Procédures modérées
Étude de tolérance d’une nouvelle argile en tant qu’additif alimentaire pour l’élevage de la truite arc-en-ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
1 600 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries pendant 90 jours avec trois doses d'argile, 1 200 d'entre elles peuvent perdre l'appétit et du poids, et 64 subissent un test de stress consistant en une minute de pourchasse à l'épuisette suivie de cinq minutes de confinement dans un seau, avant d'être tuées trente minutes plus tard. Les truites sont ensuite disséquées pour analyser leur sang, leurs organes, la composition de leur chair et son goût. Le demandeur est un exploitant et vendeur de substances minérales qui cherche une autorisation de mise sur le marché pour une de ses argiles, et présente l'essai comme démontrant à la fois l'innocuité du produit et son bénéfice pour le "bien-être" des poissons, dont il prévoit pourtant la mise à mort intégrale.
Objectifs
Les argiles sont une famille de minéraux d’origine volcanique, ayant une très bonne capacité d’échange d’ions, les rendant intéressants dans de nombreux domaines (industrie, agriculture, médecine...), et notamment en nutrition animale. Dans ce domaine, ils sont utilisés comme agents de liaison et/ou fluidifiant pour la fabrication d’aliment. De plus, ils améliorent l’utilisation des nutriments et par conséquent les performances de croissance des animaux en élevage. Un exploitant et vendeur de substances minérales, souhaite étudier la faisabilité d’une mise sur le marché d’une de ses argiles à la composition différente de celles déjà autorisées dans l’alimentation animale. C’est pourquoi l’objectif de cet essai est double, il vise à mettre en évidence 1) l’innocuité d’une nouvelle argile pour l’alimentation des poissons, ainsi que 2) son effet positif sur la nutrition et le bien-être animal. Cet essai a été mis en place en tenant compte des exigences de l’Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (EFSA) afin que les données obtenues puissent servir à l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché en tant qu’additif zootechnique pour l’alimentation des salmonidés. Ainsi, un essai d’une durée de 90 jours va être réalisé sur des truites arc-en-ciel de 15 g, au cours duquel des aliments contenant différentes doses d’argiles seront distribuées. En plus d’un suivi d’élevage traditionnel (rationnement, croissance, mortalité) qui visera à la fois à démontrer l’innocuité et l’intérêt zootechnique de l’additif, des analyses sur le sang et les organes des poissons seront réalisées en fin d’essai afin de confirmer l’innocuité de l’additif, et des études sur la digestibilité de l’aliment, son impact sur le stress des poissons et sur la qualité de la chair (composition et dégustation) seront également menées. La truite arc-en-ciel a été choisie comme modèle d’étude en raison de son importance économique en France et dans le monde, de sa sensibilité aux paramètres environnementaux, et du cahier des charges de l’EFSA pour ce type de test (à réaliser sur truite ou saumon).
Bénéfices attendus
Le premier bénéfice attendu de ce projet est que les quantités d’argile incorporées à l’aliment ne mettent pas en évidence d’effets délétères sur les animaux en essais, contribuant à démontrer que cet additif n’a aucun effet néfaste sur la santé des poissons, et qu’il peut faire l’objet d’une évaluation pour autorisation de mise sur le marché. Le second bénéfice attendu est qu’au moins une des doses d’argile testées mette en évidence un intérêt pour l’élevage de la truite, comme de meilleures performances de croissance, une meilleure digestibilité ou une meilleure résistance au stress. Ces bénéfices pour l’alimentation piscicole seraient à moyen terme, puisqu’ils devront être évalués ensuite par l’EFSA avant d’obtenir une autorisation de mise sur le marché.
Procédures
La pêche à l’épuisette, d’une durée inférieure à la minute, sera réalisée 1 fois sur 1536 poissons (transfert dans bac pour mise à mort), et 2 fois sur 64 poissons (changement de bac, puis test de stress). La procédure expérimentale ‘test de stress’ sera réalisée une fois sur 64 poissons, et durera 6 minutes (1 min de pourchasse dans le bac + 5 min de confinement), et sera suivi 30 min plus tard d’une mise à mort.
Impact sur les animaux
Une inappétence, une croissance moindre et une perte de poids pourront être observées sur les 1200 poissons nourris avec un aliment à base d’argile (3 lots de 400 poissons). Ces nuisances sont considérées comme modérées sur une durée de maximum 7 jours. A l’issu des 90 jours d’alimentation expérimentale, 64 poissons seront soumis à un test de stress aigüe (16 poissons par lot, 4 par bac), nécessitant au préalable un changement de bac, suivi d’une acclimatation de 96h. Les nuisances attendues sont le stress généré par ce transfert qui durera 1 minute (pêche à l’épuisette et changement de bac), puis le test de stress en lui-même qui consiste en une chasse à l’épuisette d’une durée de 1 minute, suivi d’un confinement dans un seau pendant 5 minutes. Afin de limiter la production de déjections et d’éviter une pollution de l’eau, notamment pendant la phase de confinement, les poissons ne seront pas alimentés le jour du test de stress. Cette période de mise à jeun sera inférieure à 24h. Cette nuisance est considérée comme modérée en raison du nombre limité de nuisances et de la durée relativement courte des stress induis.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour la réalisation de différentes analyses (sang, organes, composition nutritionnelle, dégustation).
Remplacement
Il n’existe pas à notre connaissance d’expérimentations déjà décrites dont le but est de montrer l’intérêt de cet argile spécifique. L’objectif de ce projet étant de démontrer que ce produit n’a pas d’effet délétère, et qu’il amène des atouts supérieurs en termes de nutrition et de stress par rapport à d’autres argiles, il n’est pas possible d’en faire abstraction. Pour ce type d’approche, il n’existe pas aujourd’hui de méthodes alternatives à l’expérimentation animale.
Réduction
Il a été choisi en amont de ce test de réaliser 4 répétitions de bac pour chaque régime alimentaire. Ce nombre de répétitions est un bon compromis entre l’effort à réaliser au cours de l’étude (en termes de prélèvements, de matériel, de maintiens des animaux) et la puissance statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives. Il a également été décidé de n’intégrer à cette étude, que 100 poissons par bac, permettant d’assurer un comportement normal de truites en élevage et la croissance associée, et un nombre d’animaux suffisant aux analyses post-mortem (30 par bac) et associées au test de stress (4 par bac). Ce nombre d’animaux a été réduit au maximum, en tenant compte du nombre de poissons par bassin pour obtenir un optimum pour le bien-être des animaux, tout en assurant la robustesse statistique de l’analyse de données. Ces données seront étudiées paramètre par paramètre.
Raffinement
La procédure expérimentale a été conçue pour minimiser les dommages causés aux animaux. Les pêches et pourchasses de poissons seront réalisées avec des équipements adaptés (bacs et épuisettes) ne risquant pas de blesser les poissons, et la taille des lots de poissons échantillonnés sera réduite à 10 poissons maximum afin de limiter la compression au sein de l’épuisette. Les poissons impliqués dans les mesures de poids moyens seront préalablement anesthésiés puis, suite à la mesure de poids moyen d’une durée inférieure à la minute, mis à récupérer en eau neuve avant d’être replacé dans leur bac d’origine. Les 16 poissons changés de bacs seront acclimatés pendant 96h avant la réalisation des tests de stress. Lors des phases de confinement des tests de stress, une attention particulière sera portée sur le maintien d’une teneur en oxygène dissous supérieur à 90% dans les seaux, via un bullage faible mais continu d’oxygène. De même, la qualité de l’eau utilisée pour le confinement sera identique à celle des enceintes d’élevage. Tout cela afin que seul le volume restreint et donc la charge plus importante en poissons soit de nature à engendrer un stress.
Choix des espèces
L’espèce truite arc-en-ciel a été choisie comme modèle d’étude en raison de son importance économique en France et dans le monde, et de sa sensibilité aux paramètres environnementaux, et du cahier des charges de l’EFSA pour ce type de test. Les animaux utilisés seront des juvéniles de truites arc-en-ciel de 15 g en début d’essai. Cette taille initiale est demandée par l’Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (taille minimale de 10 g en début d’essai pour la truite) dans le cadre d’une étude de tolérance.
Evaluation de thérapie génique dans un modèle murin de pathologie dominante liée à RYR1
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Pour tester une thérapie génique contre les mutations dominantes du gène RYR1, 336 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 40 d'entre elles anesthésiées et tuées avant tout réveil. Elles reçoivent un poinçon à l'oreille pour le génotypage, une injection unique dans l'abdomen ou dans le muscle, puis des tests de comportement destinés à mesurer leur force musculaire, dont la nature n'est pas précisée, toutes les deux semaines pendant deux mois. Le porteur indique que l'anesthésie peut déclencher chez les souris porteuses de la mutation une crise d'hyperthermie maligne, avec montée de température et contraction musculaire généralisée aux effets parfois fatals, et que le traitement lui-même peut entraîner une fonte musculaire. Toutes sont tuées pour prélever les muscles, le porteur affirmant qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'évaluer la force musculaire ou la sensibilité aux anesthésiques.
