Procédures modérées

Des écouvillons dans les yeux, la bouche, le nez, le rectum ou le vagin, parfois chaque jour, et des prises de sang régulières : 188 chats de moins d'un an vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les études, ils reçoivent sous anesthésie, par le nez, la bouche, l'œil ou le péritoine, le calicivirus félin, le virus de la panleucopénie, l'herpèsvirus félin ou Chlamydia felis, et peuvent souffrir d'abattement, de fièvre, d'ulcères buccaux, de diarrhées, de vomissements ou de douleurs abdominales, au plus fort pendant trois à cinq jours. Le projet vise à produire du sérum de chat, à choisir des souches récentes pour de nouveaux vaccins félins et à vérifier leur efficacité. Au plus 16 chats pourront être adoptés et 40 réutilisés, les 132 autres étant tués pour des prélèvements de sang ou d'organes. Les jeunes chats sont retenus, selon le porteur, parce qu'ils forment "la population la plus sévèrement touchée" par ces virus.

Objectifs

Le projet vise à développer de nouveaux vaccins pour les chats, notamment dirigé contre le calicivirus félin (FCV), le virus de la panleucopénie (FPV), le virus de l'herpes félin (FHV), et Chlamydia felis. Les objectifs principaux sont la sélection de souches de FCV récentes à inclure dans un nouveau vaccin plus efficace, la mise au point de modèles félins d'infection par les différents pathogènes à partir de souches récentes collectées sur le terrain, la vérification de sûreté/innocuité des vaccins mis au point, ainsi que la vérification de leur efficacité.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mettre au point de nouveaux vaccins à destination des chats, afin d'offrir une meilleure protection contre des maladies courantes et potentiellement graves, telles que le coryza, le typhus, la rhinotrachéite virale et la chlamydiose.

Procédures

Les animaux recevront des administrations intranasales, orales, intra-oculaires ou intrapéritonéales, sous anesthésie générale et dans le respect des ligne directrices sur les volumes reçus. Cela représente environ 15 minutes/animal Des prises de sang seront effectuées régulièrement, en respectant les volumes maximaux, non préjudiciables aux animaux (quelques millilitres/semaine). Afin de ne pas stresser les animaux, elles pourront être effectuées sous sédation. (env. 2 minute par prise de sang) Des écouvillons seront également effectués, parfois quotidiennement, au niveau oculaire, buccal, nasal, rectal ou vaginal, pour mesurer la présence des virus ou bactéries. Le matériel utilisé est des très petite taille, de façon à être compatible avec la taille des animaux, et à ne pas générer de douleur (env. 2 minutes par jour)

Impact sur les animaux

Le projet nécessite d'administrer des microorganismes pathogènes aux chats, ils vont donc potentiellement développer les symptomes des maladies: - pour le calicivirus felin, symptomes du coryza: abattement, perte de poids, hyperthermie, jetage nasal et/ou oculaire, éternuements, toux, ulcères buccaux et/ou nasaux, conjonctivite, dyspnée - pour le virus de la panleucopénie, symptomes du typhus: abattement, perte de poids, hyperthermie, perte d'appétit, diarrhées, vomissements, déshydratation, douleurs abdominales Les symptomes pourront durer 1 à 2 semaines sous des formes légères, mais leur expression maximum n'est attendue que sur quelques jours (3-5 jours). - pour le virus de l'herpès ( rhinotrachéite infectieuse) et la chlamydiose: encombrement des voies respiratoires, éternuements, écoulement au niveau des narines, conjonctivite, kératite, et écoulements oculaires. Les animaux seront également soumis à des contraintes liées à des contentions brèves (quelques minutes au plus) et anesthésies pour la réalisation des différents actes techniques. Un conditionnement positif permettra de réduire la contrainte et le stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux de sang et/ou d'organes ou pourront être réutilisés si ces prélèvements ne sont pas nécessaires. Quelques animaux pourront être adoptés, à condition d'avoir retrouvé un état de santé compatible, de ne présenter aucun risque de contagion pour l'humain ou d'autres animaux et sous réserve de la validation de l'adoption par les autorités sanitaires.

