Procédures modérées

680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de la queue et deux à quatre injections intrapéritonéales avant analyse post-mortem, pour vérifier des invalidations géniques touchant la fabrication des protéines de surface des neurones. Le porteur qualifie ce travail d'étude pilote portant sur un nombre "relativement restreint" d'animaux, et l'un de ses objectifs affichés consiste à vérifier que ces invalidations ne provoquent pas de phénotype dommageable. La description des gestes infligés tient en une ligne, et les retombées annoncées pour les maladies humaines restent lointaines.

Objectifs

Le développement et la fonction des neurones requiert la genèse de nombreuses protéines de surface qui permettent aux neurones de percevoir et d’interagir avec leur environnement. Nos travaux précédents montrent que des étapes spécifiques de la maturation des protéines ne sont pas nécessaires pour la production de protéines de surface fonctionnelles par les neurones, contrastant avec d’autres types cellulaires où ces étapes sont requises. Les mécanismes cellulaires sous-jaccents sont cependant encore mal caractérisés. Des études étendues de ces processus ont été réalisées dans des modèles de culture cellulaire à l’aide d’agents pharmacologiques. Nous souhaitons maintenant généraliser ces résultats en utilisant des modèles d’invalidation génique chez la souris. Notre projet a pour but de valider cette approche par des analyses post mortem et de vérifier l’absence de phénotypes dommageables provoqués par ces invalidations géniques. Ces étapes de maturation sont modulées dans de nombreuses maladies neurologiques ou psychatriques. Ce projet de recherche fondamentalle permettra de mieux comprendre les bases cellulaires de ces variations, contribuant ainsi in fine à l’identification de nouveaux biomarqueurs ou de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les expériences réalisées nous permettront de préciser le rôle d’étapes importantes de la synthèse des protéines de surface des neurones, un mécanisme cellulaire fondamental, apportant des informations manquantes sur les causes responsables des dérégulations de ce processus qui sont observées dans de nombreuses maladies humaines sévères et actuellement non ou difficilement traitables.

Procédures

injections intrapéritonéales (entre 2 et 4) ou sous-cutanées (1) (gestes de 1-2 minutes)

Impact sur les animaux

Douleurs de quelques secondes lors des injections IP et de la biopsie de la queue.

Devenir

Les expériences prévues impliquent toutes une analyze post mortem des échantillons.

Remplacement

Les études qui seront réalisées font suite à des études étendues de ces processus dans des systèmes de culture cellulaire. Il est maintenant essentiel d’étudier ces mécanismes in vivo dans des neurones intégrés dans leur environnement tissulaire complexe pour étudier plus avant leur rôle physiopathologique.

Réduction

Nous réalisons ici une étude pilote sur un nombre relativement restreint d’animaux qui nous permettrons de tester la faisabilité d’expériences projetées dans des modèles de neuropathologies. Le nombre de souris requis a été estimé sur la base de nos travaux précédents et d’études comparables pour avoir des résultats statistiquement valides après analyse a posteriori.

Raffinement

Les résultats de cette étude pilote nous permettront d’optimiser nos procédures pour des analyses futures plus étendues. Les souris seront élevées en groupes sociaux dans des cages comprenant du matériel de nidification. Un personnel formé au bien-être animal surveille les animaux tous les jours. L’apparition de signes de stress ou de douleur sera attentivement suivie et la poursuite des expériences déterminées en fonction d’une évaluation régulière de points limites appropriés. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur des animaux.

Choix des espèces

La souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Une autre raison pour utiliser la souris est la possibilité de manipuler de types précis de cellules chez des animaux transgéniques. Les animaux seront utilisés entre 2 semaines (stade le plus approprié pour le genotypage) et 6 mois de vie (stade suffisant pour le suivi longitudinal efficace de nos expériences avec des souris adultes).

Soumis à deux ou trois anesthésies en une semaine, à des injections dans la veine jugulaire et à cinq ou six prises de sang, neuf moutons seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur cale une technique d'IRM au manganèse sur le cerveau ovin et injecte un composé qu'il reconnaît neurotoxique à forte dose chez l'humain, en jugeant la toxicité aiguë "très peu probable" chez les ruminants. Les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour être réanalysés à plus haut champ. Parmi les bénéfices annoncés figure l'appui de futurs appels à projet.

Objectifs

L’objectif est de mettre en place la technique d’Imagerie par Résonnance Magnétique du manganèse in vivo à l'échelle du cerveau entier chez l’ovin. Les propriétés paramagnétiques du manganèse (Mn2+) permettent son utilisation comme agent de contraste pour l'IRM (MEMRI : IRM du ManganEse). C’est un composé qui pénètre et s'accumule dans les neurones actifs, donc sa concentration intracellulaire est le reflet direct de l'activité neuronale. Cette technique permet de visualiser les changements structurels et fonctionnels en réponse à des stimulis. La dynamique du Mn2+ (biodisponibilité, pharmacocinétique) dépend de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin pour lequel aucune étude n’est disponible dans la littérature.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir la dose minimale de Mn2+ nécessaire pour l’obtention du meilleur contraste en IRM MEMRI. Il permettra également de se placer dans la fenêtre temporelle la plus favorable pour l’acquisition d’un contraste optimum. Les mises au point des conditions de dose et temps dans cette expérimentation préliminaire bénéficieront à des appels à projet ultérieurs.

