Procédures modérées

154 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux anesthésies générales et une chirurgie qui provoque un infarctus du myocarde en fermant transitoirement une artère coronaire, suivie d'un traitement par une fraise vibrante placée dans la coronaire. Le porteur reconnaît un risque d'arrêt cardiaque définitif pendant l'intervention, qui l'amène à prévoir davantage d'animaux. Tous les cochons sont mis à mort pour l'étude histologique du cœur.

Objectifs

L'infarctus du myocarde, appelé couramment crise cardiaque, est une destruction d’une partie du cœur due à un manque de sang et d’oxygène (ischémie). Cela se produit lorsqu’une artère coronaire (vaisseau sanguin apportant le sang et l’oxygène au cœur) s’obstrue. Les lésions forment une zone tissulaire morte dite infarcie qui ne permet plus une bonne contraction du cœur. La zone infarcie provoque une modification structurelle du cœur appelée remodelage, modification inévitable mais pathologique. Le remodelage est la cause la plus fréquente d’insuffisance cardiaque, caractérisé par une hypertrophie-dilatation du cœur associée au développement d’une fibrose myocardique délétère. Il existe des techniques médico-chirurgicales qui contribuent à améliorer cela en débouchant physiquement l’artère, mais les conséquences à long terme restent potentiellement néfastes. C’est pourquoi il est impératif de trouver des traitements complémentaires. Notre projet a donc pour but de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques pouvant protéger le cœur en diminuant la taille de la zone infarcie et en limitant le remodelage, et ainsi améliorer la qualité de vie des personnes ayant eu une crise cardiaque. Actuellement, par leur caractère préclinique, et en complément des études in vitro, les modèles animaux sont une étape indispensable pour tester de nouvelles stratégies cardio-protectrices permettant de réduire les conséquences de l’infarctus du myocarde. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est d’anesthésier les animaux, de pratiquer un acte chirurgical afin de simuler un infarctus du myocarde en fermant transitoirement une coronaire, puis de réaliser un traitement cardio-protecteur basé sur des vibrations à très haute fréquence produites par une micro-fraise vibrante au bout d’une tige métallique très fine placée dans la coronaire (système Rotablator). Ensuite, une analyse tissulaire après prélèvement de la totalité du myocarde sera effectuée, éventuellement complétée par des échocardiographies permettant l’analyse du fonctionnement du myocarde, afin d’évaluer l’efficacité du traitement. Seule l’utilisation d’animaux permet d’atteindre l’objectif du projet, qui doit rester proche de la réalité clinique humaine pour rester scientifiquement valable, et l’anesthésie et l’analgésie seront adaptées afin de n’induire aucune souffrance inutile.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 2 fois à une anesthésie générale, la première d’environ 2h permettant la mise place d’un infarctus, et la seconde d’environ 30 minutes se terminant par la récupération du myocarde. Tous les autres actes sont indolores et consistent en des soins ou à des échocardiographies effectués sous sédation légère afin que l’animal soit bien calme. Quelques prélèvements sanguins sont prévus totalisant au maximum 70mL sur 28j.

Impact sur les animaux

La nuisance principale de ce projet est la possibilité d’un arrêt cardiaque définitif (fibrillation ventriculaire réfractaire) lors de la mise en place de l’infarctus sous anesthésie, malgré tous nos efforts pour empêcher cela. De plus, nous ne pouvons aussi exclure une des rares complications mortelles de l’utilisation du Rotablator, principalement la perforation de la coronaire, entrainant un décès non souhaité. Cela oblige à prévoir un nombre plus important d’animaux à utiliser.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie de protection cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale. Il ne parait pas justifié d’effectuer le traitement envisagé in vitro ou sur des animaux de petite taille (rongeurs) aux caractéristiques cardiaques trop dissemblables de l’Homme, alors qu’il a donné des résultats sur notre modèle animal utilisé. Seuls des essais effectués sur un modèle d’étude cardiaque proche de l’Homme sont scientifiquement acceptables pour envisager une extrapolation vers la pratique clinique humaine.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque groupe, et le nombre par lot est fixé à 9. De plus, à chaque fois que c’est possible, les animaux des lots témoins sont mutualisés pour chaque stratégie.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées. Il est à noter que chez l’Humain, l’infarctus en lui-même peut entrainer de la douleur, mais dans nos conditions expérimentales, elle n’a pas été objectivée (pas de différences comportementales entre avant et après l’infarctus). Des signes indicatifs de fatigue inhérents au modèle expérimental seront possiblement observés en fin de protocole lorsque les animaux seront gardés longtemps, et cette période sera plus particulièrement surveillée. Les animaux bénéficient de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et de jouets pour améliorer leur qualité de vie. Ils sont logés par petit groupe, hormis le jour de leur manipulation.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. A 2 mois ½ (25kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité.

2 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis replacés à l'issue du projet. Déjà réutilisés d'un autre protocole autorisé, ils reçoivent une injection sous-cutanée par semaine pendant quatre semaines et cinq prises de sang, pour tester la tolérance de fragments d'ADN candidats au traitement des tumeurs cutanées équines. Le porteur affirme que le remplacement n'est pas possible, le cheval étant l'espèce cible et les molécules spécifiques. Il décrit une injection peu ou pas douloureuse et une surveillance rapprochée après chaque geste.