Objectifs
Le récepteur à la ryanodine RYR1 est une protéine essentielle à la contraction musculaire. Les mutations dans le gène qui code pour cette protéine conduisent chez l’homme à plusieurs maladies graves, héréditaires et rares du muscle squelettique. Les mutations dominantes de RYR1 peuvent ainsi conduire à la myopathie à cores centraux, ou à une maladie déclenchée comme l'hyperthermie maligne, les deux pouvant être associées chez un même patient. Il n'y a pas de traitement pour ces maladies qui peuvent être mortelles. La myopathie à cores centraux se caractérise par une faiblesse musculaire de sévérité variable chez les patients, prise en charge uniquement par kinésithérapie et corticothérapie en l'absence de tout traitement curatif. L’hyperthermie maligne est un accident d'anesthésie d'origine génétique induit par l'exposition à des certains produits anesthésiques. Elle se traduit lors de l'anesthésie par une augmentation rapide de la température du patient associée à une contracture généralisée qui conduisent à la mort si le patient ne reçoit pas rapidement un traitement adapté. La fréquence de l’hyperthermie maligne est d'environ 1/50 000 anesthésies. Ces deux pathologies étant intimement liées, après l'identification d'une mutation dans le gène RYR1, un patient myopathe est considéré comme sujet à risque d'hyperthermie maligne. Pour étudier les mécanismes physiopathologiques qui découlent de mutations dans le gène RYR1, plusieurs modèles de souris ont été développés. Dans ce projet, nous souhaitons développer une thérapie génique pour toutes les mutations dominantes de RYR1, quelque soit la pathologie qui en découle. Nous avons établi la preuve de concept dans des modèles de cellule en culture du bénéfice de cette approche, et nous souhaitons maintenant l'étudier chez l'animal. Nous utiliserons un modèle de souris porteur d'une mutation dominante qui conduit chez la souris à l'hyperthermie maligne.
Bénéfices attendus
Chez les patients atteints de mutation dominante, sur les deux copies du gène RYR1, une copie est porteuse de la mutation alors que l'autre copie est saine. Nous souhaitons enlever la copie mutée et ne conserver que la copie saine, qui assurera à elle seule la fonction normale du muscle. Nous avons montré dans des cellules musculaire en culture que les fonctions essentielles la protéine RYR1 étaient améliorées avec cette approche thérapeutique, et nous allons maintenant montrer que ces fonctions sont améliorées également dans un organisme entier. Cette stratégie est novatrice car la même approche pourrait s'appliquer à tous les patients porteurs de mutation dominante dans le gène RYR1, mais également dans d'autres gènes associés à d'autres maladies génétiques.
Procédures
Le génotype des animaux sera vérifié sur un prélèvement réalisé par un poinçon à l'oreille, le prélèvement durera quelques secondes (moins de 5 s). Chaque animal subira au maximum une injection (soit dans l'abdomen, soit dans le muscle) d'une durée de moins de 20 secondes par animal, 1 seule fois dans sa vie. Sa force musculaire sera éventuellement mesurée par des tests de comportement réalisés pendant 2 mois toutes les deux semaines et d'une durée de 30 min maximum. Il subira une anesthésie gazeuse de 20 min maximum.
Impact sur les animaux
Les souris du modèle de l'hyperthermie maligne ne présentent pas de signe en dehors de l'anesthésie. Cependant, des nuisances apparaissent chez les animaux porteurs de la mutation lors d’une anesthésie réalisée avec certains composés conduisant à l'apparition d’une crise d'hyperthermie maligne, associant une montée en température et une contraction musculaire généralisée au cours de l'anesthésie. Concernant les autres nuisances potientielles, nous pouvons attendre : 1- Chez certains animaux le traitement pourra entraîner une myopathie progressive avec une fonte musculaire et une perte de la force musculaire. 2- Les injections abdominales et dans le muscle (1 seule fois) peuvent aboutir à des hématomes au site d’injection. 3- Des effets indésirables liés à une hausse de la température centrale corporelle qui peuvent être fatals durant l'anesthésie.
Devenir
Les animaux sont mis à mort et les muscles prélevés pour réaliser des analyses moléculaires et biochimiques essentielles à la confirmation des phénotypes observés lors des tests comportementaux ou de sensibilité à l'anesthésique.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, permettant l’évaluation de la force musculaire ou la sensibilité à certains produits anesthésiques, et confirmant ainsi l'efficacite du traitement que nous voulons tester. Les outils ont été préalablement sélectionnés sur des cellules musculaires en culture et seul les meilleurs seront testés chez l'animal.
Réduction
Afin de limiter le nombre conditions et donc de réduire le nombre d'animaux vivants utilisés, nous réaliserons un criblage sur des cellules musculaires en culture, et seuls les outils validés seront testés chez les animaux. Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de répétitions des expériences sont déterminés à l'aide de tests statistiques appropriés tout en optimisant l'interprétation statistique des informations recueillies. Le projet a été désigné pour une mise au point des étapes préliminaires sur un nombre réduit d'animaux, avant de tester uniquement la méthode optimale sur un plus grand nombre.
Raffinement
1- Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du premier février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Les animaux sont hébergés en groupe, en milieu adapté, à température constante, éclairage alterné (12h/12h), avec boissons et aliments sans restriction. 2- Les injections sont réalisées à l'aide d'aiguilles fines et changées à chaque animal. 3- Les tests de comportement sont réalisés après une période d'entraînement permettant de limiter le stress de la nouveauté. 4- Une grille de cotation adaptée est établie afin d'identifier les points limites les plus précoces, et de mettre en place les actions correctrices à apporter (antidouleur dans l'eau de boisson; aliment hydraté dans la cage).
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale qui a permis de comprendre de nombreuses pathologies humaines, et la plupart des modèles animaux de maladies humaines sont des modèles souris. Ainsi, nous disposons d'une souche de souris, le modèle murin R163C, permettant de modéliser une altération observée chez des patients atteints d’hyperthermie maligne. Nous avons la possibilité également de croiser des souris de différents fonds génétiques afin d’utiliser la variabilité génétique naturelle existant entre les lignées de souris pour valider nos outils thérapeutiques. Des souriceaux seront utilisés à l'age de 15 jours. Cet âge est choisi comme le plus précoce permettant de réaliser une injection abdominale sur des animaux de faible poids et donc de diminuer les quantités de vecteurs viraux à injecter. Cet âge sera destiné a apporter une preuve de concept de l'efficacité maximale de notre stratégie en se placant à un stade précoce. Des souris adultes seront utilisées à 8-10 semaines. Cet âge correspond à l'âge jeune adulte des patients chez lesquels on découvre une mutation dominante dans le gène RYR1 associée à une susceptibilité à l’hyperthermie maligne (lors d’une anesthésie le plus souvent) ou une myopathie. Cet âge sera destiné à se rapprocher des conditions cliniques réelles pour les patients atteints de pathologie dominante liée à RYR1.
Production de modèles de pathologies humaines de plaquettes à partir des mégacaryocytes dérivés des iPSC de patients
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Irradiées puis greffées de cellules humaines, 1 530 souris subissent quatre injections, une injection dans le fémur, une prise de sang et la section du bout de la queue pour mesurer leur temps de saignement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, une partie par laparotomie sans réveil, pour prélever tissus et organes. Le projet vise à tester l'effet de mutations rares sur la coagulation et la sécurité de plaquettes produites à partir de cellules souches, en vue de transfusions. Le porteur affirme être "contraint" de travailler sur la souris et indique que la thrombose ne peut s'étudier qu'in vivo, l'espèce étant retenue parce qu'elle tolère les greffes de cellules de patients.
Objectifs
Ce projet a pour objectif 1) étudier l’effet de différentes mutations trouvées dans les pathologies très rares sur la coagulation, évènement qui est impossible d’étudier in vitro, et tester l’effet des drogues identifiées dans une étude sur la coagulation réalisée en parallèle in vitro à partir de cellules souches de patients. 2) étudier la fonctionnalité des plaquettes générées à partir des plaquettes dérivés de cellules souches adultes, notamment leur capacité à participer à la formation de caillot ; et tester la sécurité de ces plaquettes dans le but de leur utilisation pour la transfusion (pas de développement d’hémopathies malignes).
Bénéfices attendus
1) Identification et validation de drogues permettant l’arrêt de saignement dans les maladies rares conduisant à des thrombopénies/thrombopathies 2) Développement de stratégie de production de plaquettes in vitro dans le but de transfusion, notamment test de fonctionnalité et sécurité des plaquettes produites in vitro à partir des cellules souches adultes plaquettaires.
Procédures
Irradiation par rayonnements ionisants à faible dose, pas d'effet délétère. Injections (n=4, durée 1 minute sous anesthésie locale). Injection intra-fémorale (n=1), durée 5 minutes sous anesthésie générale puis analgésie bi-modale., Prise de sang (n=1, durée 1min) .Mesure de temps de saignement : par section de l'extrémité de la queue sous anesthésie générale (durée maximale 10 minutes). Laparotomie sous anesthésie générale en procédure terminale, sans réveil.