Procédures

Les animaux de la procédure 1 subiront 2 anesthésies à 10 jours d'intervalle pour passage à l'IRM. La première durera 1 heure, la 2ème 6 heures. Ils recevront également une injection intra-péritonéale (durée totale contention comprise d'une minute). Ils subiront 2 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies, ainsi que 6 prises de sang vigiles (durée totale contention comprise d'une minute). Les animaux de la procédure 2 subiront 3 anesthésies réparties sur 7 jours pour passage à l'IRM. Chaque anesthésie durera 1 heure 30. Ils recevront également une injection intra-péritonéale sous anesthésie. Ils subiront 3 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies, ainsi que 5 prises de sang vigiles (durée totale contention comprise d'une minute).

Impact sur les animaux

Bien qu’il soit un élément nécessaire au bon fonctionnement de l’organisme, le manganèse est cependant neurotoxique à forte dose. Chez l’homme, il provoque maux de tête, insomnies, pertes de mémoire, instabilité émotionnelle, dystonie, tremblements, troubles du langage et des troubles de la marche. Selon la littérature, les cas de toxicité aigüe au manganèse chez les ruminants sont très peu probables. Nous n’attendons donc pas d’effets indésirables suite à l’injection de Mn2+, mais les animaux seront surveillés étroitement après l'injection. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse, ou après les prises de sang à la veine jugulaire.

Devenir

A la suite des acquisitions, tous les animaux seront mis à mort toujours sous anesthésie générale, car leurs cerveaux seront prélevés et ré-analysés ex-vivo par IRM à plus haut champ.

Remplacement

Cette étude d‘imagerie cérébrale permettant de déterminer la dose minimale de Mn2+ et la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste ne peut être réalisée qu’in vivo. Il est en effet impossible d’étudier ou de reproduire ces expériences in vitro et encore moins in silico. Ce projet est un prérequis pour développer l’approche d’imagerie MEMRI qui permettra, ultérieurement, de mettre en place des projets longitudinaux, avec des nombres restreints d’animaux expérimentaux.

Réduction

Ce projet concerne 9 animaux expérimentaux maximum, qui seront utilisés pour tester trois doses de Mn2+ et déterminer la fenêtre d’observation optimale de l’activité cérebrale par IRM MEMRI. Pour cette expérience pilote, nous avons besoin de déterminer la dose minimale qui nous permet d’acquérir des images IRM informatives, et pour cela nous ne disposons que de quelques données dans la littérature sur les rongeurs uniquement. Par conséquent, il nous faut tester plusieurs doses. De la même manière, nous n’avons aucune donnée sur la biodisponibilité du manganèse dans l’organisme d’ovin et donc nous ne connaissons pas la cinétique de disponibilité du manganèse dans le cerveau.

Raffinement

Les animaux expérimentaux feront l’objet d’une surveillance accrue dans la période qui suivra l’administration de Mn2+ jusqu’à l’anesthésie pour l’imagerie. Au cours de cette période, l’apparition de tremblements, les difficultés de déplacement, la prise alimentaire seront particulièrement surveillés. Nous serons attentifs à la survenue de signes de mal être (position des oreilles, port de la tête, prostration). Dans le cas où de tels signes apparaitraient, un traitement analgésique sera administré. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux expérimentaux seront maintenus en groupe au sein d'un environnement social stable, dans des conditions adaptées aux herbivores, litière de paille et foin ad libitum. Ils seront manipulés dans le calme par des agents expérimentés. Ils arriveront la veille de l’anesthésie, et seront mis à jeun avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Les brebis seront maintenues sous oxygène à la fin de la première anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé.

Choix des espèces

Nous souhaitons développer la technique de l’IRM réhaussé par le manganèse (MEMRI) chez l’ovin adulte pour plus tard étudier les mécanismes de plasticité cérébrale associés aux changement de photopériode chez cette espèce saisonnée. La dynamique du Mn2+ dépendant de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin pour lequel aucune étude n’est disponible dans la littérature. Nous utiliserons des adultes pubères, de sexe indifférent.

Toutes tuées entre neuf et quatorze jours de vie, 280 souris subissent une biopsie de la queue puis l'administration d'une substance activant la voie de l'acide rétinoïque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié des mâles, écartés après génotypage parce que leur génotype ne convient pas, sont tués sans même être prélevés. La mise à mort passe par une anesthésie à dose létale suivie d'une perfusion de dix minutes, pour prélever les testicules. Le porteur affirme qu'une approche sur animaux est "indispensable" et qu'un système in vitro est impossible, et cite un contraceptif masculin parmi les retombées envisagées.

Objectifs

L’acide rétinoïque et les récepteurs de l’acide rétinoïque sont indispensables à la différentiation des spermatogonies pendant la spermatogenèse. Nos études suggèrent l'existence de différentes populations de spermatogonies qui émergent à différents stades du développement prépubère et qui seraient contrôlées par l’un ou l’autre des récepteurs de l’acide rétinoïque. Dans ce projet nous induisons la différentiation de spermatogonies chez des souris présentant un arrêt de la spermatogenèse par administration de diverses substances activatrices de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque. Les testicules des animaux traités sont soumis à des analyses visant à élucider l’émergence de plusieurs populations de spermatogonies pendant la période prépubère.

Bénéfices attendus

Dans la mesure où inhiber la synthèse d’acide rétinoïque bloque la différenciation des spermatogonies dans de nombreuses espèces, y compris les êtres Humains, il est logique de penser que les mécanismes régissant la spermatogenèse qui sont découverts ici chez des souris altérées dans la voie de signalisation de l’acide rétinoïque sont pertinents pour les êtres Humains. En comprenant comment la voie de signalisation de l'acide rétinoïque agit sur les spermatogonies chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour évaluer si des cas d'infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde, sont liés à des altérations du fonctionnement de ces voies de signalisation. La possibilité de perturber temporairement la signalisation de l'acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux.

