Procédures modérées

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des yeux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation dégradant les photorécepteurs dès la naissance, elles reçoivent une injection quotidienne pendant trente-deux jours puis un électrorétinogramme sous anesthésie, pour cribler jusqu'à quarante molécules censées protéger la vision. Le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer une inflammation et une douleur, l'animal étant tué s'il souffre. Il précise avoir testé les molécules sur cellules et tissus mais affirme que leur fonctionnalité "ne peut être évaluée que sur un modèle vivant".

Objectifs

La dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) est une maladie chronique de la macula, zone centrale de la rétine où sont concentrés les photorécepteurs à cônes. Ces derniers sont indispensables à la vision fine et centrale. S’ils dégénèrent, le patient perd l’information visuelle et aperçoit des scotomes (tâche noire) qui comble ce manque d’information. La DMLA est la première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans dans le monde. Il existe deux formes de DMLA : sèche et humide. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement curatif, seulement quelques traitements permettant de ralentir la propagation de la forme humide. Pour la forme sèche, qui représente 80pourcents des cas de DMLA, de nouveaux traitements sont actuellement en phase clinique. Ces traitements sont des antioxydants (vitamine E) ou bien des traitements agissant sur le système immunitaire, mais aucun de ces traitements ciblent spécifiquement le mécanisme de mort cellulaire des photorécepteurs à cônes. Ainsi, le but du projet est de trouver une/des molécule(s) protégeant les photorécepteurs à cônes de la dégénérescence lorsqu’un patient est atteint de DMLA. Avant de passer sur un modèle vivant, des tests préalables in vitro (photorécepteurs en culture et explants de tissus rétinien) ont été réalisés pour évaluer les effets potentiels neuroprotecteurs des molécules.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d’identifier des molécules qui préviennent la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Si une ou des molécule(s) est, sont identifiée(s), un traitement pourra ensuite être envisagé pour soigner les millions de patients atteints de DMLA (dégénérescence maculaire lié à l'âge) dans le monde.

Procédures

Injection intrapéritonéale : Nous allons procéder à des injections intrapéritonéales quotidiennement sur animal vigile, pendant 32 jours. Chaque injection dure moins d’une minute par animal. Anesthésie générale : Au bout du 33ème jours, une anesthésie générale sera effectuée sur chaque animal afin de réaliser l’ERG. L’anesthésie générale sera injectée en intrapéritonéale. Electrorétinogramme (ERG) : Cet examen clinique permet de mesurer l’activité des photorécepteurs suite à un stimulus lumineux. Ainsi, cet examen nous permettra de déterminé si l’animal à une vision restauré ou non selon les molécules injectées. Pour cela, la cornée sera anesthésiée localement et la pupille sera dilatée par médication. Des électrodes seront placées afin d’enregistrer l’activité électrique généré par la rétine suite à un stimulus lumineux. Les deux yeux seront soumis à cette procédure. L’ERG dure environ 40 minutes par animal. Les souris passeront 1 fois par cette étape expérimentale. Les souris seront placées en chambre de réveil chauffée à 32 degrés et seront surveillées jusqu’à leur complet réveil après l’anesthésie. Les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien afin de réaliser le prélèvement des yeux et les analyses nécessaires.

Impact sur les animaux

Une inflammation peut être entraînée par les injections intrapéritonéales au niveau abdominal ainsi qu’un léger stress et une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme). Risque faible de mauvaise réaction à l’anesthésie générale lors de l’électrorétinogramme.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et les yeux prélevés (après euthanasie) pour permettre des analyses histologiques complémentaires. Tous les animaux des procédures seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Remplacement

Les molécules qui seront injectées in vivo ont été préalablement sélectionnées. En effet, celles-ci ont été testées sur deux modèles différents : l’un cellulaire et l’autre tissulaire dont tous deux présentaient une dégénérescence des photorécepteurs à cône. Grâce à ces modèles nous avons sélectionné des molécules ayant une double action,1) de protection contre la mort cellulaire et 2) de préservation de la structure des photorécepteurs à cône. La fonctionnalité des photorécepteurs ne peut quant à elle être évaluée uniquement sur un modèle vivant. Dans le cas présent nous effectuerons les tests sur un modèle murin présentant une dégénérescence similaire à celle de l’Homme.

Réduction

Suite à un calcul de puissance, nous estimons que 10 souris par groupe (1 groupe correspondant à 1 molécule ou 1 véhicule) est suffisant pour réaliser des tests statistiques. Nous prévoyons de tester un maximum de 40 molécules sur les 5 ans. Soit un total de 800 souris. Les lots seront composés de la manière suivante : souris et molécule ou souris et véhicule (témoin). Pour une interprétation fiable des résultats, ces derniers seront soumis à des tests statistiques. De plus, dans un esprit de réduction du nombre d’animaux, nous regrouperons les témoins pour les molécules aillant le même véhicule.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton pour le nid, maison en carton), alimentation et abreuvement à volonté. Pour la réalisation des électrorétinogrammes, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale associée à une anesthésie locale de la cornée. Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant la procédure. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intrapéritonéale. Nous appliquerons une noisette de pommade anti-inflammatoire et antibactérienne à la fin de l’électrorétinogramme. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (coton pour le nid, maison en carton), ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. Les animaux utilisés dans ce projet naissent dans notre animalerie. Les injections intrapéritonéales répétées peuvent induire une douleur chez les animaux. Si cela se produit, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris utilisée dans ce projet est un modèle lié à une mutation spontanée induisant une dégénérescence précoce des photorécepteurs. Ce modèle est très utilisé par la communauté scientifique dans le cadre de rétinopathie pigmentaire récessive très utilisé par la communauté scientifique. Ces molécules seront injectées sur ces sourisqui , présentent une dégénérescence précoce des photorécepteurs dès leur naissance.. La dystrophie des photorécepteurs à cône débute aux alentours de 14 jours après la naissance (P14) des animaux et se termine à 90 jours après leur naissance. D’après une étude, nous pouvons réduire la fenêtre de dégénérescence de P14 à P45, où moins de 50 pourcents des corps cellulaires et moins de 25 pourcents des segments externes sont encore présent chez les photorécepteurs à cônes. Donc, nous injecterons les animaux entre P14 à P45, soit la période à laquelle les photorécepteurs à cône dégénèrent.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection sous-cutanée d'une formulation à libération prolongée puis onze prélèvements sanguins à la veine de la queue, pour comparer le profil pharmacocinétique de six formulations d'un "laboratoire pharmaceutique client". Le porteur reconnaît que les prélèvements répétés stressent les animaux et peuvent léser leur queue. Il présente le recours à l'animal entier comme "nécessaire et obligatoire d'un point de vue réglementaire" et retient le rat plutôt que la souris pour son volume sanguin plus élevé.

Objectifs

Le laboratoire pharmaceutique client a développé des matrices de type gel qui peuvent être complexées avec des composés thérapeutiques et être administrées par voie sous-cutanée afin d'induire une libération prolongée du composé complexé. Ce type de formulation (ou galénique) permet ainsi, en théorie, de réduire très sensiblement la fréquence d'administration de médicaments dont la voie d'administration est sous-cutanée. Néanmoins, il est nécessaire de tester, pour chaque composé à complexer, sa stabilité à moyen long terme dans la matrice afin que ce dernier conserve son efficacité. Par ailleurs, la durée de libération va également dépendre étroitement de la composition du gel. Le présent projet vise ainsi à explorer le profil pharmacocinétique de 6 formulations à libération prolongée du médicament X administrées par voie sous-cutanée chez le rat, dans le but d'optimiser son développement. Les données obtenues seront comparées aux profils pharmacocinétiques obtenus après administration d'une galénique classique du composé X par voie intraveineuse et sous-cutanée. La formulation permettant la meilleure stabilité du compose X et de ses paramètres pharmacocinétiques sera conservée pour la suite du développement, notamment dans un cadre clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de catégoriser les formulations à libération prolongées du médicament X de notre client en fonction de leur paramètres pharmacocinétiques et de prioriser les meilleures formulations pour la suite du développement préclinique et clinique. La formulation à libération choisie prolongée devrait à terme permettre de réduire considérablement la fréquence d'administration du composé X qui est déjà utilisé en clinique humaine sous sa forme galénique classique.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Pesée (1min ; 2 fois). Habituation aux boîtes de contention (5min ; 2 fois). Anesthésie gazeuse (5min ; 1 fois). Administration sous-cutanée du composé d'intérêt (1min ; 1 fois). Prélèvements sanguins (5min ; 11 fois).