Remplacement

La production d'immunserum felin contre différentes souches virales de FCV necessite un organisme complet avec un système immunitaire fonctionnel et un système sanguin, qui ne peuvent être reproduits artificiellement. Il s'agit d'anticorps polyclonaux ne pouvant être produits à partir de banques de phages / culture cellulaire. La mise au point de modèles d'infection par différents virus félins, l'évaluation ultérieure de vaccins innovants, ainsi que l'évaluation de sureté et d'immunogénicité de souches bactériennes ou virales necessitent également un organisme complet avec un système immunitaire fonctionnel, un système sanguin et la présence des organes cibles des pathogènes, qui ne peuvent être reproduits artificiellement du fait de la complexité des mécanismes / intéractions.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est réduit au strict minimum nécessaire, et ajusté selon les exigences de la pharmacopée européenne: 2 chats / souche de FCV justifié par la quantité d'antisérums nécessaires pour réaliser l'essai de neutralisation croisée contre un panel de 25-50 isolats de terrain du FCV (tests in vitro). Quatre chats / souche de FPV: la pharmacopée correspondante indique 5 chats par groupe témoin infecté non vacciné pour les essai d'épreuve virulente, cependant considérant qu'il s'agit d'études de mise au point il a été décidé d'utiliser un nombre inférieur jugé suffisant pour l'obtention de données cliniques. Cinq chats / groupe de FHV: la pharmacopée correspondante indique 10 chats par groupe pour les essai d'épreuve virulente, cependant considérant que cela est suffisant pour une étude d’efficacité visant à évaluer la protection contre la rhinotrachéite féline causée par une souche du FHV pré-selectionnée. Pour les autres pathogènes, le nombre sera également réduit au minimum nécessaire à l'obtention de données pertinentes, tout en respectant les exigences réglementaires, soit 3 à 8 chats par groupe expérimental.

Raffinement

Les animaux seront retirés de l'étude s'ils doivent suivre un traitement concomitant qui compromet leur aptitude à participer à l'étude, ou si leur état de santé se détériore au point de compromettre leur bien-être. Afin d'éviter de compromettre le bien-être des animaux pendant l'essai, les chats seront évalués quotidiennement par du personnel qualifié et, si le bien-être des animaux est compromis, des mesures correctives seront appliquées. Des tableaux de signes cliniques seront utilisés afin de déterminer un score journalier d'état clinique. Dans le cas où l'animal présenterait de la douleur, de la souffrance ou de la détresse, selon la ponctuation obtenue dans l'évaluation des signes cliniques, un vétérinaire examinera l'animal afin de déterminer l'origine de la douleur, de la souffrance ou de la détresse et des actions correctives seront appliquées (traitement si possible, ou sortie d'étude) Les animaux seront hébergés en groupe d'individus compatibles, dans de grandes salles d'hébergement, avec un enrichissement adapté à l'espèce et à leur âge, et avec des intéractions positives quotidiennes avec le personnel en charge des soins. Un programme d'entrainement basé sur le renforcement positif sera mis en place afin de limiter le stress engendré par les manipulations nécessaires à l'étude, et de diminuer autant que possible le recours aux sédations.

Choix des espèces

Le chat est l'espèce cible des vaccins mis au points et des virus utilisés Les animaux seront de jeunes chats âgés de moins d'un an, correspondant à la population la plus sévèrement touchée par les virus étudiés.

Ce projet sert à faire naître des souris porteuses de la mutation du syndrome de Rett, destinées ensuite à d'autres expériences. 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées à l'issue de l'élevage. Les mâles porteurs se développent normalement jusqu'à cinq semaines, puis leur état se dégrade avec des atteintes musculaires, cardiaques et respiratoires qui en tuent environ la moitié entre huit et douze semaines. Le porteur les tue au sexage et au génotypage pour devancer ce phénotype, et revendique la mise à disposition de la communauté scientifique de "modèles précliniques" de la maladie.