Impact sur les animaux
Nous n’anticipons aucun effet indésirable après l’injection de MKs ou plaquettes dérivées de cellules souches. Les principales nuisances seront celles dues aux interventions. Injections simples, de contrainte légère sous anesthésie locale. L'irradiation a faible dose n'a pas d'effet délétère. L'injection intra-fémorale peut entraîner une gêne modérée transitoire. La section d'une petite partie de la queue pour étudier le temps de saignement entraîenra une contrainte légère et de courte durée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour études sur tissus et organes, certains à l'issue d'une procédure terminale sans réveil.
Remplacement
Bien que les plaquettes soient étudiées chez les patients, il est rarement possible d’étudier toutes les étapes dérégulées et aboutissant à la pathologie. Ainsi, il est difficile de les étudier chez l’homme. Nous sommes donc contraints de travailler sur souris afin de comprendre le dysfonctionnement dans la production plaquettaire dans les thrombopénies héréditaires qui sont des maladies rares. Cela est possible uniquement sur un modèle animal avec un suivi sur une durée prolongée. Par ailleurs, pour bien comprendre les mécanismes sous-jacents à la pathologie, il est important de les valider sur un nombre de sujets valable sur le plan statistique, possible uniquement sur le modèle animal. De plus, nous nous intéressons, dans chaque pathologie étudiée, à la dérégulation de la thrombose qui peut être étudiée uniquement in vivo.
Réduction
Les effectifs des lots par condition ont été déterminés grâce à l'expérience antérieure du laboratoire et en tenant compte du taux de prise de greffe. Si nous nos résultats obtenus avec les cellules souches contrôles sont reproductibles entre trois expériences indépendantes, nous ferons les expériences uniquement avec les cellules souches mutées sans et avec la drogue ce qui permettra de réduire le nombre de souris greffées avec les cellules souches contrôles. Si certaines drogues sont inefficaces sur les souris greffées avec les cellueles souches mutése, elles ne seront pas re-testées dans les 2 autres expériences pour valider le résultat négatif. Les résultats seront analysés par analyse de variance.
Raffinement
Toutes les interventions (greffes, prélèvement de sang) seront faites sous anesthésie générale. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour s'assurer de leur santé physique et comportementale. Un régime énergétique adapté sera ajouté dans les cages en cas de diminution de la prise alimentaire et les points limites strictement appliqués. Les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi en tout temps (abri en carton, papier, coton, ...). Dans un souci de bien-être animal, les souris greffées, sous traitement ou non, seront suivies quotidiennement, les injections et prélèvements sanguins seront réalisés sous analgésie ou anesthésie et des points limites définis afin de limiter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Nous travaillons sur la souris car nous voulons étudier l’impact de certaines mutations humaines sur un modèle animal tolérant les greffes de cellules de patients. Ainsi, les techniques de transgénèse et greffes sont bien documentées et maîtrisées chez la souris. De plus, en vue de nombreuses publications sur les modèles murins, cette dernière constitue un modèle pertinent pour les projets que nous menons. Les souris sont également adaptées à l’étude d’inhibiteurs que nous testons dans un but thérapeutique. Enfin, la souris semble plus adaptée à l’étude de la formation d’une thrombose in vivo car une étude similaire a déjà été publiée. Cette dernière est à approfondir sur certains aspects, ce que nous souhaitons faire. De plus, nous possédons l’expertise et les moyens techniques nécessaires (vidéomicroscopie chez le petit animal) pour apporter les réponses aux question posées. Pour certaines études, des contraines physilogiques (masses graisseuses autour des vaisseaux chez les animaux plus âgés empêchant la visualisation en vidéomicroscopie) nous imposent d’utiliser des souris âgées de 3 à 5 semaines (jeunes). Pour les autres études nous utiliserons des souris de 8 à 15 semaines (adultes).
Mécanismes moléculaires de la mise en place de l’hypersensibilité mécanique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour comprendre comment s'installe l'hypersensibilité mécanique, 306 souris reçoivent une injection sous-cutanée de la molécule testée ou d'un placebo, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour prélèvement de tissus. 114 subissent une incision de la peau de la patte au scalpel sous anesthésie et 114 autres l'injection d'un composé inflammatoire dans la patte. La sensibilité de la patte lésée est mesurée avec des filaments calibrés la veille et le lendemain, le porteur indiquant que ces lésions accroissent la sensibilité et peuvent entraîner une perte de poids. Il déclare viser à terme la prescription de la molécule comme antidouleur en clinique, et affirme que la douleur ne peut pas être dissociée du système physiologique global de l'animal.
Objectifs
Depuis 2013, notre équipe travaille sur une molécule nommée Tafa4. Cette molécule est présente naturellement en petite quantité dans notre organisme et celui des souris. Si on supprime cette molécule chez la souris, on transforme une douleur aigue en douleur chronique quel que soit le type de lésion. Nous avons aussi constaté que l'injection de Tafa4 permettait de réduire l'hypersensibilité mécanique suite à une lésion, c’est-à-dire qu’après une lésion, les souris sont moins en douleur. Cette molécule a donc une forte valeur thérapeuthique et notre équipe de recherche se propose d'étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de cet effet. Recemment, nous avons montrés que l'injection de Tafa4 avant une lésion post opératoire (type chirurgie) empêchait la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, ou de la douleur chez la souris. Ainsi, ce projet possède un double objectif. D'une part de comprendre comment la preinjection de tafa4 empêche la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, augmentant encore son potentiel thérapeuthique. D'autre part, cet effet préventif est le modèle parfait pour comprendre comment l'hypersensibilité mécanique se met en place, ce qui est une question biologique ouverte depuis des années et qui serait à même d'avoir une incidence sur la prise en charge de certaines douleurs.
Bénéfices attendus
Le but final est que TAFA4 soit prescrite comme une molécule antidouleur en clinique. De plus, comprendre comment l'hypersensibilité se met en place ouvrira un nouveau panel de solution pour la prise en charge de patients souffrant de douleurs chroniques.
Procédures
Afin d’étudier l’effet préventif de TAFA4, nous serons ammenés à injecter la molécule (ou un placebo) en sous-cutannée sur toutes les souris (306). 114 d’entre-elles seront opérées chirurgicalement sous anesthésie général. L’anesthésique sera administré par voie intra-péritonéale. La chirurgie consiste en une fine incision de la peau de la patte avec une lame de scalpel. Pour le modèle inflammatoire, nous injecterons un composé inflammatoire dans la patte de la souris sur 114 d’entre-elles. Ces interventions dureront moins de 20 minutes. Un jour avant et un jour après ces procédures, nous mesurerons la sensibilité au niveau de la patte des animaux grâce à des filaments exerçant une pression donnée.
Impact sur les animaux
Avec les differents modèles de lésions post-opératoires et inflammatoires, la sensibilité des souris au niveau de la patte lésée sera acrue. Ces lésions peuvent entrainer une perte de poids. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en oeuvre pour minimiser la nuisance provoquée. Il y aura une surveillance accrue les jours suivant les chirurgies.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car nous devons prélever leurs tissus qui seront par la suite analysés. En effet, l’analyse est indispensable pour comprendre les mécanismes de la douleur et nottamment l’effet préventif de TAFA4.
Remplacement
La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes non-animales. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers des zones spécialisées du cerveau. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. .
Réduction
Des stratégies seront mises en place afin d’éviter ou de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues en réalisant toute une série de tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie/analgésie lors du procédé chirurgical et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Un examen clinique sera effectué quotidiennement afin de vérifier la cicatrisation et l’état général de l’animal. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, differents tissus impliqués dans l'intégration nociceptives (peau, neurones sensoriels et moèlle epinière) sont parfaitement décrit chez la souris. La recherche sur la douleur est menée sur les rongeurs mâles depuis des décennies. Pourtant, plusieurs études ont montré que les femmes ont des seuils de douleur aiguë plus bas que les hommes et qu’elles sont prépondérantes parmi les patients souffrant de douleurs chroniques, ce qui suggère fortement des mécanismes sexuellement dimorphiques impliqués dans la perception, la modulation et le traitement de la douleur. Nos travaux seront donc réalisés sur des souris mâles et femelles. Lorsque les phénotypes étudiés sont comparables entre mâles et femelles, les données seront regroupées. Cela aura alors un impact considérable sur le nombre total de souris utilisées
Evaluation des mécanismes de mort des cellules hépatiques au cours de la maladie du foie gras reproduit chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes reçoivent une injection intraveineuse de vecteur viral sous anesthésie, 980 sont soumises à un régime hypercalorique pendant douze ou vingt-quatre semaines et 500 à des prises de sang, rétro-orbitales pour partie, tous les quinze jours. Le porteur affirme que la maladie du foie gras induite "reste indolore" et ramène les atteintes à un manque d'appétence initial, tout en signalant que l'un des régimes provoque un diabète de type 2 et une polyurie. Il conclut que seuls les modèles in vivo reproduisent le caractère multifactoriel de cette pathologie.
