Procédures modérées

Treize écouvillonnages du nez et de la trachée, cinq lavages des bronches, deux ponctions de moelle osseuse et jusqu'à six prises de sang par semaine : 246 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 216 d'entre eux sont infectés par la grippe puis par un pneumocoque et seront tués pour analyse des tissus, les 30 autres pouvant être réutilisés dans d'autres études après récupération et avis vétérinaire. Le porteur décrit une ponction lombaire par macaque, pouvant provoquer un hématome sous-cutané et aller jusqu'à l'hémorragie intrarachidienne ou intramédullaire, et un hébergement individuel pendant la phase d'infection. Le choix de cette espèce tient, selon lui, à la proximité génétique et physiologique avec l'être humain, à un appareil respiratoire de structure et de dimensions voisines et à un système immunitaire qui réagit de façon similaire.

Objectifs

La grippe constitue un enjeu majeur de santé publique. Des complications sévères peuvent survenir notamment lorsque l’infection par le virus de la grippe est suivie d’une infection bactérienne, appelée « surinfection ». Dans ce cas, les défenses naturelles des poumons sont affaiblies par le virus, ce qui permet à certaines bactéries opportunistes de s’installer plus facilement et d’aggraver la maladie. L’une des bactéries les plus souvent impliquées est Streptococcus pneumoniae, responsable notamment de pneumonies. Les surinfections bactériennes surviennent le plus souvent chez les personnes les plus fragiles, comme celles hospitalisées pour une grippe sévère, les patients en réanimation ou ceux ayant déjà d’autres problèmes de santé. Dans ces situations, la combinaison du virus et des bactéries peut entraîner des formes graves de maladie, avec un risque accru de complications voire de décès. Ce projet cherche à réduire ces complications. L’objectif est d’évaluer la sécurité et l’efficacité de nouveaux traitements limitant la gravité de la maladie lorsque virus et bactéries sont présents en même temps.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, certaines bactéries, comme Streptococcus pneumoniae, deviennent de plus en plus difficiles à traiter, car elles résistent aux antibiotiques habituellement utilisés, ce qui rend les infections plus difficiles à traiter. Ce projet vise à évaluer de nouveaux traitements innovants pour lutter contre les infections à Streptococcus pneumoniae. Les résultats, obtenus dans un modèle animal proche de l’humain, fourniront des connaissances essentielles pour mieux comprendre ces infections et développer de nouveaux traitements. Ils permettront également de proposer des solutions plus efficaces aux patients et d’améliorer globalement leur prise en charge. Ce projet pourrait contribuer à mieux protéger la santé humaine face à un problème de plus en plus préoccupant à l’échelle mondiale : la résistance aux antibiotiques.

Procédures

Les interventions prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et seront regroupés pour limiter les anesthésies (1 à 7x par semaine, 246 animaux, 30-45 minutes) : Prélèvements : - Prélèvements sanguins (1 à 6 10 fois par semaine, 246 animaux, 5 minutes). - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux (13 fois, 246 animaux, 2 minutes) - Retrait de ganglions lymphatiques, (2 fois maximum, 216 animaux, 20 minutes) - Lavage broncho-alvéolaire (5 fois, 246 animaux, 10 minutes) - Ponction lombaire (1 fois, 216 animaux, 20min) - Moëlle osseuse (2 fois, 246 animaux, 10 minutes) Interventions - Implantation d’une puce de suivi de température (1 fois, 246 animaux, 30 minutes) - Infection par voie respiratoire, (2 fois, 216 animaux, 30 min) - Imagerie in vivo (5 fois, 246 animaux, 45 minutes) - Traitements avec des molécules thérapeutiques (jusqu’à 6 fois, 120 animaux, 5 minutes)

Impact sur les animaux

Les prélèvements et anesthésies répétés peuvent engendrer une perte d’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure, un hématome au niveau du site du prélèvement ou uneinfection au niveau du site de prélèvement dans les jours qui suivent le prélèvement. Après traitement, une réaction locale, des démangeaisons/douleurs dans les heures/jours suivant peuvent apparaitre. L’infection grippale peut causer de la fièvre, de la toux et un encombrement bronchique. Ces symptômes peuvent être augmentés par la surinfection par pneumocoque. L’état des animaux sera observé tous les jours et des points limites sont prévus dans le projet en cas de progression de la maladie ou d’éventuels effets inattendus du traitement. L’implantation de puces de télémétrie peut créer une réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons Les lavages bronchoalvéolaires, peuvent provoquer une toux, ou des difficultés respiratoires légères juste après le geste Les écouvillonnages nasotrachéaux peuvent provoquer un saignement nasal (léger à modéré) Le retrait de ganglions peut engendrer une réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours l’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui. La ponction lombaire peut amener à un hématome sous-cutané, pouvant aller jusqu’à l’hémorragie intrarachidienne ou intramédullaire.

Devenir

Tous les animaux infectés seront euthanasiés afin de réaliser des dosages et une analyse des tissus. Les autres animaux pourront être inclus dans d’autres études après récupération complète des animaux et sur avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’évaluer la sécurité et l’efficacité de nouvelles stratégies de traitements contre des infections respiratoires complexes associant le virus de la grippe et Streptococcus pneumoniae. À ce jour, les méthodes alternatives telles que les études menées sur des cellules en laboratoire (approches in vitro), sur des modèles informatiques (in silico), ou encore sur des tissus isolés (ex vivo) ne permettent pas de reproduire toute la complexité anatomique du poumon humain, notamment les interactions entre les différents types de cellules et tissus, et le fonctionnement du système immunitaire dans son ensemble. C’est pourquoi, malgré les efforts pour privilégier ces alternatives, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour atteindre les objectifs du projet. Ce modèle animal permet de reproduire la complexité de l’ensemble des mécanismes biologiques impliqués dans cette double infection et d’évaluer de façon fiable la sécurité et l’efficacité de nouveaux traitements avant toute application chez l’humain.

