie génique, l'utilisation de mammifères est indispensable et les souris représentent un bon modèle. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Pour l'injection, nous utiliserons des nouveau-nés et souris juvéniles. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris juvéniles et adultes

Gavages quotidiens, prélèvements sanguins répétés, injections dans le sinus rétro-orbitaire deux fois par œil : 1 500 souris et 750 rats vont subir ces gestes pour que des personnels apprennent à les exécuter, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'inexpérience des apprenants peut causer une perforation de l'œsophage, une fausse route mortelle, une nécrose ou une brûlure de la queue, une section de la queue au scalpel, une éraflure de l'œil rendant l'animal borgne. L'objectif affiché reste pourtant de garantir le bien-être des animaux non-humains par la maîtrise du geste, pour cinq personnes formées par an pendant cinq ans. La mise à mort sert elle aussi d'exercice : le porteur indique qu'elle permettra à la personne formée d'apprendre la dislocation cervicale et l'appareil à hypoxie au CO2.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de permettre au personnel de notre laboratoire de pouvoir se former aux gestes et techniques de base de notre métier. Ces procédures menées sur les animaux de laboratoire doivent être accomplies avec une maîtrise parfaite des gestes techniques pour garantir leur bien-être ou pour réduire au maximum l’inconfort résultatnt de l'expérimentation. La période d’apprentissage de l’expérimentateur est importante car elle va conditionner la qualité du travail qui sera fourni ultérieurement.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu par ce projet est de former un personnel et de transmettre un savoir-faire en expérimentation animale à des personnels novices ou nécessitant une remise à niveau.

Procédures

Les administrations intra gastriques (gavages) ne doivent pas prendre plus de 15 secondes par animal que ce soit pour les souris ou pour les rats. Ils peuvent être répétés quotidiennement pour s’assurer que le geste est bien maîtrisé et qu’il n’entraîne pas de perte de poids. Les prélèvements sanguins pourront être faits jusqu’à 4 fois par animal avec un temps de récupération d'une semaine nécessaire avant de procéder à un nouveau prélèvement. Ce sera aussi l'occasion pour l'expérimentateur d'apprendre à utiliser le système dédié à l'anesthésie volatile gazeuse. Lorsque le prélèvement est maitrisé, un ultime prélèvement terminal pourra être fait en fin de procédure, il sera d’un volume plus important. S'ensuivra toujours sous anesthésie gazeuse, la mise à mort de l'animal par dislocation cervicale, toujours sous la surveillance d'une personne habilitée et expérimentée au sein de notre établissement utilisateur. Pour les souris, les administrations en sous-cutané, en intra-péritonéale, en intra-musculaire et intraveineuses pourront être faites jusqu’à 3 fois avec un minimum de 3 jours entre chaque injection. Dans le cas de l'injection intra veineuse au sinus rétro-orbitaire, chaque animal ne pourra être utilisé que 2 fois par œil injecté avec un délai de repos de 5 jours entre 2 injections. Chaque geste d’injection durera environ 10 secondes. Tous ces gestes sont effectués sous la surveillance d'une personne expérimentée au sein du laboratoire.

Impact sur les animaux

Lors des apprentissages certains effets néfastes peuvent être rencontrés dûs à l'inexpérience des utilisateurs. Lors des gavages, une irritation de l'oesophage voire la perforation est possible entrainant pour le premier une perte de poids et pour le second la perte de poids précédent la mort de l'animal. De même une fausse route entraînera la mort de l'animal. Lors des administrations intraveineuses à la veine caudale, l'injection d'une bulle d'air bien que ne devant pas se produire, pourrait arriver entrainant la mort de l'animal. Les injections répétées et/ ou ratées peuvent engendrer des lésions sur la queue de l'animal pouvant aller jusqu'à la nécrose, de même lorsque la queue est trempée dans de l'eau chaude pour dilater les veines, la brulûre de la queue est à envisager. Lors d'administrations intraveineuses au sinus retro orbitaire, une mauvaise insertion de l'aiguille peut entraîner une eraflure de l'oeil entrainant une cécité de l'oeil concerné. Une anesthésie gazeuse ou injectée mal maîtrisée peut entrainer l'arrêt cardio-respiratoire de l'animal et la mort. Lors des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire l'éraflure de l'oeil avec le capilaire peut entrainer une cécité de l'oeil concerné, de même une mauvaise compression de l'oeil suivant le prélèvement peut engendrer un hématome entrainant l'exorbitation nécessitant la mise à mort de l'animal. Lors des prélèvements de sang à la veine caudale, une mauvaise maîtrise du geste de scarification au scalpel peut entrainer le sectionnement de la queue. Toutes des interventions sont qualifiées de modérées.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés soit par dislocation cervicale, soit par hypoxie au CO2. On estime que ces animaux auront vieilli et ne seront plus suffisamment naïfs pour participer à d'autres études. De plus, ce sera l'occasion pour la personne formée d'apprendre à utiliser l'appareil à euthanasie par hypoxie au CO2 et d'apprendre la technique de dislocation cervicale sous le contrôle d'une personne habilitée et expérimentée.