Objectifs
Au cours de la maladie du foie gras (ou NASH), la mort des cellules principales du foie (hépatocyte) alimente l’état inflammatoire au sein de l’organe, participe à la chronicité et à l’aggravation de la maladie. Des travaux ont évalué indépendamment les 3 principales voies de mort cellulaire programmée (apoptose, nécroptose et pyroptose), suggérant que chacune d’elle pourrait contribuer à la mort des hépatocytes. En parallèle, des interconnexions entre ces différentes voies de mort cellulaire programmée ont été découvertes. Ces interconnexions peuvent conduire à un basculement d’une voie de mort cellulaire à une autre si l’une d’elle est inhibée. Une thérapie basée sur l’inhibition de la mort des hépatocytes devra donc cibler les différentes voies impliquées. Pour preuve, un inhibiteur de l’apoptose aggrave la NASH chez l’Homme probablement en favorisant une voie de mort pro-inflammatoire (nécroptose et/ou pyroptose). L’objectif de notre projet vise à évaluer la pertinence d’un ciblage multiple des principales voies de mort cellulaire programmée. Pour cela des lignées de souris génétiquement modifiées pour rendre les hépatocytes résistants à l’apoptose ou/et à la nécroptose ou/et à la pyroptose seront soumises à un protocole expérimental induisant une NASH. Nous comparerons alors la susceptibilité des différentes lignées à développer la maladie afin de déterminer quelle(s) combinaison(s) pourraient permettre de les protéger de la NASH.
Bénéfices attendus
Lors de la maladie du foie gras (NASH), la mort des cellules principales du foie, l’hépatocyte, alimente l’état inflammatoire du foie et contribue à la chronicité de l’hépatite et donc à son aggravation. Ce projet a pour but d’évaluer l’intérêt thérapeutique d’inhiber individuellement ou en combinaison les 3 principales voies de mort cellulaire programmée (apoptose, pyroptose et nécroptose) qui pourraient être activées au sein de l’hépatocyte au cours de la NASH. Ce projet permettra d’évaluer l’éventuelle nécessité d’un ciblage multiple de 2 ou des 3 types de mort cellulaire programmée. En effet, non seulement, différentes voies de mort cellulaire programmée pourraient être induites dans des hépatocytes distincts mais l’existence d’interconnexions entre elles pourrait permettre un basculement vers une voie de mort cellulaire programmée alternative lorsque celle initialement activée est inhibée. Evaluer l’intérêt d’un ciblage multiple sur les différentes voies de mort cellulaire programmée est donc un préalable pour envisager une thérapie visant à prévenir la mort des hépatocytes lors de la NASH.
Procédures
Différents protocoles expérimentaux seront appliqués sur des périodes de temps différentes s’étalant sur 2 semaines au minimum ou sur 25 semaines maximum. La totalité des animaux (1080) recevront une injection intraveineuse sous anesthésie générale pour inoculer soit un vecteur viral contrôle qui n’induit aucune réaction, soit un vecteur viral capable d’induire une recombinaison génétique ciblée. La procédure incluant la mise sous anesthésie, l'injection et le début du réveil dure moins de 5 min. Pour induire une NASH, des groupes de souris (980) seront soumis à un régime hypercalorique, sur une période de 12 ou 24 semaines selon le type de régime, capable d’induire la maladie du foie gras qui reste indolore. Pour suivre l’évolution de la maladie au cours du temps et permettre de réduire le nombre d’animaux à intégrer à l’étude, un prélèvement sanguin (inférieur à 150 µL) sera effectué tous les 15 jours sur toute la période de mise sous régime hypercalorique, sur une partie des animaux (500). Cette procédure de prélèvement intermédaire s'effectueant sous anesthésie durera moins de 5 min.
Impact sur les animaux
La maladie induite (NASH) est une pathologie indolore. Au cours du protocole expérimental, le seul léger désagrément transitoire ressenti par l’animal sera lié au manque d’appétence initiale pour les régimes alimentaires hypercaloriques. Par ailleurs, l'un de ces régimes induit après plusieurs semaines un diabète de type 2 pouvant résulter en une polyurie nécessitant un suivi régulier de l’état hygrométrique de la litière. Ce régime induit également une prise de poids plus importante qu’un régime standard.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement de plusieurs organes nécessaires à l’analyse de différents paramètres cliniques indispensables à l’évaluation du stade d’avancement de la maladie.
Remplacement
Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite (maladie du foie gras) dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissus adipeux, intestins et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constituent le foie. Par conséquent, compte tenu de la nature multifactorielle de la physiopathologie de la NASH, de la composition hétérogène du microenvironnement cellulaire et de la contribution du microbiote intrahépatique, seuls les modèles précliniques in vivo permettent jusqu’à présent de reproduire les diverses caractéristiques d’un organisme multicellulaire atteint par cette pathologie.
Réduction
La stratégie expérimentale a été définie de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs tout en évitant des réplicas inutiles. En se basant sur les données de la littérature scientifique utilisant des modèles murins de maladie du foie gras induits par un régime alimentaire hypercalorique, un test statistique de calcul d’effectif minimal a été réalisé. Ainsi, un effectif de 10 animaux par groupe permettra de déceler de faibles variations quantitatives entre les groupes expérimentaux tout en prenant en compte la variabilité inter-individuelle et en conservant une sécurité en cas de perte accidentelle d’un individu lié au hasard. Par ailleurs, la conception du projet en étapes successives permet de limiter l’effectif nécessaire à la réalisation de l’étude. Ainsi, un arbre décisionnel d’intégration des lignées dans les étapes successives a été établi. La première étape sert à valider les vecteurs viraux sur un nombre limité de souris avant d’engager les étapes suivantes impliquant un plus grand nombre d’animaux. Alors que les 7 lignées de souris seront intégrées à l’étape suivante, seules celles présentant un phénotype spécifique de protection ou d’aggravation seront incluses aux étapes ultérieures. Enfin, un suivi longitudinal de l’évolution de la maladie par prises de sang régulières évite la constitution de groupes de souris supplémentaires pour des points de cinétique intermédiaires additionnels.
Raffinement
Les études seront conduites dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux. Un suivi régulier de l’état des animaux sera mis en œuvre, a minima de façon hebdomadaire lors des pesées ou plus régulièrement si nécessaire. Par ailleurs, un grand nombre de mesures sur les échantillons prélevés sont envisagées pour récolter un maximum d’informations. Les manipulations sur les animaux seront réalisées sur des temps courts par un personnel expérimenté, dans une pièce d’expérimentation dédiée distincte de la pièce d’hébergement où résident leurs congénères. Toutes les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant d’intégrer un protocole expérimental. Pour conserver une sociabilisation, les animaux d’une même fratrie seront hébergés à plusieurs au sein des cages. En cas de nécessité d’hébergement individuel lié à de l’agressivité de dominance, les cages disposeront d’un enrichissement approprié. Une anesthésie générale sera effectuée pour les injections ou les prélèvements retro-orbitaux et un anesthésique locorégional sera appliqué pour diminuer l’inconfort induit.
Choix des espèces
Cette espèce (souris) permet de modéliser la pathologie humaine sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cet animal. Par ailleurs, ce modèle murin permet de tester in vivo les conséquences de l’absence d’expression au sein de l’hépatocyte d’une ou plusieurs protéines potentiellement impliquées dans la pathologie. D’ailleurs, des animaux génétiquement modifiés sont déjà disponibles auprès de la communauté scientifique pour cibler spécifiquement les protéines d’intérêts identifiées pour ce projet. Les souris seront incluses aux protocoles expérimentaux au stade d’adultes (8 semaines). En effet, la pathologie du foie gras (NASH) se développe essentiellement chez les adultes. L’âge est d’ailleurs un facteur de risque majeur dans le développement de la NASH.
Phénotypage de porcs issus de races, lignées et croisements pour la sélection, le développement de nouveaux critères et le suivi des évolutions
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Soumis à des prélèvements de cartilage d'oreille, de sang, de salive et de fèces, parfois avec une corde passée autour du groin, 13 230 cochons sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué au titre de la procédure, tous réintégrant leur groupe d'engraissement jusqu'à 115 ou 125 kg, le RNT mentionnant par ailleurs des mesures effectuées à l'abattoir. Le porteur indique que la décision de les garder en vie revient au responsable du projet, au responsable de l'élevage et à la structure chargée du bien-être des animaux non-humains. L'objet déclaré est d'affiner les critères de sélection génétique de la filière porcine française, la surface allouée étant de 1,1 m² par animal.
Objectifs
Le projet consiste à participer au contrôle des performances des animaux de races et lignées et au suivi des performances des animaux croisés qui en sont issus, à travers un protocole de contrôle de performances du post-sevrage vers trois semaines d’âge à la fin de leur engraissement vers 115 ou 125kg. L’obtention de performances classiquement relevées en élevages de sélection, en parallèle de mesures novatrices ou plus complexes à recueillir, ainsi que de mesures à l’abattoir, permet de conforter l’évaluation des animaux des races utilisées couramment en France mais aussi de tester de nouveaux critères d'évaluation et leur applicabilité sur le terrain afin d’explorer de nouvelles voies d’amélioration génétique.