Impact sur les animaux

La répétition des prélèvements sanguins via la veine de la queue est de nature à induire un stress aux animaux. Par ailleurs, ces prélèvements répétés pourraient s'avérer générateurs de lésions problématiques au niveau de la queue. Afin de limiter le stress, les animaux seront manipulés de façon quotidienne par les expérimentateurs et habitués aux systèmes de contention utilisés au cours des prélèvement. Afin de se prémunir de lésions potentielles au niveau du site de prélèvement sanguin, ceux-ci seront pratiqués à l'aide de microperfuseurs à ailettes, ces derniers autorisant un prélèvement sanguin en n'insérant que le premier millimètre de l'aiguille dans la veine. Une attention particulière sera portée à la queue des animaux. Si un hématome venait à apparaitre, les prélèvements suivants seraient pratiqués sur le côté opposé de la queue. Par ailleurs, le volume de sang prélevé pour chaque point est limité au volume minimum possible pour la réalisation des analyses pharmacocinétiques (PK) ultérieures.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Après euthanasie, certains organes seront prélevés (coeur, poumons, cerveau...) afin d'étudier une accumulation éventuelle à leur niveau du composé X ou d'éléments constituants de la matrice de libération prolongée.

Remplacement

Le présent projet vise à déterminer les paramètres pharmacocinétiques de formulations à libération prolongée d'un médicament X. Le recours à l’animal entier reste une étape nécessaire et obligatoire d'un point de vue règlementaire pour ce type d'étude. Le choix du modèle rat a été préféré à la souris du fait des capacités accrues de prélèvements sanguins sur ce modèle (volémie plus importante).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure d'obtenir des données significatives sur les paramètres pharmacocinétiques étudiés. Le nombre d'animaux par groupe a été choisis selon les recommandations d'un ouvrage de référence. Le nombre de 6 animaux par groupe a été choisi en tenant compte d'une possibilité de variabilité plus importante de la biodisponibilité des drogues progressivement libérées par la matrice en sous-cutanée par rapport à une administration classique (libération immédiate).

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études pharmacocinétiques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Notamment, les volumes des prélèvements sanguins en série seront limités au strict nécessaire pour l'élaboration des dosages. Par ailleurs, les prélèvements seront réalisés par ponction de la veine de la queue à l'aide de microperfuseurs à ailettes, ces derniers autorisant un prélèvement sanguin en n'insérant que le premier millimètre de l'aiguille dans la veine. Les animaux seront hébergés avec un enrichissement du milieu de vie qui sera assuré par l'ajout de petites briquettes en bois et de tubes cartons spécifiques pour rat. Enfin, un suivi journalier des animaux permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis (administration d'analgésiques; cf annexes).

Choix des espèces

Le rat a été préféré à la souris compte tenu du nombre de prélèvements et des volumes sanguins nécessaires à l'étude. La même étude sur la souris aurait nécessité de limiter drastiquement le nombre de prélèvements par animal, ce qui aurait eu pour conséquence d'augmenter considérablement les effectifs de l'étude. Par ailleurs à ce stade, les études sur animaux non rongeurs n'ont pas été envisagées par soucis de Remplacement (Règle des 3Rs). Il nous apparait que les études sur les mammifères non murins devraient être limitées aux études règlementaires sur des molécules actives déjà sélectionnés. Or dans le cas présent il s'agit d'une étude de sélection de formulations, permettant d'optimiser la recherche et développement du client et de limiter le développement ultérieur aux formulations présentant les meilleurs propriétés pharmacocinétiques. Les animaux utilisés seront des rats adultes (300 g à réception/350g env. au démarrage des expérimentation). Ce stade de développement a été choisis: - en se basant sur le recommendations d'un ouvrage de référence. - en considérant le nombre de prélèvements et les volumes sanguins nécessaires à la bioanalyse.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus hématopoïétiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation ou un traitement détruisant leur moelle, une greffe de cellules par voie intraveineuse ou intra-fémorale, puis des prélèvements de sang et de moelle répétés pendant un an. Le porteur indique que le conditionnement peut faire chuter le poids et que les prélèvements intra-fémoraux peuvent provoquer un boitement. Il affirme qu'aucun test ne remplace l'injection de ces cellules dans une souris hôte et conclut à "aucune possibilité de remplacement", ce volet étant la seconde partie d'une étude sur une enzyme des cellules souches du sang.

Objectifs

La fabrication des cellules du sang (globules blancs, rouges et plaquettes) dont la durée de vie est limitée dans le temps se fait à partir de cellules souches (appelées CSH). Ce processus se passe dans la moelle osseuse où sont localisées les CSH (chez la souris il se déroule également dans la rate). L'objectif ce projet de recherche fondamentale est de déterminer le rôle d'une enzyme dans le processus de fabrication des cellules sanguines en particulier si en agissant sur cette enzyme il est possible d’augmenter le nombre et d’améliorer la fonction des CSH.

Bénéfices attendus

Il est à noter qu'à ce jour pour certaines hémopathies la greffe de cellules souches hématopoïétiques est la seule option thérapeutique curative mais l'une des limites à cette approche reste le faible nombre de cellules ; il est donc essentiel de mieux comprendre leur mode de régulation et de trouver des moyens d'augmenter leur nombre. 40 000 greffes de CSH ont été faites en Europe en 2018 et les chiffres montrent que ce nombre est en augmentation.

Procédures

Les animaux subiront les mêmes procédures que celles utilisées aujourd'hui en clinique. Tout d'abord une irradiation ou un traitement myéloabatif: pour l'irradiation il y aura un transport d'une animalerie à l'autre. La procédure d’irradiation (trajet inclus) durera moins de 1h30. Pour le traitement myéloablatif, il y aura une injection par jour pendant 5 jour en IP sur animal vigile (temps du geste 1 minute). Ensuite les animaux subiront une greffe de cellules : cela se fait par injection en intra veineux dans la veine de la queue sur animal vigile (le geste dure moins d’une minute) ou par injection intra-fémorale sur animal anesthésié (le geste dure moins de 10 minutes). Enfin le suivi de la prise de greffe se fait par prélèvement. Le prélèvement sanguin submandibulaire : 50μL de sang prélevé une fois par mois pendant 1 an maximum. Ce geste, de moins d’une minute, est réalisé sur animal vigile et dure moins d'une minute. Le prélèvement intrafémoral : 25µL de moelle osseuse, prélevée tous les 3 mois et nous alternerons les genoux donc genou droit 2 prélèvements à 3 et 9 mois, gauche 1 prélèvement à 6 mois. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins de 5 minutes. Le prélèvement sanguin rétro-orbitaire : 200µL de sang prélevé une seule fois avant l'euthanasie. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins d'une minute.

Impact sur les animaux

L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. L'injection ou le prélévement intra-fémoral peuvent entrainer un léger boitement sur 12h maximum. Le prélèvement sanguin en mandibulaire nécessite une contention qui peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate et thymus) pour les analyser.