Procédures

Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). - Biopsie de queue (entre le 1e et le 3e jour ou entre le 5e et le 10e jour) sur animaux vigiles pour génotyper les animaux. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’un médicament à l’âge de 4 jours, 8 jours ou 13 jours pour rétablir la différentiation des spermatogonies. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’anesthésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique. Etape finale de mise à mort réalisée entre l’âge de 9 jours et 14 jours. Les souris sous anesthésie sub-létale/profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Nous générons des souris porteuses d’une mutation restreinte à un type cellulaire du testicule et aucun phénotype dommageable n’est attendu ; le phénotype attendu se limitant à une stérilité non obstructive chez les mâles. Une biopsie de la queue est réalisée pour le génotypage. L’administration de substances entraîne une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau.

Devenir

Après la réalisation du génotypage, les mâles ne présentant pas le génotype d'intérêt (contrôles non mutants) seront exclus de la procédure et euthanasiés sans prélèvement (1/2 des mâles). Tous les animaux mutants sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les testicules.

Remplacement

La spermatogenèse est un processus complexe impliquant divers types cellulaires du testicule. Les interactions entre les cellules somatiques et germinales sont cruciales pour assurer une production continue de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le rôle de l'acide rétinoïque dans le maintien de ces interactions cellulaires dans un contexte physiologique. Il est important de souligner que l'utilisation d'une approche expérimentale avec des animaux est indispensable pour répondre à ces questions. Un remplacement par un système in vitro (conformément au 1e R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires est calculé de manière précise pour répondre aux exigences de réduction de l'utilisation d'animaux, tout en garantissant la qualité des résultats et la robustesse de leur validité statistique. Étant donné que notre étude se focalise sur la spermatogenèse, seuls les mâles (représentant statistiquement la moitié des naissances) sont inclus dans les expériences. Les traitements sont administrés exclusivement aux mâles mutants préalablement sélectionnés par génotypage. Les mâles mutants représentent la moitié des individus produits par les croisements, et cette proportion ne peut être augmentée. Les testicules controlatéraux de chaque mâle sont utilisés pour évaluer l'efficacité des traitements. Les deux testicules sont fixés de manière distincte et servent à deux voire trois types d'analyses, ce qui s'aligne parfaitement avec le 2e R de la règle des 3R en réduisant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans le souci du bien-être des animaux, une surveillance constante de leur état de santé est assurée. En cas de souffrance ou de modification de leur comportement, des mesures correctives sont rapidement prises en concertation avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire. Les animaux étudiés présentent des mutations dans les cellules de Sertoli du testicule, ce qui ne cause aucune souffrance car le phénotype attendu se limite à la stérilité non obstructive des mâles. Ce génotype d'intérêt concerne la moitié des mâles produits avec les croisements en place, et cette proportion ne peut être augmentée. Les procédures débutent par l'identification des mâles et la biopsie de queue pour le génotypage. Ces étapes sont effectuées avant l'administration du médicament, permettant ainsi une sélection visant exclusivement les animaux mutants d'intérêt. Ainsi, le raffinement (conformément au 3e R de la règle des 3R) est pleinement intégré dans notre projet.

Choix des espèces

La petite taille de la souris, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, font d’elle un modèle animal de choix pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome : temps de génération court ; génome connu, outils moléculaires). D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre qui impliquent la voie de signalisation de l’acide rétinoïque sont conservés chez l’Homme. Nous identifions et génotypons tous les souriceaux mâles âgés de 1 à 10 jours pour choisir les mâles mutants qui seront traités par la suite. Les souris contrôles (non mutantes) dont le génotype n'est pas compatible à la suite de la procédure sont euthanasiées. Nous déclenchons la différenciation de toutes les spermatogonies à l'âge de 4 jours, 8 jours ou 13 jours en utilisant une méthode pharmacologique. Ces périodes correspondent aux moments où les gènes codant pour les récepteurs de l’acide rétinoïque commencent à s'exprimer, permettant une comparaison pertinente entre les moments d'expression et les moments d'administration des traitements. Nous analysons la différenciation des spermatogonies 24 heures après le traitement.

Pour tester si une thérapie photodynamique à base de ruthénium déclenche une réponse immunitaire contre les tumeurs, 384 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin du projet. Elles reçoivent deux injections sous la peau à une semaine d'intervalle, d'abord des cellules tumorales tuées en laboratoire, puis une greffe de tumeur. Le porteur écrit attendre l'apparition de tumeurs "au moins dans les groupes témoins", avec nécrose, inflammation au point d'injection et difficulté à se mouvoir. Il ne retient pour les injections elles-mêmes qu'un stress de contention, et justifie le chiffre de 384 par la seule affirmation qu'il a été "réduit au maximum".

Objectifs

Les cancers de la gorge sont traditionnellement traités par chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. Pour trouver des traitements moins toxiques, nous explorons la thérapie photodynamique, qui utilise des médicaments sensibles à la lumière (photosensibilisants) activées par un laser. Ce projet vise à montrer que des dérivés chimiques du métal nommé Ruthénium Ru, activables par la thérapie photodynamique, peuvent déclencher une mort cellulaire spécifique et une réaction du système immunitaire contre les tumeurs. Pour valider notre hypothèse, des tests de vaccination de souris seront effectués. Cette approche est reconnue par la communauté scientifique comme une méthode fiable et robuste pour démontrer l'effet immunitaire du traitement utilisé.