Objectifs

Le syndrome de Rett est une pathologie neurodéveloppementale rare et sévère qui touche principalement les filles, avec une prévalence de 1 pour 10 000 naissances féminines. Dans 95 % des cas, cette maladie résulte d'une mutation du gène porté par le chromosome X. Les garçons atteints de cette mutation décèdent in utero ou au cours des premières semaines de vie (encéphalopathie létale). Cliniquement, le syndrome de Rett chez les filles se caractérise par une régression comportementale apparaissant vers l'âge de 2 ans, accompagnée de déficits moteurs sévères, notamment au niveau respiratoire, de troubles cognitifs, et d'un syndrome autistique (altération des comportements sociaux, comportements stéréotypés), souvent associé à de l'épilepsie. À ce jour, aucun traitement médicamenteux n'est disponible pour soulager les troubles moteurs et les symptômes autistiques chez les patientes atteintes du syndrome de Rett. Sur le plan neurobiologique, les mécanismes sous-tendant les atteintes motrices et les symptômes autistiques chez les patientes demeurent incompris. L'objectif du projet est la génération de souris possédant la mutation sans l'expression d'un phénotype dommageable. Ces animaux seront utilisés dans des expériences visant à trouver des solutions thérapeutiques pour soulager les patientes atteintes de la maladie.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet est de générer des souris modèles du syndrome de Rett. Ces animaux seront utilisés dans des expériences visant à développer des solutions thérapeutiques pour soulager les patientes atteintes de cette maladie.

Procédures

Le processus décrit concerne l'élevage d'une lignée de souris présentant des problèmes de santé. Seuls les mâles porteurs de la mutation développent ces problèmes. Ces souris grandissent normalement jusqu'à environ 5 semaines. Ensuite, leur santé se détériore rapidement, avec des problèmes graves de muscles, de cœur et de respiration, ce qui entraîne leur décès vers l'âge de 12 semaines. Nous retirons les souris présentant ces problèmes avant qu'ils ne surviennent. Les souris ne subissent aucune intervention hormis les procédures nécessaires pour les élever correctement.

Impact sur les animaux

Les souris mâles présentant la mutation se développent normalement jusqu'à leur cinquième semaine. Ensuite, leur état se dégrade, conduisant à un taux de mortalité d'environ 50% entre la 8ème et la 12ème semaine de vie.

Devenir

Les mâles mutant présentent le problème de santé, et ils seront euthanasiés lors du sexage et du génotypage avant le développement de ce phénotype.

Remplacement

La compréhension des mécanismes causaux de l'autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère de validité d'aspect pour la pathologie autistique, et aussi d'évaluer le cas échéant l'efficacité d'une approche thérapeutique. L'évaluation des effets bénéfiques d'un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu'au niveau comportemental. En effet, il n'existe pas de marqueur biologique pour l'autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu'au niveau de l'animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Nous nous mettons en place une stratégie d’accouplement spécifique afin de réduire le nombre d’animaux qui présentent un problème de santé.

Raffinement

Nous affinerons nos expériences en soulageant l'inconfort ou le stress potentiel subi par les animaux tout au long de leur période d'élevage. Nous logerons les souris par groupes sociaux de 2 à 4 individus, en mettant à leur disposition le matériel nécessaire pour construire un nid (ouate et cabane en carton). Nous mettons en place une stratégie de croisement afin de limiter le nombre d'animaux présentant un phénotype dommageable.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Les déficits comportementaux détectés chez les souris modélisant l’autisme sont suffisamment importants et robustes pour tester la validité d'aspect du modèle et, le cas échéant, permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Le phénotype des souris mâles présentant la mutation génétique apparaît à l'âge de 6 semaines. L'observation hebdomadaire des animaux nous permet de surveiller l'état général des individus et d'appliquer les points limites pour décider de la mise à mort des animaux quand cela est nécessaire.

Rendues malades d'une colite hémorragique par un produit administré une semaine durant, ou d'un lupus par une injection de pristane dans la membrane entourant l'intestin, 1 080 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le lupus se déclare huit semaines après l'injection, et des prélèvements sanguins sont réalisés chaque mois sous anesthésie, pour évaluer deux molécules mises au point par l'équipe. Le porteur décrit une injection qui "n'induit peu d'inconfort et de douleur", puis annonce que certaines souris développeront des atteintes pulmonaires sévères et seront tuées en détresse. Il conclut que l'essai préclinique sur des souris récapitulant les manifestations humaines est "indispensable" avant tout essai chez les patients.