Remplacement

Pour analyser les CSH il n'existe qu'un seul test, qui consiste à injecter ces cellules dans une souris hôte et regarder comment ces cellules participent à la production des cellules sanguines de cet hôte. Pour cela, les CSH ont besoin d'être dans leur organe physiologique et à ce jour, il n'est pas possible de recréer cet environnement complexe in vitro, il n’y a donc aucune possibilité de Remplacement.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R, comme il n’existe pas de possibilité de Remplacement, nous combinerons nos lots témoins dans le but de Réduire le nombre d'animaux. Nous avons réduit le nombre de souris à 6 dans les lots pour lesquels nous attendons une faible variabilité des résultats. Pour les lots où il y a une étape de culture cellulaire nous aurons besoin de 12 souris par lot car la variabilité des résultats sera plus forte. Ces nombres ont été calculés afin que les résultats obtenus puissent être analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de respecter la notion de Raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance jusqu'à leur mort (enrichissement de la nourriture lors de l’élevage et de l’expérimentation per se, enrichissement de l’environnement avec ajout de laine de peupliers pour "faire des nids" et présence d'une structure en plexiglace rouge transparente dans lequel la souris peut se cacher...). Les souris étant des animaux grégaires ils seront élevés en groupe. Les souris seront suivies quotidiennement par les animaliers. Enfin nous avons mis en place une grille de score qui nous permet d'évaluer la "bonne forme" des animaux et déterminer ainsi si un animal atteint un point limite: sont ainsi évalués, la bonne forme générale, le comportement, l'état de la peau, le poids ainsi que des critères plus spécifiques à la procédure comme l'état de l'oeil, de la veine caudale et du genou (les sites d'injection/prélèvement). L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. Les animaux seront donc soumis à un régime de nourriture enrichie. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour les gestes pouvant générer de l'inconfort.

Choix des espèces

La souris est le modèle classiquement utilisé pour étudier les cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 semaines. À cet âge-là, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l'injection de cellules. De plus il a été démontré que la prise de greffe était optimale à cette age-là. Le suivi des souris greffées se fera sur du long-terme (jusqu'à 1 an) afin de s'assurer de la pérennité de la reconstitution hématopoiétique.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus hématopoïétiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation ou un traitement détruisant leur moelle, une greffe de cellules par voie intraveineuse ou intra-fémorale, puis des prélèvements de sang et de moelle répétés pendant un an. Le porteur indique que le conditionnement peut faire chuter le poids et que les prélèvements intra-fémoraux peuvent provoquer un boitement. Il affirme qu'aucun test ne remplace l'injection de ces cellules dans une souris hôte et conclut à "aucune possibilité de remplacement", pour étudier une enzyme des cellules souches du sang.

Objectifs

La fabrication des cellules du sang (globules blancs, rouges et plaquettes) dont la durée de vie est limitée dans le temps se fait à partir de cellules souches (appelées CSH). Ce processus se passe dans la moelle osseuse où sont localisées les CSH (chez la souris il se déroule également dans la rate). L'objectif ce projet de recherche fondamentale est de déterminer le rôle d'une enzyme dans le processus de fabrication des cellules sanguines en particulier si en agissant sur cette enzyme il est possible d’augmenter le nombre et d’améliorer la fonction des CSH.

Bénéfices attendus

Il est à noter qu'à ce jour pour certaines hémopathies la greffe de cellules souches hématopoïétiques est la seule option thérapeutique curative mais l'une des limites à cette approche reste le faible nombre de cellules ; il est donc essentiel de mieux comprendre leur mode de régulation et de trouver des moyens d'augmenter leur nombre. 40 000 greffes de CSH ont été faites en Europe en 2018 et les chiffres montrent que ce nombre est en augmentation.

Procédures

Les animaux subiront les mêmes procédures que celles utilisées aujourd'hui en clinique. Tout d'abord une irradiation ou un traitement myéloabatif: pour l'irradiation il y aura un transport d'une animalerie à l'autre. La procédure d’irradiation (trajet inclus) durera moins de 1h30. Pour le traitement myéloablatif, il y aura une injection par jour pendant 5 jour en IP sur animal vigile (temps du geste 1 minute). Ensuite les animaux subiront une greffe de cellules : cela se fait par injection en intra veineux dans la veine de la queue sur animal vigile (le geste dure moins d’une minute) ou par injection intra-fémorale sur animal anesthésié (le geste dure moins de 10 minutes). Enfin le suivi de la prise de greffe se fait par prélèvement. Le prélèvement sanguin submandibulaire : 50μL de sang prélevé une fois par mois pendant 1 an maximum. Ce geste, de moins d’une minute, est réalisé sur animal vigile et dure moins d'une minute. Le prélèvement intrafémoral : 25μL de moelle osseuse, prélevée tous les 3 mois et nous alternerons les genoux donc genou droit 2 prélèvements à 3 et 9 mois, gauche 1 prélèvement à 6 mois. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins de 5 minutes. Le prélèvement sanguin rétro-orbitaire : 200μL de sang prélevé une seule fois avant l'euthanasie. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins d'une minute.

Impact sur les animaux

L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. L'injection ou le prélévement intra-fémoral peuvent entrainer un léger boitement sur 12h maximum. Le prélèvement sanguin en mandibulaire nécessite une contention qui peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate, thymus) pour l'analyser.

Remplacement

Pour analyser les CSH il n'existe qu'un seul test, qui consiste à injecter ces cellules dans une souris hôte et regarder comment ces cellules participent à la production des cellules sanguines de cet hôte. Pour cela, les CSH ont besoin d'être dans leur organe physiologique et à ce jour, il n'est pas possible de recréer cet environnement complexe in vitro, il n’y a donc aucune possibilité de Remplacement.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R, comme il n’existe pas de possibilité de Remplacement, nous combinerons nos lots témoins dans le but de Réduire le nombre d'animaux. Nous avons réduit le nombre de souris à 6 dans les lots pour lesquels nous attendons une faible variabilité des résultats. Pour les lots où il y a une étape de culture cellulaire nous aurons besoin de 12 souris par lot car la variabilité des résultats sera plus forte. Ces nombres ont été calculés afin que les résultats obtenus puissent être analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de respecter la notion de Raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance jusqu'à leur mort (enrichissement de la nourriture lors de l’élevage et de l’expérimentation per se, enrichissement de l’environnement avec ajout de laine de peupliers pour "faire des nids" et présence d'une structure en plexiglace rouge transparente dans lequel la souris peut se cacher...). Les souris étant des animaux grégaires ils seront élevés en groupe. Les souris seront suivies quotidiennement par les animaliers. Enfin nous avons mis en place une grille de score qui nous permet d'évaluer la "bonne forme" des animaux et déterminer ainsi si un animal atteint un point limite: sont ainsi évalués, la bonne forme générale, le comportement, l'état de la peau, le poids ainsi que des critères plus spécifiques à la procédure comme l'état de l'oeil, de la veine caudale et du genou (les sites d'injection/prélèvement). L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. Les animaux seront donc soumis à un régime de nourriture enrichie. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour les gestes pouvant générer de l'inconfort.

Choix des espèces

La souris est le modèle classiquement utilisé pour étudier les cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 semaines. À cet âge-là, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l'injection de cellules. De plus il a été démontré que la prise de greffe était optimale à cette age-là. Le suivi des souris greffées se fera sur du long-terme (jusqu'à 1 an) afin de s'assurer de la pérennité de la reconstitution hématopoiétique.

1 050 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'ablation d'un rein, des administrations répétées de composés jusqu'à deux fois par jour, des prélèvements sanguins, des échographies cardiaques et des séjours en cage métabolique, pour mettre au point un modèle de maladie rénale chronique. Le porteur qualifie la chirurgie d'induction d'invasive et douloureuse et décrit un stress chronique lié aux gestes répétés. Il reconnaît que des modèles in vitro à base de sphéroïdes ou d'organoïdes sont en développement dans la société, tout en concluant à l'usage du rat, la finalité restant le développement de thérapies pour les patients.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques peuvent avoir diverses origines : inflammatoires, insuffisances aigues, associées au diabète, infectieuses, …. Elles ont pour conséquence d’induire une perte de fonctionnalité rénale dont les traitements envisagés actuellement se résument à la dialyse ou la transplantation rénale. De plus, ces maladies peuvent induire des altérations cardiaques graves menant à l’insuffisance cardiaque. L'objectif de ce projet est de développer des modèles mimant les maladies rénales chroniques pour permettre le développement de thérapies moins impactantes pour la vie du patient que celles dont on dispose actuellement.

