Procédures modérées

Jusqu'à vingt-quatre séries de mesures de pression artérielle de quinze minutes, six isolements de vingt-quatre heures, douze injections et douze incisions de la queue : 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Elles reçoivent une alimentation riche en sel ou une molécule dans l'eau de boisson, en continu pendant quatre à vingt-quatre semaines, pour comprendre comment des mutations génétiques conduisent à une hypertension secondaire. Aucun point limite ni seuil d'arrêt n'est indiqué. Le porteur justifie le choix de la souris par la facilité avec laquelle son génome se manipule et affirme que l'hypertension artérielle est "impossible à analyser sans l'utilisation d'un modèle animal".

Objectifs

L’hypertension artérielle est un facteur de risque cardiovasculaire majeur qui touche 10 à 45% de la population. Malgré le développement de stratégies thérapeutiques de plus en plus efficaces, le contrôle optimal de la pression artérielle n’est atteint que chez environ un tiers des patients. Ces dernières années des mutations génétiques ont été identifiés comme responsable du développement de forme secondaire d’hypertension artérielle. Afin de mieux prendre en charge ces formes spécifiques d’hypertension, il est nécessaire de comprendre les changements provoqués par ces mutations dans les cellules. L’objectif de ce projet est de comprendre comment ces mutations conduisent au développement d’hypertension secondaire mais aussi d’étudier les conséquences cardiovasculaires et métaboliques associées.

Bénéfices attendus

A terme ce projet permettra de comprendre comment ces mutations sont responsables du développement de certaines formes d’hypertension et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et ainsi améliorer la prise en charge de patients.

Procédures

Alimentation riche en sel et/ou eau de boisson contenant une molécule : en continu pendant 4 à 24 semaines – Mesures pression artérielle : 15 min/série de mesures, jusqu’à 24 fois – Echocardiographie sous anesthésie : 5-10 min, 1 fois – Isolement : 24h, 6 fois – Injections : quelques secondes, 12 fois – Incision au niveau de la queue : quelques secondes, 12 fois – prélèvement de sang : 30 secondes, 1 fois

Impact sur les animaux

Il peut exister un inconfort lié à la préhension et à la contention des animaux ; une douleur légère au point d’injection ; un stress lié à l’isolement ; un stress et une hypothermie liés à l’anesthésie

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes nécessaires aux analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Des approches dans des modèles de culture ont permis de valider la stratégie qui va être appliquée chez la souris. L’utilisation d’animaux est maintenant indispensable pour comprendre les mécanismes de développement de la pathologie ainsi que pour évaluer les complications cardiométaboliques associées.

Réduction

Le nombre optimal d’animaux a été établi par des tests statistiques. Un suivi longitudinal des animaux pour l’étude de certains paramètres permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation du projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d’hébergement et d’élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie de la souris. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les périodes d’isolement sont réduites au minimum nécessaire. Une surveillance hebdomadaire sera mise en place et une grille d’évaluation établie afin de permettre une surveillance objective des animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel technique qualifié de l’animalerie ou par les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes de souffrance ou de mal-être.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix en raison de ses caractéristiques génétiques et physiologiques proches de l’homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Ce raisonnement s’applique tout particulièrement à l’étude de l’hypertension artérielle, maladie complexe et impossible à analyser sans l’utilisation d’un modèle animal. Nous utiliserons des animaux adultes, âgés de 16 à 20 semaines au début des expérimentations, la pathologie à laquelle on s’intéresse se développant chez l’adulte. Le développement d’une hypertension est un processus long, justifiant de suivre les souris sur plusieurs mois (jusqu’à l’âge de 44 semaines).

Pour établir si des Escherichia coli pathogènes accélèrent les lésions cancéreuses du côlon, 2 372 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont mises à jeun une nuit, gavées jusqu'à six fois, reçoivent jusqu'à sept injections intrapéritonéales et jusqu'à sept instillations intrarectales sous anesthésie, chacune d'environ trente minutes. Le porteur attend une diarrhée passagère et une perte de 10 % du poids après l'administration de l'agent inflammatoire, et prévoit une perte de poids modérée dans la dernière phase pour les groupes colonisés par la bactérie. Toutes seront tuées pour le prélèvement de l'intestin et du côlon, et la rubrique raffinement s'interrompt en milieu de phrase, laissant la surveillance annoncée sans description.

