Procédures modérées

180 rongeurs, 120 souris et 60 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour des travaux pratiques de pharmacologie destinés à des étudiants. Chaque animal reçoit des injections par plusieurs voies, une incision de la queue pour doser la glycémie et passe des tests de comportement, les mêmes animaux servant à quatre séances espacées d'au moins une semaine. Le porteur indique que ces gestes et un jeûne de douze heures avant les séances peuvent provoquer stress et douleur. Il présente ces séances comme une découverte de l'expérimentation in vivo, les animaux étant réutilisés puis, pour ceux qui ne le sont pas, tués.

Objectifs

Ce projet a pour objectif pédagogique de faire découvrir aux étudiants l’expérimentation in vivo. Il vise à proposer des TP de pharmacologie expérimentale aux étudiants inscrits dans 3 parcours universitaires différents. Ces parcours universitaires peuvent destiner les étudiants vers les métiers de l’industrie pharmaceutique ou de la recherche dans lesquels des connaissances sur l’expérimentation animale sont nécessaires. L’ensemble des TP sont réalisés avec des souris swiss et/ou des rats wistar qui sont des modèles communément utilisés pour la recherche. Il s’agit également de souches calmes qui pourront être plus facilement manipulées par les étudiants. Afin de respecter le bien-être animal, les TP sont réalisés en accord avec les exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (3R) : le nombre d’animaux est réduit au minimum et les mêmes animaux sont réutilisés pour les 4 travaux pratiques. De plus, les TP seront encadrés par des enseignants qualifiés avec le niveau concepteur.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche éducative. En effet, l’objectif est de faire découvrir l’expérimentation in vivo à des étudiants destinés à des métiers où des connaissances sur l’expérimentation animale sont nécessaires. Pour ce faire, différents travaux pratiques vont être réalisés afin de présenter aux étudiants plusieurs protocoles qui peuvent être réalisés en expérimentation in vivo. L’ensemble des TP seront réalisés dans le respect de l’éthique en expérimentation animale et les enseignants veilleront au bien-être des animaux tout au long des travaux pratiques.

Procédures

Contention de l’animal. Sur chaque animal (souris et rats) et au maximum 2 fois par séance, une injection intra-péritonéale (3 min) une administration par voie orale (1 min) et une injection sous-cutanée (3 min) seront réalisées. Une incision à l’extrémité de la queue après application d'une crème anesthésiante sera effectuée afin de prélever une goutte de sang à 4 temps différents. Pour le comportement (uniquement chez la souris), chaque animal recevra une unique injection intra-péritonéal (3 min) puis réalisera 4 tests de comportement différent (20 min pour les 4 tests). Pour la mesure de la pression artérielle, les rats seront placés dans un tunnel de contention quelques minutes afin de placer le brassard gonflable. Les mêmes animaux seront réutilisés pour les TP en respectant un intervalle d'une semaine au minimum entre chaque TP pour le bien-être des animaux.

Impact sur les animaux

Lors des travaux pratiques, les animaux recevront des administrations par voie orale, intra-péritonéale et/ou sous-cutanée. Ces injections peuvent engendrer un stress chez les animaux. Lors d'un TP, les rats seront placés dans un tunnel de contention quelques minutes afin de réaliser la mesure de la pression artérielle. Cette contention peut engendrer un stress. Lors d'un autre TP, une incision est réalisée à l’extrémité de la queue de l’animal pour récupérer une goutte de sang et cela peut entrainer une douleur. De plus, les animaux seront privés de nourriture 12h avant la séance de TP. Cela peut engendrer un stress.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront proposés au sein de l’EU et potentiellement réutilisés. Les animaux non réutilisés seront euthanasiés

Remplacement

Ces TP visent à sensibiliser les étudiants aux bonnes pratiques de l’expérimentation animale en conformité avec la réglementation et dans le respect du bien-être animal et de la règle des 3R. Pour cela, il est important que l’étudiant soit en contact avec l’animal. Cet enseignement pratique vient en complément de cours magistraux dans lesquels sont abordés la règlementation, l’éthique, la règle des 3R, les méthodes alternatives, les différents types d’animaleries, la conception de projets). Il vient aussi en complément de TP réalisés in vitro. L’objectif de cette formation est de préparer les étudiants à leur insertion professionnelle dans les laboratoires pharmaceutiques dans le domaine de la R&D.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum pour l’ensemble des TP, mais sera suffisant pour que chaque étudiant puisse manipuler un animal. Deux parcours universitaires réalisent les TP à la même période de l’année donc les mêmes animaux seront utilisés (12 rats et 12 souris au total). Les étudiants du troisième parcours universitaire réalisent les TP à une autre période de l’année donc les animaux ne pourront pas être réutilisés mais afin de réduire le nombre d’animaux, les TP seront réalisés uniquement sur des souris (12 souris au total).

Raffinement

Lors des TP, les animaux recevront des administrations par voie orale, intra-péritonéale et/ou sous-cutanée. Au maximum, deux administrations seront réalisées pour chaque voie et les volumes administrés seront largement inférieurs aux volumes maximaux autorisés. Les administrations seront espacées dans le temps du TP afin de minimiser le stress lié à cette procédure. Lors d'un des TP, après l’application d’une crème anesthésiante, une incision sera réalisée à l’extrémité de la queue de l’animal afin de doser la glycémie. A l’issue de la manipulation, de la biseptine sera appliquée pour éviter toute infection. Les jours suivants, les animaux seront surveillés pour s’assurer de la bonne cicatrisation. Les séances de TP seront espacées au minimum d’une semaine afin de réduire au maximum le stress occasionné lors de la manipulation des animaux. Entre chaque séance, les animaux seront surveillés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces animales les plus couramment utilisés pour l’enseignement et la recherche. Les souches choisies sont calmes et adaptées aux travaux pratiques avec les étudiants. Les animaux seront âgés de 7 à 8 semaines au démarrage du premier TP. Ensuite les procédures se dérouleront sur une période de minimum 2 semaines et maximum 4 semaines. Réaliser les expériences sur des animaux âgés de 7 à 11 semaines permet d’avoir des jeunes animaux en bonne santé et facilement manipulable tout au long des travaux pratiques.

250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit quatre à sept injections d'un antigène et plusieurs prélèvements de sang, avant d'être tuée pour prélever sa rate et produire des anticorps servant à des kits de diagnostic. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer une sensibilité locale, voire un affaiblissement et un mal-être selon l'antigène. Il précise que la production se fait ensuite in vitro, le recours à l'animal se limitant à l'immunisation, et signale des technologies alternatives "en cours d'étude" mais jugées encore insuffisantes.