Bénéfices attendus

Seuls la dialyse ou la transplantation rénale sont envisagées pour traiter ces maladies rénales. Ce sont des traitements lourds qui impactent de façon importante la vie du patient. Ainsi, il est nécessaire de trouver de nouveaux axes thérapeutiques pour éviter d’arriver à ces thérapies relativement lourdes. La mise en place de ce type de modèle préclinique le permettra. De plus, des thérapies ciblant les conséquences au niveau du cœur peuvent être également testés.

Procédures

1 – l’induction de l'insuffisance rénale aigue : La chirurgie consistant à retirer un rein se déroule en plusieurs étapes et dure 1h30. 2 - Les composés à tester/de référence seront administrés jusqu’à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutannée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié (pendant maximum 2 semaines). L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. 3- Des prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (quelques jours avant la chirurgie, puis 24h, 48h et 72h après la chirurgie et une fois par semaine pour les projets chroniques ) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. 4 - Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies et des mesures de pression artérielle sur animal anesthésié en début et fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration du rein (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang.)

Impact sur les animaux

1 – l’induction d'une insuffisance rénale aigue : cette chirurgie est invasive et douloureuse pour l’animal. En induisant la pathologie, une différence de production d’urine peut être attendue. De la même façon, une différence de prise hydrique peut être attendue. 2 - Les prélèvements de sang peuvent engendrer des hématomes, les sites de prélèvements seront observés de près. La mesure de débit de filtration du rein nécessitant une anesthésie isoflurane et une injection intraveineuse à la veine caudale entraine des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. L'echographie et la mesure de la pression artérielle sont non invasives mais nécessite une anesthésie légère, le reveil des animaux sera surveillé de près. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal. 3 – Les traitements : le geste de traitement, i.e. gavage, injection sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, réalisé à répétition génèrent un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé : apathie, prostration, agressivité, etc.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le rein, paramètres métaboliques et de fonction rénale dans le sang...)

Remplacement

L’insuffisance rénale aigue pourrait être étudiée à partir de culture de cellules rénales in vitro mais le modèle est discutable car il ne mime par réellement l’organisation cellulaire du rein. Des modèles in vitro à partir de système sphéroïde ou organoïde sont en cours de développement au sein de la société.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. D’autre part, nous réduisons le nombre d’animaux du groupe de rats sains (non néphrectomisés).

Raffinement

Lors de la chirurgie et en post-chirurgie, des stratégies analgésiques locales et systémiques seront utilisées pour réduire la douleur. L'animal est placé sur tapis thermorégulé avec sonde rectale de température avec mesure instantanée de la température corporelle, garantissant le maintien de l'animal à 37°C pendant la chirurgie. Un concentrateur à dioxygène est couplé à l'appareil à isoflurane pour favoriser la respiration des animaux anesthésiés. Les rats seront hébergés par deux pour respecter les normes d’hébergement compte-tenu du poids et puisque le rat est un animal social. De l’enrichissement est également ajouté dans les cages d’hébergement afin de répondre aux différents besoin des rats. Une double litière pourra être déposée en fond de cage pour éponger l'urine produite au maximum et garantir le confort de l'animal. Après la chirurgie, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids, comportement) par les personnes qui ont réalisé la procédure et la SBEA. Après la chirurgie et jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points suivants : hypothermie, prostration, perte de poids >20%, ce dernier sera euthanasié. En raison de l’évolution rapide de la pathologie, les animaux seront visités de façon biquotidienne et des mesures d’approches et de préhension seront adaptées pour ne surprendre et stresser l'animal. En cas de déshydratation, un gel d'hydratation peut être ajouté ou une injection sous cutanée de solution saline peut être envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Une phase d'habituation sera réalisée pour la mise en cage à métabolisme pour limiter le stress de l'animal. De la même façon, la prise hydrique sera monitoré plusieurs fois par semaine.

Choix des espèces

L’utilisation de rat permet d’étudier à la fois le pan rénal et le pan cardiaque de façon robuste. De plus, les traits de la pathologie sont comparables à ce qui est observé chez l’homme. Les animaux utilisés seront étudiés à l’âge adulte afin que la maturation de leur physiologie (hormonale, immunitaire) soit stable et garantir une homogénéité des résultats.

2 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent notamment une séparation maternelle quotidienne de trois heures pendant les trois premières semaines de vie, l'injection d'un composé perturbant la puberté, des prélèvements vaginaux quotidiens et jusqu'à seize prélèvements sanguins par coupure de la queue. Le porteur décrit la séparation maternelle comme une "situation de fort stress pour la mère et les petits" et reconnaît que les prélèvements répétés génèrent douleur et stress. Il affirme que l'animal vivant "ne peut être remplacé" faute de conserver le lien cerveau-gonades et qu'il n'existe "pas d'autre méthode ni de modèle alternatif" pour étudier l'âge de la puberté.

Objectifs

La puberté est une étape cruciale du développement qui permet d’assurer le maintien des espèces par la reproduction sexuée. Cette période se caractérise par l’acquisition de caractères sexuels secondaires et dépend de l’activation de neurones localisés dans une région spécifique du cerveau : l’hypothalamus. Une fois activés, ils sécrètent dans le sang une neurohormone : la GnRH ou gonadolibérine et sont donc appelés neurones GnRH. Cette sécrétion de GnRH est l’élément déclencheur de la maturation des gonades et de la puberté. L’activation des neurones GnRH, jusque-là en dormance, est donc une étape clé dont le moment est finement régulé. En général, la puberté débute entre 8 et 13 ans chez la fille, et entre 9 et 14 ans chez le garçon. Cependant, certains enfants souffrent de dysfonctionnement du développement cérébral altérant l’activation des neurones GnRH et entrainant une puberté qui survient trop précocement (puberté précoce centrale) ou bien qui ne démarre pas. Les causes de ces altérations sont encore largement méconnues. Notre projet a pour objectifs d’identifier les mécanismes permettant de contrôler l’activation des neurones GnRH et leurs perturbations lors de troubles de la puberté. Pour cela nous utilisons tout d’abord des approches in vitro sur des cultures de cellules neurales humaines reproduisant des mutations retrouvées chez des enfants atteints de troubles pubertaires soit des cellules directement issues de ces patients. Néanmoins, cette approche n’est pas suffisante car elle ne permet pas une observation intégrée. L’analyse in vivo de l’activité du système GnRH chez la souris est donc nécessaire afin de déterminer 1/ l’impact de l’environnement et 2/ le rôle des gènes mutés identifiés chez les patients, sur le fonctionnement des neurones GnRH, l’initiation de la puberté et les capacités reproductives. Ce projet permettra in fine de comprendre les mécanismes d’activation des neurones GnRH et le rôle combiné des gènes et de l’environnement sur l’âge de la puberté. Les résultats apporteront des données précieuses sur le contrôle par le cerveau de la reproduction et plus généralement renforcera nos connaissances du développement cérébral durant l’enfance.

Bénéfices attendus

Les capacités de reproduction s’acquièrent lors de la puberté, un moment clé du développement qui permet la transition de l’enfance à l’adulte. Il existe différents troubles pubertaires dont les répercussions peuvent être variables : allant de l’altération de l’âge de la puberté (précoce ou retardée) avec des retombées importantes sur la croissance et la psychologie de l’enfant, à des atteintes plus graves conduisant à l’infertilité. Nombreuses de ces atteintes ont pour origine un défaut du développement cérébral et plus précisément touchent le fonctionnement des neurones GnRH. Pour la plupart les causes et les mécanismes de ces dysfonctionnements restent incertains. Notre projet se base sur une approche multifactorielle (environnement externe et génétique) et interdisciplinaire alliant recherche clinique et fondamentale. Il permettra 1/ de développer des modèles murins reproduisant des troubles de la puberté similaires à ceux observés chez l’enfant 2/ d’identifier des facteurs génétiques et environnementaux important pour la puberté et la reproduction et 3/ de déterminer les mécanismes d’activation des neurones GnRH et ainsi de mieux contrôler la puberté et le moment de son initiation. Puisque la mise en place des neurones GnRH et leur activation font parties du développement cérébral, nos découvertes pourront apporter des connaissances plus larges et précieuses pour la compréhension du neurodéveloppement et de ces atteintes lors de pathologies neurologiques. Ce projet aura des retentissements importants dans le domaine de la santé publique puisqu’il y a une baisse de l’âge de la puberté depuis le milieu du 19ème siècle dont les causes restent incomprises. De nombreux facteurs semblent pouvoir être impliqués, le surpoids, les perturbateurs endocriniens et l’adoption. Notre projet permettra d’apporter des réponses cruciales sur les rôles de ces différents paramètres sur le développement cérébral et l’initiation de la puberté. Il est important de souligner que notre projet aura des impacts multiples et interdisciplinaires. En effet, plusieurs études ont montré que les pubertés précoces chez la femme sont plus souvent associées à la survenue de pathologies communes chez l’adulte telles que le cancer du sein ou le diabète, suggérant qu’il puisse exister des mécanismes communs. Ce projet pourrait ainsi identifier ces mécanismes et participer à la mise en place d’actions de prévention.