Objectifs

Les mélanomes représentent 3,8% des tumeurs chez le cheval et affectent plus de 80% des chevaux gris de plus de 15 ans. Le mélanome équin est un cancer d’évolution lente mais très métastatique et invasif. Il entraine progressivement des douleurs et troubles fonctionnels (en particulier digestifs), voire des hémorragies chez les chevaux de plus de 10 ans. Actuellement, il n’y a pas de traitement spécifique totalement efficace et les chevaux affectés ont une espérance de vie réduite. Par ailleurs, les jeunes chevaux de races diverses sont fréquemment atteints par des tumeurs cutanées de type sarcoïde, induites par un papillomavirus d’origine bovine ; ces tumeurs souvent placées dans les zones très mobiles (pli du coude, du grasset, passage de sangle) peuvent entraîner saignements et gêne à l’utilisation des animaux, voire leur réforme anticipée.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une étude préliminaire de tolérance de fragments d'ADN candidats au traitement des tumeurs cutanés chez le Cheval (mélanomes et sarcoïdes). Les doses testées vont de ½ à 4 fois la dose de traitement envisagée. Si les injections répétées à 4 fois la dose de traitement par voie sous-cutanée sont bien tolérées, cette étude permettra d’envisager l’utilisation de ces fragments d'ADN à la dose prévue par voie intratumorale (diffusion générale probablement moindre) chez des cas cliniques (chevaux porteurs de mélanomes ou de sarcoïdes).

Procédures

Vigiles, les chevaux sont soumis à une injection sous cutanée une fois par semaine pendant 4 semaines (soit 4 injections au total, 30 s par injection) et à une prise de sang avant le début du protocole puis une fois par semaine pendant 4 semaines (soit 5 prises de sang au total, durée 30 s chacune).

Impact sur les animaux

L’injection est normalement peu à pas douloureuse. Le fragment d'ADN testé est une poudre diluée dans du sérum physiologique, donc facile à injecter avec une aiguille de petit diamètre et ne causant pas d’irritation locale. D’une manière générale ces fragments sont bien tolérés que ce soit par voie générale (injection sous-cutanée ou intra-musculaire) ou locale (intrathécale ou intraoculaire) aussi bien chez l’animal de laboratoire que chez l’homme (nombreux essais cliniques faits et en cours). Il s'agit dans cette demande d'un ADN modifié nu sans emballage lipidique, ni adjuvant ; il est de qualité très purifiée et normalement non réactive. Après purification, un contrôle d’absence d’endotoxine est réalisé par le fabriquant. La dose injectée est faible au regard de la masse totale de l’animal. Nous n’attendons donc normalement pas de réaction particulière après les injections. Néanmoins, cette étude est menée pour le vérifier.

Devenir

La procédure ne devrait pas causer de dommage aux animaux ; ils seront replacés à l’issue du projet.

Remplacement

Le remplacement n’est pas possible, le cheval étant l’espèce cible du traitement évalué, et les fragments d'ADN utilisés des molécules spécifiques. La molécule testée a été retenue parmi d’autres molécules candidates à l’issue d’études in vitro et s’est montrée la plus efficace sur cultures cellulaires issues de tumeurs de cheval.

Réduction

Le nombre de 2 chevaux est le nombre minimal pour cette étude préliminaire observationnelle. Il permettra de vérifier sur deux individus différents que la molécule testée est bien tolérée localement et sans effets généraux. Aucun test statistique n'est donc envisagé. Les 2 chevaux sont réutilisés d'un autre projet autorisé.

Raffinement

Les chevaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée après chaque injection avec des examens toutes les 2 heures dans les 8 heures suivant l’injection, puis deux à trois fois par jour. Les chevaux seront dans un environnement hospitalier permettant une surveillance quasi continue et une intervention rapide au moindre signe d’inconfort ou de douleur. Pendant l’essai, les chevaux seront hébergés en box individuel sur paille, avec contact visuel avec des congénères. Ils seront nourris avec du foin à volonté et des granulés complémentaires de fourrage distribués en trois repas par jour. Ils seront pansés et sortis marchés en main 15 minutes deux fois par jour. Les boxes sont également enrichis (foin dans un filet pour allonger le temps d’alimentation, pipolino-balle distributrice de granulés/friandises, etc).

Choix des espèces

Le cheval est l’espèce cible du traitement testé. Par ailleurs, les fragments d'ADN sont spécifiques. Animaux jeunes adultes (en général entre 3 et 5 ans).

808 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises jusqu'à vingt semaines à un régime gras destiné à provoquer une fibrose du foie, elles reçoivent jusqu'à onze injections intraveineuses sous anesthésie, avec un risque de lésion ou de douleur de l'œil. Le porteur indique que le régime entraîne une perte de poids les premières semaines puis une reprise, et que toutes les souris développent la fibrose. Leur foie est prélevé après la mise à mort pour récolter les cellules étudiées.