Réduction

Dans ce projet, plusieurs mesures sont mises en place pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Les premières étapes du projet serviront à ajuster les conditions d’infection les plus pertinentes (par exemple la quantité de bactérie utilisée) afin de reproduire de façon la plus fiable les symptômes observés chez l’humain sans multiplier les essais et selon un procédé, étape par étape, déjà publié dans la littérature scientifique. Pour affiner les paramètres importants comme la sécurité, la dose ou la manière d’administrer les traitements, seuls de petits groupes d’animaux seront utilisés. Cela permettra de sélectionner les meilleures conditions avant de passer à des études d’efficacité. Enfin, pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux par groupe est strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats solides et interprétables. Ce nombre a été déterminé de façon à pouvoir détecter de réelles différences entre les groupes tout en évitant d’utiliser plus d’animaux que nécessaire.

Raffinement

Les prélèvements et interventions sur les animaux sont réduits au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Ils seront effectués sous anesthésie générale pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs et seront regroupés au maximum lors d’une même anesthésie afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. L’état général des animaux sera observé quotidiennement. À chaque intervention, l’état de santé des animaux sera évalué à l’aide d’une grille d’observation. Si des signes de maladie apparaissent, le vétérinaire sera immédiatement prévenu afin d’adapter le suivi et les soins. Le recours à des médicaments anti-douleur pourra être envisagé si nécessaire. Les points limites seront raffinés en fonction des résultats obtenus au cours de la mise en place du modèle. Les prélèvements de sang et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Pour limiter l’irritation de la trachée liée à l’intubation lors du lavage pulmonaire, un spray anesthésique sera appliqué localement en amont de la manipulation. L’implantation de puces électroniques, permettant un suivi régulier de la température corporelle, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique sera appliqué avant la chirurgie. Les animaux seront hébergés en groupes avant infection et en hébergements individuels proches permettant des interactions sociales pendant la phase d’infection (conservation du contact sensoriel, et hébergements face à face séparés par 2 m). Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. Cet hébergement individuel est nécessaire pour éviter les biais lors de l’évaluation de la température mesurée par puce électronique, pour éviter une contamination croisée et limiter le stress lié à la cohabitation d’animaux développant la maladie

Choix des espèces

Dans ce projet, le modèle primate non-humain est choisi pour sa proximité génétique, et physiologique avec l'être humain, ce qui en fait le modèle le plus pertinent pour l’évaluation de traitements. Son appareil respiratoire ressemble beaucoup à celui de l’être humain, aussi bien par sa structure que par ses dimensions. Son système immunitaire réagit de manière similaire, avec une sensibilité aux mêmes types d’infections. De plus, les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés chez cette espèce. Ces études seront réalisées sur des animaux adultes. Le traitement à tester étant destiné principalement à la population adulte et le système immunitaire évoluant en fonction du stade de développement et de l’âge des individus, des animaux au système immunitaire mature seront donc utilisés dans ce projet.

2 232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont gavées une fois par jour pendant cinq jours, reçoivent dans le quadriceps sous anesthésie une injection de glycérol ou de cardiotoxine qui lèse le muscle, subissent des tests métaboliques avec injection intrapéritonéale et prises de sang à la queue, et une partie d'entre elles passe des tests d'agrippement, de cadre inversé et d'endurance sur tapis roulant. Une partie est soumise à un régime enrichi en lipides, dont le porteur écrit que l'inconfort peut durer plusieurs semaines, et les mises à mort sont échelonnées à 2-3, 6-7, 12-13 ou 18-19 mois pour prélever les tissus. L'effectif, lui, repose sur les habitudes expérimentales de l'équipe et sur des expériences préliminaires, un calcul de puissance étant présenté comme difficile à mettre en œuvre avec autant de tests dans la même procédure.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 3 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans les établissements utilisateurs 1 ou 3, la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux des établissements utilisateurs (EU1 et 2) (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

Irradiées en totalité à faible dose puis injectées de cellules cancéreuses humaines, 87 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque semaine, pendant huit semaines au maximum, elles reçoivent dans le ventre un produit d'imagerie, sont anesthésiées puis photographiées jusqu'à trente minutes, et subissent quatre à cinq prises de sang à la queue. Le porteur annonce une leucémie avec diminution de l'activité, perte de poids et développement possible de petites tumeurs intra-abdominales dans les trois premières semaines, et la mise à mort de toutes les souris au plus tard quatre-vingts jours après l'injection. Il écrit avoir échoué à établir une alternative humaine en trois dimensions, et conclut de cet échec qu'il est "nécessaire" de passer par la souris.