Objectifs

La Rectocolite hémorragique (RCH) est une maladie inflammatoire digestive sévère dont les causes sont mal comprises. De plus, cette pathologie peut être caractérisée par une résistance du traitement. Le lupus érythémateux systémique (LES) est une maladie auto-immune pouvant engendrer des atteintes cutanées, rénales, articulaire et vasculaire dont les cause ne sont pas encore bien comprise. De plus, les traitements actuellement disponibles ne permettent que de partiellement contrôler la pathologie. C'est pour ces raisons que le développement de nouveaux outils thérapeutiques tant pour le LES que pour la RCH est nécessaire pour une meilleure prise en charge des patients. De nouveaux mécanismes pathologiques communes à ces deux pathologies ont récemment été décrit et nous avons développé de nouvelles molécules afin de réguler ces mécanismes pathogéniques et de diminuer les atteintes d'organes. Les objectifs de ce travail seront donc d'évaluer le pouvoir thérapeutique des deux molécules développées par notre équipe et de les comparer aux traitements de référence ou en combinaison avec ces derniers pour amplifier leurs effets. Ces thérapeutiques étant nouvelles, et nécessitent une validation préclinique avant le passage éventuel chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les thérapeutiques actuellement disponibles pour les patients atteints de recto-colite hémorragique (RCH) ainsi que celles disponibles pour le lupus érythémateux systémique (LES) sont imparfait. En effet certains patients peuvent être résistant au traitement, de plus ces derniers peuvent aussi engendrer de lourds effets indésirables. En partant de ce constat, notre équipe essaye de développer de nouveaux outils thérapeutiques en rapport avec les derniers avancés sur la compréhension de la physiopathologie de ces deux maladies. Avant tout, essaie sur les patients l'essai pré-clinique sur des modèles murins permettant de récapituler les manifestations cliniques humaines est indispensable. Le bénéfice attendu à long terme est donc la génération de nouvelles molécules thérapeutiques pour traiter la RCH et le LES.

Procédures

Le modèle de colite induit en 1 semaines est utilisé pour cette étude est largement validé et utilisé dans la littérature engendrant de l'irritation et inflammation au niveau intestinal. La sensibilité des animaux a la maladie peut varier selon les individus et la détérioration de l’état général peut être plus rapide chez certains. Le poids et l’état général seront donc surveillés quotidiennement pendant la durée du traitement. Il est admis que si l’animal perd plus de 20% du poids du corps, il doit être euthanasié plus rapidement que prévu. Pour les prélèvements sanguins, les souris seront anesthésiées pendant 2 minutes le temps du prélèvement pour limiter leur inconfort. Le modèle murin de lupus est induit par une injection rapide durant moins de 30 secondes au niveau de la membrane entourant l'intestin, ce type d'injection est classique et n'induit peu d'inconfort et de douleur. La maladie lupique est induite a partir de 8 semaines après l'injection.

Impact sur les animaux

Le modèle de colite utilisé pour cette étude est largement validé et utilisé dans la littérature engendrant de l'irritation et inflammation au niveau intestinal. La sensibilité des animaux a la maladie peut varier selon les individus et la détérioration de l’état général peut être plus rapide chez certains. Le poids et l’état général seront donc surveillés quotidiennement pendant la durée du traitement. Il est admis que si l’animal perd plus de 20 % du poids du corps, il doit être euthanasié plus rapidement que prévu. Le modèle murin de lupus induit par le pristane est un modèle validé, certains animaux peuvent développer dans les premières semaines des atteintes pulmonaires sévères, mais ces souris vont rapidement être reconnu comme étant en détresse et seront rapidement euthanasié afin de limiter le plus possible la durée de leur detresse. Les animaux qui n'auront pas développé d'atteinte pulmonaire vont progressivement avoir une légère détérioration de leur fonction rénale.

Devenir

Tous les animaux utilisé seront euthanasié conformément à l'annexe IV de la directive 2010/63/CE. Cette mise a mort des animaux est neccesaire afin d'évaluer les paramétres immunologiques et l'évolution de la pathologie en fonction des différents traitements.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologie observée chez l’homme peut apporter la preuve de l’intérêt d’un traitement ciblant GPX4 ou le s- CD95L dans la RCH et le LES. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé statistiquement comme étant le nombre minimum d'animaux pour réaliser des tests statistiques robustes et permettant de conclure quant à l'efficacité thérapeuque de nos molécules.