Objectifs

La fibrose hépatique correspond à une cicatrisation du foie, en réaction à une agression, qui finit par entraîner un mauvais fonctionnement de cet organe. La cause première est l'alcoolisme, mais les maladies chroniques du foie comme les hépatites, ou les maladies métaboliques liées à l’obésité, sont aussi à l'origine de fibroses. Une fibrose peut à son tour dégénérer en cirrhose, puis en cancer du foie - l'un des plus mortels. Or il n'existe à l'heure actuelle pas de traitement contre la fibrose. Vu l’augmentation de l’obésité dans la population, les maladies du foie vont devenir un problème mondial de santé publique dans les années à venir. L’objectif de ce projet est d’étudier un type de cellules du foie, connu pour être impliqué dans la fibrose hépatique, les cellules stellaires hépatiques. Il a été récemment découvert que certaines de ces cellules prenaient une forme particulière lors de la maladie hépatique, qualifié de cellules stellaires "hypertrophiées". Ces cellules ont été découvertes à la fois sur des modèles animaux et sur des biopsies de patients atteints de fibrose hépatique. Nous évaluerons dans un modèle murin qui mime la fibrose hépatique chez l’homme, l’efficacité d’un traitement sur la disparition de la fibrose et la forme des cellules stellaires. L’étude approfondie de ces cellules au cours de ce projet permettra de mieux comprendre leur rôle dans la fibrose hépatique et de déterminer de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la fibrose du foie.

Bénéfices attendus

La fibrose hépatique n’ayant à ce jour pas de traitement, nous pensons que cette étude pourra permettre d’identifier des cibles potentielles pour le développement de médicaments pour soigner la fibrose et la cirrhose hépatiques, actuellement incurables.

Procédures

Les administrations de molécules thérapeutiques seront réalisées par voie intraveineuse sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie 10 min, durée de l’injection 30 secondes) toutes les 2 semaines pendant 5 mois maximum, soit 11 injections au maximum. A la fin de l’expérience, une anesthésie profonce de l’animal est réalisée (injection de l’anesthésique = 20s) et un prélèvement sanguin est réalisé (30 secondes). Les animaux seront soumis à un régime alimentaire spécifique (riche en gras et à quantité contrôlée en acides aminés) pendant 20 semaines maximum.

Impact sur les animaux

Le régime alimentaire utilisé pour induire une fibrose hépatique aux animaux entraine une légère perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines pour reprendre ensuite une croissance normale. Les injections répétées peuvent induire un stress, une lésion ou des douleurs potentielles de l’œil.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin des expériences car il est indispensable de récupérer le foie pour récolter les cellules d’intérêt ou de récolter leur foie et leur sang pour étudier les effets du traitement testé sur la fibrose hépatique.

Remplacement

Les expérimentations nécessaires à ce projet ont été élaborées et réfléchies afin de minimiser le nombre d’animaux tout en permettant de réaliser une étude statistique valable. Nous avons préalablement évalué plusieurs formulations de notre molécule in vitro pour ne tester chez l’animal que celles optimales.

Réduction

Ce modèle de fibrose hépatique présente une très faible variabilité d’apparition de la maladie entre les souris (sur plus de 100 souris étudiées, toutes développent une fibrose hépatique). Mais la qualité des cellules d’intérêt obtenues à partir du foie des souris ayant développée une fibrose peut être variable. Ainsi le nombre d’animaux nécessaire a été calculé pour pour obtenir un nombre suffisant de résultats exploitables. De plus suivant les durées de régime, l’expression de certains marqueurs peut être plus ou moins variable. Ainsi, le nombre d’animaux nécessaire pour étudier l’efficacité d’agents thérapeutiques a été calculé pour pouvoir exploiter les résultats statistiquement. Toutes les expériences seront réalisées d’abord sur un premier petit groupe d’animaux, la validité statistique des résultats sera testée, et l’expérience sera poursuivie sur des animaux supplémentaires si nécéssaire. Ainsi, le nombre d’animaux indiqué est un nombre maximum. Dans un souci de réduction, certains animaux âgés de 6 à 18 mois seront des anciens reproducteurs issus de fournisseurs agrées.

Raffinement

Ce régime entraine une perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines. Les souris reprennent ensuite une croissance normale. L’état des souris sera surveillé quotidiennement et leur poids mesuré toutes les semaines. Le milieu sera enrichi pour le bien-être des animaux (cotons de nidifications, bâtonnets et igloos…). Les injections de médicaments seront réalisées sous anesthésie générale et un suivi attentif des animaux est prévu à chaque étape des expériences. Les animaux seront régulièrement évalués à l’aide de points limites bien définis. Pour chaque animal mis à mort, nous exploiterons un maximum de données disponibles.

Choix des espèces

Pour ce projet, l’espèce animale choisie est la souris. Les modèles de maladie hépatique chez la souris, en particulier de fibrose hépatique, ont été très largement décrits dans la littérature et sont bien connus. La souris présente en effet les mêmes étapes de développement de la maladie que la fibrose humaine, ce qui en fait une espèce de choix pour l’étude de nos cellules d’intérêt et l’élaboration de nouveaux agents thérapeutiques. Comme cela est largement décrit dans la littérature, les animaux malades utilisés devront être des souris âgées de 6 semaines (1,5 mois) afin de s’assurer que leur système gastro-intestinal soit bien développé. Et les souris contrôles devront être âgées de 6 mois à 18 mois pour obtenir un nombre suffisant de cellules d’intérêt (car plus les souris sont âgées plus le nombre de ces cellules augmente).

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de la bactérie responsable de la tularémie et subissent des prises de température rectale, pour comparer la virulence de mutants bactériens à une souche de référence. Le porteur affirme que l'analyse in vivo est "indispensable" et que les modèles in vitro ne miment pas la complexité des interactions hôte-pathogène. Toutes les souris sont mises à mort pour mesurer la multiplication bactérienne dans leurs organes.

