Procédures modérées

Les souris sont tuées quand leur tumeur atteint un centimètre cube. Elles sont 210, immunodéficientes, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales et subit dix-huit mesures au pied à coulisse, 150 d'entre elles recevant trente injections intrapéritonéales en un mois et trente autres jusqu'à trente-huit, la tumeur sous-cutanée croissant sur trois à quatre semaines avec dos voûté, activité réduite et pelage moins soigné. Le porteur cherche à savoir si le blocage d'une protéine ralentit cette croissance et présente ces travaux comme une réponse à un "besoin médical pour les patients en impasse thérapeutique", perspective qu'il renvoie à une exploration clinique ultérieure.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine impliquée dans la progression du cancer du rein à cellules claires. Pour cela, nous utilisons des modèles expérimentaux murins permettant de reproduire la formation et la croissance de tumeurs afin d’étudier l’impact de cette protéine sur leur développement. L’objectif est de déterminer 1) si l’augmentation de cette protéine conduit à une croissance tumorale plus rapide, 2) si le blocage de cette protéine, à l’aide de nouveaux traitements utilisés seuls ou en association, permet de ralentir la croissance des tumeurs.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient contribuer à développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes à explorer cliniquement, répondant à un besoin médical pour les patients en impasse thérapeutique avec les thérapies actuelles pour le cancer du rein.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur animaux vigiles : 210 animaux : 1 injection de cellules tumorales (2 minutes) + 18 mesures de la taille tumorale au pied à coulisse (1 minute) ; 150 animaux : 30 injections en intrapéritonéale sur 1 mois (30 secondes) ; 30 animaux : 38 injections en intrapéritonéale sur 1 mois (30 secondes)

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter des effets liés à la croissance de la tumeur sous-cutanée, apparaissant progressivement sur une durée maximale d’environ 3 à 4 semaines. Cette croissance peut entraîner une gêne modérée se traduisant par une diminution de l’activité, une altération de la posture (dos voûté), une diminution de l’état général et un aspect moins soigné du pelage. À un stade plus avancé, des modifications locales au niveau de la tumeur peuvent apparaître, telles qu’une tension cutanée ou une rougeur. Les administrations répétées de traitements peuvent provoquer une gêne légère et transitoire au moment des injections, associée à un stress de courte durée lié à la manipulation des animaux. La contention nécessaire aux manipulations et au suivi peut également entraîner un stress léger et temporaire. Ces effets sont transitoires pour les manipulations et progressifs pour la croissance tumorale, qui constitue la principale source de gêne au cours de l’étude.

Devenir

Les animaux seront mis à morts pour effectuer des prélèvements lorsque la tumeur atteint 1 cm3.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de reproduire de manière complète les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement dans un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle murin reste donc nécessaire pour étudier la croissance tumorale et la réponse aux traitements dans des conditions proches de la réalité biologique. Les approches in vitro sont indispensables en amont mais ne permettent pas, à elles seules, de modéliser l’ensemble de ces interactions.

Réduction

Avant la mise en place du modèle in vivo, toutes nos expériences impliquant la surexpression et l’inhibition génétique ou pharmacologique de notre protéine d’intérêt ont été validées in vitro. Les doses et modalités d’administration ont été choisies sur la base de protocoles publiés et de données expérimentales antérieures, après revue de la littérature. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous appuyons sur ces données pour définir les conditions expérimentales. La planification des expériences inclut également la mutualisation de certains groupes témoins afin d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Les analyses statistiques seront réalisées pour évaluer les effets des traitements, avec des effectifs adaptés pour permettre la détection des différences attendues.

Raffinement

Les souris immunodéficientes seront hébergées en cages ventilées individuellement sur portoirs adaptés afin d’assurer leur protection et de limiter le stress. Les expérimentateurs procéderont à une évaluation régulière (3 fois par semaine) de l’état général des souris à l’aide d’une grille de score, permettant de détecter toute altération du bien-être, notamment des changements de posture, de mobilité, de poids ou d’aspect général. Les points limites sont définis dans chaque procédure afin de permettre une intervention rapide si nécessaire et garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme modèle expérimental car elle permet d’étudier la croissance tumorale et la réponse à de nouveaux traitements dans un organisme entier. Ce modèle est largement utilisé en recherche biomédicale en raison de la proximité de certains mécanismes biologiques avec l’humain et de la disponibilité de modèles reproductibles pour le type de cancer étudié. Les animaux utilisés sont des souris jeunes adultes âgées de 6 à 8 semaines à leur arrivée, correspondant à des animaux ayant atteint leur maturité sexuelle et présentant une physiologie stable, ce qui permet de limiter la variabilité entre individus et d’assurer la comparabilité des résultats expérimentaux.