Objectifs

Le but de notre projet est de fabriquer un traitement contre un cancer du sang (leucémie ou lymphome) pour lequel il n’existe pas de traitement pour les patients qui rechutent ou qui ne répondent pas au traitement de chimiothérapie classique, en utilisant les globules blancs du système immunitaire de l’Homme, aussi appelée « immunothérapie ». Nous avons dans un premier temps réalisé des tests en laboratoire, avec des cellules cancéreuses et des cellules thérapeutiques dont les résultats semblent prometteurs et nécessitent maintenant d’être confirmés sur des souris, étape indispensable avant d’envisager des études chez l’Homme. Le projet va se dérouler en 2 étapes (2 tâches) avec d’abord une tâche pour déterminer le nombre de cellules cancéreuses à injecter pour déclencher la maladie puis une deuxième tâche pour tester nos cellules thérapeutiques en présence de cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

Pour le type de cancer du sang que nous étudions, les traitements basés sur les globules blancs (immunothérapie) ne sont pas encore disponibles pour les patients, en dehors d’essais cliniques précoces, que ce soit pour des adultes ou pour des enfants. Notre « immunothérapie » qui utilise un autre type de globules blancs que ceux habituellement utilisés, permettrait une approche thérapeutique plus efficace et ne présente pas de risque de rejeter le traitement.

Procédures

- Une radiothérapie corps entier de faible dose de chaque animal -Une injection intraveineuse sur animal éveillé, une seule fois en début d’expérience pour 9 souris de la tâche 1, et 2 fois pour 78 souris de la tâche 2. Ces injections se feront avec contention douce et dureront moins d’une minute. - Contention manuelle et injection ventrale d’un produit d’imagerie permettant de suivre les cellules leucémiques, - Pendant le temps où la substance agit (10min), induction de l'anesthésie pour que l’animal reste immobile pendant l’imagerie (15min max) - A l’issue des 10min d’attente, imagerie du signal lumineux (30min maximum). Ces injections auront lieu toutes les semaines pendant un maximum de 8 semaines. – 4 à 5 prélèvements de sang sur animal éveillé, au niveau de la veine de la queue, après anesthésie locale.

Impact sur les animaux

- L’injection intraveineuse est douloureuse mais de courte durée, et peut induire un saignement léger au point de ponction. - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront une maladie type leucémie avec une diminution de leur activité, une perte de poids et possiblement le développement de petites tumeurs en intra-abdominal dans les trois premières semaines sans traitement. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans le ventre. Les souris seront endormies et ne ressentiront aucune douleur pendant la prise des images. - Le prélèvement sanguin au niveau de la queue sera réalisé avant la prise des images, avec contention douce.

Devenir

Les souris étant dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules cancéreuses, une progression tumorale va se développer. Les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injection, ni en cas de point limite atteint. Elles seront mises à mort à la fin de l’expérimentation.

Remplacement

Nous poursuivons nos expériences sur des cellules afin de valider la fonctionnalité des cellules thérapeutiques et de limiter le nombre d'expériences réalisées sur les animaux. Cependant, à ce jour, malgré nos efforts, nous n'avons pas réussi à établir un modèle humain en 3D. Pour démontrer l'effet thérapeutique des cellules que nous développons à une fin thérapeutique il est nécessaire de mettre en place un modèle animal sur des souris. Par ailleurs tous les modèles de culture cellulaire disponibles pour l'étude du microenvironnement tumoral humain concernent les tumeurs solides et non les cancers liquides, comme les leucémies. À ce jour, aucun modèle in vitro (2 ou 3 dimensions) ni in silico ne permet de reproduire les interactions complexes entre cellules leucémiques et cellules thérapeutiques chez l’humain.

Réduction

Dans une volonté de réduction, la tâche 1 permettra de réduire le nombre d'animaux pour la tâche 2 en connaissant préalablement les bonnes doses administrées aux souris.

Raffinement

Les souris seront logées dans une grande cage suffisamment spacieuse avec des jouets et des matériaux. La pièce où les souris seront logées sera bien aérée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, une personne qualifiée vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, une grille de score permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper le mal être. L’utilisation d’anesthésique et la bonne organisation du plan d’expériences permet de réaliser les expériences dans un temps court afin de limiter le stress et les douleurs des souris.

Choix des espèces

La souris utilisée ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.

Valider un appareil neuf : 48 rongeurs, 24 souris et 24 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués par inhalation de CO2 à l'issue. Le premier jour, une session de 6 minutes 20 délivre un choc électrique de 0,4 mA pendant une seconde, et le lendemain deux sessions de rappel, l'une de six minutes sur le contexte, l'autre de huit minutes sur les indices, mesurent la peur conditionnée. Le porteur écrit qu'il n'existe pas de méthode de remplacement et que le conditionnement de la peur chez le rongeur est la référence pour l'étude de la mémoire aversive. Le projet vise la seule confirmation que le matériel neuf donne les mêmes réponses que celui qu'il remplace.

Objectifs

L’objectif du projet est de valider le nouveau matériel en reproduisant le protocole de conditionnement de la peur chez le rat et la souris, et de confirmer que les réponses comportementales observées sont comparables à celles obtenues avec le dispositif précédent.

Bénéfices attendus

La validation du nouveau matériel permettra de s’assurer de la reproductibilité du protocole de conditionnement de la peur chez la souris et le rat, et de confirmer la comparabilité des résultats avec ceux obtenus précédemment. Elle assurera ainsi la fiabilité du nouvel équipement pour les études à venir.

Procédures

Les animaux seront soumis au test de conditionnement de la peur. Ce test comprend 3 sessions. Le premier jour, une session de 6 min 20 sec est réalisée durant laquelle un choc électrique (0.4 mA pendant 1 sec) est délivré. Le deuxième jour, 2 sessions de test sont réalisées. Une session de rappel contextuel d'une durée de 6 min a lieu le matin. Une session de rappel des indices d'une durée de 8 min a lieu l'après-midi.

Impact sur les animaux

Le protocole de conditionnement de la peur implique un stimulus aversif modéré, qui peut induire un stress aigu transitoire chez les animaux.