Objectifs

La tularémie est une maladie zoonotique (c'est à dire que se transmet des animaux vers l'homme) qui est fréquente en Scandinavie (pays du Nord de l'Europe: Norvège, Suède, Finlande). Cette maladie se traduit par un syndrome de type grippal (c'est à dire ressemblant beaucoup à une grippe) mais peut évoluer vers des formes sévères voire létales (c'est à dire entraînant la mort). Cette maladie est une maladie infectieuse causée par un microbe (ou microorganisme) et plus précisément une bactérie. Cette bactérie est dite pathogène car elle peut causer une maladie. L'objectif du projet est de valider l'importance de certains facteurs d'une bactérie pathogène dans un modèle murin (i.e. chez la souris) de la maladie. Pour cela des mutants bactériens sélectionnés et validés au préalable dans des expériences in vitro seront testées en compétition avec une bactérie virulente de référence pour déterminer leur virulence dans la souris. L'objectif est de vérifier le role clef des facteurs testés en vue de faire progresser la connaissance sur cette bactérie et sur la maladie et à long terme de les cibler par des médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de faire progresser la connaissance sur une bactérie pathogène qui cause une maladie appelée tularémie. Cette maladie peut tuer des humains et touche une centaine de patients par an en France et beaucoup plus en Scandinavie. A terme ce projet devrait permettre de mettre en place des thérapies innovantes pour lutter contre cette bactérie.

Procédures

prise de température rectale (durée < 1min, 3 fois: jour 0 et 24h, 30h, J0 sous anesthésie gazeuse, 24h-30h animaux vigiles, pour tous les animaux) Injection de bactéries sous la peau (durée < 1 min) sous anesthésie gazeuse (c'est à dire que les souris sont endormies pendant cette procédure), 1 fois à j0 pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

L'injection de bactéries sous la peau sous anesthésie gazeuse est une source potentielle de douleur locale et/ou de stress transitoire (qui ne perdure pas) pour les animaux. Pendant les deux jours d'infection, les souris pourraient resentir les effets de l'infection même si les doses et les temps d'étude devraient limiter les effets indésirables.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour anayse de la multiplication des bactéries dans les différents organes en vue de faire progresser la connaissance sur la bactérie et la maladie qu'elle cause et à long terme de développer des traitements.

Remplacement

L'analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet et valider l'importance des facteurs étudiés dans la virulence de la bactérie. En particulier, les modèles in vitro étudient la réplication de la bactérie dans un seul type de cellule dans un contexte non-inflammatoire et ne peuvent pas mimer la complexité des interactions hôte-pathogène rencontrées lors d'une infection.

Réduction

Les expériences in vivo arrivent en fin de projet après une sélection fine des mutants in vitro de façon à limiter le nombre de mutants à tester in vivo et donc le nombre d'animaux. De plus, la technique utilisée dite "index de compétitivité" diminue la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Finalement, la chronologie des expérimentations a été définie de façon à ajuster et à limiter le nombre d'animaux requis pour obtenir une information fiable.

Raffinement

Nous prévoyons les points de raffinement suivants: 1) anesthésie lors de l'inoculation des bactéries 2) Les points limites sont définis spécifiquement pour ce projet de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux 3) les doses de bactéries inoculées sont non-létales sur la durée de l'expérimentation et ont été choisies avec soin sur la base d'expérimentations passées et de la litérature 4) les signes de fièvre sont suivis régulièrement par la prise de température 5) en cas de fièvre, un analgésique est administré aux souris avec un suivi de l'efficacité du traitement.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé est le modèle standard (car il mime très bien la maladie humaine) dans le domaine (comme en atteste de nombreuses publications scientifiques validées par des pairs) pour tester la virulence de mutants bactériens. Les animaux utilisés seront de 6 à 12 semaines (age adulte pour la souris avec donc un système immunitaire mature).

10 macaques à longue queue, tous des femelles, vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections intraveineuses de vecteurs de thérapie génique et subissent de nombreux prélèvements sanguins sous anesthésie répétée, avant d'être tués un mois plus tard pour prélèvement des tissus. Le porteur affirme que le macaque apporte les meilleures connaissances transposables à l'humain et qualifie le recours à cette espèce d'"indispensable", la complexité des réactions immunitaires excluant selon lui les méthodes in vitro. Il décrit les gestes comme peu ou pas invasifs, tout en pratiquant euthanasie et prélèvements terminaux.