Objectifs

Un évènement important dans la genèse et l’évolution des cancers du tractus digestif est la dysbiose (déséquilibre) du microbiote intestinal. Ceci a été établi chez les patients atteints de cancer colorectal, et confirmé dans le modèle animal murin. Comment la présence, liée à ces dysbioses, de certaines bactéries peut promouvoir des mécanismes tumoraux au sein des cellules épithéliales intestinales ou influencer la réponse immunitaire pro ou antitumorale est la question principale à laquelle se propose de répondre ce projet. Notre hypothèse est que des E. coli pathogènes porteuses de certaines toxines et facteurs de virulence pourraient stimuler des mécanismes qui favorisent le développement du cancer dans la couche de cellules recouvrant le tractus digestif (épithelium). Les travaux expérimentaux sur cellules nous ont permis de caractériser les activités enzymatiques de ces toxines, leurs cibles cellulaires ainsi que certains mécanismes de réponse de la cellule normale de l’hôte pour maintenir l’intégrité du génome et une homéostasie tissulaire lorsque ces voies sont exacerbées. Basés sur le développement du modèle de souris colonisée par E. coli et sensibilisés au cancer colorectal par action d’un mutagène local ou par traitement chimique, les objectifs de ce projet sont : i. D’analyser si la sévérité des lésions cancéreuses ou inflammatoires intestinales induites par le traitement mutagène ou mutagène et inflammatoire peut être accélérée par la présence de E. coli pathogène dans le compartiment intestinal, ceci plus particulièrement dans la souris défi-ciente pour un gène d’homéostasie, associé au développement de tumeurs lorsqu’il est muté, que nous avons caractérisé. ii. De déterminer si ces mécanismes sont associés à des effets systémiques. iii. De définir les toxines et facteurs de virulence bactériens impliqués, en colonisant les souris par des bactéries génétiquement invalidées dans chacun des gènes étudiés. Ceci établira le rôle causal d’un ou plusieurs facteurs bactériens dans l’étiologie du cancer colorectal.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes à l'origine du développement des cancers colorectaux induits par E.coli pathogène. De plus ces données peuvent aboutir à des stratégies de dépistage et prévention du développement du cancer colorectal par surveillance du microbiote fecal ainsi que nous permettre d’identifier des cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront mises à jeun sur une nuit (1 fois par souris, moins de 16h) ce qui peut induire un stress dû à l’absence de nourriture pendant cette période. Elles pourront développer une irritation œsophagienne due à la répétition d’administrations par gavage (maximum 6 par souris, au moins 24h entre 2 actes, durée de l’acte inférieure à 30 s). Certaines souris recevront un traitement par injection intraperitonéale qui peut provoquer une douleur légère, réversible et de courte durée (maximum 7 par souris, 1 semaine entre 2 actes, durée de l’acte inférieure à 30 s). Certaines souris recevront un traitement par instillation intra-rectale, sous anesthésie chimique, pouvant provoquer un inconfort passager (maximum 7 par souris, 1 semaine entre 2 actes, durée de l’acte d’environ 30 minutes). Les souris seront mises à mort par une méthode réglementaire en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiellement attendus sont modérés. Durant la période de traitement par un mutagène (6 semaines) aucun effet indésirable n’a été rapporté pour la lignée murine étudiée dans la littérature. Il est attendu dans les 2 à 3 jours suivant l’administration sur 7 jours d’agent inflammatoire l’apparition de diarrhée passagère. Elle peut s’accompagner d’une perte de 10% du poids de l’animal, qui devrait revenir à la normale en quelques jours. Durant la progression du protocole, il est envisageable que les groupes colonisés par la bactérie contrôle, et pour lesquels nous anticipons une accélération ou aggravation des lésions pré-tumorales, présentent une perte de poids modérée dans la dernière phase de l’essai.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure : ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car la finalité des procédures correspond au prélèvement du tractus intestinal (intestin + colon) de chaque animal.