Devenir

Le test ne pouvant être répété, les animaux seront euthanasiés par inhalation de CO2 à l'issue de la procédure.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode de remplacement. Le conditionnement de la peur chez le rongeur est le modèle de référence pour l’étude de la mémoire aversive.

Réduction

La variabilité des résultats obtenus avec ce nouveau dispositif n’étant pas encore connue, ce premier jeu d’animaux permettra d’en estimer la dispersion et de définir, pour les études futures, un effectif minimal adapté aux objectifs expérimentaux.

Raffinement

L'intensité du choc est faible (0,4 mA pendant 1 s) pour limiter la douleur. Les sessions sont courtes (6-8 min). Les animaux sont habitués aux manipulateurs et à la salle, logés avec enrichissement (nids), et observés attentivement avant/après chaque session.

Choix des espèces

Ces deux espèces couvrent les modèles utilisés dans le laboratoire. La validation sur souris et rat garantit la polyvalence du nouveau matériel pour les projets futurs. Les animaux seront utilisés au stade adulte jeune. Nous les réceptionnerons à l'âge de 8 semaines et ils seront testés à l'âge de 11 semaines.

3 800 rongeurs, 3 200 souris et 600 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir jusqu'à huit prises de sang en vingt-quatre heures et jusqu'à quatre-vingt-seize heures d'hébergement individuel en cage de collecte des urines et des fèces. Les molécules sont administrées par voie orale sans anesthésie, ou par injection sous anesthésie gazeuse. Tous sont tués à l'issue de chaque procédure pour prélever leurs organes. Le porteur présente ce travail comme une activité de plateforme, dont les résultats servent à décider de la poursuite ou de l'arrêt du développement d'une molécule.

Objectifs

Le développement d’un nouveau médicament est un processus long, qui nécessite de nombreuses étapes avant de pouvoir envisager son administration chez l’être humain. Il est notamment indispensable d’étudier son comportement dans un organisme vivant. Des équipements spécialisés permettent ainsi d’analyser comment une molécule est absorbée, distribuée dans les différents organes, transformée puis éliminée par l’organisme. Ces études permettent de déterminer si elle atteint bien les tissus ciblés, en quelle quantité, pendant combien de temps et par quelles voies elle est évacuée. Ces informations sont essentielles pour évaluer le potentiel d’une molécule innovante et accompagner son développement dans le cadre de projets de recherche scientifique et préclinique.

Bénéfices attendus

Les études menées par notre plateforme permettent de fournir des informations indispensables sur la répartition et la concentration de la molécule dans l’organisme, ainsi que sur sa persistance et ses voies d’élimination. Ces informations sont nécessaires pour évaluer la pertinence des molécules candidates et orienter la décision quant à la poursuite ou non de leur développement. D’un point de vue médical, une connaissance des paramètres de ces molécules dans des organismes vivants permettent une translation clinique de ces paramètres chez l’Homme.

Procédures

Un opérateur spécialisé réalisera une administration orale (30 secondes) sur un animal vigil ou une injection (30 secondes) sur animal sous anesthésie gazeuse. Des prises de sang(1 minute) seront réalisées : au maximum 8 sur une période de 24h par animal vigile. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant maximum 96 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines et les fèces.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables relatifs à la manipulation sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection ou un stress lié à la contention des animaux lors de l’administration orale, un stress lors de la prise de sang et un stress avec parfois une légère perte de poids lié à l’hébergement individuel dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines et fèces.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour prélever leurs organes.

Remplacement

Bien que des études in vitro ou des études preuve de concept soient réalisées en amont pour l’ensemble des molécules, il n’est pas possible de recréer in vitro ou in silico la complexité d’un organisme entier avec tous les composants biologiques qui entrent en jeu. Dans le cadre d’une application future en santé humaine, il est donc indispensable de mener une étude in vivo.

Réduction

Afin de limiter le recours aux animaux, une sélection préalable des molécules d’intérêts sera réalisée in vitro. Pour chaque molécule retenue, une seule dose sera évaluée in vivo. Cette dose sera définie à partir des paramètres pharmacologiques obtenues in vitro et des données in vivo préliminaires déjà disponibles dans la littérature. Enfin, les analyses statistiques reposeront sur un nombre minimum d’animaux. Les molécules seront évaluées chez les deux sexes avec le nombre minimum d’animaux à manipuler, soit 3 à 5 animaux par sexe.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi comprenant des maisons, des tunnels en carton, de la paille ou du mouchoir en papier pour leur nid et des bâtonnets en bois à ronger, pendant une période d’acclimatation d’au moins sept jours. Ils feront l’objet d’une surveillance quotidienne assurée par du personnel formé et habilité. Pour réduire ou supprimer le stress relatif aux administrations et aux prélèvements, ceux-ci seront réalisés dans une pièce au calme sans passage. La douleur engendrée est de courte durée et limitée par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse lorsque cela est possible. Bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, souffrance et angoisse associées à l’administration des composés, les animaux seront sous surveillance accrue durant les 24H à 96H de la manipulation. Afin de détecter au plus vite tout signe de souffrance , une surveillance de leur état général et de leur comportement sera réalisée grâce à une grille de score et à l’utilisation de points limites définissant les circonstances potentielles pour lesquelles des prises en charge appropriées doivent être mises en place rapidement. Enfin, pour réduire ou supprimer le stress lié à l’hébergement individuel dans les cages spéciales permettant de recueillir les urines, les animaux maintiendront un contact visuel, olfactif et auditif car les cages sont transparentes, semi-ouvertes et localisées sur le même portoir dans la même pièce. De plus, des bâtonnets à ronger et des jeux suspendus seront ajoutés dans ces cages.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des organismes-modèles reconnus pour l’étude de la physiologie et de la physiopathologie de l’être humain. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, correspondant à une période où les principales fonctions physiologiques, métaboliques, rénales, cardiovasculaires et hépatiques sont matures et stabilisées. Ce stade permet d’obtenir des paramètres biologiques interprétables, tout en limitant les biais liés à la croissance, au développement postnatal ou au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes est ainsi adaptée aux objectifs du projet et cohérente avec les standards des études précliniques réalisées chez le rongeur.