Établir un lien causal entre le tissu adipeux intramusculaire et le métabolisme du glucose conduit à utiliser 2 232 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de glycérol ou de cardiotoxine dans le quadriceps sous anesthésie pour provoquer une lésion musculaire, des gavages quotidiens pendant cinq jours, des injections intrapéritonéales et des prélèvements sanguins caudaux allant jusqu'à 130 microlitres cumulés, une partie étant soumise à un régime enrichi en lipides dont le porteur écrit que l'inconfort "pourrait durer plusieurs semaines". La fonction musculaire est évaluée par trois tests nommés, agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant, et les souris sont tuées par groupes d'âge, à 2-3, 6-7, 12-13 ou 18-19 mois, pour la récolte des tissus. Le porteur écrit qu'un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre ici et qu'il s'est appuyé sur ses "habitudes expérimentales" pour fixer l'effectif.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 3 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans les établissements utilisateurs 1 ou 3, la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux des établissements utilisateurs (EU1 et 2) (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

Les femelles gestantes opérées sont tuées après le sevrage de leurs portées, et leur descendance après prélèvement du cerveau : 3 129 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À 13,5 jours de gestation, chaque femelle subit sous anesthésie générale l'ouverture de la cavité abdominale, l'exposition des cornes utérines, une injection dans le cerveau des embryons et une électroporation, en trente minutes au maximum. Les souriceaux ainsi porteurs d'un médulloblastome reçoivent, pour une partie d'entre eux, deux injections par jour en contention entre le quatrième et le quatorzième jour de vie, et le porteur annonce des pertes embryonnaires, une croissance ralentie et des troubles neurologiques aux stades avancés. Il écrit que la mise à mort de l'ensemble des souris est justifiée par "la nécessité scientifique des analyses réalisées, l'impossibilité de réutilisation et la prise en compte prioritaire du bien-être animal".

Objectifs

Le médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente chez l’enfant et représente environ 20 % des cancers du système nerveux central pédiatrique. Il est lié à une croissance anormale de certaines cellules du cervelet, une région du cerveau impliquée dans la coordination des mouvements et l’équilibre. Normalement, ces cellules se développent de manière contrôlée au cours de l’enfance puis arrêtent de se multiplier. Lorsque ce processus est perturbé, elles peuvent se multiplier de façon excessive et former une tumeur. Des travaux récents suggèrent que des mécanismes moléculaires liés au développement normal du cerveau, ainsi que l’activité des neurones, pourraient influencer la croissance de ces tumeurs. Mieux comprendre ces interactions est essentiel pour progresser dans la compréhension de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition et la progression du médulloblastome. Il vise à mettre en place un modèle expérimental chez la souris permettant d’étudier le développement de cette tumeur, à identifier les mécanismes moléculaires qui contrôlent la croissance des cellules tumorales, à étudier le rôle de l’activité des cellules nerveuses dans l’évolution de la tumeur et enfin, à explorer les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement dans le cervelet. Les résultats permettront d’améliorer la compréhension de cette maladie et pourraient contribuer, à long terme, à l’identification de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente chez l’enfant. Bien que des traitements existent, ils peuvent entraîner des effets secondaires importants et ne sont pas toujours efficaces à long terme. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent l’apparition et la croissance de ces tumeurs afin d’améliorer leur prise en charge. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur la manière dont certaines cellules du cervelet deviennent tumorales et sur les facteurs qui influencent leur prolifération. En particulier, il vise à mieux comprendre le rôle de l’environnement et l’activité des cellules nerveuses et tumorales dans l’évolution de la maladie. Les résultats obtenus pourraient contribuer à identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le développement du médulloblastome. À plus long terme, ces connaissances pourraient orienter la recherche vers de nouvelles approches thérapeutiques, potentiellement plus ciblées et mieux tolérées par les patients. Par ailleurs, ce projet présente également un intérêt plus large en biologie, car il permettra d’améliorer la compréhension du développement normal du cervelet, en particulier des mécanismes qui régulent la croissance et la maturation de certains neurones.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’électroporation in utero, ainsi qu’à une procédure terminale de prélèvement des tissus. La procédure principale est réalisée chez des femelles à 13,5 jours de gestation. Cette intervention est réalisée une seule fois par femelle et dure 30 minutes maximum. Elle consiste en une anesthésie générale suivie d’une ouverture de la cavité abdominale, de l’exposition des cornes utérines, d’une injection dans le cerveau des embryons, puis d’une électroporation permettant l’entrée du matériel génétique dans les cellules du cervelet. Elle est suivie d’une phase de récupération et d’un suivi post-opératoire des femelles gestantes. L’intervention sur chaque embryon dure quelques minutes. Chez les animaux du lot d’étude de l’activité neuronale, des injections seront réalisées sur animaux vigiles maintenus par contention, deux fois par jour (en alternant de côté) entre 4 et 14 jours après la naissance, et durent quelques secondes par injection. La procédure terminale correspond à l’injection d’un euthanasiant sous anesthésie générale avant traitement puis prélèvement postmortem des tissus. Cette intervention est réalisée une seule fois par animal et dure une dizaine de minutes.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale afin de réaliser l’électroporation in utero. Cette procédure peut entraîner une douleur post-opératoire modérée, un stress lié à la manipulation, ainsi qu’un risque faible d’infection ou de complication au niveau de la plaie chirurgicale. Chez les embryons manipulés, la procédure peut entraîner des pertes embryonnaires ou une variabilité dans le développement. Après la naissance, les souriceaux peuvent présenter une variabilité de croissance, notamment en raison de la procédure ou de l’efficacité de l’électroporation. Chez les animaux développant une tumeur, des effets indésirables peuvent apparaître au cours de la progression tumorale, tels qu’une diminution de la croissance, une altération du comportement, une réduction de l’activité ou, dans les cas les plus avancés, des troubles neurologiques. Dans le cadre de la modulation de l’activité neuronale, les injections répétées peuvent entraîner un stress léger, ainsi qu’une irritation locale au point d’injection.