Objectifs

Le diagnostic de plusieurs maladies graves chez l'homme ou animal comme les hépatites, des maladies tropicales nécessite l'utilisation de kits de diagnostic fabriqués avec des anticorps monoclonaux qui sont produits in vitro dans des bioréacteurs. Cependant, pour le démarrage de ces productions, une phase animale qui utilise très peu d'animaux permet d'initier le développement de ces anticorps monoclonaux. En effet, la première étape consiste à immuniser un petit nombre de souris avec la molécule d'intérêt (Antigène). La souris sera la seule espèce utilisée pour ce projet. Cette espèce reste l'un des modèles référence pour le développement d'anticorps monoclonaux dans les Immunoessais, il est très documenté. A l'issue de la procédure, les organes lymphoides (rate) sont prélevés. C'est la seule étape qui nécessite un recours à l'animal. Toutes les étapes ultérieures sont réalisées in vitro, tri des cellules spléniques, obtention des hybridomes, production des anticorps (bioréacteur).

Bénéfices attendus

L'utilisation des anticorps monoclonaux dans des applications de diagnostic in vitro permet d'améliorer la prise en charge des patients dans différents domaines en santé humaine notamment dans les maladies infectieuses. La réponse des tests Immunoessais est rapide et va aider à l'orientation des choix de traitement.

Procédures

La phase d'immunisation est réalisée par des injections répétées de l'antigène par différentes voies sur animaux vigiles. 4 à 7 injections peuvent être réalisées sur un animal dans une procédure selon une séquence bien définie. Chaque injection dure moins de 2 minutes. Des prélèvements sanguins sont également réalisés pour suivre la réponse immunitaire de l'animal. Un maximum de 3 à 4 prélèvements sanguins sont réalisés sur un animal dans une procédure, la durée est de 2 minutes environ.

Impact sur les animaux

Les injections peuvent générer une sensibilité au point d'injection du fait de la piqure. L'injection par voie intraveineuse plus délicate peut selon l'antigène injecté générer des nuisances plus importantes comme un affaiblissement, un mal être général. Les prélèvements sanguins sont générateur de stress et de douleur au site de prélèvement. Ils sont réalisés sous anesthésie gazeuse.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Dans un lot d'animaux, ceux qui ont développé une réponse satisfaisante sont mis à mort pour prélèvement des organes lymphoides (rate). Les autres animaux du lot s'il en reste sont également mis à mort sans prélèvement d'organes.

Remplacement

Le recours à l'animal se limite exclusivement à la phase d'immunisation afin de pouvoir disposer des cellules spléniques qui sécrètent les anticorps d'intérêt. Depuis de nombreuses années, la production des anticorps se fait complètement in vitro à l'aide de bioréacteurs. Des technologies alternatives sont en cours d'étude et de développement dans l'objectif de s'affranchir de l'animal. Aujourd'hui, les premières tentatives ne permettent pas encore d'obtenir des anticorps avec totalement les performances attendues pour des applications de diagnostic in vitro.

Réduction

Depuis 10 ans, le nombre d'animaux utilisés pour cette phase d'immunisation a été diminuée de 70%. L'optimisation de nos procédures liée à l'expérience du laboratoire a permis la réduction du nombre de lots d'animaux utilisés. A ce jour, seulement un lot de 3 à 5 animaux est utilisé dans une procédure afin de limiter le nombre d'animaux tout en s'affranchissant de la variabilité biologique individuelle. Un lot d'animaux va permettre d'obtenir environ 20 à 50 anticorps qui seront ensuite sélectionnés en fonction de leurs performances. La demande pour ce projet est de 250 souris. Ce nombre permet d'envisager le développement de plusieurs centaines d'anticorps monoclonaux différents.

Raffinement

A leur arrivée à l'animalerie, les souris s'acclimatent pendant une durée minimale de 7 jours avant tout geste technique. Les animaux sont hébergés en nombre (3 à 5 souris) dans des cages conformes aux recommandations de la directive en vigueur et placées dans des enceintes ventilées. Les cages sont agrémentées de divers enrichissements tels que tunnel pour se cacher, buchettes à ronger, coton pour la nidification. Les animaux sont visités quotidiennement et examinés chaque semaine lors du changement de la litière. Les gestes techniques (injections et prélèvements) sont réalisés par le personnel formé. Les volumes des injections respectent les recommandations faites pour l'espèce selon les voies utilisées, il en est de même pour les prélèvements sanguins qui sont réalisés sous anesthésie gazeuse pour limiter la nuisance du geste. Des délais sont systématiquement respectés entre 2 injections et entre chaque prélèvement sanguin. Des points limites adaptés à l'espèce ont également été établis selon des critères de comportement, d'aspect physique et physiologique. Pour chaque critère, plusieurs niveaux et un point limite sont définis. Si nous observons un affaiblissement, un mal être de l'animal, la surveillance est augmentée durant 24 heures à intervalle régulier de 4 heures dans la journée, l'animal est hydraté et de la nourriture est placée à proximité. Si l'état de l'animal continue à se dégrader et qu'un point limite est atteint, l'animal est euthanasié.

Choix des espèces

La souris reste l'un des modèles référence pour le développement d'anticorps monoclonaux, il est très documenté notamment pour la mise en oeuvre de la technologie de développement d'un hybridome qui permet d'obtenir une lignée cellulaire stable produisant un anticorps unique spécifique d'une molécule donnée. De jeunes adultes entre 4 et 6 semaines permettent d'obtenir une meilleure réponse immunitaire, ce qui limite le nombre de rappels et donc d'interventions sur l'animal.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux sont séparés de leur mère puis exposés de façon répétée à une baisse d'oxygène (hypoxie intermittente), avec imagerie du cerveau sous anesthésie et tests d'exploration, pour étudier les conséquences de l'apnée du sommeil de l'enfant. Le porteur indique que la séparation maternelle peut générer de l'angoisse et que le protocole ralentit la croissance, et que toutes les souris sont tuées entre 30 et 35 jours pour prélever leur cerveau. Il affirme que les méthodes sans animaux ne peuvent répondre à la complexité d'un "organisme entier" et juge le modèle animal "indispensable".

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) de l’enfant est une maladie fréquente (4% des enfants) responsable à moyen terme de difficultés scolaires, de troubles du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité et à long terme potentiellement de complications cardiovasculaires. Le SAOS est caractérisé par une alternance de périodes d’apnées et de périodes de respiration sans apnées. Durant les phases d’apnées, les patients présentent une diminution du taux d’oxygène (hypoxie) dans le sang pouvant être plus ou moins sévère. Le modèle de SAOS le plus utilisé est l'hypoxie intermittente caractérisée par des épisodes de diminution du taux d’oxygène dans le sang. Pour ce faire, nous faisons alors varier la quantité inspirée en oxygène et sa durée et mesurer les conséquences. Ce modèle permet donc d’étudier de façon spécifique les conséquences d’une hypoxie intermittente sur le plan cognitif et physiologique dans un modèle murin juvénile.