Bénéfices attendus

Cette approche nous permettra d’établir si les protocoles de vaccination que nous avons mis au point sont capables de mobiliser le système immunitaire. Si une action anti-tumorale prophylactique est démontrée, cela permettra d’établir un rationnel solide sur l'induction d'une MCI. Cette mort cellulaire immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter l’efficacité pour des stratégies thérapeutiques futures.

Procédures

Les animaux subiront deux injections d'une durée d’environ 1 minute réalisées sur animal vigile

Impact sur les animaux

Les animaux subiront 2 injections sous-cutanées à une semaine d’intervalle, la première ayant pour but d’introduire des cellules mortes traitées ex vivo, et la deuxième ayant pour but d’effectuer une greffe tumorale. Nous pouvons nous attendre à une nuisance liée au stress de contention occasionné par les injections. En revanche, ces gestes ne devraient pas engendrer de douleur ou de souffrance particulière. Nous nous attendons à observer l’apparition de tumeurs, au moins dans les groupes témoins. La pousse tumorale peut être à l’origine de nécrose et/ou d’inflammations au point d’injection, et de difficulté à se mouvoir.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. En effet, il est nécessaire de pouvoir continuer l'étude en réalisant des analyses au laboratoire à partir des tissus prélevés sur ces animaux.

Remplacement

Après plusieurs travaux in vitro très encourageants, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable. La démonstration de la mobilisation de la réponse immunitaire en réponse au traitement est impossible in vitro, et demande l’utilisation de souris immunocompétentes, chez lesquelles le déclanchement d’une réponse immunitaire anti-tumorale est réalisable par des expériences de vaccination. Ainsi, les enjeux de ce projet sont la démonstration de l’efficacité in vivo de cette modalité thérapeutique, qui pourra à terme trouver une application dans l’amélioration de la prise en charge des patients. La démonstration de la capacité de notre protocole de traitement à induire une mort cellulaire immunogène complète nécessite des éléments de preuves in vivo, chez des modèles murins immunocompétents, à travers des expériences de vaccination. Cette approche est la seule admise dans la littérature permettant de prouver la mobilisation du système immunitaire et la constitution d’une mémoire immunitaire anti-tumorale.

Réduction

Le projet nécessitera un nombre maximum de 384 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnettes). Les animaux bénéficieront de deux semaines d’acclimatation et d’habituation. Les animaux sont surveillés quotidiennement comme l'exige la réglementation en vigueur. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites ont été établis (taille et aspect de la tumeur) permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.

Choix des espèces

Les lignées cellulaires utilisées ont initialement été générées à partir de souris. Afin d’éviter des phénomènes de rejet de greffe (dans la mesure où la procédure de vaccination décrite dans ce projet requiert l’utilisation d’animaux dont le système immunitaire est actif), il est indispensable que les lignées cellulaires et l'organisme entier utilisé pour cette étude aient le même fond génétique. Ces souris auront un âge de 6 à 8 semaines, qui correspond à la période de maturité du système immunitaire

402 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie cérébrale de deux heures trente sous anesthésie gazeuse, puis des tests que le porteur détaille, mesure de l'activité locomotrice pendant 24 heures en cage individuelle, test d'anxiété de dix minutes, et séances répétées de nage en labyrinthe aquatique à 21 degrés pour évaluer la mémoire à long terme. Le porteur reconnaît que l'isolement de 24 heures est une source de stress et que l'eau à 21 degrés provoque une sensation de froid. Il justifie le choix du rat par des capacités cognitives élaborées et un répertoire comportemental complexe, arguments qui décrivent aussi ce que ces individus ont à perdre.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier les structures cérébrales qui permettent aux souvenirs de persister dans le temps. Cette capacité est largement diminuée dans un grand nombre de pathologies cérébrales, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie à Corps de Levy, le syndrome de Korsakoff mais également dans des troubles psychiatriques tels que la schizophrénie ou encore la dépression. Pour maintenir les souvenirs, une réorganisation progressive de l’information dans des structures cérébrales qui soutiennent la mémoire à long terme, telles que l’hippocampe et le cortex préfrontal médian est nécessaire. Cette réorganisation semble également engager un relais thalamique de la ligne médiane du cerveau. Nos expériences chez le Rat vont nous permettre de comprendre le rôle de ce relai thalamique, et à quel moment de la réorganisation du souvenir il est nécéssaire. Nous questionnerons nos animaux gràce à des taches de comportement qui testent le souvenir de leur environnement spatial.

Bénéfices attendus

En utilisant une espèce animale avec de bonnes capacités d'apprentissage et de mémoire , le Rat, ce projet va nous permettre de mieux comprendre les mecanismses cérébraux de persistence des souvenirs anciens. Cette fonction mnésique représente un des socles de la cognition animale et humaine. Notre compréhension de ces processus neurobiologiques de la mémoire alimente nos seulement des domaines appliqués tels que la modélisation, les théories de l’apprentissage, les sciences de l’éducation mais aussi ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles ouvriront une piste de cible cérébrale nouvelle et précise pour comprendre les deficits de memoire chez l’Homme.