Devenir

À l’issue des expériences, l’ensemble des animaux sera mis à mort de manière éthique et conforme à la réglementation en vigueur. Les animaux sont utilisés pour des analyses histologiques et moléculaires nécessitant le prélèvement des tissus cérébraux. Ces analyses impliquent soit une fixation des tissus, soit une extraction de matériel biologique qui ne permet pas le maintien en vie de l’animal. Par conséquent, aucune réutilisation des animaux n’est possible. De plus, le développement tumoral induit dans ce projet peut entraîner, à des stades avancés, une altération de l’état général et du bien-être des animaux. Afin d’éviter toute souffrance prolongée, des points limites stricts ont été définis et toute atteinte de ces critères entraîne une mise à mort immédiate. Les femelles gestantes utilisées pour les procédures chirurgicales ne sont pas réutilisées après les expériences et seront également mises à mort après le sevrage des portées, conformément aux pratiques de bien-être animal. Ainsi, la mise à mort de l’ensemble des animaux est justifiée par la nécessité scientifique des analyses réalisées, l’impossibilité de réutilisation et la prise en compte prioritaire du bien-être animal.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire pour ce projet, car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire de manière fiable le fonctionnement complexe du cerveau en développement et la formation des tumeurs. En particulier, certaines interactions entre les cellules du cerveau et leur environnement, ainsi que l’influence de l’activité des neurones, ne peuvent pas être étudiées correctement en laboratoire sur des cellules isolées. Cependant, afin de limiter autant que possible le recours aux animaux, des expériences préliminaires ont été réalisées sur des cellules en culture et sur des tissus en dehors de l’organisme. Ces approches ont permis de tester et d’optimiser les outils expérimentaux avant leur utilisation chez l’animal. Grâce à cette étape préalable, seules les conditions les plus pertinentes et les plus fiables sont utilisées dans ce projet, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant la qualité des résultats.

Réduction

Le projet a été conçu de manière à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible en garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux a été estimé en tenant compte des contraintes techniques et de la variabilité du modèle étudié. Ce calcul prend en compte les pertes expérimentales attendues, liées à la réussite des gestations et à l’efficacité de la procédure utilisée. Les expériences sont réalisées sur plusieurs portées indépendantes afin d’assurer des résultats représentatifs. Les expériences seront arrêtées dès que le nombre nécessaire d’animaux permettant une analyse fiable sera atteint. Par ailleurs, la méthode utilisée permet de limiter le recours à la création de nouvelles lignées animales qui nécessiteraient la production d'un très grand nombre d'animaux pour très peu d'animaux ayant les bonnes caractéristiques pour l'étude). Plusieurs types d’analyses sont réalisés sur les mêmes animaux, ce qui permet d’obtenir un maximum d’informations à partir de chaque individu.

Raffinement

Les animaux seront suivis attentivement tout au long du projet, en particulier pendant et après les interventions. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale, avec des traitements adaptés pour limiter la douleur et le stress. Des mesures strictes d’hygiène sont appliquées afin de réduire les risques d’infection. Après chaque intervention, un suivi régulier est mis en place pour vérifier l’état général des animaux, leur comportement et leur récupération. Une attention particulière est portée à leur croissance, leur mobilité et à tout signe de gêne ou de douleur. L’état des animaux est évalué à l’aide de grilles de suivi standardisées permettant de détecter rapidement toute altération. Les animaux sont observés au minimum une fois par jour, et plus fréquemment si nécessaire, notamment lorsque la maladie progresse. Si des signes de mal-être apparaissent, des mesures de soutien sont mises en place, comme un accès facilité à la nourriture et à l’eau ou une surveillance renforcée. Des critères clairs ont été définis pour intervenir rapidement si l’état d’un animal se dégrade. Si ces critères sont atteints, l’animal est mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance. Des grilles spécifiques sont également utilisées pour le suivi des femelles après chirurgie.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme modèle expérimental en raison de leur grande pertinence pour l’étude des mécanismes biologiques et des pathologies humaines. Le développement du système nerveux central chez la souris présente de fortes similarités avec celui de l’homme, ce qui permet d’étudier de manière fiable les processus impliqués dans la formation des tumeurs cérébrales. De plus, l’existence de lignées génétiquement modifiées adaptées aux objectifs du projet constitue un atout majeur pour répondre aux questions scientifiques posées. Les animaux seront utilisés à différents stades du développement, en lien direct avec les étapes de la progression tumorale. L’induction tumorale sera réalisée au stade embryonnaire correspondant à 13.5 jours de gestation chez les femelles, période clé du développement des progéniteurs à l’origine des neurones conduisant au type de médulloblastome étudié. Les analyses seront ensuite effectuées à plusieurs stades après la naissance, afin de couvrir les différentes phases de la maladie. L’initiation tumorale et les premiers événements de prolifération neuronale seront étudiés entre 7 et 14 jours après la naissance, la phase intermédiaire de croissance sera étudiée 21 jours après la naissance et la phase tardive caractérisée par des tumeurs établies 60 jours après la naissance.