Bénéfices attendus

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil chez l’enfant est très peu étudié pourtant cela concerne beaucoup d’enfants (4% de la population). Ce projet permetterait de mieux comprendre les déterminants du pronostic de ce syndrome en terme de fonction cognitive (mémoire) et de fonction cardio-vasculaire. Une meilleure compréhension permet une meilleure prise en charge.

Procédures

Séparation maternelle de 2 fois 3h pour les souris âgées de 15 à 27 jours. Entre 30 et 35 jours de vie : ces souris seront soumises une fois à une courte anesthésie (30 minutes maximum) afin de réaliser une imagerie ultrasonore fonctionnelle à temps réel du cerveau . C'est une imagerie éveillée sur boîte cranienne et peau intactes (sans cranioctomie) ) qui mesure les variations du flux sanguin cérébral et renseigne ainsi l’activité cérébrale. Gestes techniques : prise de poids et de température, tests de comportements par exposition des animaux dans une arène vide puis dans une arène munie de deux objets, préhension des animaux pour la lecture du tatouage d'identification sur les pattes, pour le déplacement dans les chambres d'exposition et pour l’administration une fois d’anesthésiant et le rasage au niveau de la tête pour l'imagerie fonctionnelle

Impact sur les animaux

- séparation maternelle limitant le contact maternel pouvant générer de l'angoisse - troubles cardio-vasculaires selon le protocole d'hypoxie intermittente (hypoxie intermittente = épisode de diminution de la fraction inspirée en oxygène réalisée de manière intermittente et non continue) - croissance pondérale ralentit selon le protocole.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort avant prélèvement du cerveau pour des études histologiques entre 30 et 35 jours de vie.

Remplacement

Dans le SAOS, les études épidémiologiques enrichissent déjà les connaissances de la maladie mais sont limitées par la possibilité d’étudier plus finement les paramètres connus et ceux potentiellement contributifs pour des raisons éthiques évidentes des tests chez l’humain. Bien que des méthodes non-animales jouent un rôle important dans la recherche scientifique pour comprendre isolément des mécanismes, elles ne peuvent pas répondre à la complexité d’un système intégré d’un organisme entier. De plus, les animaux et les humains partagent une grande similarité aussi bien sur le plan anatomique, génétique que fonctionnel. Pour étudier les maladies humaines et répondre aux exigences de sécurité pour la santé humaine, l’utilisation de modèle animal est indispensable.

Réduction

Nos méthodes de mesures étant non invasives, nous privilégions au maximum une étude longitudinale ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, nous effectuerons le bilan physiologique (ventilation, fréquence cardiaque, croissance pondérale,....), cognitif (mémoire) et cérébro-vasculaire (activité neuronal, fluctuatio du débit sanguin cérébral) sur les mêmes portées. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle dans les paramètres physiologiques, nous avons déterminé un lot expérimental de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Si toutefois, par des analyses intermédiaires, nous obtenons une puissance statistique suffisante dans le test de nos hypothèses, nous n’augmenterons pas le nombre d’animaux pour respecter le lot de 30 animaux.

Raffinement

Mesures pour minimiser une possible angoisse des animaux : durée de mesure courte, regroupement des souris lors de l’exposition à l’hypoxie intermittente, fourniture d’une quantité de sciure maternelle dans les chambres d’exposition (boîtes dans lesquelles les souris sont exposées à l'hypoxie intermittente), remise à la mère d’une heure entre les 2 sessions journalière d’hypoxie intermittente afin de maintenir le contact maternel. Fréquence de la surveillance : pesée journalière pendant l’exposition à l’hypoxie intermittente (15 à 27 jours) et à chaque point de mesure (tests comportementaux, mesures physiologiques), vérification journalière pour les besoins en eau et nourriture de la mère et de sa portée, vérification journalière des points limites (état du pelage, du comportement de la souris dans sa portée et comportement de la mère envers sa portée). Une dose letale d'aneshésiant est administrée à l'animal avant le prélèvement de cerveau pour des études histologiques.

Choix des espèces

Les souris, étant des mammifères, elles sont suffisamment proches de l’Homme. Nous partageons 95% de nos gènes avec la souris. La souris est de petite taille, la reproduction est rapide car la durée de gestation est courte, la manipulation est facile ce qui en fait un modèle efficace pour la recherche. La période choisie pour l’exposition à l’hypoxie intermittente correspond à la petite enfance jusqu'au début de l’adolescence, période de manifestation du syndrome d’apnées obstructives du sommeil de l’enfant.

Déjà passés pour la plupart par d'autres projets, 295 animaux non-humains de huit espèces (100 souris, 80 rats, 30 cobayes, 30 hamsters dorés, 30 lapins, 10 chats, 10 chiens et 5 porcs) vont être exploités dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour former le personnel d'une plateforme d'expérimentation animale. Les rongeurs reçoivent sous anesthésie trois injections d'essai, les lapins des injections, des prises de sang ou des poses de cathéter, les chiens et les chats jusqu'à huit tentatives de ponction veineuse et le geste d'ouverture de la bouche, les porcs des prises de sang à la veine sous-clavière et des cathéters posés à l'oreille. Le porteur reconnaît "un peu plus de stress, de douleur ou d'angoisse" quand la personne formée est "moins habile ou moins rapide". Il cite des cadavres, des simulateurs inertes et des vidéos, et conclut qu'il "n'est pas toujours possible de remplacer l'animal". Il prévoit de garder en vie "la plupart" d'entre eux pour d'autres séances, après sept à quinze jours de repos, sans dire ce qu'il advient des autres.

Objectifs

Notre établissement utilisateur est une plateforme expérimentale qui dispose d’un agrément pour un grand nombre d’espèces animales qui sont incluses dans des protocoles expérimentaux en fonction des autorisations de projets obtenues pour des équipes de recherche de notre institution ou d’institutions partenaires. Il arrive qu’une espèce animale pour laquelle nous disposons de l’agrément ne soit pas utilisée pendant une période d’un ou deux ans. Afin de réaliser au mieux les procédures expérimentales demandées, et l’application des procédures en limitant le stress et la douleur des animaux, tout en obtenant des résultats scientifiques fiables, il peut être nécessaire de faire appel à des séances de formation interne pour notre personnel. D’autre part, lors de l’embaûche d’un nouveau membre de notre équipe, une période de tutorat est mise en place pour l’acquisition ou la validation des compétences techniques. Dans ce cas, s'il n’est pas possible que ceci soit fait lors d’études en cours, nous organisons des séances de travaux pratiques avec ces personnes et les membres de l’équipe qui ont aussi besoin d’être formées, qualifiées ou re-qualifiées. La décision est prise par la personne en charge de l’organisation et la plannification interne, en accord avec la personne responsable du suivi des compétences, mais elle est soumise à l’avis de la Struture Chargée du Bien-Etre Animal de l’établissement.