Objectifs

Les vecteurs dérivés du virus adéno-associé (vecteurs AAV) sont actuellement les candidats-médicaments les plus utilisés dans cadre de traitement des maladies génétiques, par leur capacité à pénétrer dans un organe/tissus et y faire exprimer un gène thérapeutique. Ces vecteurs sont efficaces et bien tolérés. Cependant, leur utilisation en thérapie génique peut être limitée soit (i) en raison d’une immunité pré existante à l’AAV due à l'exposition naturelle de l'homme à certains virus AAV, (ii) de leur efficacité thérapeutique limitée dans certains organes et (iii) du risque d’une concentration importante dans des organes non ciblés. Ces problèmes sont, à ce jour, les principaux défis à relever pour accroître l'efficacité et la sécurité des vecteurs AAV. Afin de surmonter ces limites, plusieurs travaux ont été menée par notre laboratoire et ont aboutis aux résultats suivants : (i) Identification d’un nouveau vecteur AAV thérapeutique qui cible spécifiquement les muscles, tout en préservant le foie et le cœur, chez des primates non humains. (ii) Développement d’une nouvelle stratégie de thérapie génique pour la maladie de stockage du glycogène de type III (accumulation du glycogène, réserve de sucre, dans les organes tels que le muscle et le foie notamment) par utilisation d’un nouveau vecteur AAV thérapeutique dans un modèle de souris. (iii) Démonstration de l'efficacité d’une enzyme (endopeptidase), capable par son action spécifique, de diminuer l’immunité préexistante chez des primates non humains, et donc d’augmenter l’efficacité de l’AAV thérapeutique. Les objectifs de l’étude que nous envisageons de réaliser chez le primate non humain sont : (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles (ii) Étudier l’efficacité, la sécurité et la toxicité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez cette espèce (iii) Démontrer qu’un traitement par l’enzyme endopeptidase couplé à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène), permettrait d’obtenir un transfert de gène efficace.

Bénéfices attendus

Les objectifs de l’étude que nous envisageons de réaliser chez le primate non humain sont : (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles. Ce qui permettrait d'éviter une accumulation du vecteur dans d'autres organe, notamment foie et coeur (ii) Étudier l’efficacité et la sécurité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez cette espèce (iii) Démontrer qu’un traitement par l’enzyme endopeptidase couplé à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène). Ce traitement combiné permettrait de diminuer, voire d’annuler 1-soit une pré immunité, ainsi un plus grand nombre de patients pourront bénéficier de de la thérapie génique AAV 2-soit une réponse immune suite à l'administration du vecteur AAV thérapeutique, permettant ainsi la possibilité d'une deuxième injection thérapeutique

Procédures

Les animaux de cette étude seront soumis aux interventions suivantes : - Dans le mois avant l’injection, les 10 animaux auront 2 prélèvements sanguins (J-30 et J-8), sous anesthésie de courte durée (15-20 min) afin de répartir les macaques dans 3 groupes en fonction du niveau de leur immunité préexistante. - Pour le groupe 1 (n=2) : le jour de l’injection (J0) : une prise de sang et une injection par voie intraveineuse lente du vecteur AAV thérapeutique testé précédé ou non par une injection de « l’AAV à capside vide » par voie intraveineuse en fonction de leur immunité préexistante à l’AAV. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures) - Pour le groupe 2 (n=4) : Le jour de l’injection (J0) : une prise de sang et une injection par voie intraveineuse lente du vecteur AAV thérapeutique testé, précédé ou non par une injection de « l’AAV à capside vide » par voie intraveineuse en fonction du niveau de l’immunité préexistante à l’AAV. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures). - Pour le groupe 3 (n=4) : La veille de l’injection (J-1) : un traitement immunosuppresseur et antihistaminique par voie intraveineuse. Le jour de l’injection (J0) : une injection par voie intraveineuse lente du vecteur AAV thérapeutique testé, précédé par une injection de « l’AAV à capside vide » ou d’une solution saline (contrôle) par voie intraveineuse. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures). Le nombre de prises de sang sous anesthésie (entre 15 et 30 min) seront les suivants : à J0 : n= 8 et entre 1 et 30 jours post-injection : n = 5 - A 30 jours post-injection (J30) : un prélèvement sanguin, avant euthanasie par injection intraveineuse d’une dose létale d’anesthésique.

Impact sur les animaux

Tous les gestes réalisés sur ces animaux seront non ou peu invasifs : (i) administration lente des produits par voie intraveineuse, et (ii) prélèvements sanguins par ponction veineuse. Aucune douleur ni aucun stress physique ou thermique n'est anticipé pendant la procédure ou en post-injection. Dans le but de réduire au maximum le stress des animaux lié à la contention, toutes les manipulations, à l'exception des observations biquotidiennes, seront effectuées sous anesthésie, ainsi qu’une induction de cette dernière par injection intramusculaire sur des primates préalablement isolés dans des cages individuelles. Un jeûne d'une durée maximale de 12 heures, sera mis en place pour tous les animaux avant leur anesthésie, dans le but de prévenir les régurgitations et les fausses routes pendant la procédure. Cependant, il est important de noter que ces injections n'auront aucun impact sur leur consommation alimentaire et hydrique. Les primates seront réintégrés dans leur cage ou volière une fois pleinement réveillés de leur anesthésie afin de réduire au maximum tout stress environnemental. Malgré tout, un suivi rapproché des paramètres cliniques (observations quotidiennes et examens cliniques) et des paramètres sanguins (hématologie et chimie clinique) des animaux sera mis en place afin de pouvoir détecter toute potentielle anomalie non phénotypique en post-injection.