Bénéfices attendus
Les objectifs du projet sont pérennes, en recueillant en un lieu unique des données d’animaux de différentes origines, mais apparentés, pour une meilleure précision des schémas de sélection porcin français ou la connaissance des croisements qui en sont issus. Ces données sont évolutives avec l’avancée de la sélection et nécessitent une veille en continu. En outre, le recueil de performances nombreuses sur peu d’animaux peut permettre d’éprouver de nouveaux critères de sélection.
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles : prélèvements de cartilage d'oreille : 1 à 2, ce prélèvement ne prend que quelques instants ; prélèvements de fèces : 4 maximum (5 minutes maximum) ; prélèvements de sang : 3 maximum (2 minutes maximum) ; prélèvements de salive : 5 maximum (30 secondes maximum, avec un second essai en cas d’échec, sur une durée de 5 minutes maximum).
Impact sur les animaux
Les procédures mises en œuvre dans ce protocole sont d'un degré de sévérité modérée du fait de la possible accumulation de certains prélèvements sur une partie des animaux : prélèvements de cartilage à l'oreille, sang, salive, fèces, mesures par échographie à ultrasons. Les contentions, si elles sont nécessaires aux prélèvements ou observations, sont le maintien en cage individuelle, ou dans les bras par un technicien animalier ou à l'aide d'une corde autour du groin, toujours brèves, inférieures à 5 minutes et assurées par du personnel compétent sur l'espèce porcine.
Devenir
L’ensemble des animaux réintégreront leur groupe d’engraissement à la fin de la procédure expérimentale. La décision de garder en vie les animaux revient au responsable du projet en coordination avec le responsable de l’élevage et la Structure de Bien-Etre Animal de l'établissement utilisateur.
Remplacement
Les mesures sur animaux sont requises car l’objectif est la sélection des animaux, le suivi de l’évolution de leurs performances et l’exploration l’intérêt de caractères prospectifs (l’efficacité digestive, etc.) sur eux ou leurs issus croisés.
Réduction
Certaines mesures restent uniquement réalisables en station ou à l’abattoir sur les animaux phénotypés en station, pour celles-ci il n’existe pas d’alternative satisfaisante et peu de corrélation avec les mesures réalisées en élevages. La station est aussi un outil privilégié pour la réalisation d’expérimentations et de comparaisons de performances d’animaux de différentes races, lignées ou croisement, ou élevages intra type génétique, dans un environnement unique. Les effectifs sont ceux autorisés par la capacité de la station et permettent d’améliorer la précision des valeurs génétiques estimées et l’efficacité des programmes de sélection. Tous les animaux ne sont pas soumis à l’intégralité du protocole, les mesures invasives sont limitées au nombre strictement nécessaire : l’apposition d’une seconde boucle munie d’un système de suivi à distance pour enregistrer les mouvements des animaux, les prélèvements de fèces, les prises de sang ou recueil de salive ne concerneront chacun pas plus du tiers des animaux ; un animal pouvant être soumis à aucune de ces procédures comme au protocole complet. Les effectifs de porcs croisés entrant en station doivent être suffisants pour permettre de déceler des différences sur les critères de consommation, croissance et qualité des carcasses.
Raffinement
Ce protocole est réalisé dans un bâtiment entièrement dédié. Les salles de post sevrage sont équipées d'auges collectives avec aliment sec, d'un abreuvoir, de lampes chauffantes, radiateurs mobiles et les cases sont enrichies avec des jeux manipulables. Les salles d'engraissement que les porcelets rejoignent après le post sevrage, sont équipées chacune d'une station d'alimentation automatique individuelle avec plateau de pesée automatique et d'un abreuvoir permettant de mesurer les consommations d'aliment et croissances individuelles des animaux élevés en groupe en conditions proches de celles rencontrées pratiquement en élevage de sélection. L’environnement des animaux en engraissement est aussi enrichi par des jeux manipulables. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel expérimenté et en respectant des points limites afin de réduire la souffrance et la douleur des animaux. Les mesures de raffinement consisteront à réduire le plus possible l’intensité et la durée de la douleur ou du stress que peuvent engendrer les interventions. La durée des contentions des porcs sera limitée à 5 minutes. Les prises de sang seront stoppées au bout de 2 minutes. Les collectes de fèces ou de salive seront aussi interrompues si sans succès au bout de 5 minutes. Les animaux sont surveillés quotidiennement et le seront plus particulièrement après chaque intervention.
Choix des espèces
Le porc est l’espèce cible des projets. Leur but est en effet de participer à la plus fine connaissance des races et leurs issus et le cas échéant de participer à l’élaboration de nouveaux critères pouvant être mis à la disposition de la filière porcine. Les animaux sont élevés en groupes de 14 individus issus d’un même élevage. Chaque bande regroupe neuf lots de 14 individus d’âges proches, et est hébergée dans une salle de neuf cases collectives. Les porcelets entrent en station en post-sevrage (3 ou 4 semaines d’âge) où ils restent cinq à sept semaines selon leur poids de livraison. Ils sont ensuite transférés en salle d’engraissement par case entière, en une ou deux fois par bande, et y demeurent jusqu’à la fin de leur engraissement (vers 115 à 125kg). Les animaux sont hébergés dans des conditions similaires à celles des animaux de ferme élevés dans un but commercial. La surface par animal (1,1 m² / animal) répond aux normes fixées dans les directives 98/58/CEE,91/629/CEE et 91/630/CEE (>0,65 m² / porc pour les animaux jusqu’à 110kg).
Thérapie génique de la perte d’audition
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Toutes tuées à l'issue, y compris les reproducteurs transgéniques tués à six mois puis remplacés, 8 132 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré pour tester des vecteurs de thérapie génique contre la surdité. Elles subissent cinq à six tests auditifs sous anesthésie, des injections intrapéritonéales de tamoxifène et une chirurgie intracochléaire de vingt minutes. Le porteur reconnaît que cette chirurgie peut léser l'oreille injectée et faire perdre l'audition, tout en indiquant qu'il ne s'attend à aucun signe de souffrance ni d'inconfort, la surdité provoquée restant unilatérale. Il affirme qu'aucune alternative n'existe, faute de pouvoir mettre en culture les systèmes auditifs périphérique et central.
Objectifs
Entendre, c’est pouvoir identifier et localiser les sources sonores dans l’espace, de jour comme de nuit ; l’audition contribue ainsi à la sécurité des individus. L’audition est devenue chez l’homme le sens prépondérant sur lequel repose la communication inter-individuelle. Or, l’importance de l’audition continue d’être fortement sous-estimée : le risque que la perte de l’audition fait peser sur les individus, risque qui inclut le déclin des fonctions cognitives, n’est ni compris, ni anticipé et les campagnes d’information et de prévention ont été jusqu’ici peu fructueuses. Par leur ampleur et leurs conséquences, les atteintes de l’audition constitueront, avant 2030, la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien, selon l’organisation mondiale de la santé. La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds. Il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitables par thérapie génique. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression de surdités génétiques. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif.
Bénéfices attendus
La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires ; elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds mais pas pour les déficits auditifs postnatales dont la presbyacousie. Cependant, il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitable par thérapie génique. De plus, il a récemment été mis en évidence l’existence de forme génétique de presbyacousie. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de certains vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression des surdités. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif. Si les résultats sont probants, ce projet pourrait poser les bases d’un développement clinique.
Procédures
Les animaux des modèles de surdité seront soumis à des tests auditifs, au nombre de 5 à 6 maximum, avec un intervalle minimal d’au moins un mois entre chaque tests. Le test complet correspond à une anesthésie fixe puis une mesure des amplitudes de la réponse auditive du tronc cérébral et suivie d’une mesure des produits de distorsion des otoémissions acoustiques. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. Les tests auditifs seront réalisés au plus tôt à P16. Des animaux seront soumis à des injections avec une dose unique ou fragmentée (3 fois maximum sur une même semaine) par voie intrapéritonéale avec 100µL d'une solution de tamoxifène (une injection prendra quelques secondes Les animaux seront soumis à des injections de vecteur de thérapie génique qui seront réalisées par voie intra cochléaire une seule fois sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. L’ensemble de la chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, les nuisances et effet indésirables attendus sur les animaux sont l’induction de la surdité (surdité congénitale ou acquise, profonde ou modérée, selon le modèle) et les suites de la chirurgie nécessaire à l’administration des vecteurs viraux dans la cochlée. Concernant l’induction de la surdité chez l’animal, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Nous ne nous attendons pas à ce que l’injection du tamoxifène puisse engendrer des effets secondaires. Nous nous attendons à ce que la chirurgie de la cochlée puisse entrainer des lésions et donc une baisse/perte d’audition de l’oreille injectée. La surdité potentielle étant unilatérale, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Concernant les suites chirurgicales, l’état général des souris sera régulièrement suivi après l’injection des vecteurs AAV afin de détecter les signes potentiels de souffrance ou d’inconfort (infection ou problème de cicatrisation du site d’injection, souriceau cyanosé ou délaissé par la mère, cachexie, expression faciale de souffrance (yeux plissés, oreilles couchées vers l’arrière), prostration, immobilité, poil non toiletté).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Animaux pour élevage : Les anciens reproducteurs sont des animaux transgéniques ne pouvant être adoptés, ils seront mis à mort au bout de 6 mois et renouvelés Animaux utilisés pour les expériences : Pour réaliser nos analyses histologiques sur les oreilles internes, les animaux seront mis à mort. Post mortem nous prélèverons donc les cochlées pour évaluer infra cliniquement performances de nos stratégies de vectorisation.