Procédures

Une chirurgie cérébrale sera réalisée sur tous les animaux de ce projet, sous anesthésie gazeuse contrôlée et continue pendant 2h30. Une analyse comportementale sera réalisée sur une cohorte de 120 animaux vigiles sur une période de 55-60 jours/animal. Ces analyses nous permettront d'étudier le phénotype locomoteur (1 seance de 24h dans un environnement où les mouvements sont quantifiés), l’anxieté (1 séance de 10 min), les capacités de flexibilité cognitive (6 séances, composées chacune de 4 x 1 min dans un environnement aquatique) ou de mémoire à long terme (9+1 séances composées chacunes de 4 x 1 min dans un environnement aquatique). Ces tests auront une durée de 1 à 9 jours consécutifs et seront séparés les uns des autres de 2 jours en moyenne. Une autre cohorte de 252 animaux vigiles participera à l'étude des différentes phases de la consolidation de la mémoire à long terme sur une période de 9 séances consécutives + 1 séance de rappel 5 ou 25 jours après (chaque séance est composée de 4 x 1 min dans un environnement aquatique).

Impact sur les animaux

Pour nos procédures, nous attendons un inconfort suite à la chirurgie intracérébrale. La douleur et l’inconfort pendant la chirurgie seront pris en charge par les anesthésiques, les antidouleurs locaux et la couverture anti-inflammatoire, prolongée après la chirurgie. Les animaux seront observés minutieusement et quotidiennement après la chirurgie par les expérimentateurs formés pour détecter des signes d’inconfort prolongé et les traiter. Suite aux expérience de comportement dans les labyrinthes aquatiques (21°) une sensation de froid peut être générée, mais seulement pour un temps court (1 min). Les animaux s’habituent et nagent très vite se qui raccourcit le temps dans l’eau pendant les phase d’apprentissage à moins de 20 sec. Ils sont ensuite séchés et réchauffés rapidement à la sortie de l’eau avant de retrouver leur cage habituelle et leurs congénères. Les rats seront isolés 24h dans des cages pour mesurer l'activité générale individuelle. Cette phase peut entrainer une nuisance d'isolement social, et peut conduire à un stress durant cette courte periode d'isolement. Pour limiter l'impact de cet isolement social les cages individuelles seront disposées de façon à maintenir le contact visuel, sonore et olfactif avec les congénères et un baton à ronger sera ajouté dans chaque cage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses des tissus post-mortem.

Remplacement

Ce projet étudie une fonction cognitive telle que la réorganisation des souvenirs pour les maintenir à très long terme, il ne peut pas être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être modélisé par l’informatique et l’I.A. Notons que les modèles murins possèdent des fonctions cérébrales proches de l’Homme, et que les processus pathologiques impliquant la mémoire sont particulièrement étudiés chez ces animaux. Ces modèles récapitulent également des altérations fonctionnelles de l’Homme comme celles de la maladie d’Alzheimer ou même de la schizophrénie. Les études chez le rat représentent ainsi des opportunités uniques pour l'étude de fonctions cognitives essentielles et pour l’ouverture vers de nouvelles approches thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes d’animaux expérimentaux avec leurs contrôles pertinents. L’impact de chaque traitement sera mesuré à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs faits tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Enfin, nous avons établi une progression dans les expériences qui nous permettra de ne pas réaliser les expériences suivantes si une cohorte d’animaux suffit à valider ou à invalider une de nos hypothèses de travail.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ils seront maintenus en groupe de 3 tout au long de ces procédures. Une exception pour le test d’activité locomotrice concernant 120 rats qui seront hébergés dans des cages individuelles pour 24h uniquement. Tous les rats bénéficieront de soins appropriés pour optimiser leur bienêtre et un élément (barre à ronger) est renouvelé dans les cages. Une observation soutenue du comportement spontanée dans la cage avec les congénères ou du comportement évoqué en interaction avec les expérimentateurs sera réalisé. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir tout au long des procédures et particulièrement pendant ou après la chirurgie cérébrale. Les rats sont habitués à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors des expériences de comportement.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle Rat car il possède des capacités cognitives élaborée et un répertoire comportemental complexe. La question cognitive posée requiert un modèle animal possédant une structure neuro-anatomique comparable à celle du cerveau humain, c'est le cas du Rat, mais pas des organismes plus simples tels que c elegans, drosophila, zebra fish. Les structures cérébrales impliquées dans la réorganisation et le maintien du souvenir sont aussi celles qui sont sujettes à des dysfonctionnements et des dégénérescences dans le cadre de pathologie cérébrale et mentale telles que la maladie d’Alzheimer, mais aussi le stress post-traumatique ou la dépression, qui ont en commun de présenter des déficits de la cognition et de la mémoire en particulier. Les animaux arriveront à l'age de 7 semaines pour etre en expérimentation entre 9 et 18 semaines, soit le stade jeune adulte.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une séquence d'ultrasons destinée à ouvrir temporairement la barrière qui protège le cerveau, une injection intraveineuse par cathéter posé dans la veine de la queue, et des séances d'imagerie sous anesthésie de deux heures répétées jusqu'à deux fois par semaine. Le porteur indique que l'ouverture de cette barrière provoque de légers dommages cérébraux dans moins de 10 % des cas, avec des douleurs transitoires possibles. Il présente les ultrasons comme un "espoir majeur" pour des maladies génétiques cérébrales sans traitement, alors que le projet se limite à évaluer le passage de particules virales et l'état du cerveau après traitement.