Devenir

Les 10 animaux concernés par cette procédure seront suivis pendant 1 mois après l’injection du vecteur testé puis euthanasiés pour prélèvements de tissus post-mortem. L’euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir des prélèvements de tissus sur lesquels s’appuieront des analyses de biodistribution et d’expression du transgène, ainsi que des analyses histopathologiques et immunohistochimiques

Remplacement

Les études réalisées chez le Primate Non Humain (macaque fascicularis) apportent les meilleures connaissances transposables à l’homme en termes de toxicité, d’efficacité et d’immunogénicité de l’AAV. La complexité des réactions en jeu ne permet pas le recours à des méthodes substitutives, telles que les études in vitro isolées et justifie notre recours à des animaux. Les résultats obtenus sont transposables en terme de biodistribution et tolérance et permettent d'envisager de futurs essais cliniques chez l'homme (Primate Humain).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude (n=10) a été déterminé sur la base d’études précédentes en thérapie génique. Ce nombre est réduit à son minimum tout en assurant une exploitation possible des résultats. En effet, la constitution de 3 groupes différents permettra de (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles (ii) Étudier l’efficacité, l’innocuité la sécurité et la toxicité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez le primate non humain (iii) Evaluer la synergie et l’efficacité d’un traitement par l’enzyme endopeptidase combinée à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène).

Raffinement

L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement tout le long du projet (techniciens animaliers et vétérinaire). Des protocoles anesthésiques seront mis en place selon la procédure à réaliser. Les administrations expérimentales (injections par voie intraveineuse d’antihistaminique, d’immunosuppression et des vecteurs) se dérouleront sous anesthésie générale. Les prélèvements sanguins seront effectués sous protocole anesthésique permettant d'obtenir une anesthésie de courte durée (environ 10 min). Ces actes étant peu ou pas douloureux, le protocole analgésique ne sera pas basé sur des opioïdes mais par contre sur les effets analgésiques des molécules anesthésique utilisées. Pour favoriser les échanges sociaux entre animaux et favoriser leur bien-être, les macaques seront hébergés en cage en post-injection, et en volières dès que possible pour favoriser les déplacements verticaux.

Choix des espèces

La capacité des vecteurs AAV à pénétrer dans un organe/tissu et y faire exprimer un gène thérapeutique est espèce dépendante. Les objectifs principaux de ce projet étant : (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles (ii) Étudier l’efficacité, l’innocuité la sécurité et la toxicité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez le primate non humain (iii) Evaluer la synergie et l’efficacité d’un traitement I par l’enzyme endopeptidase combinée à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène), Il est donc indispensable de choisir l’espèce en conséquence. Un vecteur peut être efficace chez le rongeur mais pas chez l'homme. Le macaque fascicularis représente l’espèce animale de choix dans le modèle préclinique de par sa morphologie, sa physiologie, sa proximité phylogénétique et sa similitude avec le système immunitaire de l’homme. 10 singes (Macaca fascicularis) femelles (2-3 ans, 2.5-4.5 kg) seront inclus dans l’étude. Par conséquent, les animaux utilisés dans cette étude sont de jeunes adultes ayant leur système immunitaire mature, indispensable pour notre étude.

516 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer une inflammation puis des tumeurs cutanées vers 8 à 10 mois, elles subissent des fibroscopies par voie rectale, une phalangectomie pour le génotypage et des applications répétées d'adhésif sur l'oreille destinées à provoquer une inflammation. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les échanges entre intestin, microbiote, système immunitaire et peau à l'échelle de l'"organisme entier", et conclut que le recours à la souris est "indispensable". Les retombées annoncées, de nouvelles cibles contre les cancers de la peau, restent renvoyées à une étape ultérieure.

Objectifs

Les tumeurs présentent des caractéristiques et capacités particulières qui sont essentielles à leur développement. Parmi celles-ci, on peut retrouver leur capacité à proliférer indéfiniment, leur capacité à muter et à échapper au système immunitaire. De nouvelles études suggèrent que le microbiote, micro-organismes vivants dans notre corps, impacte aussi la croissance tumorale. Dans le cas du mélanome par exemple, un déséquilibre du microbiote intestinal est lié à une meilleure progression de la tumeur, de plus, le remplacement du microbiote « malsain » par un microbiote "sain" chez les patients atteints de mélanome permet d’améliorer l’efficacité des traitements par immunothérapie. De même, les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI telle que la maladie de Crohn), maladie où le microbiote intestinal joue une rôle important, présentent régulièrement des symptômes cutanés tels que des dermatites, de l’acné, une rosacée. Ceci suggère un lien entre microbiote intestinal, efficacité du système immunitaire et développement tumoral cutané ou d’une inflammation cutanée. Le projet proposé ici vise à étudier le lien qui peut exister entre ces trois acteurs. Pour ce faire, l’utilisation de modèles animaux est nécessaire afin de pouvoir étudier les interactions, échanges et influences du microbiote et système immunitaire sur le développement tumoral à distance.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment notre système immunitaire agit dans nos intestins et sur notre peau. Le but est de découvrir les mécanismes permettant la mise en place d’une inflammation cutanée qui mène au développement de tumeurs ; ainsi que l’impact du microbiote sur ces mécanismes et réponses. Ceci nous permettra ensuite d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des cancers de la peau et de proposer une nouvelle approche pour soulager les problèmes de peau chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI).

Procédures

Une fibroscopie, comparable à une coloscopie chez l’Homme, sera effectuée sur certains animaux afin d’étudier la communication immunitaire entre intestins et peau. Cette fibroscopie ne durera pas plus de 10 min par animal et sera réalisée 1 fois sur les animaux, à l’exception des animaux d’une manipulation où le geste sera répété 3 fois en 20 jours. Avant chaque fibroscopie, une injection d’analgésique sera faite sur les animaux. Celle-ci durera 10 secondes au total par animal. Les animaux seront anesthésiés avant la fibroscopie. Certains animaux seront traités par antibiotiques par voie orale. L'identification et le genotypage des animaux se fera par phalangectomie distale donc en un seul geste avant calcification. Certains animaux auront une application d’adhésif sur l’oreille permettant de mimer l’apparition de lésions cutanées. Cette application sera répétée 3 fois sur une oreille et entrainera une inflammation au site de « l’épilation ».