Deux applications quotidiennes d'une crème inflammatoire sur le dos pendant quatorze jours, chacune avec dix à quinze minutes de contention, puis au quinzième jour une injection intraveineuse de trente minutes sur chaise de contention pendant une quarantaine de minutes : 20 macaques à longue queue vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent quatre prélèvements de sang de 2,5 ml, dix millilitres au total sur trois semaines, et quatre biopsies de peau par macaque sous anesthésie générale, précédées d'un jeûne pouvant aller jusqu'à seize heures. Le porteur attend des lésions cutanées, une fièvre par relargage de cytokines et des hématomes, signale qu'une déhiscence de plaie ou une infection du site de biopsie restent possibles, et projette un documentaire ou un dessin animé sur tablette pendant les contentions pour limiter l'ennui. Tous sont tués à la fin du projet pour que leurs organes soient récoltés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de reproduire une réaction inflammatoire de la peau chez le macaque, similaire à celle observée chez l’Homme dans certaines maladies auto-immunes comme le psoriasis. Pour cela, une crème contenant un principe actif est appliquée sur la peau. Cette substance stimule le système immunitaire local et provoque une inflammation visible, avec des rougeurs, un épaississement de la peau et une infiltration de cellules immunitaires. Ce modèle permettra de tester l’efficacité d’un nouveau traitement. Ce traitement est un anticorps qui cible un type particulier de cellules immunitaires impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes tel que le psoriasis. Au cours de l’étude, des échantillons de peau et de sang seront prélevés afin d’analyser les réactions de l’organisme, notamment au niveau de l’expression des gènes. Cela permettra de vérifier si le traitement agit comme attendu sur l’inflammation. Ce modèle a été développé en collaboration avec un partenaire scientifique afin de garantir sa pertinence. Les résultats obtenus pourraient contribuer, à terme, au développement de nouveaux traitements pour des maladies auto-immunes telles que le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la sclérose en plaques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement basé sur un anticorps ciblant un type spécifique de cellules du système immunitaire, connues pour jouer un rôle important dans plusieurs maladies auto-immunes. L’étude permettra de vérifier si ce traitement est capable de réduire l’inflammation dans un modèle expérimental reproduisant certaines caractéristiques des maladies humaines. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre l’action de cet anticorps et de confirmer son intérêt comme approche thérapeutique. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouveaux traitements pour des maladies auto-immunes, comme le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la sclérose en plaques, avec l’objectif d’améliorer la prise en charge des patients grâce à des thérapies plus ciblées et adaptées.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles auront une application de crème sur une petite surface du dos identifiée, deux fois par jour pendant 14 jour. L’application de la crème et la contention durera environ 10 à 15 minutes. Cette contention pour l’application de la crème permettra également de faire une observation dermatologique rapprochée quotidienne du site d’application. Au 15ème jour, le modèle inflammatoire sera effectif, nous n’appliquerons plus de crème, et les animaux vigiles recevront un candidat médicament ou un contrôle par voie intra-veineuse de façon unique à différentes dose (contrôle, faible, moyenne, haute). L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux auront également 4 prélèvements de sang de 2,5ml, pour un volume total prélevé de 10 ml sur 3 semaines avant et après administration de l’élément d’essais. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang uniquement les jours sans biopsie de peau. Les jours de biopsie, les animaux seront anesthésiés, les prélèvements de sang se feront donc à ce moment-là. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Quatre prélèvements de peau par animal seront réalisés avant et après administration de l’élément d’essais, chez tous les animaux et sous anesthésie générale et analgésie (après une mise à jeun inférieur à 16h). Pendant cette anesthésie, des mesures spécifiques dermatologiques : plie de peau et taux de perte d’eau transépithéliale seront mesurés de manière non invasive avec des appareils de mesure spécifiques par un vétérinaire spécialisé. Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie et mesures comprises). Le suivi des paramètres physiologique (température et poids) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action du principe actif contenu dans la crème et de sa cible cutanée, des lésions au niveau de la peau pourront être observées. Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible sur le système immunitaire, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivant les administrations liées à un relargage de cytokines. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Les prélèvements de peau sous anesthésie pourront provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (maximum 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront mis à mort dans le but de récolter les organes pour évaluer l’efficacité de l’élément d’essais.