Procédures

Ce projet vise à déterminer le rôle de l’environnement et des gènes dans l’âge de la puberté et la reproduction. 4 facteurs seront testés : l’injection d’un composé qui perturbe le fonctionnement des régions cérébrales impliquées dans la puberté et la reproduction, la séparation maternelle et deux mutations génétiques. Les interventions seront réalisées sur des groupes d’animaux différents : -Injection unique ou deux injections espacées de 5h à 6h d’un composé qui perturbe la puberté à 8 jours après la naissance -Séparation maternelle quotidienne pendant 3h de 1 jour après la naissance à 21 jours de vie -Manipulation, observation et pesée quotidienne de 8 jours après la naissance jusqu’à l’âge adulte : Analyse de l’âge de la puberté. Ces manipulations n’excèderont pas 5 min par animal. Pour les femelles, dès l’ouverture vaginale (environ 30 jours après la naissance), des prélèvements vaginaux seront réalisés tous les jours jusqu’à l’âge adulte (environ 60 jours après la naissance). -Mise en accouplement durant 8 semaines -Prélèvements sanguins répétés à partir d’une coupure unique de l’extrémité de la queue préalablement analgésiées (lidocaïne en crème), puis massage (10 à 30 s / prélèvement). 16 prélèvements sanguins pour dosages hormonaux a différents temps, espacés de 20 à 60 min. Ce groupe sera soumis à une injection unique d’un composé activant les sécrétions hormonales, répétée deux fois à 15 jours d’intervalle. -Prélèvements rapide de queue (un prélèvement unique fait à 6 jours après la naissance)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, différents effets nuisibles sont à prévoir : La séparation maternelle prévue est une situation de fort stress pour la mère et les petits. Les souris pourront ressentir un état de stress lié à la manipulation quotidienne par l’expérimentateur lors des mesures anatomiques (pesée, vérification de l’ouverture vaginale, de la séparation préputiale) Les souris pourront ressentir de l‘inconfort et stress durant les prélèvements vaginaux Une douleur légère de courte durée sera induite lors du prélèvement d’un bout de queue pour identifier la nature génétique des souris La coupure unique de l’extrémité de la queue lors des dosages hormonaux répétés pourra également être source de stress et d’inconfort. L’absence de cicatrisation lors d’une série de 16 prélèvements permet d’éviter la douleur lors des prélèvements répétés. Le volume total prélevé est très faible (moins de 3% du volume sanguin total) et aura été récupéré entre les deux séries espacées de 15 jours. La deuxième série qui a lieu après 15 jours de récupération, se fera sur une queue cicatrisée donc plus sensible ce qui pourra générer de la douleur et du stress lors de la première et unique incision.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à différents temps afin de pouvoir prélever les tissus en fin de procédure et analyser les cellules et leur fonctionnement. Cela permettra de mieux comprendre le rôle de l’environnement et des gènes sur le développement après la naissance des cellules cérébrales et l’impact sur l’âge de la puberté.

Remplacement

La puberté est un processus physiologique complexe et progressif qui débute lors de l’activation de neurones localisés dans le cerveau. Une fois activés, ces neurones sécrètent une neurhormone qui va agir au niveau des gonades. En réponse les gonades sécrètent des hormones stéroides sexuelles qui excercent en retour un effet sur le cerveau. Il s’agit d’une boucle cerveau-hormones-gonades dont le terme est la maturation totale de la fonction de reproduction. Afin de comprendre les rôles des facteurs environnementaux et génétiques sur la puberté, l’animal vivant ne peut être remplacé, car cela necessite de conserver le lien entre le cerveau et les gonades. Ce projet est mis en place pour apporter une analyse complémentaire et indispensable aux études in vitro réalisées dans l’équipe, à partir de lignées de cellules humaines et de cellules neurales produites à partir de cellules prélevées chez les patients. Il permettra de faire le lien entre les mécanismes purement cellulaires décrits in vitro et l’effet sur la physiologie de l’animal. L’ensemble de ces résultats apportera des données cruciales pour la compréhension des mécanismes d’initiation de la puberté et la contribution des gènes et de l’environnement sur l’âge de la puberté et la reproduction. Il n’y a pas d’autre méthode ni de modèle alternatif.

Réduction

LLe projet a été établi de manière à limiter au strict nécessaire le nombre d’animaux. Pour cela, les études in vivo font suite à des analyses préliminaires in vitro (culture cellulaire) qui certifient l’intérêt de l’utilisation de l’animal. Les expériences pour chaque procédure, seront réalisées séquentiellement et seules les expériences préalablement réalisées sur un groupe restreint d’animaux (124 souris) et qui montrent une altération de la puberté ou de la reproduction, seront reconduites pour une analyse plus poussée des mécanismes. Pour cela, une partie du projet utilise des souris génétiquement modifiées, dont le fond génétique est contrôlé et homogène avec des souris contrôles provenant des mêmes croisements que les souris mutées. Cela permet de réduire la différence de résultats entre les individus, donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer des modifications significatives. En utilisant les mêmes animaux dans différentes expérimentations au cours d’une procédure (les animaux utilisés pour l’observation anatomique, la détermination de la puberté et l’étude des capacités reproductives seront également utilisés pour l’analyse des tissus, des cellules et des molécules), nous augmentons les mesures multiples sur un seul animal et réduisons le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. La taille de l’échantillon est basée sur des études précédentes réalisées dans le domaine et tient compte : de la variabilité entre les différents individus et au sein du même animal ainsi que de la baisse d’effectif en cours de procédure (euthanasies expérimentales). Cet échantillon permet d’obtenir en fin de procédure un nombre d’animaux suffisant, en accord avec les études précédentes, pour une analyse statistique fiable.

Raffinement

Afin de prévenir tout mal être des animaux utilisés dans cette étude, ils seront quotidiennement monitorés par les membres qualifiés de l’animalerie pour s’assurer de leur bien-être. Tout comportement anormal est directement communiqué à la personne responsable du projet ou personnel formé participant au projet, qui fournira l’ensemble des soins nécessaires en concertation avec l’équipe vétérinaire. Les animaux seront également monitorés quotidiennement par les expérimentateurs confirmés responsables du projet et connaissant bien le modèle murin. Les animaux en cours d’expérimentation auront un double suivi : une surveillance quotidienne visuelle à heure fixe et une surveillance plus approfondie avec grille d’évaluation adaptée à l’âge de l’animal. Cette grille permettra d’évaluer par des critères objectifs le bien-être animal et de décider, en cas de souffrance s’il est préférable pour l’animal d’être euthanasié. Les protocoles expérimentaux ont été mis au point afin de prendre toutes les mesures nécessaires pour atténuer et à minimiser la douleur, la souffrance ou le stress subis par l’animal, ils incluent des périodes d’habituation, un renforcement positif, l’utilisation de crème analgésique et de produits anesthésiants. Ils permettront d’assurer le bien-être animal au cours de cette étude. Pour limiter le stress lié aux manipulations, les animaux seront préalablement habitués et seul l’expérimentateur ayant réalisé l’habituation sera en charge de réaliser les mesures. Afin de réduire le stress lié aux prélèvements sanguins et permettre l’habituation des animaux à cette procédure, une friandise pour rongeur de 2g morcelée au préalable en 16 petits morceaux sera apportée aux animaux après chaque prélèvement. Il n’y a pas de conséquence digestive. Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi (sopalin, maisons en plexiglas autoclavable rouge) pour minimiser leur stress.