Objectifs

La principale limite à l'efficacité des thérapies dans le cerveau est leur accès restreint en raison de la barrière protégeant le cerveau de tout élément pouvant être toxique, mais limitant aussi le passage de la majorité des médicaments. Récemment, une technique utilisant des ultrasons a attiré l'attention en tant que moyen non invasif pour perturber temporairement cette barrière. Les ultrasons permettent de perturber cette barrière à travers le crâne et donc sans opération chirurgicale nécessaire. Dans cette étude, nous évaluerons chez la souris le potentiel thérapeutique de cette approche. En plus des données que nous obtiendrons avec des séances d'imagerie médicale, reflétant le caractère réversible ou non de l’ouverture de la barrière, nous évaluerons la durée d'efficacité du traitement. Enfin, nous étudierons les modifications provoquées dans le cerveau après avoir reçu une onde ultrasonore afin d’en évaluer l'intégrité après traitement.

Bénéfices attendus

Les ultrasons représentent un espoir majeur de traitement de nombreuses pathologies cérébrales tel que les maladies génétiques. Des essais cliniques utilisant cette technique chez l'homme sont en cours. Nous souhaitons ici évaluer des approches plus performantes que les traitements habituels et profiter d'une délivrance par ultrasons. Avec le développement en cours des ultrasons chez l'homme, les méthodes que nous proposons pourraient bénéficier d'un transfert rapide vers l'homme. Dans le cas de maladies génétiques, nous souhaitons évaluer le potentiel des ultrasons pour administrer un traitement efficace et durable dans le cerveau. Cette approche pourrait permettre de corriger, au niveau génétique, des anomalies au niveau cérébral, ce qui représente un espoir conséquent pour les personnes atteintes de ce type de maladie, qui ne disposent à ce jour d'aucun traitement efficace, à l'exception de traitements de leurs symptômes.

Procédures

Tous les animaux seront exposés à une séance d'imagerie médicale anatomique pour une durée maximale de 2h, anesthésie incluse. Pour les besoins de l'imagerie médicale effectuée dans ce projet, une partie des animaux recevront une injection permettant d'améliorer la qualité de l'image. Tous les animaux recevront une séquence ultrasonore ainsi qu'une injection intraveineuse de notre traitement. Tous les animaux seront également exposés à des séances d'imageries servant à évaluer l'efficacité du traitement et nécessitant une injection dans l'abdomen, ces séances pouvant être répétées jusqu'à 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

De possibles douleurs transitoires pourraient apparaître suite à l’apparition de légers dommages dans le cerveau provoqués par l'ouverture de la barrière le protégeant, visualisables par imagerie médicale (fréquence observée inférieure à 10%). Notre protocole nécessite une pose de cathéter dans la veine de la queue, ainsi que des injections dans l'abdomen qui seront réalisées sous anesthésie générale, présentant des contraintes de classe légère pour les animaux et n’engendre pas de souffrance ou de stress. Le transport entre les laboratoires du projet peut également générer un léger stress ou inconfort chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'en analyser les tissus.

Remplacement

Le projet portant sur l’étude de la réponse du cerveau, et plus particulièrement la barrière le protégeant, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. De plus, il n'existe pas à ce jour de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent l'étude du passage de particules virales à travers cette barrière grâce aux ultrasons. L’étude qui en découle comporte des analyses du cerveau afin d'évaluer l’impact cellulaire des ultrasons qui ne sauraient être remplacées par un modèle informatique ou cellulaire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer. Ce nombre tient compte des risques de mort et d’exclusion d’un animal lors des différentes procédures. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats. Le suivi de l'efficacité du traitement se faisant sur plusieurs semaines pour chaque animal, notre étude nécessite très peu de groupes de souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'Annexe II du premier février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie adaptée, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué lors des séances d'imagerie médiale et de traitement par ultrasons. L'imagerie médicale nous permettra également de visualiser l'apparition d'éventuel dommage au cerveau avant le réveil de l'animal, permettant une administration préventive d'un analgésique dans ce cas. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir des points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal. De plus, dans le cas où certains signes de douleurs seraient observés, sans dépassement des points limites, un traitement sous-cutané avec un analgésique sera mis en place.

Choix des espèces

L’ensemble des animaux utilisés seront des souris à l'âge adulte, soit à partir de 6 semaines. Nous avons optimisé les protocoles pour des animaux de ce calibre, ce qui nous permettra un transfert sans difficulté pour ces expérimentations.

Blessés volontairement par brûlure, découpe d'un morceau de peau ou délabrement cutané, 100 cochons et 50 moutons seront tous tués pour autopsie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une ou deux chirurgies pouvant durer plusieurs heures, des prélèvements sanguins jusqu'à une fois par semaine et un jeûne de douze à vingt-quatre heures avant chaque anesthésie, avec une douleur post-opératoire que le porteur annonce sur plusieurs jours. Le nombre d'animaux a été fixé sans calcul de puissance, le porteur écrivant qu'"aucune approche statistique n'a été réalisée". Il justifie le choix de ces espèces par une anatomie de taille comparable à celle de l'humain et qualifie l'expérimentation sur l'"organisme entier" d'"incontournable" et d'obligation réglementaire.

Objectifs

La cicatrisation cutanée est un phénomène complexe au cours duquel des évènements dermiques et épidermiques sont étroitement impliqués. Cette capacité de réparation tissulaire peut être compromise en condition pathologiques (plaies du diabétique, escarres, accident radiques, maladies génétiques, etc…). De nombreuses stratégies ont besoin d’être améliorées et de nouvelles approches sont proposées pour stimuler la cicatrisation, diminuer les complications et la douleur. Le projet de recherche a pour objectif de valider de nouvelles approches innovantes, l’apprentissage des personnels de santé, et le développement de nouvelles stratégies pouvant réduire le traumatisme tissulaire, améliorer le diagnostic et pallier une dysfonction de la réparation du tissu cutané. L’évaluation et le développement des nouveaux dispositifs, molécules et techniques pour la réparation des tissus cutanés, nécessite une phase de recherche et développement. Les différentes itérations de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale dans un contexte qui reproduit fidèlement le contexte clinique, fonctionnel et anatomique / tissulaire qui sera celui visé par les applications chez les patients. Ainsi la phase initiale du projet s’appliquera à raffiner les prototypes afin de pouvoir en geler les versions jugées efficaces et sécuritaires. Ces versions ultimes entreront ensuite dans la phase règlementaire du projet en vigueur.