Raffinement

1. Hébergement: les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance, perte de poids trop importante. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur: certaines souris auront un prélévement sanguin une fois par mois et afin de limiter leurs stress, incomfort et douleurs ce geste sera fait sous anésthésie générale.

Choix des espèces

Souris C57Bl/6 : nous utiliserons ces souris car elles ont largement été utilisées dans la littérature avec le modèle DSS ou pristane et y sont sensibles.

Le protocole sert à classer six formulations d'un médicament déjà utilisé en clinique humaine, pour le compte du laboratoire client qui les a mises au point. 48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit onze prélèvements sanguins à la veine de la queue, le porteur reconnaissant que ces ponctions répétées peuvent provoquer des lésions et des hématomes. Il qualifie le recours à l'animal entier d'étape "nécessaire et obligatoire", et retient le rat pour sa volémie, qui autorise davantage de prélèvements par individu et réduit d'autant l'effectif de l'étude.

Objectifs

Le laboratoire pharmaceutique client a développé des matrices de type gel qui peuvent être complexées avec des composés thérapeutiques et être administrées par voie sous-cutanée afin d'induire une libération prolongée du composé complexé. Ce type de formulation (ou galénique) permet ainsi, en théorie, de réduire très sensiblement la fréquence d'administration de médicaments dont la voie d'administration est sous-cutanée. Néanmoins, il es nécessaire de tester, pour chaque composé à complexer, sa stabilité à moyen long terme dans la matrice afin que ce dernier conserve son efficacité. Par ailleurs, la durée de libération va également dépendre étroitement de la composition du gel. Le présent projet vise ainsi à explorer le profil pharmacocinétique de 6 formulations à libération prolongée du médicament X administrées par voie sous-cutanée chez le rat, dans le but d'optimiser son développement. Les données obtenues seront comparées aux profils pharmacocinétiques obtenus après administration d'une galénique classique du composé X par voie intraveineuse et sous-cutanée. La formulation permettant la meilleure stabilité du compose X et de ses paramètres pharmacocinétiques sera conservée pour la suite du développement, notamment dans un cadre clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de catégoriser les formulations à libération prolongées du médicament X de notre client en fonction de leur paramètres pharmacocinétiques et de prioriser les meilleures formulations pour la suite du développement préclinique et clinique. La formulation à libération choisie prolongée devrait à terme permettre de réduire considérablement la fréquence d'administration du composé X qui est déjà utilisé en clinique humaine sous sa forme galénique classique.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Pesée (1min ; 2 fois). Habituation aux boîtes de contention (5min ; 2 fois). Anesthésie gazeuse (5min ; 1 fois). Administration sous-cutanée du composé d'intérêt (1min ; 1 fois). Prélèvements sanguins (5min ; 11 fois).

Impact sur les animaux

La répétition des prélèvements sanguins via la veine de la queue est de nature à induire un stress aux animaux. Par ailleurs, ces prélèvements répétés pourraient s'avérer générateurs de lésions problématiques au niveau de la queue. Afin de limiter le stress, les animaux seront manipulés de façon quotidienne par les expérimentateurs et habitués aux systèmes de contention utilisés au cours des prélèvement. Afin de se prémunir de lésions potentielles au niveau du site de prélèvement sanguin, ceux-ci seront pratiqués à l'aide de microperfuseurs à ailettes, ces derniers autorisant un prélèvement sanguin en n'insérant que le premier millimètre de l'aiguille dans la veine. Une attention particulière sera portée à la queue des animaux. Si un hématome venait à apparaitre, les prélèvements suivants seraient pratiqués sur le côté opposé de la queue. Par ailleurs, le volume de sang prélevé pour chaque point est limité au volume minimum possible pour la réalisation des analyses pharmacocinétiques (PK) ultérieures.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Après euthanasie, certains organes seront prélevés (coeur, poumons, cerveau...) afin d'étudier une accumulation éventuelle à leur niveau du composé X ou d'éléments constituants de la matrice de libération prolongée.