Impact sur les animaux

Le projet implique l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui développent une inflammation et des tumeurs cutanées. Ces animaux vivent normalement pendant les 6 premiers mois de vie sans aucun symptôme. Ils commencent à développer une inflammation cutanée vers 6 mois de vie et des tumeurs cutanées vers 8/10 mois de vie. Certaines expérimentations impliquent l’insertion d’une fibre optique par voie rectale dans l’animal. Celle-ci ne devrait normalement pas générer de lésions ou de gêne puisque cela s’apparente à l’insertion d’un thermomètre rectal chez l’Homme. Certains animaux auront un endommagement de la barrière cutanée de l’oreille des souris, à l’aide d’un ruban adhésif.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit suite à la fin de la procédure afin de prélever les organes, soit lorsqu’un point limite est atteint et qu’aucun geste ne permet un retour à l’état normal et ce afin d’éviter toute souffrance.

Remplacement

L’étude de la migration des cellules immunitaires entre deux organes ne peut se faire, pour le moment, qu’à l’échelle de l’organisme entier. Aucune technologie actuelle n'est capable de mimer les interactions entre le système digestif, le microbiote, le système immunitaire et la peau. Cette étude ne peut se faire qu'à l'échelle d'un organisme entier. De plus, la complexité du système immunitaire ainsi que son contrôle et sa régulation imposent que cette étude se fasse dans un système intégré, à l’échelle de l’organisme entier. L’utilisation d’animaux est donc indispensable à l’avancée de ce projet.

Réduction

De précédentes études montrent que 100% des animaux développent une inflammation intestinale/colorectale ainsi qu’une transformation tumorale cutanée. L’effet étant indépendant du sexe de l’animal, tous les animaux générés pourront être utilisés. Cela permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. De plus, lors de la mise à mort des individus, certains organes pourront être collectés afin de servir à un autre projet développé dans le laboratoire, permettant ainsi de ne pas utiliser d’autres souris pour cet autre projet. Également, les animaux des groupes contrôles seront mutualisés, permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés ici. Afin de réduire encore plus le nombre d’animaux, une formation au geste de « fibroscopie » a été réalisée en suivant un protocole établi et utilisé en routine par d’autres manipulateurs. Pour le calcul du nombre de souris utilisables par groupe, nous avons réalisé des simulations statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux pour la validation des objectifs.

Raffinement

Des éléments d’enrichissement seront systématiquement mis dans les hébergements afin de favoriser le bien-être animal. Les animaux qui seront anesthésiés feront l’objet d’une surveillance accrue post-anesthésie. Pendant la période d’anesthésie, un gel hydratant et protecteur sera appliqué sur leurs yeux afin d’éviter toute déshydratation et donc toute gêne pour l’animal. Un analgésique sera également administré aux animaux en prévention de tout geste. Afin d’augmenter le raffinement, l’application d’une pommade anesthésique et d’un lubrifiant au niveau anal sera faite pour tous les animaux qui auront une endoscopie/fibroscopie afin de faciliter la fibroscopie (amélioration du protocole). En plus de la surveillance mise en place pour assurer le bon réveil des animaux, une surveillance supplémentaire 1 heure après le réveil des animaux sera faite afin de détecter de potentiels saignements chez les animaux ayant subi la fibroscopie. Si des saignements sont détectés et durent plus d’une heure, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La complexité du système immunitaire ainsi que son contrôle et sa régulation font que l’étude ne peut se faire que dans un système intégré et donc à l’échelle de l’organisme entier. L’étude de la transformation tumorale cutanée, sous l’influence du microbiote intestinal, implique que les expérimentations soient menées à l’échelle physiopathologique sur un modèle animal de choix. La souris (mus musculus) correspond à ces critères. Premièrement, les souris présentent un système immunitaire similaire à celui de l’Homme. De plus, le rôle de la molécule d’intérêt est conservé à plus de 97% entre l’Homme et la souris, ce qui permet de transposer facilement les études réalisées sur la souris chez l’Homme et inversement. Également, le microbiote de cette espèce est particulièrement bien caractérisé et peut-être facilement contrôlé et étudié, ce qui est important pour le projet que l’on souhaite mettre en place. Enfin, l’ensemble des outils nécessaires à l’étude, comme les anticorps, protocoles et kits, sont développés sur le modèle murin depuis plus de 20 ans. La souris est donc le modèle le plus adapté pour l’exécution de ce projet. Le but du projet est de comprendre l’impact de la signalisation de la molécule d’intérêt sur la réponse du système immunitaire au microbiote et le lien avec le développement tumoral cutané. Cette transformation peut commencer vers 6 mois de vie mais est complétement visible à 8-10 mois de vie. De plus, la maturité du système immunitaire intestinal est établie après 2 mois et l’intestin de souris est mature après 45 jours de vie. De ce fait, seules des souris adultes seront utilisées. Elles seront utilisées à 2, 6 et 8/10 mois de vie (la sortie des animaux entre 8 et 10 mois de vie dépendra des signes cliniques observés lors de la surveillance quotidienne dont feront l’objet les souris).