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes : - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'évaluation de dispositif en réparation cutanée avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'évaluation de dispositif en réparation cutanée associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim, lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 24 heures pour les ovins/caprins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif ou de la méthode de réparation cutanée, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type anastomose, création d'un defect tissulaire, brûlure, délabrement cutané, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs et techniques testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Le nombre d'études intéressant ce projet a été estimé jusqu'à une dizaine impliquant chacune une douzaine d'animaux. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs doivent être testés sur une anatomie semblable à celle de l’Homme (de l’enfant à l’adulte de grande taille), cela impose l’expérimentation sur des gros animaux. Les différences interspécifiques tissulaires, anatomiques et fonctionnelles nécessitent différentes espèces pour optimiser l’expérimentation. L’évaluation des différents dispositifs du projet se fera uniquement sur le modèle animal préalablement identifié comme le plus pertinent : Les ovins pour la durabilité des stratégies opératoires des dispositifs testés. Ses intérêts principaux sont sa croissance limitée et sa robustesse. Les porcins pour la durabilité de l’ancrage des dispositifs (feuillets valvulaires épais par exemple pour les dispositifs cardiaques). Ils sont utilisés pour la robotique digestive. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

59 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour le volet mené dans le premier des deux établissements de ce projet. Une chirurgie de 45 minutes ouvre un orifice d'un millimètre dans le crâne pour injecter dans le cervelet un vecteur produisant une molécule inflammatoire, puis cinq injections abdominales suppriment les cellules régulatrices de l'immunité. Le porteur indique un stress modéré lié aux manipulations répétées, une douleur post-opératoire possible sur la zone suturée et une perte de poids qui pourrait atteindre le point limite en cas de toxicité de la molécule. Il justifie le projet par la rareté des échantillons de patientes et affirme qu'"aucune méthode alternative" ne permet de satisfaire le remplacement.

Objectifs

La pathologie qui fait l’objet de cette étude est caractérisée par une dégénérescence des neurones du cervelet. Les symptômes associés sont des troubles de l’équilibre et de la coordination conduisant à un handicap sévère en quelques mois. Elle touche principalement des femmes atteintes d’un cancer gynécologique (ovaire, sein). Chez ces patientes, le système immunitaire normalement responsable de détruire la tumeur, s’attaque également aux neurones du cervelet et les détruisent. Le diagnostic est confirmé par la détection d’anticorps présents dans le sang et dans le cerveau dont la caractéristique est de reconnaître les neurones du cervelet ainsi que la tumeur des patientes. La théorie en vigueur suppose que la tumeur est responsable de l’activation du système immunitaire et par des mécanismes encore mal compris, le système immunitaire va également s’activer dans le cerveau et détruire les neurones du cervelet. Afin d’étudier les mécanismes à l’origine de la pathologie, le recours à un modèle animal est indispensable à cause de la rareté des échantillons disponibles auprès des patients. Ce modèle permettra des analyses plus approfondies depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. L’objectif est donc de développer un modèle de la maladie chez la souris qui soit au plus proche de la maladie humaine. A ce stade l’objet de cette demande d’autorisation est d’évaluer et valider 2 méthodologies qui seront employées pour modéliser la maladie chez la souris. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Grâce à la modélisation de la maladie chez la souris, l’identification des mécanismes qui conduisent à l’activation des défenses immunitaires contre les neurones du cervelet permettra à terme de développer une thérapie efficace pour guérir les femmes atteintes par la maladie.

Procédures

Interventions réalisées à l’EU1 : -En début de protocole une chirurgie d’environ 45 minutes est réalisée sous anesthésie et analgésie pour l’injection dans le cervelet, à travers un orifice minime d’un millimètre dans l’os cranien, d’un vecteur capable de faire sécréter une molécule inflammatoire localement par les cellules immunitaires. -Un prélèvement de sang est effectué en quelques secondes sur animal anesthésié avant mise à mort. -Cinq injections d’une molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité seront faites par voie abdominale sur 2 semaines à 3 jours d’intervalle. Intervention réalisée à l’EU2 : une injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral est réalisée sous analgésie et anesthésie profonde sans réveil.

Impact sur les animaux

-Stress modéré induit par la manipulation répétée des animaux et leur contention -Une perte de poids engageant le point limite pourrait survenir dans le cas d’une toxicité de la molécule employée pour induire la suppression des cellules régulatrices de l’immunité. -stress lié à la contention pour réaliser le prélèvement de sang au niveau du sinus de l’oeil -douleur causée par les actes invasifs lors de la chirurgie sous anesthésie -Stress post-opératoire (physique, thermique, nutritionnel) et douleur potentielle sur la zone cutanée après suture. -Un état fébrile ou une perte de mobilité pourraient être induits si l’inflammation est trop disséminée dans le cerveau. Elle devrait néanmoins rester localisée car l’injection est faite localement dans le cervelet et pas en intra-veineuse. -douleur causée par les actes invasifs nécessaires à l’injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral sous anesthésie profonde sans réveil

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Procédure N°1 : Les animaux seront mis à mort pour contrôler et analyser l’efficacité et la durée de la suppression des lymphocytes régulateurs de l’immunité. Procédure N°2 : Les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse du cervelet afin de valider la production intra-cérébelleuse d’une molécule pro-inflammatoire.