Choix des espèces

A ce jour, la souris est le modèle mammifère le plus propice aux modifications génétiques. L’ensemble des modèles mutants et transgéniques indispensables à la faisabilité du projet ont déjà été développé, ce qui permet de faciliter et accélérer de façon considérable la réalisation du projet. Il existe une grande littérature sur la physiologie de la puberté et le fonctionnement des neurones de l'hypothalamus chez la souris contrôle. Cela permet d’avoir des références de comparaisons indispensables à l’étude, qui limiteront les besoins expérimentaux et le nombre d’animaux. Le laboratoire a une grande expertise dans le modèle murin et les travaux précédents de l’équipe ont ainsi permis d’identifier des gènes responsables troubles pubertaires et de comprendre les mécanismes impliqués. Les nombreuses collaborations de l’équipe avec des chercheurs travaillant sur la souris permettent de faciliter l’étude et d’assurer son accomplissement éclairé par le partage de connaissances et d’expertises. L’ensemble du projet est axé sur l’étude d’un phénomène développemental, qui justifie l’utilisation de souris à différents âges après la naissance. La puberté se fait relativement rapidement chez la souris autour de P30 chez la souris femelle et P40 chez le mâle. Enfin la durée de gestation relativement courte (environ 20 jours) et la facilité d’accouplement en fait un modèle de choix pour l’étude des capacités reproductives.

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Placées en marge d'un faisceau d'irradiation cinq jours par semaine pendant sept semaines, elles reçoivent des anesthésies répétées, un suivi par bioluminescence et un traitement par gavage, puis sont hébergées jusqu'à dix-huit mois pour observer l'apparition de cancers secondaires. Le porteur estime que 168 souris suffisent mais en prévoit le double "en cas de problème", et signale que le composé administré est toxique pour certaines cellules sanguines. Il indique avoir mené des études préalables sur cellules mais affirme devoir passer à l'animal pour vérifier ces mécanismes dans un organisme entier doté d'un système immunitaire.

Objectifs

Plus de la moitié des cancers sont traités par radiothérapie, seule ou en combinaison avec de la chimiothérapie ou de la chirurgie. Les radiations utilisées pour le traitement créent des cassures sur les deux brins de la double hélice d’ADN qui sont létales pour les cellules cancéreuses. Bien que les techniques de radiothérapie soient de plus en plus précises, les rayonnements touchent toujours des cellules saines à proximité de la zone traitée ce qui induit des effets secondaires. Certains sont immédiats, comme une réaction inflammatoire, d’autres sont beaucoup plus tardifs, avec un risque de développement d’un second cancer. Les seconds cancers sont extrêmement rares mais souvent sévères, avec un taux de survie à 5 ans compris entre 10 et 40%. Comme ils se développent de nombreuses années après la radiothérapie initiale, ils concernent principalement des personnes ayant souffert d’un cancer durant leur enfance ou leur vie de jeune adulte. Il est donc important et urgent de comprendre les mécanismes responsables du développement de ces cancers afin de pouvoir mieux prévenir leur formation. Lors d’études précédentes réalisées sur des cultures de cellules, nous avons montré que les cellules saines en bordure de zone traitée, recevant uniquement de très faibles doses de rayonnements, subissent aussi des cassures de l’ADN mais seulement sur un brin, ce qui n’est pas létal pour les cellules, mais induit leur sénescence prématurément ce qui se traduit entre autres par un arrêt de prolifération. Puis, quelques rares de ces cellules sénescentes évoluent vers un état pré-tumoral. L’objectif de ce projet est de vérifier les résultats obtenus in vitro dans un organisme complexe, la souris. Il s’agit d’un projet multi-site qui se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs identifiés comme EU 1/2 et EU 2/2.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes responsables du développement des seconds cancers post-radiothérapie. Les résultats seront publiés dans une revue scientifique internationale à comité de lecture. La compréhension de ces mécanismes pourrait doter la clinique de marqueurs prédictifs de risque d’apparition des seconds cancers que pourraient être les marqueurs de sénescence et de cassures simple-brin l’ADN. Des traitements préventifs ciblant les cellules sénescentes pourraient ensuite faire l’objet d’essais cliniques.

Procédures

Ce projet se déroule en une procédure multi-étapes et multi-sites. Après acclimatation d’au moins 1 semaine, l’ensemble des animaux (168 souris) seront endormies par anesthésie gazeuse (2min) afin de tondre une partie de leur pelage au niveau du dos (10 sec) et seront mises en contact via l’application d’un gel d’échographie sur leur peau avec un fantôme qui sera irradié (84 souris) ou non irradié (84 souris) (durée de l’irradiation 68 sec). Les irradiations seront réalisées 5 jours par semaine pendant 7 semaines dans l’EU 2/2. Au cours de et après les irradiations, les souris seront suivies par bioluminescence à raison de 1 fois par semaine les 3 premiers mois puis 1 fois par mois. Pour cela, les 168 souris seront transportées vers l’EU 1/2 où elles recevront une injection d’anesthésiques (30 sec) puis, une fois endormies, une injection de luciférine (30 sec). Après la lecture, les animaux seront réveillés par une injection d’un agoniste des anesthésiques (30 sec ; durée totale de l’anesthésie : 30 min) puis seront retransportées vers l’EU 2/2. Après la fin des irradiations, l’ensemble des souris seront transférées définitivement vers l’EU 1/2, 84 souris recevront un traitement sénolytique et 84 souris recevront un placebo par gavage (durée 30 sec ; 5 jours de traitement / placebo puis 2 semaines de repos puis 5 jours de traitement / placebo). Les souris seront ensuite hébergées sans autre manipulation que les contrôles de leur état et de la bioluminescence (1 fois par mois) jusqu’à 18 mois après les irradiations. En fin de procédure, les souris seront étudiées via une analyse par PET-Scan (anesthésie gazeuse, durée 15min) dans l’EU 1/2 puis seront mises à mort. Pour résumer : Seules les anesthésies gazeuses pour la tonte et les irradiations seront réalisées dans l’EU 2/2. Pendant la période d’irradiation, les souris seront hébergées dans l’EU 2/2. Les actes réalisés dans l’EU 1/2 sont les suivants : anesthésies gazeuses pour la tonte (après la période d’irradiation, anesthésie par injection pour la lecture de bioluminescence (avec injection de luciférine) + injection d’antisedan pour le réveil des animaux, gavage avec le sénolytique (2x5 jours avec une pause intermédiaire de 2 semaines) et anesthésie gazeuse pour la réalisation du PET-Scan avant mise à mort des animaux. Nous prévoyons le double d’animaux, pour pouvoir refaire tout ou partie la procédure et ce, uniquement en cas de problème.

Impact sur les animaux

Les souris n’étant pas directement irradiées (elles seront placées en marge de la zone irradiée), les effets potentiels liés à une irradiation directe (comme les brûlures) ne s’appliquent donc pas aux animaux. Le transport de l’EU 2/2 vers l’EU 1/2 peut engendrer un stress chez les animaux. Pour la lecture de la bioluminescence, les animaux subiront une anesthésie par injection. Le gavage des animaux étant un geste maitrisé par les expérimentateurs, seul un stress au moment de la contention pourra éventuellement être ressenti par les souris. Cependant, le sénolytique utilisé lors du gavage est connu pour avoir un effet toxique sur les mégacaryocytes (Souers et al., 2013). Pour remédier à ce problème, le traitement sera délivré par intermittence, 5 jours de traitement, une pause de deux semaines puis de nouveau 5 jours de traitement.