Bénéfices attendus

Nous attendons des séances de formations pratiques en interne qu’elles donnent suffisamment de dextérité et d’assurance aux personnels pour que les procéures expérimentales exigées par les projets autorisés soient menées avec succès et en limitant le stress, l’angoisse et la douleur des animaux inclus.

Procédures

Rongeurs (souris, rat…) : 3 essais des actes différentes tel qu’une administration sous-cutanée ou une administration intra-musculaire ou intra-péritonéale, pendant l’anesthésie. Lapins : une injection sous-cutanée/ intra-musculaire et une prise de sang/pose de cathéter sous anesthésie général ou sur animal vigile avec anesthésie local, avec un maximum 2 ponctions par site. Chiens/chats : geste de l’ouverture de la bouche ainsi qu’un prélèvement sanguin, à raison d’un maximum de 8 essais de ponctions veineuses, mais au maximum 2 ponctions par site. Ceci est un maximum qui est rarement atteint, en général 2 à 3 essais sont suffisants. Porc : le prélèvement sanguin à la veine sous-clavière et la pose de cathéter à l’oreille sous anesthésie et pas plus de deux ponctions par veine et par séance (auriculaire et sous clavière). La durée de ces actes est estimée de quelques secondes à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, il s’agit principalement de permettre aux nouveaux arrivants d'apprendre les gestes techniques comme : le prélèvement sanguin / la pose de cathéter ou l'injection sous-cutanée / intramusculaire / intra-péritonéale, ou le geste d'ouverture de la bouche. Les nuisances sont celles qui sont inhérentes à chaque acte technique auquel les animaux sont soumis, mais avec, potentiellement, un peu plus de stress, de douleur ou d’angoisse si la personne en formation est moins habile ou moins rapide. À titre d’exemple, pour une séance de travaux pratiques, un rat peut subir deux ou trois injections par voie sous cutanée ou intraveineuse qui normalement dure moins d’une minute. Ici la durée sera un peu plus long.

Devenir

Dans ce projet, la grande majorité des actes techniques à mettre en place sont peu invasives. Ainsi, la plupart des animaux seront gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire et de la structure chargée du bien-être animal, prenant en compte un temps de repos suffisant en fonction de la procédure qui a été effectuée sur l'animal, ainsi que leur état de santé et des possibilités de réutilisation.

Remplacement

La progression pédagogique pour l’acquisition des actes techniques passe par la formation théorique. Elle inclut un cours ou l’étude des documents qualité, le visionnage de photos et de vidéos, l’utilisation de cadavres ainsi que de modèles inertes de simulation présents dans notre institution. Tout au long du déroulement du projet, nous enrichirons notre banque d’images et de vidéos pour améliorer la qualité des cours. Ces éléments sont toujours à disposition de l’équipe de l’établissement pour un visionnage à volonté. Il est également possible de former les nouveaux arrivants au cours des études, ce qui est déjà le cas. Cependant, dans certains cas, il est nécessaire de pratiquer les gestes techniques sur des animaux vivants pour garantir la qualité des résultats d’étude. Il n’est pas toujours possible de remplacer l’animal dans le cadre des formations.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans une séance est limité au minimum et nous utilisons principalement des animaux qui ont déjà participé à un autre projet et qui n’ont pas de problème clinique suite à cette inclusion. L’acquisition d’un geste technique sur un rongeur ne nécessite pas plus de 3 répétitions bien réalisées par la personne formée. Pour les prélèvements et/ou administrations chez le rongeur : deux à trois animaux par personne et par séance sont donc suffisants. En revanche, chez les porcs, les chiens et les chats, un animal peut être utilisé par plusieurs personnes successivement et anesthésié si besoin, ce qui peut mener à utiliser par exemple un porc pour former 2 à 3 personnes aux prises de sang. De plus, nous privilégions la formation des nouveaux arrivants pendant les études.

Raffinement

Les techniques utilisées sont les mêmes que celles que nous mettons en œuvre pour nos projets. Deux principales mesures de raffinement sont utilisées. La première est la limitation du nombre d’actes par animal et par séances. Deux à huit répétitions de geste par animal et par séance. Si ce nombre devait être dépassé, la séance se passe sous anesthésie générale. Les volumes administrés ou prélevés sont minimes (< 1 ml). Largement inférieurs aux recommandations d’usage en recherche, puisque ce qui compte est que le geste soit bien réalisé. L’autre est un enregistrement précis des utilisations et réutilisations de chaque animal en respectant un temps de repos de 7 jours entre deux séances sans anesthésie et 15 jours entre deux séances avec anesthésie. Toute blessure au cours de la séance est prise en charge et prolonge le temps de repos de l’animal. De plus, les conditions hébergement des animaux seront adaptées à chaque espèce, ainsi que leurs soins quotidiens. Seuls les animaux en bonne santé participent à ces séances de formation. Les séances sont interrompues si les animaux montrent un signe de mal-être ou de stress trop important.

Choix des espèces

Globalement, nous pouvons être amenés à organiser des TP sur toutes les espèces animales qui sont utilisées dans nos procédures de recherche. Les séances de formation sont organisées pour les nouveaux arrivants ou pour des rappels aux personnes déjà en place. Elles concernent les gestes techniques sur rongeurs, lapins, porcs, chiens ou volailles. Exceptionnellement et beaucoup plus raprement pour d’autres espèces, les formations se font par tutorat pendant les procédures.Si nous devions utiliser d’autres espèces, nous le signalerons. Les animaux sont des animaux réutilisés d’autres projets qui généralement font appel à de jeunes adultes

424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections quotidiennes pendant quatorze jours, une autre subit une chirurgie du cerveau, et toutes passent un test de sociabilité de dix minutes avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde. Le porteur décrit un risque d'inflammation aux points d'injection et de complications post-opératoires comme une hémorragie ou une infection. Il conclut que l'autisme, faute de marqueur biologique, ne peut être modélisé qu'au niveau de l'animal entier exprimant son répertoire comportemental, et justifie ainsi le recours à la souris.