Tués à l'issue de l'expérience parce que la capsule de mesure implantée dans un muscle interdit ensuite leur abattage pour la consommation, 45 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La pose se fait sous anesthésie courte, après incision, et les porcs subissent ensuite une élévation progressive de la température ambiante reproduisant une vague de chaleur estivale. Neuf d'entre eux portent en plus deux capteurs à microaiguilles posés sous sédation dans l'encolure et maintenus jusqu'à six jours, et cinq collectes de salive sont réalisées sur l'ensemble du groupe. Le porteur reconnaît qu'une hyperthermie grave au-delà de 41,5 °C ne peut pas être exclue durant les heures les plus chaudes, et attend de ces données des recommandations de conduite d'élevage adaptées à des vagues de chaleur plus fréquentes.

Objectifs

Le projet vise à caractériser la réponse de porcs en croissance à une vague de chaleur en fonction des choix alimentaires fait par l’animal avant, pendant et après l’exposition à une température ambiante élevée.

Bénéfices attendus

Les données collectées seront utilisées pour déterminer l’aptitude des porcs à faire des choix alimentaires qui facilitent leur adaptation à une vague de chaleur, et selon des dynamiques journalières qui sont déterminées par chaque animal. Ces données sont indispensables pour recommander de futures stratégies de conduite en élevage au regard des conditions climatiques futures (fréquence accrue de vagues de chaleur estivales), et qui seront compatibles avec certains principes de l’agroécologie (utiliser les ressources internes au système d'élevage, préserver la santé des animaux, valoriser des ressources alimentaires localement produites). Les connaissances acquises sont aussi de nature à nous permettre de mieux connaitre la relation entre le fait d’offrir des choix à l’animal dans son milieu d’élevage et son niveau de bien-être.

Procédures

Pour suivre les effets de la chaleur ambiante sur la physiologie des porcs en croissance et leur confort, une capsule connectée de mesure de la température interne sera placée sur 45 porcs au début de l'expérimentation. Sur 9 porcs, deux capteurs seront aussi placés au niveau de l'encolure de l'animal, pour mesurer les échanges de minéraux et de glucose dans le liquide circulant sous la peau; ils seront maintenus en place durant 6 jours maximum. Lors de cinq matinées, des collectes de salive seront également réalisées pour les 45 porcs en leur tendant un tampon de gaze qu'ils viennent spontanément machouiller.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont principalement celles liées à l’exposition à une température ambiante plus élevée que la température de confort thermique. Le porc est un animal capable de s’adapter à la survenue d’une vague de chaleur. Dans ce projet, les variations de températures ambiantes seront gérées de manière progressive avec des températures minimales chaque jour permettant une récupération de l’animal lors des phases plus fraîches et un ajustement de ses comportements. La survenue d’une hyperthermie grave (>41,5°C) ne peut cependant pas être exclue durant les heures les plus chaudes. La pose d'un capteur de température pour suivre les évolutions de la température interne en dynamique nécessite une anesthésie courte et une petite incision sur un muscle; le processus de cicatrisation peut entraîner une légère douleur temporaire. Cependant, ce capteur nous permet aussi de détecter précocement un animal qui supportera mal la vague de chaleur, et d'agir rapidement avec un bénéfice immédiat pour sa santé. Deux capteurs sont aussi posés sous sédation légère, et la présence de microaiguilles qui pénètrent le derme (couche superficielle de la peau) peut entraîner une légère gêne pour l’animal lors de certains mouvements. Les régimes alimentaires diffèrent principalement par leur teneur en fibres et par la production de chaleur endogène que leur ingestion va produire. Exprimés par kg d’aliment, ils sont formulés pour apporter strictement au même niveau les nutriments nécessaires à l’animal (énergie nette, acides aminés digestibles, éléments traces dont minéraux et vitamines).

Devenir

L'implantation d’une capsule interne de mesure de la température, un dispositif nécessaire pour étudier les variations dynamiques de la température corporelle lors d’une exposition à la chaleur puis d’un retour à une température ambiante de confort, n'est pas compatible avec le retour des animaux comme fournisseurs de viande dans la chaine alimentaire. Ils seront donc euthanasiés à la fin de l'expérimentation.