Remplacement

Des études in vitro préliminaires sur cellules et organoïdes ont permis de mettre en évidence l’intérêt du facteur de virulence bactérien étudié dans ce projet dans des questions en lien avec le cancer colorectal. Cependant, pour confirmer le rôle de ce facteur dans la capacité de différentes souches bactériennes à induire des lésions pré-néoplasiques ou néoplasiques, seul un modèle in vivo permet de répondre aux questions complexes soulevées par ce projet, i.e. étudier la réponse d’un organisme entier à une colonisation du microbiote intestinal par une espèce bactérienne particulière sur les mécanismes de tumorigenèse et via la mobilisation de son système immunitaire. Dans le cas de l’infection par E. coli, le modèle souris permet de récapituler l’ensemble de la cascade d’évènements décrits en pathologie humaine, allant du polype au cancer. La réponse immunitaire observée chez la souris reflète parfaitement celle observée chez l’Homme. De même, la souris est une espèce de choix pour l’étude des facteurs de virulence de E. coli car elle est permissive à l’infection par ce pathogène opportuniste sans nécessité de manipulations génétiques ou de modification du statut immunitaire des animaux. Ainsi, l’utilisation du modèle souris se justifie parfaitement car il remplit la condition essentielle de reproduire plusieurs aspects des pathologies observées chez l’Homme.

Réduction

Le nombre de souris utilisées sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Le nombre de souris par groupe a été déterminé sur la base d’expériences antérieures du laboratoire et des effets décrits dans la littérature. La littérature concernant ces infections étant abondante et les modèles expérimentaux bien établis, cela permettra d’obtenir des résultats fiables en limitant le nombre d’animaux utilisés. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les différents groupes. Plusieurs échantillons seront prélevés (intestin, colon : mise en culture organotypique, ARNs, tissus fixés pour histologie ; feces, …) sur toutes les souris utilisées dans ce projet afin de collecter un maximum d’échantillons et d’éviter de relancer des expérimentations additionnelles. Les effectifs proposés ont été estimés par notre statisticien (pour des tailles d'effets proches de 1) et sont donc dimensionnés par rapport aux objectifs du projet. Le succès d'infection par animal rentre également en considération.

Raffinement

Les faibles doses de substance pro cancéreuse utilisées n’ont pas d’effet néfaste rapportés sur la lignée de souris utilisée. Nous serons toutefois particulièrement vigilants grâce à une surveillance accrue au cours des 6 semaines de traitement afin de prévenir au plus tôt tout

Choix des espèces

Le modèle murin est adapté car il reproduit de nombreux aspects des pathologies humaines étudiées. Des protocoles standardisés d’induction de tumeurs colorectales chez différentes lignées de souris sont publiés et utilisés en recherche fondamentale dans le monde entier. Après une semaine d’acclimatation (animaux commerciaux ou provenant d’une autre animalerie), les souris seront utilisées au stade de jeunes adultes (environ 8-10 semaines). Il s’agit du stade le plus largement décrit et validé dans les publications. A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation aisée et leur système immunitaire est mature.

Trois macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un anticorps anticancéreux par perfusion intraveineuse de trente minutes, placé sur une chaise de contention pendant environ quarante minutes. Les trois subissent quatorze prélèvements sanguins totalisant 53 ml en quatre semaines, et les deux qui poursuivent la seconde phase dix-huit de plus, pour 65 ml en cinq semaines. Deux seront tués pour le prélèvement de leurs organes, le troisième gardé en vie et réutilisable après accord du vétérinaire. L'objet immédiat de l'étude est d'affiner les doses et les protocoles d'études réglementaires ultérieures, elles aussi menées sur des primates.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer les effets biologiques ainsi que le devenir dans l’organisme d’un anticorps développé pour cibler et éliminer les cellules tumorales dans le cadre du développement d’un futur traitement anticancéreux destiné à l’homme. Cet anticorps sera administré par voie intraveineuse chez le macaque en administration unique à trois doses distinctes (phase 1) puis selon un schéma d’administrations répétées (cinq injections) à deux niveaux de dose (phase 2). La selection des deux doses pour les administrations répétées sera basée sur les résultats des adminsitrations uniques. Cette étude permettra d’identifier les doses et les modalités d’administration les plus adaptées en vue de la réalisation de futures études à plus grande echelle et réglementaires. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement et de sélection des doses du candidat médicament.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un nouvel anticorps capable de créer une thérapie anticancéreuse ciblée et puissante. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études à plus grandes echelles puis des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de sélectionner la meilleure dose et le meilleur schéma d’administration mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Trois animaux réaliseront la phase 1 et à l’issue de cette phase, deux animaux continueront vers la phase 2 Les animaux vigiles recevront un candidat médicament par voie intra-veineuse de façon unique à différentes dose (faible, moyenne, haute) lors de la première phase puis deux doses seront selectionnées pour poursuivre les administrations répétées (x5) pour la seconde phase. L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Pour la seconde phase, es animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre les administrations. Les animaux auront également 14 prélèvements de 1 à 5 ml, pour une volume total prélevé de 53 ml sur 4 semaines en phase 1 et 18 prélèvements de 1 à 8,5ml, pour une volume total prélevé de 65 ml sur 5 semaines en phase 2. Les animaux seront vigiles mais une sédation sera envisagée en cas de besoin. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris) Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible sur les cellules de l'immunité, une réaction de type fièvre peut apparaître les jours suivant les administrations liées à un relargage de cytokines. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements.