Remplacement

La maladie neurologique qui nous intéresse est caractérisée par la perte des neurones du cervelet et reste encore mal comprise. Les analyses possibles à partir des biopsies des patients sont très réduites de par la rareté de la maladie et concernent essentiellement les liquides biologiques (sérum, liquide céphalorachidien), et les tumeurs. Les biopsies de cerveau n’ont fourni que des informations sur la phase terminale de la maladie. Seul l’impact des anticorps sur le fonctionnement des neurones a pu être étudié sur coupe fraîche de cervelet de rat, mais l’effet observé n’est pas confirmé à l’échelle de l’animal. L’objectif de notre modèle est d’accéder aux mécanismes de la réponse immunitaire qui est dirigée initialement contre la tumeur pour en comprendre le rôle dans l’inflammation du système nerveux central. Aucun modèle cellulaire actuel ne permet de récapituler ces éléments de manière concomitante in vitro. Un modèle animal est donc indispensable pour atteindre nos objectifs et permettra une analyse complète depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance.

Réduction

Notre protocole vise à évaluer la fonctionnalité biologique de nos méthodologies et à déceler d’éventuels effets indésirables sur les capacités motrices de nos souris. En préambule, la qualité de 2 lots de molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité sera évaluée grâce à un effectif réduit à 6 animaux contrôles sans consommer inutilement l’effectif total prévu aux tests en cas de toxicité d’un lot. Pour assurer la significativité des résultats obtenus aux tests de motricité, un effectif minimum de 16 animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique de puissance pour chacune des 2 méthodologies. Avant la réalisation des tests de motricité, 3 ou 4 animaux supplémentaires devront être mis à mort à 3 moments clés pour réaliser les analyses biologiques et évaluer la fonctionnalité de la méthodologie employée. Ces moments clés ont été choisis sur la base des études publiées sur nos méthodologies et réduites au minimum sans compromettre le but visé en sus. De plus, les animaux employés aux tests de motricité serviront à un 4ème et dernier point d’analyse qui viendra compléter en terminal les 3 points d’analyse précédents. Ainsi aux 16 animaux précédemment mentionnés, s’ajoutent 12 animaux pour la 1ère méthodologie et 9 animaux pour la 2ème. Ainsi sont nécessaires au projet un total de 34 (6+16+12) et 25 (16+9) animaux, soit 59 animaux.

Raffinement

-Pour limiter le stress des animaux, les souris sont habituées quotidiennement à l’expérimentateur pendant une semaine avant le début de l’expérimentation (5 min par animal. -Une surveillance accrue du bien-être de l’animal grâce à un système de scorage permettra d‘anticiper la perte de poids, de la mobilité et du toilettage pour anticiper au maximum la survenue des points limites. -Une phase d’habituation aux tests de motricité est réalisée sur 4 jours. Une récompense type céréale est donnée en fin de test. Une cage refuge permet de réduire le stress de la traversée sur barre. Les appareils sont nettoyés pour éviter un stress lié à l’odeur des animaux précédents. - des animaux morts n’ayant subi aucune procédure expérimentale seront utilisés pour la mise au point des protocoles d’analyse avec des prélèvements effectués en post-mortem, et pour l’entrainement aux gestes de la chirurgie -Le prélèvement de sang dans le sinus de l'oeil est réalisé avant la mise à mort sous anesthésie gazeuse pour réduire le stress et la souffrance de l’animal. La chirurgie est réalisée sous analgésie sur animaux anesthésiés. Après induction de l’anesthésie, les griffes des animaux sont écourtées pour éviter les infections par grattage de la zone suturée en post-opératoire. Des soins post-opératoires sont appliqués : l’animal est placé dans une enceinte chauffée à une température de 36-38°C pour un réveil optimal en cage individuelle pendant 24h avec mise à disposition facilitée de nourriture (pâté de croquettes humidifiées) et de boisson (en gelée) renouvelées les 2 jours suivants, et avec du matériel de nidification neuf pour contrôler le maintien d’un comportement stéréotypé. L’injection d’analgésique sera répétée les jours suivant. Une surveillance du bien-être sera effectuée les heures suivant le réveil et quotidiennement les jours suivants grâce à une grille de scorage jusqu’à la cicatrisation, puis 2 fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. Selon l’évolution de la cicatrisation, on appliquera de la crème cicatryl ou dermaflon sur la zone suturée pendant 3 jours. En point final, tous les prélèvements seront effectués après la mise à mort.

Choix des espèces

La souris sera utilisée en raison de l’abondance de littérature sur ce modèle couramment utilisé pour l’étude des pathologies neurologiques. En effet, il s’agit d’une espèce dont l’architecture cérébrale est proche de l’architecture du cerveau humain. La souris est également un bon modèle car il existe un répertoire important de cellules cultivées au laboratoire capables de former une tumeur chez la souris. Il existe aussi de nombreuses lignées de souris génétiquement modifiées, comme celle que nous utilisons pour manipuler le système immunitaire qui nous aidera à comprendre les mécanismes pathologiques responsables de la maladie. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 à 8 semaines car elles sont sexuellement matures et ont presque atteint leur taille définitive.