Remplacement

Le modèle d’inflammation cutanée vise à reproduire une réponse inflammatoire cutanée complexe, impliquant des interactions immunitaires proches de celles observées chez l’homme. Ces caractéristiques sont essentielles pour garantir la pertinence des résultats et la prédictivité des réponses thérapeutiques. Bien que des modèles de peau in vitro permettent d’étudier certains mécanismes cellulaires, ils restent limités dans la reproduction de la complexité immunologique, vasculaire et systémique observée in vivo. À ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de capturer de manière fiable cette dynamique intégrée. La cible de l’anticorps est conservée chez le macaque et présente des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques proches de celles observées chez l’Homme, justifiant le choix de cette espèce. L’utilisation des animaux demeure donc indispensable pour valider le modèle et assurer la transposabilité des données vers la clinique dans le cadre du développement de nouvelles thérapies.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement exploitables. Un effectif de 5 animaux par groupe a été retenu afin de permettre la réalisation d’analyses robustes, tout en évitant une utilisation excessive d’animaux. Le design expérimental comprend 4 groupes (un groupe contrôle et trois groupes recevant des doses croissantes), permettant d’évaluer la relation dose-effet ainsi que de recueillir des données de pharmacocinétique au sein d’une même étude, limitant ainsi le recours à des expériences supplémentaires. Par ailleurs, le choix de cet effectif prend en compte la variabilité interindividuelle et génétique observée chez le macaque. Des études préliminaires menées sur un nombre restreint d’animaux ont mis en évidence plusieurs profils de réponse distincts à l’induction inflammatoire. L’augmentation du nombre d’animaux par groupe est donc nécessaire pour garantir la représentativité et l’homogénéité des groupes, tout en assurant la fiabilité de l’interprétation des résultats. Ainsi, le nombre total de 20 animaux constitue un compromis raisonné entre la réduction du nombre d’animaux utilisés et les exigences scientifiques nécessaires à la validation de l’étude.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux macaques d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, application de la crème). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple.

Choix des espèces

L’utilisation du macaque pour le modèle d’inflammation cutané induit par l’application d'une crème contenant un principe actif sur la peau est justifiée par sa similarité immunologique avec l’humain. Les macaques ont un système immunitaire proche de celui de l’humain, notamment au niveau des voies de signalisation impliquées dans la réponse inflammatoire. Ce modèle induit une inflammation cutanée et une activation immunitaire locale. Chez le macaque, ces récepteurs sont exprimés de manière comparable à l’humain, ce qui garantit une réponse pharmacologique et immunologique pertinente pour l’évaluation des thérapies. La cible de l’anticorp est conservée chez le macaque et présente des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques proches de celles observées chez l’Homme, justifiant le choix de cette espèce. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements de peau seront réalisés dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, privées de rate par ablation chirurgicale, et porteuses de cellules immunitaires et tumorales humaines greffées : 297 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après la splénectomie viennent une injection intrapéritonéale de cellules immunitaires humaines et une injection sous-cutanée de cellules tumorales, puis une injection intraveineuse d'un photosensibilisateur suivie trois heures plus tard d'une illumination de trente minutes, des injections intraveineuses hebdomadaires d'immunothérapie, des prélèvements de sang chaque semaine et des mesures de la tumeur au pied à coulisse. Dans les groupes témoins et chez les souris que le traitement ne freine pas, le porteur écrit que la tumeur continuera de croître jusqu'au point limite. Il conclut que "ces nécessités, éthiques et scientifiques" justifient la mise à mort des souris en fin de procédure, après avoir écrit : "Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite".

Objectifs

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est un cancer fortement immunogène. Le traitement de première intention repose sur des thérapies ciblées quand cela est possible ou des chimiothérapies de sels de platines avec ou sans immunothérapies. Cependant certains patients échappent au traitement. Dans ce contexte, il est indispensable de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

Il s'agit pour nous d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dirigés contre le CPNPC humain. Les paramètres de PDT-Neptune testées ont préalablement été sélectionnés sur un ensemble d'expériences réalisées sur les modèles cellulaires en laboratoire. Il s'agira donc de confirmer l'efficacité de la PDT-Neptune dans le cadre d'un être vivant complet humanisé. Les bénéfices à long terme seront de pouvoir mettre sur le marché un nouveau traitement et d'aider dans la lutte contre le CPNPC. L'analyse de l'importance de la réponse immunitaire sur leur mode d'action fait que ces futurs traitements pourront s'intégrer dans des programmes adaptés à chaque patient au bénéfice d'une médecine personnalisée.

Procédures

Toutes les procédures ont en commun la mise en place du modèle et pour cela les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale (10 min entre l’endormissement et le réveil). Une semaine après, les animaux subiront l’injection de cellules humaines (immunitaires en IP avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 26G (0.45 x 13 mm) et tumorales SC avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 23G (0.6 x 25 mm). Le modèle en place permettra de tester les traitements. Pour la PDT, les animaux auront une injection intra veineuse du PS Neptune et seront illuminées (extracorporel) 3h après pendant 30 min. L’immunothérapie sera ajoutée par une injection IV qui sera répétée toutes les semaines (1 fois par semaine) avec un cathéter 24G (0.7 x 19 mm) dans la veine caudale. Pour le suivi immunologique, un prélèvement de sang sera réalisé préalablement à tout traitement, puis une fois par semaine. Le suivi de la croissance se fera par 2 méthodes. Pour les procédures il s’agira d’utiliser les propriétés du modèle cellulaire et de faire un suivi par imagerie. Ce dernier nécessite l’endormissement sous anesthésie gazeuse des animaux, puis l’injection IP du substrat lumineux avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 26G (0.45 x 13 mm). Toutes les souris auront également le suivi régulier de la croissance par le pied à coulisse. En fin de protocole, l’ensemble des animaux sera euthanasié, le sang, la tumeur et les organes vitaux seront récupérés pour analyse complémentaires

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent être relevés sur ce projet lors de nos interventions : - injections / prélèvement sanguins / pesées ; ces actions nécessitent une contention qui peut générer un stress léger de courte durée mais répété - anesthésie; les anesthésies notamment gazeuses à l'Isoflurane peuvent également générer un stress léger de courte durée mais répété - acte chirurgical pour la splénectomie; peut générer un problème lors de la cicatrisation notamment une légère démangeaison pendant un maximum de 5 jours – la croissance tumorale: les cellules tumorales sont injectées en un point précis prévu pour ne gêner en rien le comportement normal de l'animal, un risque de gène du déplacement pourrait être observable au cours des 4 semaines mais cela sera strictement géré (cf. points limites).