Remplacement
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.
Réduction
Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 10%. Nous utilisons classiquement les tests de student, de Mann-Whitney, test du Xhi2, et ANOVA pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet. Nous avons établi des tests de criblage de capsides in vitro pour réduire le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire. De plus nous nous appuyons sur les données obtenues dans nos précédentes expériences pour le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire.
Raffinement
Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Un bâtonnet de coton sera ajouté dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification, ainsi qu’un igloo pour les femelles avec portée. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des animaux entre 0 et 21 jours après la naissance. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront surveillés tous les jours pendant une semaine après chirurgie puis deux fois par semaine minimum la semaine suivante pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans notre grille d’évaluation de référence.
Choix des espèces
Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de 10 jours après la naissance ; avant 8 jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. En fonction des modèles de déficits auditifs (congénital ou induit), les animaux seront utilisés dès la naissance ou à l’âge adulte.
Développement d’une immuno-oncothérapie basée sur des vecteurs lentiviraux contre le cancer du sein et évaluation de son effet anti-tumoral dans un modèle orthotopique murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 992 reçoivent une injection intramammaire de cellules tumorales sous anesthésie, suivie de trois à quatre semaines de croissance tumorale, d'une à deux vaccinations intramusculaires et de deux à quatre injections intrapéritonéales. Le porteur précise que même les souris dont la tumeur a disparu sont tuées, leur système immunitaire modifié empêchant selon lui toute réutilisation, replacement ou adoption. Il affirme qu'aucun système cellulaire in vitro ne peut remplacer la recherche vaccinale et que la réponse anti-tumorale doit s'observer dans un "organisme entier".
Objectifs
Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules qui subissent une transformation maligne. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement les lymphocytes T cytotoxiques, capables de détruire les cellules tumorales de façon spécifique. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur des vecteurs lentiviraux ayant pour cible des antigènes tumoraux pertinents dans le cancer du sein, pourrait être particulièrement efficace pour permettre l’activation des lymphocytes T spécifiques de ces antigènes et le contrôle immunitaire de la prolifération tumorale. L’objectif du projet est d’établir la preuve de concept de cette immunothérapie contre le cancer du sein et d’étudier les mécanismes du contrôle immunitaire mis en place dans l’organisme par une immuno-thérapie basée sur des vecteurs lentiviraux. Ultimement, les vaccins candidats ayant une activité anti-tumorale notable seront développés en vue d’un essai clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont la preuve du concept d'utilisation des vecteurs lentiviraux dans la vaccination contre le cancer du sein. Les vecteurs lentiviraux codant pour des antigènes pertinents se sont révélés sûrs et efficaces comme des candidats vaccins contre des flavivirus (ZIKA et Dengue), le SARS-CoV-2, Mycobacterium tuberculosis, d'autres agents pathologiques, ainsi que des tumeurs induites par des «Human Papilloma Virus» (HPV). Le dernier est en cours d’obtention de l’approbation de la FDA pour entrer en phase clinique I/IIa de traitement des cancers du col de l’utérus ou oro-pharyngés résultant des infections par HPV aux USA en 2024. Avec le projet actuel du cancer du sein, nous espérons prouver que les vaccins à base de vecteurs lentiviraux pourront être plus efficaces que les vaccins à base de peptides ou protéines adjuvantés ou d'ARN messager dans le cancer du sein. Les avantages à long terme seront l'utilisation de ces vaccins en clinique contre le cancer du sein.
Procédures
Dans une procédure de sévérité légère, environ 72 souris au maximum seront immunisées avec un candidat vaccin (quelques secondes), et mises à mort au bout de 30 jours afin d'analyser leur réponse immunitaire. Les autres procédures de sévérité moyenne, et à appliquer à un maximum de 992 souris, comprennent dans un premier temps l'injection intra-mammaires de cellules tumorales (quelques secondes) sous anesthésie gazeuse puis la surveillance de la croissance tumorale pendant 3 à 4 semaines. La vaccination sera ensuite réalisée en intramusculaire via 1 à 2 injections espacées de 3 semaines (quelques secondes). Dans le cadre de la dernière procédure, les souris subiront également 2 à 4 injections en intrapéritonéale (quelques secondes) sous deux semaines.
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront une légère douleur au moment de l'injection mammaire du petit volume de suspension cellulaire. L'injection de cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie générale. Normalement, la croissance de la tumeur est bien tolérée par les souris, mais peut dans certains cas s’associer à une perte d'activité normale, en particulier si la tumeur atteint la taille limite. La période maximale de nuisance sera de 1 à 2 jours.
Devenir
Les souris présentant des tumeurs seront mises à mort pour des raisons éthiques (pour éviter les souffrances). Si les souris ne présentent plus de tumeur grâce aux différents traitements, elles seront suivies pendant deux mois. Même les souris sans tumeur ne peuvent être réutilisées car leur système immunitaire a été modifié par la vaccination. Par conséquent, tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats vaccins destinés à l’humain. Ce type d’étude implique nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité de la réponse vaccinale et anti-tumorale au niveau d’un organisme entier. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’humain, en complément des études réalisées in vitro. Actuellement, aucun système cellulaire in vitro ne peut être utilisé pour remplacer la recherche vaccinale et immuno-thérapeutique sur les animaux.
Réduction
Sur les conseils d’un biostatisticien, les groupes seront constitués de 5 à 10 animaux, en fonction de la nature de l’expérience, et du fait de la variabilité de la croissance tumorale de façon à obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes, pourra être réduit si la variabilité observée est moins élevée que celle actuellement estimée. Des études précédentes ont permis d’optimiser le protocole de vaccination avec des vecteurs lentiviraux et de définir la cinétique de vaccination permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les vecteurs lentiviraux seront préalablement validés par des études d’immunogénicité chez la souris afin de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses cellulaires T spécifiques des tumeurs chez la souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. Si un candidat vaccin n'a pas d’effet significatif sur la croissance de la tumeur, les procédures suivantes, qui devraient permettre de comprendre le mécanisme d'action d'un vaccin, ne seront pas réalisées.
Raffinement
Selon notre expérience antérieure, l’injection de vecteurs lentiviraux n’induit aucun signe clinique chez les souris. L’implantation de tumeurs mammaires peut induire une gêne modérée, qui sera contrôlée au cours des expériences. Les tumeurs seront implantées seulement au niveau des 4èmes glandes mammaires (gauche ou droite) où, par rapport aux glandes mammaires situées plus haut, il y a plus d’espace pour la croissance tumorale et par conséquent sans gêner la mobilité des souris afin de limiter à minima la gêne occasionnée par la tumeur. Les animaux seront observés pour détecter tout signe d’inconfort ou de souffrance, si un point limite (nécrose ou la taille de tumeur) est atteint. La souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents, comme des poils hérissés, inactivité, plusieurs mesures seront prises, incluant l’ajout de gel hydrique, réhydratation sous cutanée, chauffage des cages ou bien l’amélioration de l’enrichissement qui consistera à ajouter la litière à base de cellulose quand les tumeurs seront palpables pour éviter l’irritation par les coupons de bois.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe de nombreux modèles de tumeurs qui peuvent être utilisés chez la souris pour tester nos candidats vaccins. De plus, des études précédentes montrent que les vecteurs lentiviraux sont immunogéniques chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier les réponses immunitaires chez cette espèce. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.
Preuve de concept de l’efficacité d’un produit vétérinaire pour le contrôle du prurit induit par une cytokine chez le chien
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Pour la commercialisation d'un produit vétérinaire contre la dermatite atopique, 60 chiens reçoivent des injections intraveineuses d'une cytokine qui provoque délibérément des démangeaisons, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Pendant environ deux heures après chaque injection, ils se grattent, se lèchent, se mordillent les pattes, le flanc ou la région anale, secouent la tête et se frottent le corps, sous surveillance vidéo. Chacun subit deux à quatre injections de cytokine par phase, plus quatre à six prises de sang. Aucun n'est tué dans ce projet, tous restant disponibles pour d'autres procédures expérimentales après un temps de repos.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité chez le chien de produits vétérinaires sur les démangeaisons induites par une cytokine. L’objectif final étant la commercialisation de nouveaux produits permettant de traiter la dermatite atopique qui est la plus fréquente des maladies cutanées allergiques du chien.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la production de nouveaux produits dans le cadre de développement de nouvelles options thérapeutiques dans la prise en charge de la dermatite atopique chez le chien. La dermatite atopique est une maladie inflammatoire chronique qui réduit significativement la qualité de vie de l’animal.