Devenir

Deux doses seront sélectionnées en fin de procédure 1 pour être évaluée dans la procédure 2 (sur 2 animaux). L’animal non utilisé pour la procédure 2 sera gardé en vie et pourra être réutilisé (après accord du vétérinaire). En fin de procédure 2, tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la toxicité du candidat médicament.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de toxicité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la biodisponibilité des candidats médicaments et permettent d’affiner la connaissance de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les modèles animaux permettent dans ce cas d'objectiver l'apparition des signes cliniques et donc de mettre en évidence une éventuelle toxicité de la molécule en test. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 3 primates répartis en 3 lots de 1. Il a été réduit au minimum. La période de washout (periode d'elimination de l'organisme du candidat médicament) entre les deux phases permet de réutiliser 2 animaux pour l’évaluation des doses répétées ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique. Des points limites précoces et spécifiques ont été définis et seront utilisés en cas de besoin.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, notamment en ce qui concerne les populations de lymphocytes T γδ et l'expression des cibles impliquées dans le mécanisme d'action du candidat médicament, le macaque a été retenu dans le cadre de ce projet. L’anticorps cible des récepteurs présents chez le macaque mais absents ou très différentes chez les rongeurs. En effet les rongeurs ne possèdent pas de système γδ comparable à celui de l'Homme. Des jeunes adultes seront utilisés dans ce projet car certaines études montrent que les animaux matures (>4,5ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées sous anesthésie, les composés testés sont administrés une à deux fois par jour pendant quatre semaines, et chaque souris passe 40 heures seule en cage sans enrichissement pour la mesure de la dépense énergétique. La force musculaire est évaluée par un test d'agrippement sur grille, la composition corporelle par imagerie. L'objectif immédiat reste de vérifier qu'une méthode d'induction de la cachexie par greffe tumorale est reproductible et laisse les souris survivre jusqu'aux mesures, le porteur affirmant que le recours à des animaux non-humains est "indispensable" parce que la cachexie met en jeu des interactions que l'in vitro et l'in silico ne reproduisent pas intégralement.

Objectifs

La cachexie cancéreuse est une complication fréquente des cancers avancés. Elle se caractérise par une perte progressive et importante de poids, notamment de masse musculaire et de masse grasse. Cette perte s’accompagne souvent d’une diminution de l’appétit, d’une baisse de la force musculaire et d’une augmentation des besoins énergétiques de l’organisme. À l’heure actuelle, il existe très peu de traitements efficaces et aucun médicament n’est approuvé en Europe pour traiter spécifiquement cette pathologie. L’objectif principal de ce projet est de mettre en place et de caractériser un modèle expérimental de cachexie cancéreuse chez la souris, obtenu par l’implantation de cellules tumorales. Ce modèle permettra de vérifier qu’il est fiable, reproductible et qu’il induit une cachexie suffisamment marquée tout en permettant aux animaux de survivre jusqu’aux différents moments de mesure prévus dans l’étude. Un second objectif est de vérifier que ce modèle permet bien d’évaluer l’efficacité de traitements contre la cachexie. Pour cela, nous testerons un médicament qui agit sur un récepteur qui est connu pour stimuler l’appétit et améliorer la masse musculaire dans certains contextes de cachexie. Ce projet vise donc à développer un modèle préclinique robuste et pertinent permettant d’étudier les différents aspects métaboliques, fonctionnels et biologiques de la cachexie cancéreuse ; d’évaluer de nouveaux candidats thérapeutiques ciblant cette pathologie ; et de développer une expertise scientifique et technologique dans le domaine de la cachexie cancéreuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer et valider un modèle murin de cachexie cancéreuse intégrant des paramètres fonctionnels, métaboliques et biologiques, ce qui représente un enjeu majeur en recherche préclinique. Les bénéfices scientifiques attendus incluent une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la cachexie, l’identification de paramètres robustes et reproductibles de suivi de la maladie, la validation d’un modèle pertinent pour le criblage de nouvelles approches thérapeutiques. À moyen et long terme, ce modèle contribuera au développement de traitements innovants destinés à améliorer la qualité de vie et le pronostic des patients atteints de cancer. Les connaissances générées pourront également être transposées à d’autres pathologies associées à la cachexie.