Objectifs

Parmi les troubles affectant la capacité à interagir socialement, les troubles du spectre autistique (TSA) sont les plus courants, touchant environ 1% de la population selon des études récentes à grande échelle. Ces troubles englobent des pathologies dont les causes sont connues (syndrome du X fragile, de Prader-Willi, de Rett) et d'autres dont l'origine reste inconnue, regroupées sous le terme de "troubles du spectre autistique" (TSA). Ce projet de recherche vise à approfondir notre compréhension des bases neurobiologiques des TSA et à développer des molécules atténuant les symptômes, en particulier les déficits d'interaction sociale, particulièrement impactants pour les patients et leurs proches. Le défi majeur ici est de trouver de nouvelles molécules agissant sur divers modèles précliniques des TSA. Des études récentes ont mis en évidence un déséquilibre dans la transmission d'informations nerveuses dans certains modèles de souris TSA, notamment celles présentant une déficience génétique pour des protéines spécifiques. Des traitements pharmacologiques ont montré des effets bénéfiques en atténuant les déficits sociaux et les comportements stéréotypés chez ces souris. Ces résultats indiquent que moduler l'activité de deux récepteur peut soulager ces symptômes. L'objectif actuel de la recherche est d'explorer les mécanismes biologiques sous-jacents à ces effets bénéfiques, en se concentrant sur des modèles murins d'autisme.

Bénéfices attendus

Le projet permettra une meilleure compréhension des populations de neurones impliquées dans le développement de l'autisme et proposera de nouvelles solutions thérapeutiques pour soulager cette pathologie.

Procédures

Une partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale. Un groupe d'animaux subira une chirurgie stéréotaxique. Tous les animaux seront exposés à une tâche de sociabilité d'une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Des animaux seront soumis à des administrations répétées d'agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale. On ne peut donc pas exclure une inflammation au niveau du site d'injection. D'autres animaux feront l'objet d'une chirurgie stéréotaxique. Ces animaux subiront donc une douleur post-opératoire, les conséquences d'une anesthésie et un risque de complication post-opératoire (hémorragie, infection). L'ensemble des animaux sera soumis à une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde.

Devenir

A la fin de chaque expérience, les animaux seront mis a mort pour des expériences ex-vivo ultérieur

Remplacement

e développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de l'autisme nécessite la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de ces pathologies. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées ont été créées à cette fin, basées sur les mutations identifiées chez les patients autistes. L'évaluation des effets bénéfiques d'un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu'au niveau comportemental. En effet, il n'existe pas de marqueur biologique pour l'autisme, et le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu'au niveau de l'animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique adéquate

Raffinement

Nous prendrons en charge l’ensemble des contraintes que subissent les animaux au cours des expériences. Concernant l’hébergement, les souris seront regroupées en groupes sociaux de 2 à 4 individus, avec du matériel approprié pour la construction de nids (ouate et cabane en carton). Les animaux seront manipulés quotidiennement par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons des individus des deux sexes, les testerons dans différentes tâches, et appliquerons les tests statistiques appropriés. Pendant les expériences, nous surveillerons quotidiennement le bien-être des animaux, en particulier leur poids, leur posture et leur point d’injection. Pour les chirurgies, nous mettrons en place une procédure d'anesthésie appropriée (anesthésique associé à un analgésique), ainsi qu'un suivi post-opératoire renforcé. Nous administrerons un traitement anti-inflammatoire pour réduire la douleur, et nous assurerons un suivi quotidien de la cicatrisation de la plaie, du poids et de la posture des animaux. Des critères limites seront établis pour éviter toute souffrance inutile aux animaux. Bien que nous ne puissions nous passer du modèle animal, l'autisme étant une pathologie complexe, nous veillerons à minimiser la détresse des animaux en exprimant l'ensemble de leur répertoire comportemental.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux chez lesquels les altérations des compétences sociales, symptômes clés de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. De plus, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées sont disponibles pour modéliser cette pathologie au niveau préclinique. Les déficits comportementaux détectés chez ces souris modèles sont suffisamment importants et robustes pour permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.

1 940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe d'îlots pancréatiques sous anesthésie, des injections de lymphocytes, des dosages de glycémie trois fois par semaine pendant quatre mois et une biopsie de la queue, pour étudier le rôle d'une protéine dans le diabète de type 1 sur la souris NOD, qui développe spontanément un diabète. Le porteur indique que le diabète provoque soif, déshydratation et perte de poids, et que la greffe d'îlots peut entraîner douleurs et mobilité réduite. La retombée annoncée, une nouvelle cible thérapeutique, reste conditionnelle, tandis que le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace la souris, qu'il décrit comme un "outil incontournable".

Objectifs

Le diabète représente un enjeu majeur de santé publique dont l’importance ne cesse de s’accroitre Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune complexe qui résulte de la destruction spécifique des cellules pancréatiques qui produisent l'insuline et de la perte de la capacité́ à contrôler le niveau de glucose dans le sang. La maladie survient suite à une réaction anormale du système immunitaire. Des cellules du système immunitaire, les lymphocytes T, identifient les cellules du pancréas comme des cellules étrangères à l’organisme du patient, et les éliminent. Au cours d’une réponse immune ces cellules jouent un rôle crucial dans la reconnaissance et élimination des cellules qui présentent des fragments des protéines appelés peptides, issues de pathogènes ou des protéines de notre organisme. Ce projet vise à examiner le rôle d’une protéine responsable de la réduction des peptides à la taille optimale pour l’activation du système immunitaire dans la physiopathologie du diabète auto-immun et à étudier les mécanismes qui contribuent à déclencher la réponse auto-immune. Le modèle de la souris non-obèse diabétique, qui développe un diabète auto-immun spontané partageant de nombreuses caractéristiques avec le diabète de type I humain sera utilisé dans ce projet. Ce travail pourrait, à terme, permettre l’identification et l’utilisation de cette protéine comme une nouvelle cible thérapeutique dans le diabète auto-immun.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est la détermination du rôle de la protéine étudiée dans la pathogenèse du diabète auto-immun. Si cette protéine est impliquée dans l’apparition du diabète elle pourrait faire l’objet d’un ciblage thérapeutique.