Procédures
La première procédure expérimentale se déroulera sur plusieurs semaines de prétests incluant les interventions suivantes pour les chiens inclus (jusqu’à 15 par test) : 1) 2 à 4 Injections intraveineuses d’une cytokine sur animaux vigiles (avec pose d’un cathéter ou micro-perfuseur) à 6 ou 7 jours d’intervalles pour induire le prurit et l’évaluer pendant environ 2 heures (ex : J-20, J-14 et J-7). 2) Un prélèvement sanguin sur animaux vigiles pour la réalisation d’analyses sanguines avant la seconde procédure (ex : J-7). Puis la seconde procédure expérimentale se déroulera sur plusieurs semaines pour les chiens inclus (8 à 12 par test) avec les interventions suivantes : 1) Une administration de produit d’essai sur animaux vigiles, selon la voie recommandée par le fournisseur, au démarrage de l’étude (J0). 2) 2 à 4 injections intraveineuses d’une cytokine sur animaux vigiles (avec pose de cathéter ou micro-perfuseur) pour induire le prurit et l’évaluer pendant environ 2 heures et à différents temps après administration du produit d’essai le lendemain de l’administration du produit d’essai puis à intervalle régulier (ex : J1, J30 et J61). 3) 4 à 6 prélèvements sanguins sur animaux vigiles pour analyses sanguines au démarrage de l’étude puis à intervalle régulier (ex : J0, J14, J30 et J61).
Impact sur les animaux
L’injection de la cytokine provoque délibérément une démangeaison transitoire chez le chien qui se dissipe naturellement en 1 à 2 heures. Le chien peut se gratter, se lécher, se mordiller les pattes, le flanc ou la région anale, trottiner, secouer la tête et se frotter le corps. Aucune lésion durable n'est attendue. Un érythème au niveau des zones léchées ou grattées plus intensément est cependant possible et réversible très rapidement, soit en moins de 24 heures. Les effets indésirables potentiellement attendus suite à l’administration du produit d’essai ou de référence seront déterminés pour chaque élément d’essai en fonction de la molécule testée et de la bibliographie communiqué par le sponsor. Ainsi des points limites adaptés seront établis avant le démarrage de l’étude afin de mettre en place des traitement adéquates en cas d’effets indésirables pour pallier rapidement à ces nuisances. Au moment des prélèvements sanguins ou injections de produit, les animaux subissent une nuisance limitée liée au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille sous la peau entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.
Devenir
A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.
Remplacement
L'utilisation de chiens sur ce projet est justifiée car ils représentent l’espèce cible du produit et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. D’autre part, aucune étude alternative ne peut à ce stade remplacer l’étude sur l’espèce cible. Il s'agit d'une étude pilote "preuve de concept" avant de s’engager sur la voie des études d’enregistrement. Cependant, le Sponsor s’engage à avoir effectué tous les tests in vitro possible et nécessaire avant la réalisation de l’étude.
Réduction
Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum pour que chaque test inclut le nombre d’animaux requis afin d’obtenir des résultats interprétables. Ce nombre ne permet pas une analyse de non-infériorité mais permet d'une part de démontrer que le produit test réduit le prurit chez les chiens recevant le challenge avec la cytokine et d'autre part que cette réduction est comparable à celle du produit de référence et ou supérieure au placébo.
Raffinement
La salle de test est séparée des autres salles d’hébergement. Les chiens, par groupe de 2 à 4 individus, seront habitués à l’environnement de cette salle de test pendant minimum 14 jours avant le début de l’étude pour limiter leur stress. Des enrichissements seront présents dans les box (jouets, radio…). Durant l’étude, les volumes administrés respecteront les recommandations du Gircor en fonction de la voie d’administration. Après l’injection de la cytokine, les animaux seront suivis et ou filmés en continue pendant environ 2 heures afin de détecter tout signe de prurit très intense. Dans ce cas, la personne suivant les animaux (derrière le moniteur) alertera immédiatement le vétérinaire et l’animal concerné sera pris en charge. Les mesures mises en place dépendront de la gravité et la nécessité de l’exclusion de l’étude sera évaluée au cas par cas. Durant toute la durée du projet l’état clinique des chiens sera suivi et documenté (poids, état de la peau, condition générale, appétit, état des selles). Des analyses hémato biochimiques pourront être réalisées pour surveiller les paramètres physiologiques des animaux. Les prélèvements sanguins seront réalisés par des personnes compétentes avec du matériel adapté. Les volumes prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations du Gircor en fonction de la voie d’administration.
Choix des espèces
Le chien est l’espèce cible du produit testé. Tester l’efficacité du produit d’essai sur une autre espèce que l'espèce cible ne serait pas informatif. Chiens adultes d'âge et de poids correspondant à celui indiqué pour le traitement.
Cibler le métabolisme lipidique et les cytokines pour traiter les cancers au stade primaire et métastatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
11 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de trente minutes, jusqu'à trois prises de sang mandibulaires, des injections intrapéritonéales deux à quatre fois par semaine sur quatre semaines, un gavage quotidien et de l'imagerie sous anesthésie deux fois par semaine. Le porteur indique que la croissance tumorale peut aboutir à une dégradation de l'état général des souris. Sur le remplacement, il consacre deux phrases à affirmer que ces études sont "essentielles" et qu'elles ne peuvent pas être remplacées par des analyses in vitro, sans autre argument.
Objectifs
Des modulations de la production de lipides et de cytokines jouent un rôle majeur dans le développement du cancer. En effet, les cytokines et lipides sont des acteurs essentiels de la régulation de la fonction et du déplacement des cellules immunitaires. Ils participent également à réguler la capacité qu'ont certaines cellules immunitaires à reconnaitre et détruire les cellules tumorales. Certains de ces facteurs peuvent donc constituer des cibles thérapeutiques. Notre projet a pour objectif général de clarifier le rôle de certains lipides et de certaines cytokines dans des phénomènes clés de l'initiation et de la progression des cancers: prolifération, réponse et résistance aux traitements anticancéreux, migration et dissémination, modulation du microenvironnement tumoral incluant les réponses immunitaires locales et systémiques.
Bénéfices attendus
Les thérapies visant à stimuler les réponses immunitaires ont permis d'augmenter de façon considérable la survie des patients atteints de divers cancers et particulièrement les thérapies ciblant des protéines inhibitrices de la réponse immunitaire anti-tumorale. Cependant, de nombreux patients résistent à ces thérapies ou rechutent dans les 5 ans suivant l'initiation du traitement. Nos travaux visent à identifier de nouvelles thérapies permettant de lever certaines de ces résistances et d'essayer de transposer ces stratégies en clinique. Identifier plus particulièrement le rôle joué par les cytokines et lipides est essentiel au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et à l'identification de potentiels biomarqueurs de réponse aux thérapies existantes.
Procédures
Les animaux inclus dans ces études pourront être soumis à des chirurgies. Une seule chirurgie sera pratiquée par animal et la durée n'excèdera pas 30 minutes. Les souris vigiles pourront également être soumises à des prélèvement de sang réalisés au niveau mandibulaire. Trois prélèvements maximum par souris espacés d'une semaine. Des injections au niveau de la peau (3 fois maximum par souris), intrapéritonéales (2 à 4 fois par semaine sur 4 semaines maximum) ou intraveineuses (1 fois pour chaque souris) pourront être pratiquées. Les souris pourront être imagées sous anesthésie à raison de 2 fois par semaine pendant 20 minutes maximum. Des traitements pourront être administrés par gavage à raison de 1 fois par jour maximum pendant la durée de l'expérience ou par injection intrapéritonéale à raison de 3 fois par semaines maximum pendant la durée de l'expérience.
Impact sur les animaux
Ce projet est associé à la réalisation de chirurgies pouvant induire des douleurs, une hypothermie, une déshydratation associées à l'opération. Les points de suture réalisés lors de la fermeture des plaies pourrons être associés à une gêne. Les traitements donnés aux animaux par voie orale et par injection pourront induire du stress, une gêne ou une douleur au point d'injection. Les traitements donnés aux souris auront également la possibilité de déclencher des troubles digestifs. Enfin, les modèles de croissance tumoraux peuvent provoquer une gêne et aboutir à une dégradation de l'état général des animaux. Le génotypage des souris élevées au sein de la structure sera réalisée selon une procédure générique standardisée du centre éleveur. Les nuisances associées sont décrites dans la DAP du centre éleveur (douleur légère et de courte durée).
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés.