Procédures

Les cellules sont implantées sur animal anesthésié. L’injection dure environ 2 à 5 minutes. Le volume tumoral (longueur et largeur) sera mesuré 3 fois par semaine (2 min sur animal vigile). Les composés à tester seront administrés une à deux fois par jour par toutes les voies possibles, pendant 4 semaines maximum. L’administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 2 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre les paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements visant à quantifier des paramètres biologiques, les animaux pourront être mis à jeun pour une durée de 2h maximum avant le prélèvement. Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en fin de période de traitement. Pour mesurer la force musculaire, nous testerons l’agrippement sur grille en début et fin d’étude (2 minutes sur animal vigile) La composition corporelle sera mesurée en début et fin d’étude sous imagerie, cela dure moins de 2 minutes sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Les animaux sont susceptibles de présenter des effets indésirables liés à l’implantation tumorale (douleur transitoire, inflammation locale ou risque d’infection au site d’incision, à la progression tumorale (risque de nécrose, possible qu’ils ressentent une faible gêne lors de la locomotion suite à l’encombrement de la tumeur), au développement de la cachexie (perte de poids, diminution de la masse musculaire et grasse, anorexie ou déshydratation). Un stress de l’animal peut être provoqué par les manipulation répétées (pesées, mesures fonctionnelles, administrations de traitement). Les prélèvements sanguins peuvent créer une lésion au niveau du site de prélèvements. Les traitements peuvent créer des lésions au niveau du site d'injection. Les mises à jeun (2h) lors de prélèvement de sang, peuvent être une source de stress pour l’animal. Les mesures de dépenses énergétiques nécessitent un isolement pendant 40 heures (16 heures d’acclimatation puis 24 heures de mesure). Cela peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet pour prélever les organes d'intérêt.

Remplacement

Le recours à l’animal est indispensable dans ce projet car la cachexie est un syndrome systémique (cela signifie qui implique des interactions complexes entre différents paramètres: la tumeur, le métabolisme énergétique, les systèmes musculaires, immunitaires et hormonaux). Cela ne peut être reproduit intégralement par des modèles in vitro ou in silico. Un système de tissu musculaire squelettique ex vivo challengé par du milieu conditionné de cellules tumorales est décrit dans la littérature mais ne permet pas de répondre à l’ensemble des objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Plusieurs mesures ont été mises en place afin de réduire le nombre d’animaux utilisés : - utilisation d’un design expérimental optimisé avec groupes témoins mutualisés, - collecte de multiples paramètres sur un même animal (fonctionnels, métaboliques, biologiques), - réalisation d’une phase pilote permettant d’éviter la répétition inutile d’études non optimales, - recours à des techniques non invasives. Ces mesures garantissent une utilisation raisonnée du nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques.