Procédures

Le dosage glycémique avec un lecteur de glycémie capillaire, pour suivre l’évolution du diabète sera effectué par prélèvements d’une goutte de sang lorsque la glycosurie mesurée avec une bandelette urinaire s’avère positive. Le temps estimé pour effectuer le dosage de glycosurie ou de glycémie est environ 10 secondes par souris. La frequence sera de 3 fois par semaine sur un periode de 4 mois. L'administration des produits par voie intrapéritonéale se fera une seule fois et le temps necessaire est de 5 secondes par souris. L’injection des lymphocytes par voie intraveineuse se fera une seule fois, après induction de l’anesthésie, le temps necessaire est de 5 secondes par souris. La greffe d'îlot sera effectuée une seule fois sous anesthésie generale et la durée de l'intervention est de 15 minutes. La biopsie de la queue avant sevrage entre 2 et 4 semaines se fera une seule fois, ce prélèvement s'ajoutera au marquage des animaux par tatouage réalisé par le personnel de l'animalerie. Le temps necessaire est de 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Le diabète est responsable d’une augmentation de la soif et d’une déshydratation et tardivement une perte de poids. Ces manifestations sont précédées d’une augmentation du taux de sucre dans le sang et les urines. Les injections intrapéritonéales et les prélèvements sanguins au niveau de la veine mandibulaire ou de la veine caudale induisent un douleur de courte durée. L’animal peut subir un stress au cours de l’anesthésie. Les greffes d’îlots peuvent induire chez les animaux des douleurs les jours suivant la chirurgie accompagnées d’une perte de poids et d'une mobilité́ réduite.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que l'incidence du diabete sera determinée et la reponse immune alors caractérisés.

Remplacement

Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l’étude des mécanismes immuno-pathologiques. Aucun modèle alternatif in vitro n’est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun, alors que la souris NOD représente un modèle très performant et hautement informatif. Étant donné que le paramètre principal étudié dans ce projet est la survenue d’une maladie résultant d’un ensemble complexe d’acteurs cellulaires et de médiateurs solubles, l’utilisation du modèle de la souris est incontournable.

Réduction

Le nombre de souris utilisées est maintenu au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. L’incidence du diabète et les différences entre les populations lymphocytaires au cours des différents traitements seront analysées par un test statistique adapté. Le protocole expérimental prévoit l’analyse du système immunitaire des animaux pour limiter la répétition des expériences. La stratégie d’accouplement qui a été choisie permet de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les points finaux pour chaque procédure ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés dans des cages adaptées, 3-5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une surpopulation. L’environnement est enrichi par des objets. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux et par les expérimentateurs. Les injections intraveineuses sont effectuées sous anesthésie générale. Les animaux qui ont subi une greffe d’ilots seront suivis quotidiennement la première semaine puis 3 fois par semaine par la suite. Du dietgel sera ajouté dans les cages la première semaine pour faciliter l’alimentation.

Choix des espèces

La souris NOD est considérée comme le meilleur modèle du diabète spontané insulino-dépendant auto-immun et permet d’étudier la maladie et la réponse immunitaire diabétogène. La souris NOD développe un diabète auto-immun entre 13 et 30 semaines d'âge. Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l'étude de cette maladie, en effet les mécanismes immunopathologiques décrits à l'aide des modèles murins se sont avérés très similaires aux mécanismes de la maladie chez l'homme. Aucun modèle alternatif in vitro n'est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun. Les souris NOD femelles adultes développent un diabète auto-immun entre 13 et 30 semaines d'âge. Notre étude d’incidence se concentre sur des animaux déclarant un diabète entre 13 et 22 semaines d’âge.

850 rongeurs, 600 souris et 250 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Non pour produire des connaissances mais pour entraîner du personnel aux gestes techniques, chaque animal pouvant servir jusqu'à neuf actes simples répétés, ou une chirurgie complexe de vingt à soixante minutes suivie de deux semaines de soins. Le porteur décrit des atteintes possibles comme infections, saignements, lésions oculaires après prélèvement rétro-orbitaire et douleurs post-opératoires. Il affirme que le recours à l'animal vivant est "indispensable" pour acquérir les gestes en conditions réelles.

Objectifs

Dans notre installation, certains de nos projets nécessitent le recours à l’utilisation de modèles animaux. Certaines procédures expérimentales incluent des interventions chirurgicales qui ne peuvent se pratiquer sans y avoir été formé auparavant Certains actes chirurgicaux peuvent être enseignées sur un cadavre ou sur papier (suture) mais le recours à l’animal vivant est indispensable pour apprendre la chirurgie en conditions réelles et les soins post-opératoires. Les actes simples s’acquièrent en quelques essais, d’autres plus complexes nécessitent une répétition plus importante des gestes techniques. Ces animaux peuvent être des animaux provenant d’autres projet, (fin de projet sans euthanasie, élevage), ou si cela n’est pas possible, des animaux issus de fournisseurs agréés.

Bénéfices attendus

Formation du personnel permanent et non permanent.

Procédures

Un même animal pourra être utilisé pour l’apprentissage de plusieurs actes expérimentaux simples, au maximum 9 (injections, administration orale ou nasale, prélèvements, sutures, biopsie, implantations sous cutanées …). Chaque geste expérimental, d’une durée de quelques secondes à quelques minutes pourra être réalisée 3 fois, à au moins deux jours d’intervalle entre chaque période. Les animaux dédiés à l’apprentissage des actes chirurgicaux complexes ne seront utilisés qu’une fois et gardés uniquement pour les soins post-opératoires, comprenant l’apprentissage des gestes post-opératoires, jusqu’à deux semaines après la chirurgie. Les actes chirurgicaux complexes peuvent durer de 20 à 60 minutes par animal, en fonction du type de chirurgie réalisée. L’apprentissage des gestes post-opératoires (en plus des soins) correspond à l’apprentissage des manipulations des animaux opérés par exemple pour les positionner dans l’IRM, pour prélever du sang ou injecter du sérum physiologique via les cathéters implantés, pour utiliser en conditions réelles les appareillages d’électrophysiologie.

Impact sur les animaux

Une infection peut apparaitre pour tout acte avec une piqure ou une coupure. Des saignements peuvent être observés pendant quelques minutes lors des biopsies. Les animaux peuvent montrer des lésions oculaires après un prélèvement au sinus rétro-orbitaire. En cas de chirurgie avec ouverture cutanée ou craniotomie, les animaux peuvent ressentir une douleur post-opératoire ainsi qu’une inflammation des tissus cicatriciels, transitoire sur quelques jours. Les animaux peuvent montrer des signes cliniques (douleurs, inflammations, stéréotypies, stress) liés à une chirurgie non réussie (hémorragies…) ou invasive (résection de tumeurs internes) ou à une chirurgie entraînant une lésion cérébrale (implantation et résection d’une tumeur).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après l’apprentissage des actes chirurgicaux complexes (chirurgie + soins post-opératoires), ou après avoir été utilisés pour l’entraînement à plusieurs procédures simples.

Remplacement

Certaines pratiques peuvent être apprises en première instance sur du papier ou un cadavre mais le recours à l’animal vivant est indispensable afin d’acquérir les bons gestes chirurgicaux en conditions réelles, avec la gestion des pertes sanguines, et pour réaliser correctement les soins post-opératoires.