Devenir

Tous les animaux auront reçu l'injection d’une masse tumorale suivi ou non d'un traitement expérimental. Selon l’efficacité des traitements la croissance de la tumeur sera ralentie voire disparaitra, dans le cas contraire et pour les groupes témoins, la tumeur continuera de croitre jusqu'au point limite critique pour son bien-être. Nous pouvons ajouter également que pour des raisons scientifiques, nous devons procéder à la récupération des tissus (sang, tumeur, organes vitaux) qui nous serviront à confirmer l'efficacité du traitement et confirmer son mode d'action. L'ensemble de ces nécessités, éthiques et scientifiques, justifient le sacrifice des animaux en fin de procédure.

Remplacement

Notre objectif est de tester l’efficacité anti tumorale de la PDT-Neptune (qui de plus est immuno-activatrice) seule ou en combinaison avec des Immunothérapies (réduction des mécanismes immunorégulateurs). Des travaux préalables ont été réalisés sur les modèles de lignées cellulaires. Ces résultats mettent en évidence la faisabilité du projet au travers de la validation de l'application de la PDT et/ou des Immunothérapies in-vitro ; dont plusieurs paramètres ont été ainsi fixés. Cependant, s'agissant de développer une nouvelle approche thérapeutique, il est primordial que celle-ci soit également évaluée dans un système physiologique complet, en ce sens un modèle in- vivo est le plus adéquat, voire nécessaire. Le suivi par bioluminecence permet de diminuer le nombre d'animaux, néanmoins, une validation de l'efficacité nécessite d'emblée que plusieurs groupes expérimentaux soient présents, notamment les groupes contrôles (PS Neptune seul ; pour la PDT), non traité, et traitement unique ou traitement combiné de manière à limiter quantitativement les expérimentations. Dans la mesure où la modélisation expérimentale cellulaire ou in-silico est trop imparfaite, ce type de modèle demeure indispensable à la validation de ces futurs traitements.

Réduction

Grâce à notre expérience nous bénéficierons de protocoles déjà approuvés et mis en place au laboratoire, ce qui permet de ne pas avoir à faire de mise au point. L'ensemble des animaux ne servira uniquement que pour l'étude de l'effet des traitements. Néanmoins, dans un souci de conservation de la fiabilité des résultats et pour ainsi éviter d'avoir à refaire les expériences, nous réaliserons des groupes d'étude suffisamment solides d'un point de vue biostatistique (validé grâce à l'outils de l'EDA). Ainsi, pour des modèles humanisés des groupes de 5 souris pour 5 reconstitutions seront suffisants. Le suivi de croissance tumorale se fera de manière externe sans nécessité de recours à une dissection, permettant ainsi un suivi longitudinal optimisé sans sacrifice. Enfin, il s'agira de ne tester que les molécules déjà présélectionnés pour leur efficacité dans les modèles précliniques in-vitro. Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaire (grâce aux outils de l'EDA), nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.

Raffinement

Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de 5 animaux maximum par cage, dans un environnement enrichi (maison, carré de coton) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycles jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 à 10 jours dans leur salle d'hébergement. Concernant le projet, nous avons cherché à optimiser l'expérimentation en mettant en place une méthodologie d'étude courte et efficace : suivi de tumeur sur un temps limité (4 semaines maximum), tout en minimisant les douleurs ou détresse. Nous avons ainsi choisi des modèles de souris dont nous connaissons les comportements et la capacité de prise de greffe. Les animaux plus jeunes, seront manipulés régulièrement et ainsi entrainés en vue d'une réduction du stress. En cours d'expérimentation, nous avons choisi de faire les greffes tumorales uniquement sous-cutanées (au flanc) de manière à ne gêner en rien la vie de l'animal (locomotion, alimentation), le suivi sera ainsi facilité par mesure manuelle externe sur animal vigile (mesure au pied à coulisse), ou grâce à un système d'imagerie par bioluminescence (l'animal sera alors sous anesthésie dans l'appareil à +37°C et aura préalablement reçu une injection de luciférine). Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaire (grâce aux outils de l'EDA), nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.

Choix des espèces

Les souris sont des petits rongeurs qui permettent de réaliser des groupes cohérents et limités pour l'étude efficace des effets des molécules thérapeutiques testées en faibles quantités. Nous utilisons des souris SCID pour permettre la xénogreffe de cellules humaines (tumorales et immunitaires). Par ailleurs le campus dispose d'outils performants spécialement adaptés à la souris (Imagerie du petit animal). Les souris entreront en phase expérimentales à partir de l’âge de 7 semaines. Elles seront déjà sevrées et sexées. A ce stade de développement elles seront suffisamment robustes pour supporter les traitements et suffisamment grande pour supporter les injections et le développement des cellules tumorales.