Raffinement

Avant l’implantation des cellules tumorales, les animaux seront manipulés pour les habituer progressivement aux gestes de pesée, prélèvement, administration de traitement. L’implantation de cellules tumorales est réalisée sous couverture analgésique adaptée. Les animaux sont sur tapis chauffant de l’endormissement jusqu’au réveil. Après implantation tumorales, les animaux seront remis en collectif et l’état physique des animaux monitoré et scoré 1 fois par jour tout le long du projet. En cas de déshydratation, une injection de soluté de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Dans le cas d’apparition de nécrose ou tout autres atteintes des points limites, l’animal est mis à mort. Les points limites sont définis de manière conservatrice afin d’éviter toute souffrance excessive. En cas d’apparition de plaies au cours de l’étude, des soins seront réalisés jusqu’à l’apparition des croûtes. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’isolement de l'animal pendant plusieurs heures se fait la veille de la mise à mort. Une acclimation de 16h la veille à 7h30 le sera réalisée avant le début des mesures.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme espèce animale pertinente pour ce projet en raison de sa large utilisation et de sa validation dans les modèles précliniques de cancer et de cachexie. Ce modèle reproduit de manière robuste les principales caractéristiques de la cachexie cancéreuse observée chez l’Homme, incluant la perte de masse musculaire et grasse, l’anorexie, l’altération fonctionnelle et les modifications métaboliques. La taille de l’animal permet également la réalisation de mesures répétées in vivo (composition corporelle, tests fonctionnels, calorimétrie indirecte) avec un niveau de stress limité. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines (jeunes adultes), afin d’étudier la cachexie cancéreuse sur un organisme mature tout en évitant les effets liés au vieillissement, tels que la sarcopénie, susceptibles de constituer un facteur de confusion.

Les souris infectées par le virus de l'encéphalite à tiques sont mises à mort dès l'apparition de signes neurologiques. 3 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune porte sur le dos une capsule remplie de larves, de nymphes ou de tiques femelles qui se gorgent de son sang, ce qui provoque des démangeaisons, et 2 250 d'entre elles subissent trois prélèvements de sang par le sinus rétro-orbitaire, aux sixième, dixième et quatorzième jours, avant que sang, oreille et organes soient prélevés après la mort. L'effectif se déduit du nombre de tiques gorgées récupérables sur chaque souris, le porteur précisant qu'aucune analyse statistique ne sera réalisée sur le nombre de souris utilisées.

Objectifs

Les tiques sont les premiers vecteurs d’agents pathogènes en Europe et constituent un risque majeur pour la santé humaine et animale en transmettant la plus grande variété de microorganismes (bactéries, parasites et virus). La plupart des agents pathogènes transmis par les tiques sont zoonotiques (transmissibles de l’animal à l’Homme), certains ne touchent que les animaux mais avec un impact économique très important et d’autres sont découverts chaque année. Les principales maladies liées aux tiques en Europe sont la Borréliose de Lyme, l’Anaplasmose granulocytaire et l’Encéphalite à tiques, et leur vecteur est la tique Ixodes ricinus, qui présente une très large répartition géographique. Dans ce projet nous étudions la compétence vectorielle des tiques Ixodes ricinus vis-à-vis de différents agents pathogènes, en infection simple (un seul agent pathogène à la fois) et en co-infection (deux agents pathogènes à la fois). En effet la compétence vectorielle des arthropodes est un caractère sous contrôle génétique et peut varier selon la souche de tique, et la souche de l’agent de pathogène étudié. De plus, dans diverses études il a été mis en évidence que les co-infections dans les tiques (plusieurs microorganismes présents dans une même tique) pouvaient être très fréquentes. Chez l’Homme, des patients présentant une maladie de Lyme chronique rapportent également des co-infections par d’autres bactéries ou d’autres parasites. Enfin en laboratoire il a été démontré que chez des souris co-infectées par deux bactéries (Borrelia et Anaplasma) on constatait une différence de réponse immunitaire de la souris suite à l'infection, une différence de pathogénicité des bactéries chez la souris ainsi qu'un impact sur l'acquisition de ces bactéries par les tiques comparativement à des infections simples. Nos travaux visent à comparer la compétence vectorielle des tiques lors d’infection simple et de co-infection par des bactéries (Borrelia, Anaplasma) et des virus (différentes souches du virus de l’encéphalite à tiques). Pour étudier cette compétence vectorielle, il nous faut etudier 3 étapes clés en laboratoire : (i) l’acquisition de l’agent pathogène ; (ii) la transmission transstadiale de l’agent pathogène (c'est à dire la persistance de l’agent pathogène au fil des stades de développement) ; (iii) la transmission de l’agent pathogène de la tique infectée vers un hôté vertébré sain (souris naïve).

Bénéfices attendus

Les tiques sont d'importants vecteurs d'agents pathogènes qui provoquent des maladies graves chez l'Homme et les animaux. Les phénomènes de co-infections peuvent aggraver ces maladies mais ne sont pas étudiés en laboratoire. Notre projet vise à mieux comprendre le risque lié aux tiques pour l’Homme et l’animal, notamment en comparant les infections simples avec les co-infections.