Réduction

Le nombre d’animaux potentiellement utilisé sera dépendant du nombre de personnes à former, de leurs compétences déjà existantes, de leur capacité à apprendre et du nombre de procédures à apprendre ou à se réapproprier par année et par personne. Sur 5 ans, nous pensons avoir un pool d’une dizaine de personnes à former, au maximum. Pour les gestes techniques simples nous envisageons d’utiliser environ 100 souris et 100 rats, soit 10 animaux de chaque espèce par personne. Pour les procédures complexes nous envisageons d’utiliser 500 souris et 150 rats. C’est-à-dire 50 souris et 15 rats par personne, sur 5 ans, une même personne pouvant avoir le besoin d’apprendre plusieurs procédures complexes la même année. Soit un total de 600 souris et de 250 rats. Le nombre de souris prévu est plus important que celui du nombre de rats car la taille supérieure des organes et des vaisseaux sanguins des rats permet d’envisager une prise en main plus rapide. Le nombre de modèles est également plus réduit chez le rat. Autant que possible, les animaux utilisés seront des animaux inutilisés dans d’autres projets de l’installation (en fin de projet sans euthanasie). Les animaux utilisés pour l’apprentissage des gestes techniques simples seront utilisés plusieurs fois si nécessaire, mais pas plus de trois fois par gestes, et après cela une chirurgie sans réveil pourra être réalisée.

Raffinement

Les animaux sont gardés en portoirs ventilés et en groupe tout au long des expérimentations. Un enrichissement (maisons en plastique, roue, morceaux de bois …) sera réalisé pour chacune des cages d’animaux. Les animaux sont suivis au quotidien par les zootechniciens, avant d’être utilisés pour l’apprentissage des procédures. Les procédures simples seront réalisées sur des animaux vigiles et si nécessaire anesthésiés légèrement. Un suivi par le tuteur/la tutrice et la personne en apprentissage sera réalisé pour évaluer tout signe de souffrance, un traitement antalgique pourra être administré si besoin, sur une durée de 24 heures à quelques jours après le geste opératoire. Tout signe clinique dénotant une souffrance supérieure à celle attendue (expertise du tuteur), une infection ou des dommages oculaires entrainera une euthanasie. Les actes chirurgicaux complexes seront réalisées sous antalgie et anesthésie, éventuellement également sous anti-inflammatoires. Les opérations seront réalisées en début de semaine pour voir l’évolution avant le week-end. Tout animal présentant une souffrance ou tout signe clinique signalant une infection, une opération ratée, une hémorragie excessive, des complications post-opératoires… entrainera une euthanasie immédiate. Un suivi post opératoire (avec grille de scoring) sera réalisé par la personne en apprentissage avec l’aide de son tuteur/ sa tutrice chaque jour et ce jusqu’à fin de la période de soins post-opératoire (2-3 semaines). Si nécessaire une antalgie sera administrée durant ce laps de temps avant l’euthanasie.

Choix des espèces

Les modèles animaux utilisés lors des projets sont essentiellement des rongeurs. Les modèles chirurgicaux prévus seront réalisés sur des animaux de même espèce/souche/âge que ceux prévus pour les projets nécessitant cette prise en main chirurgicale. En effet, d’une condition (espèce/souche/âge) à l’autre, il y a des différences physiologiques non négligeables qui ont des conséquences sur les actes chirurgicaux complexes et leur apprentissage. Les animaux seront adultes, ayant terminé leur croissance, pour éviter la distension des tissus cicatriciels.

140 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux anesthésies générales et une chirurgie provoquant un infarctus du myocarde par fermeture transitoire d'une coronaire, suivie d'une injection d'un produit censé protéger le cœur. Le porteur reconnaît un risque d'arrêt cardiaque définitif pendant l'intervention, qui l'amène à prévoir davantage d'animaux. Tous les cochons sont mis à mort pour l'étude histologique du cœur.

Objectifs

L'infarctus du myocarde (crise cardiaque) est une destruction d’une partie du cœur due à un manque de sang et d’oxygène (ischémie). Cela se produit lorsqu’une artère coronaire (vaisseau sanguin apportant le sang et l’oxygène au cœur) s’obstrue. Les lésions forment une zone tissulaire morte dite infarcie qui ne permet plus une bonne contraction du cœur. La zone infarcie provoque une modification structurelle du cœur appelée remodelage, modification inévitable mais pathologique. Le remodelage est la cause la plus fréquente d’insuffisance cardiaque, caractérisé par une hypertrophie-dilatation du cœur associée au développement d’une fibrose myocardique délétère. Il faut savoir qu’il y a environ 120000 infarctus du myocarde en France tous les ans avec un taux de mortalité autour de 25%. Il existe des techniques médico-chirurgicales qui contribuent à améliorer ce taux en débouchant physiquement l’artère, mais les conséquences à long terme restent potentiellement néfastes. C’est pourquoi il est impératif de trouver des traitements complémentaires. Notre projet a donc pour but de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques pouvant protéger le cœur en diminuant la taille de la zone infarcie et en limitant le remodelage, et ainsi améliorer la qualité de vie des personnes ayant eu une crise cardiaque. Actuellement, par leur caractère préclinique, et en complément des études in vitro, les modèles animaux sont une étape indispensable pour tester de nouvelles stratégies cardio-protectrices permettant de réduire les conséquences de l’infarctus du myocarde. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est d’anesthésier les animaux, de pratiquer un acte chirurgical afin de simuler un infarctus du myocarde en fermant transitoirement une coronaire, puis d’administrer le traitement (ou le placebo) consistant en une injection de produit à visée cardio-protectrice (angiopoïetine-like-4). Ensuite, une analyse tissulaire après prélèvement de la totalité du myocarde sera effectuée, éventuellement complétée par des échocardiographies permettant l’analyse du fonctionnement du myocarde, afin d’évaluer l’efficacité du traitement. Seule l’utilisation d’animaux permet d’atteindre l’objectif du projet, qui doit rester proche de la réalité clinique humaine pour rester scientifiquement valable, et l’anesthésie/analgésie seront adaptées afin de n’induire aucune souffrance inutile.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 2 fois à une anesthésie générale, la première d’environ 1h30 permettant la mise place d’un infarctus, et la seconde d’environ 30 minutes se terminant par la récupération du myocarde. Tous les autres actes sont indolores et consistent en des soins ou à des échocardiographies effectués sous sédation légère afin que l’animal soit bien calme. Quelques prélèvements sanguins sont prévus totalisant au maximum 70mL sur 28j.