Toutes tuées après des évaluations fonctionnelles terminales, sans qu'aucune soit maintenue en vie ni réutilisée, 818 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une injection intrapleurale d'un traceur, puis une chirurgie d'environ quarante-cinq minutes sous anesthésie générale ouvrant l'accès à la moelle épinière cervicale, où sont injectés des pièges extracellulaires produits en laboratoire. La perte de poids attendue va jusqu'à 10 % du poids initial dans la semaine suivant l'opération, y compris chez les souris du groupe témoin, opérées sans injection. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet d'observer à la fois ces pièges dans la moelle épinière, leur effet sur les cellules nerveuses qui commandent le diaphragme et les conséquences musculaires dans un "organisme entier".

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre comment une inflammation générale dans l’organisme peut aussi provoquer une inflammation de la moelle épinière et perturber le fonctionnement des muscles, en particulier ceux impliqués dans la respiration. Parmi les mécanismes étudiés figurent les « pièges extracellulaires », des structures libérées par certaines cellules immunitaires. Ces structures jouent normalement un rôle de défense, mais lorsqu’elles sont produites en excès, elles peuvent entretenir l’inflammation et endommager les tissus. L’objectif est de déterminer si la présence de ces pièges extracellulaires dans la moelle épinière peut, à elle seule, provoquer une inflammation locale et altérer la fonction neuromusculaire. Pour cela, des pièges extracellulaires produits en laboratoire à partir de différentes cellules immunitaires (neutrophiles, macrophages et microglies) seront injectés dans la moelle épinière de souris saines. Cela permettra de comparer leurs effets respectifs sur l’inflammation et sur le fonctionnement des muscles respiratoires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des liens entre une inflammation générale de l’organisme, l’inflammation de la moelle épinière et l’apparition de troubles musculaires et respiratoires. Nos premiers résultats suggèrent que les « pièges extracellulaires », produits par certaines cellules immunitaires, pourraient jouer un rôle dans ces altérations, mais leur effet exact reste encore mal connu. Ce projet permettra de déterminer si la présence de ces structures dans la moelle épinière est suffisante pour provoquer à elle seule une inflammation locale et perturber le fonctionnement neuromusculaire, en particulier celui du diaphragme, principal muscle respiratoire. Il permettra aussi de comparer les effets de pièges extracellulaires provenant de différents types cellulaires, afin de mieux comprendre si certains ont des effets plus délétères que d’autres. À plus long terme, ces travaux pourraient aider à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour limiter les conséquences neurologiques, musculaires et respiratoires associées à une inflammation systémique, notamment dans certaines maladies graves comme le sepsis.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie durant environ 45 minutes), permettant d’atteindre la moelle épinière cervicale et d’y injecter des « pièges extracellulaires » produits par des cellules en laboratoire. Cette chirurgie sera précédée de quelques jours par une injection intrapleurale quasi non-invasive (5 minutes) d’un traceur moléculaire permettant d’identifier les cellules permettant la contraction du muscle diaphragmatique, et localisées dans la moelle épinière cervicale. Ces souris seront ensuite soumises à des tests fonctionnels terminaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues ou effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induits par l’administration du traceur en intrapleuraléritonéal. - Perte de poids jusqu’à 10% du poids initial durant la première semaine après la chirurgie et l’injection dans la moelle épinière des pièges extracellulaires. Les animaux du groupe contrôle pourront, eux aussi, présenter des effets passagers liés à la chirurgie contrôle sans injection de pièges extracellulaires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure, après les évaluations fonctionnelles terminales. Les tissus et organes d’intérêt, notamment la moelle épinière cervicale, le diaphragme et, selon les analyses prévues, d’autres tissus associés, seront ensuite prélevés pour des analyses histologiques, immunohistochimiques, cytométriques et moléculaires. Aucun animal ne sera maintenu en vie ou réutilisé à l’issue de la procédure.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode de remplacement permettant d’étudier en même temps les effets des pièges extracellulaires dans la moelle épinière, leur impact sur les cellules nerveuses qui commandent le diaphragme, et les conséquences sur le fonctionnement musculaire. Les études réalisées uniquement sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre le système nerveux, le système immunitaire et les muscles dans un organisme entier. L’utilisation de l’animal est donc nécessaire pour répondre à cette question de recherche.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques fiables. L’organisation de l’étude repose sur l’expérience du laboratoire, sur des données préliminaires, et sur les analyses prévues à la fin des expériences. Le choix de plusieurs groupes et de plusieurs temps d’observation est nécessaire pour comparer correctement les effets étudiés, mais a été limité afin d’éviter toute utilisation excessive d’animaux. Cette stratégie permet d’obtenir des résultats exploitables tout en respectant le principe de réduction.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux pendant toute l’étude. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale, avec des mesures adaptées pour limiter la douleur et l’inconfort. Les conditions opératoires seront soigneusement contrôlées afin de réduire au maximum les risques liés aux injections et aux manipulations. Après chaque intervention, les animaux seront surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet puis de façon régulière pendant toute la durée de l’étude. Leur état général, leur déplacement, leur poids, leur température et l’aspect de la zone opérée seront contrôlés à l’aide de grilles de suivi. Si nécessaire, les animaux seront pris en charge de manière adaptée. L’isolement (dans un environnement enrichit) ne sera utilisé qu’en cas de besoin lié aux soins ou à l’état de l’animal.