Remplacement
Ces études, réalisées chez la souris, sont essentielles afin d'évaluer l'impact de nouvelles thérapies sur le traitement des cancers et la mise en place des réponses immunitaires anti-tumorales. Ces études ne peuvent être remplacées par des analyses in vitro.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, une étude approfondie de la littérature a été effectuée afin de définir au mieux les objectifs de nos travaux et ne pas reproduire des résultats déjà existants dans la littérature. Cela nous a permis de définir les meilleurs protocoles possibles afin d'adapter le nombre d'animaux à la réalisation de nos objectifs. Des études pilotes seront mises en place afin d'optimiser les conditions de chaque nouvelle expérience.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et quand nécessaire à la chirurgie. Nous porterons une attention particulière au stress et à la souffrance potentiellement ressentie par les animaux au cours de la réalisation des procédures. Les cages seront donc enrichies avec du sizzlenest pour la nidation, la préhension des souris sera réalisée grace à des tubes transparents ou des plateformes adaptées. Des narcoleptiques et analgésiques seront utilisés quand nécessaire. Les chirurgies seront réalisées sur des plaques chauffées à 37 degrés. Une injection sous cutanée de solution saline sera réalisée afin de prévenir la déshydratation potentielle des animaux. Le temps de chirurgie sera réduit au miximum (moins de 30 minutes). Des pots de gel diet seront ajoutés dans les cages pour faciliter la réhydration et la prise alimentaire des souris après chirurgie. Les volumes et les doses de traitements administrés sont optimisés et réduits au maximum afin de minimiser l'inconfort lors de l'administration et les potentiels effets indésirables. Des points limites spécifiques et adaptés à chaque procédure ont été définis. Cela permettra aux équipes des centres éleveur et investigateur de prendre une décision adaptée afin de stopper la souffrance des animaux.
Choix des espèces
De nombreuses thérapies maintenant utilisées en clinique pour le traitement de divers cancer ont été développées et optimisées en pré-clinique par utilisation de modèles murins génétiquement modifiés ou non. Cela inclus notamment les immunothérapies visant à bloquer les points de contrôle de l'immunité (Programmed cell-death1 [PD-1] et Cytotoxic T lymphocyte associated protein 4 [CTLA-4]). Non seulement l'efficacité de ces thérapies chez la souris a été confirmée chez l'Homme, mais de nouvelles combinaisons thérapeutiques développées chez la souris se montrent transposables à la clinique. Les animaux impliqués dans nos expériences seront âgés de 5 à 12 semaines. Les souris C57Bl6J et BalbC à cet âges là peuvent peser entre 16 et 21g. Tous nos traitements sont/seront optimisés (dose efficace et minimum d'effets indésirables) pour des souris rentrant dans cette fourchette de poids.
Manipulation transgénique des taux d’acides gras polyinsaturés dans des populations neuronales spécifiques: conséquences sur la prise de décision
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique de quatre-vingt-dix minutes, une privation alimentaire maintenue à 90 % de leur poids pendant environ huit semaines et treize semaines de régimes lipidiques modifiés, puis un conditionnement opérant où il faut appuyer sur un levier pour obtenir de la nourriture. 720 sont tuées pour analyse histologique et les 120 géniteurs à sept ou huit mois, à la fin de leur période de reproduction. Le porteur qualifie les effets de la privation alimentaire de "très limités" et justifie le recours aux souris par des dimensions comportementales qu'il déclare non modélisables in vitro ou in silico.
Objectifs
Le but de ce projet est de déterminer quelles sont les types de neurons qui sont vulnérables à une déficience en acides gras polyinsaturés (AGPI) de type n-3. Pour cela, nous utiliserons une approche transgénique qui permettra de restaurer les taux d'AGPI dans des populations spécifiques de neurones en situation de carence générale en AGPI n-3. Nous testerons les processus de prise de décision par des tâches comportementales de conditionnement opérant où l'animal doit appuyer sur un levier pour obtenir une récompense alimentaire. Nous mesurerons l'activité neuronale par des approches d'imagerie in vivo chez l'animal se comportant.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de comprendre comment le statut cérébral en AGPI - qui est perturbé dans plusieurs pathologies psychiatriques- influence les processus de prise de décision.
Procédures
Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) durant environ 8 semaines - 1 chirurgie stéréotaxique d'environ 90 minutes- Exposition chronique à des régimes modifiés en lipides pendant environ 13 semaines
Impact sur les animaux
Une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) a des effets très limités pour l'animal. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. L'exposition chronique à des régimes modifiés en lipides n'a pas d'impact évident pour l'animal.
Devenir
Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (720). Les géniteurs (120) seront mis à mort à l'âge de 7-8 mois, à la fin de la période de reproduction.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de tous les animaux de la descendance et comparerons les mâles et les femelles. Du fait de cette stratégie, tous les animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes.
Raffinement
Tous les efforts seront faits pour réduire la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille et seront consignés sur une fiche de scorage. Si un score élevé persiste pendant plus de 48h les animaux seront mis à mort. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations en AGPI sur le cerveau mature.
Travaux pratiques de formation réglementaire à la chirurgie chez la souris
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Tuées encore sous anesthésie, sans reprise de conscience, 200 souris subissent une incision de l'abdomen puis des sutures, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une puce d'identification, jusqu'à quatre injections intrapéritonéales et deux injections sous-cutanées. Le projet ne produit aucune connaissance, il sert des travaux pratiques de formation réglementaire à la chirurgie, à raison d'une souris par binôme d'étudiants, jusqu'à 32 étudiants par session et deux sessions par an. Le porteur indique que les sutures sont d'abord apprises sur des cuisses de poulet, et que les souris utilisées sont des animaux "de réforme" issus d'élevage qui auraient de toute façon été tués.
Objectifs
L'objectif de ce projet est la réalisation de travaux pratiques dans le cadre d'une formation réglementaire de la chirurgie pour l'enseignement de la gestion de l'anesthésie, de l'asepsie et de la douleur au cours d'un acte chirurgical réalisé chez la souris. Les étudiants auront préalablement reçu des informations théoriques en présentiel sur les bonnes pratiques en chirurgie. Ils auront également pu s'entraîner à la réalisation de sutures sur des supports inertes.
Bénéfices attendus
Les étudiants pourront mettre en pratique les cours théoriques qu'ils auront préalablement suivis et mettre en application les différents moyens mis à leur disposition pour évaluer la profondeur de l'anesthésie et l'entretien d’une anesthésie chirurgicale, pour la préparation d'un champ stérile, le travail de manière aseptique, la réalisation d'une procédure chirurgicale tout en contrôlant en permanence la qualité et la profondeur de l'anesthésie.
Procédures
Injection d'une puce d'identification et de mesure de température. Durée : quelques secondes. Une à 4 injections intrapéritonéales. Durée : quelques secondes. Une anesthésie (gazeuse ou chimique). Durée 30 minutes. Deux injections sous cutanée. Durée : quelques secondes. Une procédure chirurgicale, une incision au niveau de l'abdomen, réalisée sous anesthésie sans reveil. Durée 1h maximum. Sutures des plans musculaires et cutanés réalisées sous anesthésie: 15 minutes
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lié aux administrations en intraperitonéal (IP) et en sous-cutané (SC) et un inconfort lié au réveil à la suite de l'anesthésie.
Devenir
Les animaux issus de cette enseignement ne pourront pas être réutiliser dans d'autres expériences car ils auront subi une procédure chirurgicale. Tous les animaux sont donc mis à mort à la fin de la procédure chirugicale encore sous anesthésie pour éviter toute angoisse ou douleur liées au reveil.
Remplacement
Plutôt que d'étre réalisé directement sur des souris, l'enseignement des différents types de sutures sera réalisé sur des cuisses de poulet en amont des travaux pratiques réalisés sur la souris. La structure des cuisses de poulet permet de différentier les sutures musculaires et cutanées et une prise en main et la maitrise du geste sur un support inerte avant de le réaliser sur l'animal.
Réduction
Plutôt que l'utilisation d'une souris par étudiant, il sera utilisé une souris par binôme sans que cela ne nuise à la qualité de l'enseignement. A raison d'un maximum de 32 étudiants par session, et 2 sessions par an, cela permet la réduction de l'utilisation de 32 souris/an. Les souris seront des souris de réforme qui auraient dû être mises à mort car issues d'élevage et non utilisées ou arrivées en fin de projet (témoins ...). Des souris seront commandées chez l'éleveur que s'il n'y a pas du tout ou pas suffisamment de souris de réforme.
Raffinement
Une anesthésie chirurgicale sera réalisée pour les animaux devant subir une insition au niveau de l'abdomen avec administration conjointe d'un antalgique dès l'induction de l'anesthésie. La température au cours de l'anesthésie sera monitorée à l'aide d'une puce introduite en sous-cutané. Un gel ophtalmique de type Ocrygel sera appliqué sur les yeux des souris pendant les anesthésies pour éviter toute lésion liée à un potentiel dessèchement de la cornée.
Choix des espèces
Le modèle souris se justifie car c'est le modèle le plus utilisé en expérimentation animale et qu'il est possible, sur notre site, d'utiliser des souris normalement vouées à être mises à mort car issues d'élevage mais non incluses dans des procédures.