Remplacement

Le présent projet vise à déterminer les paramètres pharmacocinétiques de formulations à libération prolongée d'un médicament X. Le recours à l’animal entier reste une étape nécessaire et obligatoire d'un point de vue règlementaire pour ce type d'étude. Le choix du modèle rat a été préféré à la souris du fait des capacités accrues de prélèvements sanguins sur ce modèle (volémie plus importante).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure d'obtenir des données significatives sur les paramètres pharmacocinétiques étudiés. Le nombre d'animaux par groupe a été choisis selon les recommandations d'un ouvrage de référence. Le nombre de 6 animaux par groupe a été choisi en tenant compte d'une possibilité de variabilité plus importante de la biodisponibilité des drogues progressivement libérées par la matrice en sous-cutanée par rapport à une administration classique (libération immédiate).

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études pharmacocinétiques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Notamment, les volumes des prélèvements sanguins en série seront limités au strict nécessaire pour l'élaboration des dosages. Par ailleurs, les prélèvements seront réalisés par ponction de la veine de la queue à l'aide de microperfuseurs à ailettes, ces derniers autorisant un prélèvement sanguin en n'insérant que le premier millimètre de l'aiguille dans la veine. Les animaux seront hébergés avec un enrichissement du milieu de vie qui sera assuré par l'ajout de petites briquettes en bois et de tubes cartons spécifiques pour rat. Enfin, un suivi journalier des animaux permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis (administration d'analgésiques).

Choix des espèces

Le rat a été préféré à la souris compte tenu du nombre de prélèvements et des volumes sanguins nécessaires à l'étude. La même étude sur la souris aurait nécessité de limiter drastiquement le nombre de prélèvements par animal, ce qui aurait eu pour conséquence d'augmenter considérablement les effectifs de l'étude. Par ailleurs à ce stade, les études sur animaux non rongeurs n'ont pas été envisagées par soucis de Remplacement (Règle des 3Rs). Il nous apparait que les études sur les mammifères non murins devraient être limitées aux études règlementaires sur des molécules actives déjà sélectionnés. Or dans le cas présent il s'agit d'une étude de sélection de formulations, permettant d'optimiser la recherche et développement du client et de limiter le développement ultérieur aux formulations présentant les meilleurs propriétés pharmacocinétiques. Les animaux utilisés seront des rats adultes (300 g à réception/350g env. au démarrage des expérimentation). Ce stade de développement a été choisis: - en se basant sur le recommendations d'un ouvrage de référence. - en considérant le nombre de prélèvements et les volumes sanguins nécessaires à la bioanalyse.

La moitié des souris reçoit une irradiation puis une greffe de moelle osseuse par injection rétro-orbitaire sous anesthésie, toutes subissent une administration intratrachéale, et une partie reçoit des cellules cancéreuses par voie intraveineuse alors qu'elles sont éveillées. 420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le RNT qualifie les métastases pulmonaires de modèle "sans souffrance jusqu'à J21", jour de la mise à mort. Sur le remplacement, l'équipe affirme que les paramètres étudiés ne peuvent pas être reproduits in vitro et que le recours aux souris est "indispensable" pour saisir l'immunité entraînée dans sa globalité.

Objectifs

Nos travaux antérieurs montrent clairement que suite à une pneumonie aiguë, le poumon des souris ne revenait pas à l’état initial mais avait développé une cicatrice immunitaire. Cette cicatrice semble jouer un rôle majeur contre des infections secondaires et contre d’autres pathologies telles que le cancer. Les cellules immunitaires naviguent dans le poumon au sein de structures cellulaires particulières telles que les alvéoles pulmonaires et les bronchioles. Les objectifs de ce projet sont de caractériser : 1- l’impact de la cicatrice immunitaire pulmonaire sur les cellules de l’alvéole et 2- le rôle de ces cellules de l’alvéole dans la mise en place et le maintien de cette cicatrice immunitaire. L’utilisation des procédures mentionnées dans ce document nous permettra de répondre clairement à ces questions

Bénéfices attendus

Notre projet nous permettra d’évaluer l’impact de la cicatrice immunitaire sur les fonctions des cellules de l’alvéole et d’évaluer le rôle de cette paroi dans la mise en place de cette cicatrice en vue d’une potentielle valorisation et mise en place de traitement adapté pour lutter contre les infections bactériennes et le cancer.