Impact sur les animaux

La nuisance principale de ce projet est la possibilité d’un arrêt cardiaque définitif (fibrillation ventriculaire réfractaire) lors de la mise en place de l’infarctus sous anesthésie, malgré tous nos efforts pour empêcher cela. Cela oblige à prévoir un nombre plus important d’animaux à utiliser.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie de protection cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale. Le traitement envisagé a déjà été testé in vitro ou sur des animaux de petite taille (rongeurs) aux caractéristiques cardiaques trop dissemblables de l’Homme. Seuls des essais effectués sur un modèle d’étude cardiaque proche de l’Homme sont scientifiquement acceptables pour envisager une extrapolation vers la pratique clinique humaine.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque groupe, et le nombre par lot est fixé à 9. De plus, à chaque fois que c’est possible, les animaux des lots témoins sont mutualisés pour chaque stratégie.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées. Il est à noter que chez l’Humain, l’infarctus en lui-même peut entrainer de la douleur, mais dans nos conditions expérimentales, elle n’a pas été objectivée (pas de différences comportementales entre avant et après l’infarctus). Des signes indicatifs de fatigue inhérents au modèle expérimental seront possiblement observés en fin de protocole lorsque les animaux seront gardés longtemps, et cette période sera plus particulièrement surveillée. Les animaux bénéficient de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et de jouets pour améliorer leur qualité de vie. Ils sont logés par petit groupe, hormis le jour de leur manipulation.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. A 2 mois ½ (25kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité.

1 100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Implantés dès l'âge de douze jours, ils reçoivent sous la peau du dos des disques de péricarde bovin ou porcin, gardés jusqu'à deux mois, avec un risque de gonflement et de pus au site d'implantation. Le porteur affirme que l'étude de la calcification ne peut se faire que sur un organisme vivant, faute de modèle in vitro. Les ratons sont mis à mort avant le retrait des implants, décrit comme trop mutilant pour les laisser en vie.

Objectifs

La sclérose valvulaire aortique, c'est-à-dire le rétrécissement de l'ouverture de la valve aortique, est un enjeu majeur de santé publique qui touche 2 à 6 % des personnes âgées de plus de 65 ans. Sa prévalence est susceptible de doubler au cours des 50 prochaines années en raison du vieillissement croissant de la population. La sclérose valvulaire aortique est maintenant principalement considérée comme un processus incluant une calcification de la valve. Actuellement, cette pathologie est traitée par remplacement valvulaire avec une valve bioprothétique constituée de péricarde bovin ou porcin. Néanmoins, comme pour la valve native, une calcification des valves bioprothétiques au bout de 10-15 ans d'implantation a été mise en évidence, dégénérescence qui peut conduire à une ré-intervention. Ce travail permettra de valider l’efficacité de traitement des péricardes (notamment avec moins de calcification) afin de proposer une nouvelle valve bioprothétique. Nous évaluerons différents prétraitements cellulaires et moléculaires du péricarde servant à faire une bioprothèse. Nous implanterons des disques de péricarde bovin et porcin en sous-cutanée sur le dos de ratons pour une durée allant d’une semaine à 2 mois. Cette étude portera sur 1100 rats au total (550 rats immunocompétents et 550 rats immunodéprimés) implantés à l’âge de 12 jours.

Bénéfices attendus

A terme ce travail permettra de mieux comprendre le devenir des implants de péricarde in vivo et leur intégration dans les tissus (calcification, colonisation) ou leur dégradation et surtout de proposer un essai clinique humain avec une nouvelle valve cardiaque à base de péricarde porcin génétiquement modifié.

Procédures

Les animaux subissent une implantation en sous cutanée de disques de péricarde et sont gardés de 1 semaine à 2 mois avant la récupération des disques de péricarde.

Impact sur les animaux

Les ratons peuvent avoir au niveau de la zone d’implantation un gonflement, du pus. Les animaux peuvent être gardés jusque 60 jours.

Devenir

Malgré le repérage des implants par palpation la recherche des implants nécessite deux grandes cicatrices au niveau dorsal. De plus le retrait des implants abime la chair de l’animal. Ces deux points constituent une nuisance très importante pour l’animal tant au niveau de la cicatrice que de la chair ce qui nous conduit à la mise à mort de tous les animaux avant retrait des implants de péricarde.

Remplacement

L’étude du devenir du matériel à base de péricardes bovin et porcin après implantation ne peut être réalisée que sur un organisme vivant en raison des multiples interactions qui existent entre les différents types cellulaires ainsi que leur environnement et le matériau implanté. A ce jour il n’existe pas de modèle in vitro pour faire calcifier le péricarde. De plus, des tests préliminaires in vitro nous ont permis de mettre en évidence une protéine d’intérêt dans la calcification des valves. En effet, en faisant une recherche de différentes molécules d’intérêt au niveau du sang circulant de patients opérés d’une dégénérescence de bioprothèse, nous avons pu mettre en évidence la spécificité d’une molécule vis-à-vis de la calcification de ces bioprothèses.

Réduction

Dans un objectif de réduction, quatre disques de péricarde seront implantés par animal afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le chiffre de 10 péricardes est choisi suite à l’expertise du laboratoire. 2 disques sont gardés pour analyse histologique. 2 disques sont gardés pour congélation et il nous reste 6 disques pour dosage de calcium ce qui permet une analyse robuste et répétable. La taille des échantillons est réduite au minimum mais suffisante pour valider la significativité des taux de calcification. Ce nombre a été calculé selon l'expérience acquise dans notre équipe en tenant compte de la variabilité observée lors d'expériences similaires et les données de la littérature.

Raffinement

Afin de réduire au maximum la douleur et le stress, les animaux disposent d’un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson et les conditions d’hébergement sont optimisées avec des enrichissement systématique des cages avec du coton, maisonnettes et / ou bâtonnets de bois. De plus, les implantations en sous cutanée et le retrait des implants seront effectuées sous anesthésie générale. A l’’implantation des ratons, un analgésique leur sera administré afin de réduire la douleur pouvant résulter de l’implantation. Ils seront remis immédiatement après leur réveil avec leur mère afin de limiter le stress. Les animaux seront surveillés de façon hebdomadaire avec mise en place de points limites qui permettront une prise en charge précoce en cas de douleur ou de souffrance.

Choix des espèces

L’implantation en sous-cutanée chez le rat Wistar est communément admise comme modèle d’étude de calcification pour les biomatériaux dans la littérature. Le rat Nude permettra de s’affranchir de la réponse immunitaire et de tester l’implantation de péricardes contenant des cellules progénitrices endothéliales humaines. Les ratons sont âgés de 12 jours, car leur métabolisme en développement est optimal pour observer une réaction et une calcification rapide notamment en raison de l'allaitement.