Choix des espèces

La souris a été choisie car c’est une espèce largement utilisée en recherche biomédicale pour étudier les interactions entre inflammation, système nerveux et fonction musculaire. Les modèles murins de neuroinflammation sont bien connus et permettent d’obtenir des résultats comparables à ceux d’autres études. La souris est aussi adaptée aux techniques utilisées dans ce projet, comme les injections dans la moelle épinière, le marquage de certaines cellules nerveuses et les analyses des tissus en fin d’expérience. Sa petite taille, son cycle de vie court et la disponibilité de lignées élevées dans des conditions standardisées permettent de bien contrôler les conditions expérimentales et de limiter la variabilité entre animaux. De plus, la souris partage avec l’humain plusieurs caractéristiques importantes du fonctionnement des systèmes nerveux, musculaire et immunitaire, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type de recherche. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes mâles, âgés d’au moins 8 semaines. Ce choix permet d’éviter les effets liés à la croissance et au développement, qui pourraient influencer les résultats. Il permet aussi d’étudier ces mécanismes dans une situation plus proche de celle observée chez l’adulte humain.

920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont maintenues quatre semaines en caissons hypoxiques pour développer une hypertension pulmonaire, reçoivent une injection sous-cutanée par jour pendant ces quatre semaines et subissent des mesures de pression cardiaque sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur écrit que les souris deviennent un peu amorphes pendant les premières vingt-quatre heures puis "s'acclimatent ensuite très bien", et qu'aucune méthode ne permet d'étudier autrement les mécanismes de cette maladie, dont la survie humaine à cinq ans atteint 36 % dans les formes sévères. Une nécrose cutanée au point d'injection quotidien entraîne la mise à mort de la souris concernée.

Objectifs

L’hypertension pulmonaire est une maladie vasculaire qui mène régulièrement à la mort du patient. La greffe cœur/poumons est l’ultime recours pour les patients car pas ou peu de traitements pharmacologiques permettent d’améliorer les conditions de vie des malades atteints d’hypertension pulmonaire. Il est ainsi nécessaire d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de cette maladie pour établir de nouvelles molécules thérapeutiques. Ainsi, notre objectif est d’évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules sur l’hypertension pulmonaire

Bénéfices attendus

Actuellement, aucun traitement efficace ne permet de soigner l’hypertension pulmonaire. Pour cette maladie, 36% de survie des patients à 5 ans pour les formes sévères. Identifier des molécules permettant de soigner l’hypertension pulmonaire est donc une priorité

Procédures

- Hypoxie en continue pendant 4 semaines, - 1 injection quotidienne de 30 sec en sous-cutané, - Mesures de pression cardiaque sous anesthésie (1 minute/mesure)

Impact sur les animaux

- L’induction de l’HTAP nécessite d’héberger les animaux dans des caissons hypoxiques. Le changement d’environnement peut induire un stress sur les animaux. L’induction de l’HTAP rend les souris un peu « amorphe » sur les premières 24h, le temps qu’elles s’adaptent. Elles s’acclimatent ensuite très bien. - Toutes les molécules sont préalablement testées pour éviter des effets indésirables majeurs chez la souris. Seules les molécules montrant pas ou peu d’effets indésirables (toxicité, solubilité, bonne biodisponibilité de la molécule…) seront testées in vivo. - Stress induit par contention quotidienne pour injecter les molécules en sous-cutané pendant 4 semaines. Si une nécrose cutanée apparait, l’animal sera alors mis à mort.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements d’organes et pour analyses fonctionnelles et histologiques

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative permettant d’étudier les mécanismes de développement de l’HTAP. Le modèle murin d’hypoxie chronique est décrit pour se rapprocher de la pathologie humaine. Cette approche expérimentale permet ainsi d’étudier, dans un système intégré, les mécanismes impliqués dans le développement de la pathologie et également d’évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules.

Réduction

Nous avons fait une sélection in vitro des molécules à tester pour réduire l’expérimentation animale. Comme toutes les molécules sélectionnées sont solubles, le solvant sera identique pour tous les tests. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les groupes contrôles. Nous utiliserons un test statistique ANOVA (Prism, GraphPad) pour interpréter nos résultats.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par des personnes expérimentées afin d’assurer le bien-être des animaux et détecter toute souffrance. Les cages des animaux sont enrichies avec des frisottis et des bâtonnets en bois. Les traitements dureront 4 semaines avec des injections quotidiennes en sous-cutanée par contention douce. Nous injecterons à différents endroits pour éviter l’apparition de lésions cutanées.

Choix des espèces

Le modèle murin soumis à une hypoxie chronique est décrit pour se rapprocher le plus de la pathologie humaine. Les souris seront utilisées à l’âge adulte. Pour étudier le potentiel thérapeutique des molécules, nous devons travailler avec un système pulmonaire et hémodynamique mature.