Remplacement

Dans un premier temps, des vidéos ainsi que nos protocoles qualités seront mis à disposition des personnes devant se former aux gestes d'expérimentation sur les animaux. Ensuite, les apprentissages de préhension, injections et identifications par puces pourront se faire sur modèle inerte type CurVet Rat ou Mimicky Mouse. Une fois que la personne se sent suffisamment en confiance avec ses gestes, celui-ci pourra passer sur animaux vivants. L'utilisation de cadavres n'est envisageable que pour certaines actions ne nécessitant pas de visualiser une veine ou de nécessiter d'un reflux sanguin comme pour les intraveineuses. Ainsi, les cadavres pourront être utilisés pour les intra-péritonéales, les sous-cutanés ainsi que pour s'exercer à l'insertion d'un capillaire ou d'une aiguille dans le sinus rétro-orbitaire. Ils pourront également être utilisés pour les incisions de queue au scalpel ce qui permettra à l'apprenant d'appréhender le geste et les limites pour ne pas sectionner complètement la queue d'un animal vivant.

Réduction

Bien que n'ayant pas de vision à long terme du nombre de personnes à recruter et / ou former, nous estimons que la formation de 5 personnes par an est envisageable, en considérant aussi bien les besoins humains des projets en expansion que le "turn over" de la profession. En considérant 1 lot de 20 souris (ou 10 rats) pour l'apprentissage des gavages, 1 lot de 20 souris (ou 10 rats) pour les intraveineuses et un lot de 20 souris (ou 10 rats) pour les autres gestes qui peuvent être répétés tels que les IP, les sous-cutanés, cela par an pour 5 personnes en apprentissage, cela fait 15 lots de 20 souris par an et 15 lots de 10 rats par an soit 300 souris et 150 rats par an pour un total de 1500 souris et 750 rats pour la globalité du projet. Cette estimation est le maximum que nous pourrons utiliser sachant que parmi ces animaux, certains peuvent subir plusieurs gestes comme un gavage et un prélèvement sanguin. L'utilisation d'animaux de réforme n'est pas envisagée car nous n'avons pas d'élevage au sein de notre établissement utilisateur et les animaux de nos autres projets sont prévus pour une procédure précise et doivent être euthanasiés une fois la procédure achevée, il n'est pas prévu de réutilisation de ceux-ci.

Raffinement

Les apprentissages se feront dans un premier temps par le biais de vidéo éducative, puis par l'utilisation de modèle d'animaux inerte. Puis dans un second temps lorsque l'utilisation d'animaux vivants se trouvera nécessaire, une démonstration des gestes par 2 personnes du laboratoire habilitées et expérimentées sera faite. Lors de la phase d'exercice par la personne formée, celui-ci sera accompagné de personnes du laboratoire. Le formé s'occupera de ses propres animaux (change et soins) et procèdera à la pesée de ceux-ci afin de vérifier qu'ils s'alimentent et qu'il n'y pas de perte de poids nécessitant une mise à mort. Cela permettra également de former le nouvel entrant à repérer les signes de mal-être animal et de l'y sensibiliser. De plus, lorsque la personne formée se sent à l'aise avec les gestes qu'elle a acquis, une évaluation sera faite en présence du responsable du laboratoire vivo de l'établissement utilisateur ainsi que d'un assistant de recherche.

Choix des espèces

Le choix des espèces rats et souris pour ce projet de maintien de compétences et d'apprentissage de techniques est justifiée par le fait qu'il s'agit des espèces utilisées dans les programmes de recherches sur la sphère hépatointestinales effectuées au sein de notre établissement utilisateur. Les souris adultes et les rats matures seront employés car ils présentent les caractéristiques idéales pour l'apprentissage de personnel novices ou peu expérimentés