Devenir

A la fin de la procédure, en raison des traitements qui auront été réalisés sur les animaux et de la nécessité de prélever et d’analyser les organes, l’ensemble des souris seront mises à mort.

Remplacement

Nous avons déjà répondu à l’injonction de remplacement en réalisant des études préalables utilisant des cellules en culture. Nous avons ainsi pu montrer que les radiations touchant les cellules saines situées en bordure d’une zone irradiée induisent des dommages à l’ADN (des cassures simple-brin) qui s’accumulent et de la sénescence cellulaire. Ces résultats ont été publiés dans une revue scientifique internationale à comité de lecture. Cependant, nous ne pouvons pas affirmer que ces évènements (cassures simple-brin de l’ADN, sénescence et cellules sénescentes qui entrent de nouveau dans le cycle cellulaire) auront lieu dans des cellules incluses dans un organisme, avec notamment un système immunitaire qui pourrait éliminer les cellules sénescentes. C’est pourquoi, même si nous avons commencé par remplacer l’expérimentation animale par des études in vitro, nous devons maintenant procéder à des études chez l’animal.

Réduction

Pour déterminer le nombre de souris nécessaires, nous nous sommes tout d’abord basés sur les données de la littérature pour connaitre la fréquence de développement de cancers spontanés et de cancers radio-induits (dans la zone d’irradiation) chez les souris. Ces données montrent une différence très nette entre fréquences des cancers spontanés et des cancers induits par la radiothérapie. Par ailleurs, nous nous sommes basés dans un second temps sur les expériences préliminaires réalisées par le laboratoire concernant l’apparition et le suivi de sénescence également sur les souris p16-Luc. Les analyses montrent qu’il nous faudrait 42 souris par lot (avec au total 4 lots), soit un total de 168 souris. En cas de problème, nous prévoyons le double pour pouvoir refaire les manipulations (uniquement si nécessaire), soit un total de 336 souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages d’une animalerie thermiquement et hygrométriquement régulée, avec un éclairage alternant jour/nuit. Elles auront accès à l’eau et à l’alimentation à volonté. Leurs cages seront équipées d’une litière et de produits d’enrichissement. Pour les manipulations liées à la tonte, à l’irradiation et au suivi de la bioluminescence, les animaux seront anesthésiés afin de réduire leur stress (anesthésie gazeuse ou chimique). Les manipulations des animaux (mise en cage, anesthésie, irradiation, mise à mort) seront réalisées par un personnel qualifié. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance nécessitant l’arrêt des procédures et leur mise à mort. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparence reportés dans une grille standard permettant d’établir un score à ne pas dépasser. Tout animal dépassant ce score sera exclu du protocole d’irradiation et mis à mort.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée en radiobiologie et cancérologie dont la génétique et la manipulation sont bien maitrisées en laboratoire. De plus, nous utiliserons une souche de souris transgénique (p16-Luc : insertion de la luciférase dans le gène p16) qui permet d’analyser facilement les cellules sénescentes sur animaux vivants par bioluminescence permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le sénolytique qui va être utilisé a déjà été testé avec succès chez la souris. Enfin, en lien avec notre problématique, la souris est connue pour développer des cancers lorsqu’elle est soumise à des irradiations. Nous utiliserons des souris adultes jeunes ayant atteint leur taille maximale, soit âgées de 10 semaines. L’acquisition de la taille adulte permettra de placer toujours la souris de la même manière en contact avec le fantôme irradié. La sénescence cellulaire survient avec l’âge. C’est la raison pour laquelle nous utiliserons des souris jeunes pour être le moins possible parasité par la sénescence survenant spontanément avec l’âge.

132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des muscles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des séances de course en montée, une immobilisation du train arrière pendant trois semaines, une exposition à la chaleur (30 minutes à 40°C) et des injections de puromycine, pour évaluer si la chaleur amplifie la récupération musculaire après immobilisation. Le porteur indique que l'immobilisation provoque une perte de masse musculaire des pattes arrière. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" faute de modèle cellulaire reproduisant les effets "corps entier" et qualifie l'usage d'animaux d'étape "obligatoire", les retombées annoncées pour les athlètes et les personnes en rééducation restant au conditionnel.

Objectifs

L’activité physique, en sollicitant la force musculaire, provoque l’augmentation de la masse musculaire (hypertrophie). Cette modalité d'exercice est recommandée lors de situations de perte de masse musculaire (atrophie), par exemple après une période d'immobilisation (alitement, pose d’un plâtre). Par ailleurs, l'exposition à certaines conditions environnementales spécifiques, tel que la chaleur, peut amplifier la prise de masse musculaire ou limiter sa perte. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets de la récupération musculaire en atmosphère chaude après une série d’exercices de course en montée chez des souris saines ou présentant une perte de muscle suite à une immobilisation

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer si la chaleur est bénéfique pour amplifier les adaptations musculaires à l’exercice, ce qui permettra d'envisager des perspectives non seulement pour les athlètes, mais aussi chez les personnes en réhabilitation post-blessure ou post-opération chirurgicale. Les populations sédentaires ou souffrant de pathologies métaboliques (e.g. diabète, insuffisance rénale chronique) ou de pertes de masse musculaire (cancers, vieillissement) bénéficieront également de perspectives d'intérêt. D’autre part, l’exercice couplé à la chaleur permettrait d’accélérer davantage la prise de masse musculaire chez les populations atrophiées.

Procédures

Pour la procédure aigüe, les animaux subiront deux à trois interventions : - groupe E : l’exercice physique (une séance de 1 heure) + injection sur animal vigile (5 secondes) - groupe E+C : l’exercice physique (une séance de 1 heure) + la récupération en milieu chaud (30 minutes à 40°) + injection sur animal vigile (5 secondes). Pour la procédure chronique, les animaux subiront une à quatre interventions : -groupe NS (pas d’immobilisation) : une injection (5 secondes) -groupe S (immobilisation) : immobilisation de trois semaines + injection (5 secondes) -groupe NS-E (pas d’immobilisation + exercice) : 6 semaines d’entraînement + injection (5 secondes) -groupe S-E (immobilisation + exercice) : immobilisation de trois semaines + 6 semaines d’entraînement + injection (5 secondes) -groupe NS-E+C (pas d’immobilisation + exercice + chaleur) : 6 semaines d’entraînement + récupération en ambiance chaude (30 minutes à 40°) + injection (5 s) -groupe S-E+C (immobilisation + exercice + chaleur) : immobilisation de trois semaines + 6 semaines d’entraînement + récupération en ambiance chaude (30 minutes à 40°) + injection (5 s) -groupe S-C (immobilisation + chaleur): immobilisation de trois semaines + récupération en ambiance chaude (30 minutes à 40°) + injection (5 s) -groupe NS-C (pas d'immobilisation + chaleur) : récupération en ambiance chaude (30 minutes à 40°) + injection (5 s) -groupe S-SED (immobilisation + sédentarité): immobilisation de trois semaines + maintien en cage 2 semaines + injection (5 secondes)

Impact sur les animaux

Les stress auxquels seront soumis les animaux sont l’exercice physique, l'immobilisation, la chaleur et l’injection intrapéritonéale de puromycine. Les 3 séances de familiarisation permettront d’éduquer les souris au tapis de course. L'immobilisation du train arrière provoquera un déconditionnement des souris, avec une perte de masse musculaire, mais cela ne concerne que les pattes postérieures. Au niveau de la chaleur, le stress sera relativement court (30 minutes à 40°C) et l’hydratation sera ad libitum. Enfin, l’injection intrapéritonéale de puromycine durera 5 secondes. Il s’agit d’une injection dans le bas ventre de puromycine, permettant de suivre le taux de synthèse des protéines. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement également.

Devenir

La totalité des animaux sera euthanasiée à l'issue de chaque procédure dans le but de prélever les biceps fémoraux pour l'étude des gènes et protéines jouant un rôle dans la régénération musculaire.