Remplacement

Le porc est l'espèce cible de ce projet qui vise à étudier les réponses comportementales et physiologiques face à une élévation de la température ambiante mimant la survenue d’une vague de chaleur estivale, et à évaluer si offrir le choix entre plusieurs aliments permet à l’animal de limiter l’inconfort ressenti et les conséquences de la chaleur sur sa physiologie. Il n'est pas possible d'obtenir ces réponses sans utiliser des animaux représentatifs des élevages porcins commerciaux, puisque le projet vise à formuler ensuite des recommandations pratiques pour les éleveurs. L’espèce porcine présente la particularité de ne pas avoir de glandes sudoripares (glandes qui produisent de la sueur). Il n’est donc pas possible de remplacer cette espèce par une autre. Enfin, ce projet contribue à explorer si la possibilité d’exercer un choix (ici entre deux aliments) permet à l’animal d’avoir un meilleur contrôle de son environnement, ce qui peut améliorer son bien-être ; la réponse à cette question est fortement dépendante des comportementaux individuels et d’interactions avec les autres qui sont propres à l'espèce. Etudier les comportements animaux ne peut pas se faire sur des cellules cultivées in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour un projet qui considère deux lots expérimentaux visant à étudier si les choix alimentaires en période de forte chaleur dépendent du régime reçu durant la période préalable d’élevage à thermoneutralité (n = 22 à 23 porcs / lot). Ce nombre a été aussi raisonné pour un logement en petits enclos collectifs de 3 porcs chacun (la case est dans ce cas l'unité statistique) pour déterminer si les interactions sociales peuvent expliquer des différences entre individus dans le comportement alimentaire (fractionner ses repas, les décaler à certaines périodes selon le mimétisme entre les animaux, la concurrence à l’auge, etc.). Chaque porc est son propre témoin durant les quatre semaines expérimentales, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour analyser l’effet du stress thermique sur la dynamique des choix alimentaires. Des capteurs intradermiques sont posés sur uniquement neuf porcs pour valider leur utilisation comme outils de mesure des mécanismes physiologiques de l’adaptation à une vague de chaleur quand les animaux sont logés en petits groupes sociaux.

Raffinement

Les porcs seront élevés en petits groupes (3 porcs par enclos) pour préserver leus besoins sociaux tout en suivant l’activité de chaque animal (activité d’exploration de son environnement et d’interactions avec ses congénères). La pose d’une capsule de mesure de la température corporelle au début de l'expérimentation évitera tout stress généralement associée à une prise manuelle et répétée de température via un thermomètre rectal. Cette capsule améliore également la qualité de la mesure obtenue (fréquence et précision) pour suivre la façon dont l'animal régule sa température. La pose de capteurs physiologiques sur la peau (pénétration légère du derme) permettra d’éviter des prises de sang répétées pour évaluer la dynamique des concentrations sanguines en sels minéraux ou en glucose, nécessaire pour évaluer les changements métaboliques en réponse à la vague de chaleur ambiante. Pour des raisons techniques (nombre de connectiques disponibles) et scientifiques (éviter de perturber tous les animaux juste avant la vague de chaleur), ces capteurs seront posés sur un petit nombre de porcs. L'utilisation de tampons de gaze constitue une procédure éprouvée pour la collecte de salive, en alternative aux prises de sang pour le dosage des hormones du stress (cortisol). Cela raffine les manipulations de l'animal grâce à une habituation préalable à venir spontanément machouiller le tampon de gaze durant les premiers jours de l'expérimentation.

Choix des espèces

Le porc ne peut pas être remplacé par une autre espèce compte tenu de la particularité de la régulation de sa température interne, puisqu'il ne possède pas de glandes sudoripares actives (pas de production de sueur). Le porc est aussi l'espèce cible du projet qui vise à étudier les réponses physiologiques et les réponses comportementales face aux modifications de son environnement d’élevage. Les capacités à faire des choix alimentaires et celles d’apprentissage pour l'utilisation d'un distributeur automatique d'alimentation offrant ce type de choix, sont spécifiques à chaque espèce. Nous travaillerons donc sur des porcs âgés de 90-100 jours, ce qui correspond à une gamme de poids entre 50 kg et 70 kg. Cette gamme de poids respecte la législation inhérente à la taille des enclos (espace disponible et densité), et représente la plus grande partie des effectifs animaux au sein d'un élevage de porc. A ce stade de croissance, le porc est très sensible à la chaleur mais peut aussi compenser la baisse de l’énergie contenue dans l'aliment par une surconsommation d’un autre aliment, ce qui est important pour comprendre les choix alimentaires (quantité ingérée, type d'aliment et moment du repas) qu'il va faire face à une vague de chaleur.

Dépourvues de système immunitaire pour accepter la greffe de cellules cancéreuses humaines, et de ce fait plus fragiles face aux infections, 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans la veine de la queue sans anesthésie, une prise de sang par semaine pendant trois semaines, puis une injection de cellules tumorales sous la peau du flanc, la croissance de la tumeur étant suivie jusqu'à six mois. Le porteur indique que la tumeur sous-cutanée peut gêner la souris pour se déplacer et fragiliser la peau, et que la maladie peut entraîner fatigue, perte de muscle et perte de poids. Toutes seront tuées pour prélever leurs organes et leurs tumeurs et mesurer la toxicité de deux candidats médicaments, comparés à un traitement déjà administré à des patients.

Objectifs

Ce projet vise à mettre au point de nouveaux médicaments « intelligents » pour lutter plus efficacement contre le cancer. Ces médicaments transportent une substance toxique pour s'attaquer aux cellules cancéreuses tout en étant plus stables dans l'organisme. Cette stabilité permet au médicament d'être plus efficace sur la tumeur tout en réduisant les effets secondaires pour le patient. Après avoir testé plusieurs options en laboratoire (test in vitro sur cellules en culture), nous avons sélectionné les deux médicaments les plus prometteurs. Nous allons maintenant vérifier, chez la souris, quelle est la dose maximale que l'organisme peut supporter sans risque (test de toxicité) et mesurer leur capacité réelle à réduire la taille des tumeurs. Nous allons faire le test en comparant ces nouvelles molécules avec un médicament déjà utilisé pour le traitement de patients.