Procédures

La moitié des animaux seront soumis à une irradiation (de quelques dizaines de secondes), suivie d’une reconstitution en moëlle osseuse par voie (IV) intraveineuse rétro-orbitaire sous anesthésie générale. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste. Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale (IT) sous anesthésie générale. Une partie des animaux sont soumis à une administration de cellules cancéreuses par voie IV caudale en vigile. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanée (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles.. Tous les gestes IV, SC et IT sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Modèles d’infection bactérienne : Les modèles d’inflammation respiratoires aigues sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Les modèles cancéreux de métastases pulmonaires sont sans souffrance jusqu’à J21, temps d’euthanasie pour analyse. Le modèle d’irradiation avec recomplémentation de moëlle osseuse est un modèle expérimental modéré sans développement de pathologies. Les souris seront traitées avec des antibiotiques dans l’eau de boisson. Ce traitement est nécessaire pour compenser l’immunodéficience profonde mais transitoire résultant de la forte dose d’irradiation utilisée pour éliminer les cellules souches hématopoïétiques. Le traitement commencera le jour précedant l’irradiation, pour accomoder les souris au goût des antibiotiques, et se poursuivra pendant 2 semaines après l’irradiation.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.

Remplacement

Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indipensable. Les muliples intéractions entre types cellulaires différents et la complexité de la mise en place de l’immunité entraînée nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=5) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Une valeur de p

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphiniques seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’analgésiques afin d’anesthésier localement la trachée. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections bactériennes ainsi que les modèles tumoraux sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature

2 310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un carcinome ovarien leur est implanté par chirurgie ou par injection, puis elles subissent jusqu'à deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie et jusqu'à cinq administrations de traitement par semaine, pendant douze semaines, ainsi que des prélèvements de sang par ponction submandibulaire. Le porteur décrit un gonflement de l'abdomen avec ascite pouvant apparaître huit semaines après l'implantation, et prévoit alors la mise à mort de l'animal. Ce laboratoire travaille à la demande de chercheurs extérieurs et affirme qu'aucune autre méthode n'apporterait un niveau d'information équivalent, sans nommer les approches écartées.

Objectifs

Ce projet a pour but de mettre en œuvre, à la demande de chercheurs extérieurs à notre laboratoire, des modèles de cancer ovarien et de les étudier par imagerie in vivo, à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou à l'évaluation de nouveaux médicaments. Le cancer ovarien représente un défi majeur de santé publique en raison de son diagnostic tardif et de son impact sur la fertilité des femmes. Malgré des avancées significatives en termes de survie grâce aux chimiothérapies à base d’anticorps thérapeutiques, certaines patientes ne répondent pas ou peu aux traitements. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies afin d’améliorer l’efficacité antitumorale et de lutter contre les phénomènes de résistance. Le projet représente un ensemble d’études types qui pourront viser à comprendre des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou à évaluer l'efficacité thérapeutique de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’étudier par imagerie in vivo des modèles de cancer ovarien à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments.

Procédures

Induction de cancer ovarien : 1 acte par animal soit par chirurgie (15min max d’intervention sous anesthésie générale) soit sans chirurgie : injection intrapéritonéale (quelques secondes), injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie générale) Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 12 semaines sous anesthésie générale Les examens d’imagerie ont une durée de 5 secondes à 30 minutes suivant le type d’imagerie. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 12. Il faut 30 secondes au maximum pour administrer un traitement. Prélèvement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire : en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours. Il faut environs 30 secondes pour effectuer ce type de prélèvement et appliquer un point de pression avec un crayon hémostatique au point de collecte pour arrêter le saignement.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus pour les animaux sont liés à la chirurgie lors de l’induction du modèle orthotopique et au développement de foyers tumoraux au niveau sous-cutané ainsi qu’au niveau de l’ovaire et des viscères. L’administration d’antalgique 1h avant et 24 h après la chirurgie et l’utilisation de l’anesthésie gazeuse permettent de réduire la souffrance animale due à l’incision des plans musculaires et cutanées. Une gêne pourrait apparaitre dans le modèle sous cutanée à partir du moment où la tumeur atteint un volume proche du point limite. Un gonflement de l’abdomen avec présence d’ascite peut apparaitre 8 semaines après l’induction lors de l’évolution des métastases péritonéales dans le modèle orthotopique et dans le modèle carcinose péritonéale. Cette nuisance sera prise en compte dans la grille de. Le point limite étant alors atteint, l’animal sera mis à mort. Nous n’attendons pas de douleur ou d’intolérance liées aux composés testés. Si des effets secondaires apparaissaient, le suivi des animaux via la grille de scoring permettra de les mettre en évidence et de prendre les mesures adéquates.