Procédures

Pour 750 souris maximum, Pas de prélèvement durant l’expérimentation, uniquement récupération tiques gorgées. Pour 2250 souris maximum, a J6, J10, J14 = prélèvement de 10µL de sang par souris (sinus rétrorbital). Après mise à mort des animaux, récupération sang, biopsie oreille et organes souris.

Impact sur les animaux

Le gorgement des tiques induit une gêne modérée (grattement) pour les souris utilisées mais afin de limiter l’inconfort lié à une démangeaison trop intense due aux piqûres de tiques, le nombre de tiques(larves/nymphes/femelles) par animal est limité. Lorsqu’une douleur ou gêne trop intense est vue chez la souris, nous enlevons les tiques qui ne se sont pas encore gorgées ou réduisons celles déjà attachées afin de réduire l’inconfort de la souris. Pour les souris potentiellement infectées par les bactéries Borrelia et Anaplasma, pas de signes cliniques attendus. Pour les souris infectées par le virus TBE, signe neurologique attendu, les animaux seront mis à mort dès que les signes neurologiques seront observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Pour les tests de transmission des agents pathogènes, le sang des animaux et les organes sont nécessaire pour rechercher les agents pathogènes par amplification de leur matériel génétique afin de valider la transmission par les tiques.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un système de gorgement artificiel sur membrane a été développé, il peut être utilisé lors des essais d’acquisition ou de transmission des agents pathogènes. Ce système sera privilégié dès que possible mais ne fonctionne malheureusement pas pour tous les agents pathogènes (notamment ne fonctionne pas pour Borrelia et Anaplasma et donc ne fonctionne pas pour les coinfections utilisant une de ces bactéries). Les expérimentations de co-infection proposées dans cette saisine de peuvent malheureusement pas être réalisées sans l'utilisation d'animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé en fonction du nombre de tiques gorgées que l'on peut récupérer sur l'animal (maximum 50% des tiques déposées dans la capsule) et par rapport à nos besoins en tiques pour nos différentes expérimentations. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Dès que nous obtiendrons le nombre de tiques gorgées nécessaire aux analyses et à la suite des expérimentations, la répétition de l'expérimentation pour chaque modèle de co-infection sera stopée. Le nombre annoncé de répétition (10) est le nombre maximal annoncé. Nous espérons pouvoir réduire ce nombre à 5 ou 6 répétitions par type de co-infection. Il n'y aura pas d'analyses statistiques réalisées concernant le nombre souris utilisées.

Raffinement

Les souris sont élevées dans les conditions naturelles d'élevage des souris avec une maison en plastique par cage, un support pour grimper (roue), des carrés de coton. Lors des manipulations, elles seront hébergées en condition individuelle car les souris auront chacune une capsule avec des tiques sur le dos et les souris sont capables d'enlever les capsules du dos des autres souris et de manger les tiques. Les souris individuelles seront hébergées avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris, support pour grimper (roue)), et même si elles sont isolées elles pourront voir les souris des cages d’à côté. Les animaux sont isolés au maximum 21 jours.

Choix des espèces

Les souris (comparativement à d’autres modèles animaux) sont sensibles à l’infection par les 3 agents pathogènes que nous ciblons : Borrelia afzelii, Anaplasma phagocytophilum, Virus de l’Encéphalite à tiques. Les micromammifères étant notamment impliqués dans les cycles de transmission naturels de ces agents pathogènes, les souris représentent donc le modèle idéal en laboratoire. Dans les essais d'acquisition, les souris utilisées n'auront pas besoin d'être réceptives aux agents pathogènes, par contre, dans les essais de transmission, les souris utilisées devront être sensibles à l'infection par Anaplasma phagocytophilum, Borrelia et TBEV. Adultes. Minimum 4-5 semaines. Suffisamment grand pour pouvoir poser une capsule sur leur dos avec des tiques.

Porteuses d'une modification génétique qui reproduit l'hypophosphatémie liée au chromosome X, ces souris présentent un rachitisme, un retard de croissance, de légères déformations osseuses et, à partir de trois mois, une calcification anormale des tendons aux articulations des membres. 40 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, de l'âge d'un mois à l'âge de trois mois. Trois groupes reçoivent une injection par jour pendant deux mois, un quatrième une injection par semaine, l'imagerie des tendons se faisant sous anesthésie gazeuse de dix minutes. Le porteur indique arrêter le projet tôt dans le processus de calcification pour limiter l'apparition de douleur ou de handicap chez les souris témoins, qui ne reçoivent aucun traitement, et toutes seront tuées pour mesurer la calcification après la mort.