15 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue pour études histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation sous anesthésie, trois IRM et jusqu'à neuf ponctions de sang et neuf ponctions de liquide céphalo-rachidien, pour tester la faisabilité d'une thérapie de la leucodystrophie métachromatique. Le porteur reconnaît des risques anesthésiques, des douleurs post-opératoires et des fuites de liquide provoquant maux de tête et vomissements. Il présente l'étape chez le primate comme "indispensable" et "requise" par l'agence du médicament avant un essai chez l'humain, l'efficacité n'ayant été montrée que chez la souris.

Objectifs

La leucodystrophie métachromatique (MLD) est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (gaine qui isole la fibre nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une dégradation très rapide dans les 6 mois suivant les premiers symptômes et un décès des patients dans les deux ans au maximum. De nos jours la majorité des patients atteints de MLD sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités avant l’apparition des symptômes mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques. Une composante particulière de la MLD est la neuro-inflammation que développent les patients et qui est présente aussi dans le modèle souris de la pathologie. Dans ce contexte, nous proposons de mener le projet de recherche qui a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la pathologie. L’efficacité de la thérapie a été évaluée préalablement dans le modèle murin de la pathologie et les résultats préliminaires démontrent des résultats très encourageant. L’objectif ici est de démontrer la faisabilité et la tolérance de notre approche chez le primate non humain (PNH).

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de leucodystrophie métachromatique (MLD) ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Ce projet a pour but d'identifier une nouvelle voie thérapeutique pour ces patients. Le projet sera mené sur un modèle animal extrêmement proche de l’être humain afin de pouvoir proposer pour les différentes pathologies d’intérêt, un traitement et sa mise en place. A terme l’objectif est de pouvoir mettre en place un essai clinique chez l’Homme dans les prochaines années.

Procédures

- 3 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h), sous anesthésie générale repartis dans le projet ( un pré op, un immédiatement après la chirurgie et un avant la necropsie - Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie sera pratiquée sur les animaux (durée environ 1h30). - 9 prélèvements sanguins maximum et 9 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (durée du geste maximum 30min pour les 2 gestes, respectivement 10 min et 15 min max) réalisés sous anesthésie générale et analgésie. Dans ce projet, une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien + IRM selon les temps d’intérêt de l'étude, ou chirurgie + IRM). des administrations IM en vigile pour induire l'anesthésie et la pose de cathéter à chaque IRM

Impact sur les animaux

L’animal sera confronté à une chirurgie sous anesthésie générale générant un risque anesthésique et infectieux, et de potentielles douleurs post-opératoires. Sur le protocole, plusieurs prélèvements de sang et de LCR seront réalisés amenant un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques ) et la formation possibles d’hématomes au niveau des sites de ponctions. Enfin, l’animal sera soumis à un stress lié à la contention en cage pour la réalisation des injections (anesthésie, analgésie, antibiotique,…) même s’il est réalisé par des personnes formées et auxquelles les PNH sont habitués.

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux (n=15) sera euthanasié pour permettre les etudes histologiques et de biodistribution composant l'etude preclinique permettant de supporter une étude de Toxicologie et la soumission aux agences reglementaires.

Remplacement

Toutes les études possibles sur des cellules ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des constructions et des implants. Une preuve de concept a été établie dans le modèle souris de la pathologie. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude d’efficacité et de tolérance chez le gros animal (primate non humain). Ces étapes sont requises par l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé pour toute demande d’autorisation d’étude clinique chez l’Homme.

Réduction

Il y a 15 animaux maximum prévus sur ce projet, correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité des différentes approches avec des lots d’animaux. Une première étude de faisabilité sur 4 animaux suivi d’une étude de toxicité sur 11 PNH maximum, repartis en lot de 2 à 3 individus selon les demandes de nos partenaires et des agences réglementaires. L'étude concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié sans analyse statistique.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté. Le nombre d'anesthesies est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandation en terme de Bien être animal validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la même anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie. Un analgésique sera utilisé pour éviter tout inconfort. La procédure chirurgicale est raffinée avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, un suivi et un maintien des paramètres physiologiques de l’animal. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si necessaire. Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Enfin, en termes de raffinement nous avons travaillé sur la taille de notre puce à implanter qui est 10 à 15 fois plus petite que celle de notre étude précédente qui avait été utilisée chez la souris et donc parfaitement adaptée à l’implantation prévue dans ce projet. Tout ce projet sera réalisé en conditions de Bonnes Pratiques de Laboratoire (BPL) pour bénéficier du meilleur suivi qualité et permettre la valorisation de ces expériences auprès des agences réglementaires françaises et internationales en vue d’un essai clinique de phase I/II chez l’homme.

Choix des espèces

La capacité des implants a secréter de manière efficace de la protéine d'interet qui soit mobilisable par les systèmes nerveux centraux et périphériques est dépendante de l’organisme dans lequel on réalise l’implantation. Ainsi à finalité clinique, l’implantation chez le primate non humain est une étape indispensable en vue de la préparation d’un dossier d’essai clinique afin d’obtenir les donner de faisabilité et de tolerance dans un organisme entier qui soit en plus comparable à l’homme d’un point de vue physiologique et immunitaire notamment. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (2-8 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́, de plus compte tenu des patients ciblés par nos approches, ils auront une taille similaire à nos patients pédiatriques.