Bénéfices attendus

L'utilisation de ces médicaments de nouvelle génération représente une piste très prometteuse pour traiter le cancer de manière ciblée. Grâce à des technologies améliorées, cette stratégie permet d'attaquer directement les cellules cancéreuses tout en épargnant les tissus sains, ce qui limite les effets indésirables. Il a déjà été montré que ces agents sont capables de détruire des cellules cancéreuses (notamment issues de cancers du côlon) qui résistent habituellement aux traitements classiques. Nous espérons que cette étude confirmera l'efficacité de ces médicaments pour soigner des tumeurs solides, offrant ainsi aux patients une meilleure espérance de vie et une qualité de vie préservée durant leur traitement.

Procédures

Pour évaluer la sécurité de nos nouveaux médicaments, nous réaliserons une injection unique dans la veine de la queue (souris non anesthésiée, durée: 30s) de souris saines. Durant les trois semaines suivantes, nous effectuerons une prise de sang hebdomadaire pour surveiller leur état de santé (souris non anesthésiée, durée: 30s). Pour tester l'efficacité de nos traitements contre le cancer, nous injecterons des cellules tumorales sous la peau des souris, au niveau du flanc (souris non anesthésiée, durée: 1 min). Une fois que la tumeur aura atteint une taille définie, nous administrerons le médicament par voie intraveineuse dans la queue (souris non anesthésiée, durée: 30s). Nous observerons ensuite l'évolution de la tumeur sur une période pouvant aller jusqu'à 6 mois pour vérifier si le traitement permet de stopper sa croissance ou de la réduire. À la fin de l'étude, un prélèvement sanguin sera effectué (souris non anesthésiée, durée: 30s).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet n'ont pas de système de défense contre les microbes, leur permettant d'accepter l'injection de cellules tumorales d'origine humaine. Par contre, cela les rend plus fragile vis-à-vis des infections. L’administration du traitement et les prélèvements de sang peuvent générer un stress et une éventuelle gêne temporaire. Le développement de la tumeur sous la peau peut gêner la souris pour se déplacer. La peau au niveau de la tumeur peut également se fragiliser. Comme dans de nombreux cancers, la maladie peut entraîner une fatigue générale, une perte de muscle et de poids. Enfin, le médicament injecté lui-même peut provoquer des effets secondaires, comme des troubles de la digestion ou une baisse de l'activité habituelle de la souris.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés pour prélèvements d'organes et de tumeurs post-mortem afin d’évaluer la toxicité des molécules sur l’organisme et sur la tumeur.

Remplacement

À l'heure actuelle, aucun test sur des cellules isolées ne permet de reproduire fidèlement les interactions complexes qui existent au sein d'un organisme vivant. Dans le corps, les cellules cancéreuses ne sont pas seules : elles interagissent en permanence avec les cellules du système immunitaire, les vaisseaux sanguins et d'autres tissus environnants. Les modèles de laboratoire actuels sont trop simplifiés et ne permettent pas de simuler cet environnement complexe. Par conséquent, pour vérifier si ce nouveau traitement est réellement capable d'atteindre sa cible et d'agir efficacement sans causer de dommages imprévus, il est indispensable de le tester sur un modèle animal vivant entier, qui est le seul capable de refléter la complexité réelle de la maladie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été précisément calculé à l'aide d'outils mathématiques pour utiliser le strict minimum nécessaire à l'obtention de résultats fiables et solides.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. En raison de leur fragilité, les souris sont hébergées dans une structure répondant aux normes sanitaires requises avec de l’eau et de la nourriture à volonté. Des enrichissements sont mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger) afin que les animaux puissent répondre à leurs besoins primaires. Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux. Trois fois par semaine, l'évaluation de signes cliniques sera réalisée à l’aide d’une grille d'évaluation comprenant différents critères comme l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. En fonction de la présence et de la catégorie du critère observé, différentes actions seront mises en place: augmentation du suivi clinique, accessibilité de la nourriture facilité et euthanasie de l’animal en cas d’attente de point limites.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour étudier l’effet de nouveaux médicaments sur la croissance des tumeurs. Pour ce projet, nous utiliserons des souris n’ayant pas de système immunitaire. Cela est indispensable pour que les cellules cancéreuses humaines puissent se développer chez l'animal et pour que nous puissions tester l’efficacité de nos traitements, qui sont spécifiquement conçus pour reconnaître des cibles humaines. Nous utiliserons des souris adultes pour l'ensemble des tests. Ce choix est important car les cancers que nous étudions touchent principalement des patients adultes ; il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dont le stade de développement correspond à celui des personnes que nous souhaitons soigner à l'avenir.