Remplacement

Ce projet nécessite une réalisation dans un environnement très contrôlé pour éviter des biais qui pourraient provenir de facteurs externes. De plus, nous souhaitons évaluer les effets de la chaleur, ce qui ne peut être contrôlé précisément que dans des conditions de laboratoire avec des animaux. L’immobilisation partielle est aussi une contrainte qui rend difficile la réalisation du projet chez l’homme. Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets corps entier de l’immobilisation sur l’ensemble des tissus d’intérêt ainsi que les effets des méthodes de prévention. De plus, ces expérimentations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de par les résultats très précieux qu’elle génère.

Réduction

Le calcul a été effectué avec l’aide l’un logiciel de statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux tout en gardant la puissance statistique nécessaire à l’interprétation des résultats.

Raffinement

Pour l’activité physique et les tests réalisés sur tapis roulant, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit au changement d’environnement. Afin de réduire au maximum les nuisances sur le bien-être des souris, les animaux seront constamment surveillés au cours de la séance pour prévenir tout accident. Les procédures de suspensions du train arrière sont, elles, validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toute complication. Les animaux seront hébergés par deux pour éviter l’isolement. Chaque procédure possède également des points limites et critères d’arrêts stricts en cas d’évènement potentiellement néfaste pour les animaux en ce qui concerne la douleur, le mal-être, etc. Les suivis quotidiens des animaux permettent d’identifier des signes de souffrance.

Choix des espèces

Le choix des souris a été fait car nous voulons utiliser le même protocole d’entraînement que les études qui montrent des adaptations similaires post-entraînement chez l’homme et chez la souris. De plus, comme chez l’homme, il a été montré que l’immobilisation induit une perte de masse musculaire chez la souris également. La souris Mus musculus a été privilégiée pour plusieurs raisons. Les espèces murines rat et souris sont des espèces se rapprochant de l'humain en ce qui concerne le système musculosquelettique. Les systèmes de dégradation et de synthèse protéique sont similaires chez l'homme et chez la souris bien qu'il existe des différences subtiles de typologie entre les deux espèces. Ainsi, les conclusions tirées de ces études chez la souris pourront être étendues chez l'homme. Les souris utilisées seront toutes des adultes de 8 semaines.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le cytomégalovirus murin puis soumises à une série de tests comportementaux, reconnaissance d'objets, préférence à l'eau sucrée et enfouissement de billes, pour tester l'hypothèse que les cytokines d'une infection induisent un état proche de la dépression. Le porteur indique que les souris génétiquement immunodéficientes contrôlent moins bien l'infection et peuvent perdre du poids et présenter douleur, stress et baisse d'activité. Il présente le travail comme une "étude pilote" et affirme qu'un "système vivant et complet" rend l'usage d'animaux "indispensable", les applications pour les patients dépressifs restant hypothétiques.

Objectifs

Le système immunitaire est requis pour la défense de l’hôte contre les agressions par différents types de pathogène (virus, bactéries, etc..). Les cellules dendritiques (DC) sont des acteurs clef du système immunitaire, en première ligne dans la reconnaissance des microbes. Lorsqu’elles détectent un pathogène, les DC produisent des molécules, dites cytokines, véhiculées dans tout le corps pour orchestrer l’activation de tous les autres acteurs du système immunitaire. Une production de cytokines dérégulée en temps et/ou en quantité peut avoir un rôle délétère, parfois fatal, sur l’individu infecté, comme observé récemment dans la Covid. Au cours des infections virales les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont la principale source de cytokines dites Interférons (IFN), ainsi que de nombreuses autres cytokines inflammatoires. Les IFN sont indispensables pour établir une immunité antivirale efficace. Cependant, lorsque les pDC sont absentes ou incapables à produire des IFN, on n’observe pas chez l’hôte une sensibilité accrue aux infections virales. Etant donné que la capacité des pDC à produire des IFN est retrouvée dans la majorité des vertébrés, il est possible que cette fonction ait été conservée pour d’autres raisons. Notre hypothèse est que les cytokines produites par les pDC promouvraient, au-delà des réponses immunes, un état de prostration et d’isolement. Ceci aurait été initialement sélectionné au cours de l’évolution afin d’éviter la transmission de l’infection aux autres individus de la même espèce et éloigner le malade, affaibli par l’infection, du risque d’attaque de prédateurs. Ce type de comportement ressemble aux états dépressifs. D’ailleurs, des hauts taux de cytokines inflammatoires ont été retrouvé chez les patients dépressifs. L’exemple plus flagrant est représenté par les patients souffrant de tumeur ou d’hépatite C qui, lorsque traités avec des IFN, développent des syndromes dépressifs très sévères. Afin de tester cette hypothèse nous souhaitons effectuer une étude pilote sur souris ayant ou pas des pDC ou incapables de produire des cytokines inflammatoires. Nous utiliserons le modèle d’infection systémique par le cytomégalovirus murin (MCMV), un pathogène naturel de la souris, afin d’induire la production de hauts taux de cytokines inflammatoires, en particulier les IFN. Nous évaluerons l’impact de cette infection sur le comportement des souris par une batterie de tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les interactions entre systèmes immune et nerveux. Si notre hypothèse est correcte, il sera envisageable de cibler la production des cytokines, en particulier par les pDC, pour développer de nouvelles stratégies de thérapie pour les patients dépressifs. Ces nouvelles approches seront d’abord validées dans le modèle infectieux, ensuite elles pourront être étendues à d’autres contextes inflammatoires impliquant une activation de pDC, comme les maladies auto-immunes ou l’obésité.

Procédures

Les tests comportementaux ne représentent aucune source de douleur. Tous les tests sont effectués une seule fois. Les tests de localisation et de reconnaissance d'objets durent 20 minutes. Le test de préférence à l'eau sucrée dure 3 heures. Le test à enfouissement des billes dure 30 minutes. L’infection par MCMV est faite une seule fois en injectant par voie intrapéritonéale. L'infection dure entre 30 et 60 secondes maximum. Aucun prélèvement ou procédure chirurgicale sont prévus.

Impact sur les animaux

L'infection par le MCMV est généralement bien tolerée par les souris immunocompetentes. Les souris pDC-less tolèrent également bien l'infection par le MCMV, alors que les souris Myd88KO, étant immunodéficientes, contrôlent moins bien l'infection et peuvent avoir une morbidité accrue par rapport aux paramètres suivants: perte de poids, douleur, stress, inactivité, mobilité et posture.

Devenir

Mis à mort de tous les animaux car ils ne peuvent pas être utilisés pour d'autres expériences

Remplacement

Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire et comportementale au cours d’une infection virale in vivo. Ainsi, l’intégration d’un système vivant et complet est indispensable, donc l'utilisation des animaux vivants est nécessaire. Nous effectuerons nos études avec des souris car nous pouvons disposer de modèles mutants pour les cellules et/ou molécules en étude.

Réduction

Nous utiliserons 30 souris pour mener à bien cette étude pilote. Tous ces animaux seront sous fond génétique homogène pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités interindividuelles des animaux sous fonds génétiques mixtes. Nous avons une expérience de très longue durée dans le protocole d'infection, ce qui nous permet d'obtenir des résultats statistiquement significatifs avec 5 souris/génotype/traitement. Les résultats obtenus seront analysés à l'aide de tests statistiques.

Raffinement

Les souris sont élevées dans des services de zootechnie exempts d'organisme pathogène spécifique (EOPS). EOPS). Pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental, les souris seront hébergées en groupe de 2 à 5 individus dans des cages d’une superficie adequate, en conditions d'humidité, temperature et luminosité adaptées à leur physiologie. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois toutes les 2 semaines. Les animaux ont 1 semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Une surveillance journalière de routine de l'état des souris (toilettage, mobilité, poids, respiration) par les zootechniciens et l’expérimentateur permettra de détecter toute souffrance des animaux. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Pour les animaux affaiblis, l’accès à la nourriture et à l’eau sera favorisé. Les points limites ont été définis dans la procédure . Les animaux atteignant les points limites définis seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire et nerveux des 2 espèces. Nous avons maintenant formellement établi ce point en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Nous utiliserons des souris adultes à un age de 8-14 semaines car le système immunitaire rejoint sa maturité entre 2 et 3 mois d'âge.