Devenir

Toutes les souris porteuses de cellules de carcinome ovarien seront mises à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.

Remplacement

L'étude de tumeurs ou métastases résulte de l’interaction de nombreux types cellulaires et ne peut pas être modélisée in vitro. Aucune autre méthode expérimentale ne serait en mesure d’apporter un niveau équivalent d’information que la procédure expérimentale impliquant l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en oeuvre des techniques d’imagerie qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires à 10 par groupe pour réaliser des tests statistiques pertinents. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.

Raffinement

Les méthodes d'imagerie mises en œuvre sont non invasives et certains actes sont réalisés sous anesthésie ce qui limite la douleur et le stress infligé au cours de l’expérimentation. Par ailleurs, Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Elles seront hébergées au nombre de 6 animaux maximum dans des cages de type II (530cm²). Les cages sont enrichies avec des petits cylindres de coton pour la fabrication d’un nid. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. L'induction des modèles tumoraux sera réalisée sous anesthésie générale. Durant les actes de chirurgie, la douleur sera également prise en charge par l’administration d'anti inflammatoire le jour et 24h post opératoire. Les animaux seront observés quotidiennement et des grilles de scoring avec des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Modèle de cancer réalisable chez la jeune souris (5 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.

Toutes tuées lors d'un prélèvement d'organe, à l'atteinte d'un point limite ou en fin d'étude, 6 750 souris reçoivent une greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite un composé thérapeutique jusqu'à une fois par jour pendant dix-huit semaines, une molécule déplétante un jour sur deux, et jusqu'à deux micro-prélèvements de sang par jour. Parmi les effets qu'il qualifie lui-même de sévères, le porteur cite une paralysie, une perte de poids et une modification du comportement liées à la greffe, alors que l'ensemble des procédures est déclaré en souffrance modérée. Ce prestataire prévoit 75 études en cinq ans et affirme qu'il est "indispensable" de recréer la pathologie chez la souris pour évaluer les composés.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet consiste à évaluer l’efficacité d’un composé à visée thérapeutique seul ou en combinaison chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur greffée en intraveineuse. Les doses et les fréquences de traitement seront déterminées grâce aux études de pharmacocinétique, de pharmacodynamie et de toxicité préalablement réalisées et/ou en se basant sur les données de la littérature et notre expérience.

Bénéfices attendus

Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de composés à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur greffée en intraveineuse pour une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.

Procédures

• Sur animal vigile : Greffe de cellules tumorales (1 injection) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 1 fois /jour pendant 18 semaines maximum) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante (maximum 1 jour sur 2 pendant 18 semaines maximum) ; Microprélèvement de sang (maximum 2 fois /jour). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang (4 fois maximum) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois /semaine pendant 18 semaines maximum) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante maximum 2 fois /semaine pendant 18 semaines maximum) ; Prélèvement de sang terminal.

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales. Stress et douleur légère lors de l’administration du(des) composé(s) thérapeutique(s) et de la molécule déplétante/neutralisante. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, paralysie. Possibilité d’effets indésirables sévères liés au(x) composé(s) thérapeutique(s) : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.

Remplacement

Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.

Réduction

Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester sont également déterminés dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires dans les procédures impliquant une greffe tumorale. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats, statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et de celle du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Ces études sont menées à l’aide de différents modèles statistiques. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 75 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. L’apparence/comportement de l’animal ainsi que la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé injecté pourra induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement) sera suivi lors des mesures de poids (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (minimum 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.