Chacune des 96 femelles macaques à longue queue utilisées est anesthésiée une quarantaine de fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent, par macaque, une infection vaginale par Chlamydia trachomatis, une à six injections de vaccin ou de placebo, l'implantation d'une puce de télémétrie, une quarantaine de prélèvements de sang, une trentaine d'écouvillonnages vaginaux, quinze biopsies vaginales et sept biopsies ganglionnaires. Le porteur attend des diarrhées, un amaigrissement, une cervicite avec écoulement purulent, une anémie transitoire et des infections cutanées aux sites de prélèvement, et prévoit des phases d'hébergement individuel dont il reconnaît qu'elles peuvent provoquer stress et ennui. Cinquante-deux macaques seront tuées pour analyse des organes cibles de l'infection, les quarante-quatre autres gardées en vie et réutilisées après vérification de leur état sanitaire par le vétérinaire.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre une infection sexuellement transmissible fréquente causée par la bactérie Chlamydia trachomatis, et à tester de nouvelles stratégies de vaccination pour essayer de la prévenir. Cette infection est très répandue dans le monde. Elle passe souvent inaperçue, en particulier chez les femmes, car elle ne provoque pas toujours de symptômes. Pourtant, elle peut avoir des conséquences graves, notamment sur la fertilité, en augmentant le risque de douleurs chroniques, de grossesse extra-utérine ou d’infertilité. Les traitements antibiotiques permettent de soigner l’infection, mais ils ne suffisent pas toujours à empêcher la propagation de l’infection dans la population ni à éviter certaines complications. Le développement d’un vaccin pourrait donc représenter un progrès important pour la santé publique. Le projet a pour objectif de mieux comprendre la manière dont cette infection se développe dans l’organisme et d’évaluer de nouveaux vaccins potentiels. Les nouveaux modèles d’infection développés dans ce projet permettront d’étudier une situation plus proche de celle observée chez l’être humain. Les candidats vaccins ayant montré des résultats satisfaisants chez le primate non humain pourront ensuite faire l’objet d’évaluations complémentaires en vue d’un possible développement clinique chez l’être humain. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles approches de prévention pour réduire les conséquences de cette infection dans la population.

Bénéfices attendus

Le modèle d’infection développé dans ce projet aidera à mieux comprendre comment la bactérie Chlamydia trachomatis infecte l’organisme et s’y développe. Il permettra de disposer d’un outil proche de ce qui se passe chez l’être humain pour tester de futurs vaccins. Les candidats vaccins les plus prometteurs, après des résultats encourageants chez l’animal évalué au cours de ce projet, pourraient ensuite être utilisés chez l’être humain. À plus long terme, ces recherches pourraient contribuer à développer de nouvelles méthodes de prévention contre cette infection, avec pour objectif de réduire ses effets sur la santé publique

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (40 fois environ , entre 5 et 30 minutes sur tous les animaux) Les différentes interventions dans ce projet sont : - Injection des vaccins ou placebo (1 à 6 fois, tous les groupes vaccinés et contrôles, 5 min) - Infection vaginale avec la bactérie Chlamydia trachomatis (1 fois, tous les animaux, 15 min) - Prélèvement de sang (40 fois environ, tous les animaux, 5min) - Ecouvillonnage vaginal (30 fois environ, tous les animaux, 5 min) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, tous les animaux, 20 min) - Biopsies ganglionnaires (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux) - Biopsies vaginales (15 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux vaccinations et aux biopsies (peu attendues) : Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’administration ou les prélèvements. Nuisances liées à l’infection : diarrhée, amaigrissement, cervicite avec écoulement purulent (peu attendus). Nuisances liées aux anesthésies et prélèvements de sang : troubles de l’appétit avec plus ou moins de pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : l’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

En fonction des résultats obtenus, certains animaux pourront être euthanasiés à la fin de la procédure pour des analyses plus approfondies des organes cibles de l’infection. Les autres animaux seront gardés en vie à la fin de l’étude et réutilisés une fois que l’état sanitaire des animaux aura été vérifié par le vétérinaire compétent.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour mimer la pathologie observée chez l’être humain suite à l’infection par Chlamydia trachomatis. En effet, ce modèle animal permet de reproduire la réponse immunitaire induite par la vaccination et par l’infection dans un organisme entier, ce qui n’est pas réalisable avec les modèles ne recourant pas à l’animal de laboratoire (in vitro, in silico et ex vivo). Le primate non humain étant proche physiologiquement de l’être humain, son utilisation permet une meilleure extrapolation des résultats chez celui-ci.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats. Il a été ajusté au strict minimum nécessaire pour permettre une interprétation robuste des effets des conditions expérimentales, tout en prenant en compte la variabilité entre individus.

Raffinement

Les animaux seront suivis tous les jours, par une équipe dédiée. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront prises (arrêt des interventions, traitement, sortie d’étude), selon avis du vétérinaire et de la structure chargée du bien-être animal. En cas d’apparition de douleurs ou de signes cliniques liés aux prélèvements ou à l’infection, un traitement symptomatique pourra être mis en place. L’ensemble des interventions et les prélèvements seront regroupés au maximum et réalisés sous anesthésie générale des animaux. Les prélèvements sanguins, l’implantation de puces de télémétrie ou l’administration de vaccins peuvent entraîner des réactions locales (douleur, gonflement ou irritation). Si nécessaire, des soins appropriés, tels qu’une désinfection et un traitement contre la douleur, seront mis en place sur avis vétérinaire. Des phases d’hébergements en individuel seront nécessaires au cours du projet. Cet hébergement individuel pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou sachet surprise au lieu d’1 pour les hébergements en groupe). Cet hébergement individuel est nécessaire pour l’évaluation de certains paramètres biologiques notamment la température corporelle et pour limiter la surexposition bactérienne.

Choix des espèces

Seuls les primates non humains présentent des caractéristiques anatomiques et biologiques en termes de réponse immunitaire et vaccinale suffisamment proches de l’être humain pour permettre une étude pertinente de l’infection par Chlamydia trachomatis et de l’immunité. Nous avons choisi le macaque cynomolgus, modèle d’infection pour la bactérie d’intérêt déjà utilisé dans des études scientifiques précédentes et chez qui les techniques et outils d’exploration du système immunitaire sont disponibles et maitrisés. Notre étude, qui s’intéresse à l’infection vaginale par Chlamydia trachomatis nécessite d’avoir accès à des femelles adultes et matures.