Objectifs

L’hypophosphatémie liée au chromosome X est une maladie génétique rare qui au-delà d’un défaut de régulation des taux de phosphate et de calcium dans la circulation sanguine induit fréquemment le dépôt de calcium sur les zones de fixation des tendons sur les os. Les traitements actuels des patients restent malheureusement inefficaces contre la calcification des zones de fixation des tendons sur les os. Le projet a pour objectif d’étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques contre ce type de calcification. Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la complexité du processus de progression de la maladie qui est impossible à reproduire in vitro. Le projet a pour objectif de tester l’effet d’un inhibiteur de l’inflammation associé au traitement actuel sur la formation des calcifications des zones de fixation des tendons sur les os chez une souris qui reproduit la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra le développement de nouvelles thérapeutiques permettant de bloquer le dépôt de calcium sur les zones de fixation des tendons sur les os des patients atteints d’hypophosphatémie liée au chromosome X.

Procédures

Le projet consiste en une anesthésie gazeuse d’une durée de 10 minutes au cours de laquelle sont effectuées l’imagerie des tendons puis le traitement pour trois groupes est administré sous forme d’une injection par jour répartie sur une période de deux mois, chaque injection durant moins d'une minute. Pour un quatrième groupe le traitement est administré une fois par semaine sur une période de deux mois, chaque injection durant moins d'une minute. La durée totale pour chaque souris sera de 50 min sur une période de deux mois. En parallèle, un suivi quotidien sera assuré, comprenant l’observation clinique et la pesée de chaque animal.

Impact sur les animaux

Le phénotype des animaux génétiquement altérés comprend une réduction des taux de phosphate et de vitamine D dans le sang, ce qui se traduit par un rachitisme (petite taille, retard de croissance) et des troubles de la minéralisation des os pouvant s'accompagner de légères déformations osseuses et, à partir de l'âge de trois mois d'une calcification anormale des tendons au niveau des articulations des membres. Les effets attendus sont une réduction de la calcification des tendons chez les animaux recevant le traitement anti-inflammatoire donc une amélioration de la maladie par rapport aux groupes d’animaux contrôles qui ne reçoivent pas le traitement ou recevant le traitement standard de la maladie. La fin du projet fixée très tôt dans le processus de calcification des tendons permet de limiter l’apparition de douleur ou de handicap chez les souris contrôles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de pouvoir évaluer le niveau de calcification des zones de fixations des tendons sur l’os post-mortem.

Remplacement

Le rôle de l’inflammation sur la calcification des zones d’insertions des tendons sur les os ne peut pas être apprécié par des tests in vitro. Nous utiliserons des souris transgéniques qui reproduisent la maladie chez l’homme.

Réduction

Pour évaluer la calcification des zones d’insertions des tendons sur les os chaque souris sera son propre contrôle grâce à la stratégie d’analyse non invasive par scanner à rayon X au début puis à la fin du projet. De ce fait, la puissance d’analyse statistique permet de réduire le nombre d’animaux par groupe. La taille des groupes a été déterminée à l’aide d’une analyse statistique.

Raffinement

L’état de bien être des animaux sera suivi quotidiennement par leur observation. Les animaux seront manipulés sans traitement pendant une semaine avant le début du projet afin de les habituer à la manipulation permettant de réduire le stress lors des injections. L’imagerie des tendons ainsi que sera réalisée sous anesthésie gazeuse d’une durée maximale de 10 minutes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon des points limites adaptés et précoces et pris en charge au premier signe d’inconfort. La durée du projet est limité dans le temps à 2 mois et à l’utilisation des animaux jusqu'à l'âge de 3 mois afin d'éviter une aggravation des symptômes.

Choix des espèces

Des souris génétiquement modifée reproduisent la maladie de l’hypophosphatémie liée au chromosome X chez l’homme. Nous utiliserons les souris au stade jeune à l’âge de 1 mois pour étudier l’effet du traitement sur l’apparition de la maladie jusqu’à l’âge de 3 mois.