Procédures modérées

Jusqu'à six séances d'imagerie IRM ou SPECT-PET-CT sur une même souris, et jusqu'à quatre actes expérimentaux de trente minutes à une heure, tel est le programme des 640 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement. Le protocole consiste à injecter des cellules de glioblastome dans le cerveau, à créer une cavité d'exérèse pour reproduire les conditions d'une récidive, puis à administrer une radiothérapie interne sur place. Sans traitement, l'injection de cellules tumorales dégrade l'état général et peut tuer la souris au bout de trente jours. Deux souches sont utilisées, des C57BL/6JRj pour les greffes de cellules murines et des CB17-SCID immunodéprimées pour les cellules humaines, le porteur indiquant que ces dernières ne permettent pas d'étudier le rôle de l'immunité.

Objectifs

Le glioblastome est une tumeur cérébrale particulièrement agressive, son incidence de 3,3/100 000 est en augmentation, avec une multiplication par 4 sur les 10 dernières années, en faisant un véritable problème de santé publique. Une étude approfondie des caractéristiques tumorales et la découverte de potentielles nouvelles cibles pour le traitement dans différents modèles de glioblastome sont essentielles. Le projet consiste à mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques de radiothérapie interne aussi bien pour traiter les tumeurs ou leur récidive. Ces nouvelles stratégies seront basées sur des molécules qui ont été testées en amont lors d’expériences in vitro et qui méritent une attention particulière pour des développements thérapeutiques pertinents.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique en ce qui concerne les glioblastomes ou leur récidive dans le but d’améliorer la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées (durées d'environ 30 minutes à 1 heure) telles que l'injection de cellules tumorales, la création de cavité d’exérèse, l’administration de thérapies spécifiques dans le cerveau et d’un suivi par imagerie IRM / SPECT-PET-CT. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 4. Le nombre d’IRM / SPECT-PET-CT maximal réalisé sur un même animal est de 6.

Impact sur les animaux

L’administration des traitements peut entraîner une certaine fatigue et un affaiblissement rapidement réversible (environ deux jours) de l'animal. L'induction d'une tumeur par injection de cellules entraîne en l'absence de traitement une détérioration de l'état général de l'animal pouvant entraîner la mort au bout de 30 jours.

Devenir

Tous les animaux du projet sont mis à mort pour réaliser des prélèvements.

Remplacement

Le projet ici proposé a pour but le ciblage par une thérapeutique innovante sur tumeur en place ou dans des conditions mimant la récidive pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux pour valider les étapes finales d’élimination (au travers de l’application de procédures de traitement par des vecteurs sur tumeur en place ou dans des cavités d’exérèse), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Il n'y a d’ailleurs pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoïdes, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.

Réduction

En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces cellules tumorales in vitro ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables. L'utilisation de l'imagerie pré-clinique SPECT-PET-CT a son importance en ce qui concerne l'éthique puisqu'il permet de réduire le nombre d'animaux avec un suivi longitudinal où le même animal est son propre contrôle.

Raffinement

Les animaux sont stabulés dans un environnement favorable à leur bien-être, par ailleurs vérifié par la SBEA local. Pour chaque procédure, un suivi quotidien du comportement de l'animal et de sa cicatrisation est effectué suite à la chirurgie. Le suivi de la perte de poids sera réalisé 2 ou 3 fois/semaine puis quotidiennement à partir d’environ 20 jours après la chirurgie en rapport avec la croissance tumorale. Un suivi IRM ou SPECT-PET-CT est également réalisé de manière hebdomadaire pour surveiller la progression du volume tumoral dans le cerveau de l'animal. Les animaux bénéficient d’une surveillance accrue jusqu’à leur réveil afin de détecter précocement toute forme de souffrance. Ils bénéficient de soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur avec analgésique, conditions d'hébergement optimale, enrichissement du milieu. Les animaux seront hébergés dans un environnement dont la température, l’humidité, le renouvellement de l’air ainsi que le cycle d’éclairage sont contrôlés selon les normes légales en vigueur. Un enrichissement du milieu avec des petites maison et tunnel ainsi que des frisotis est mis en place du début à la fin. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Une anesthésie gazeuse sera appliquée aux animaux lors du suivi IRM ou SPECT-PET-CT hebdomadaire.

Choix des espèces

Pour ce projet, il est nécessaire de travailler avec la souris car il est prévu d’implanter des lignées cellulaires murines (modèle syngénique de gliobastome avec la souche C57BL/6JRj). Pour les modèles xénogéniques de gliobastome, des lignées cellulaires humaines seront implantées et nécessiteront cette fois-ci la souche CB17-SCID. La raison pour laquelle il est envisagé d’utiliser des cellules murines mais aussi humaines, donc d’utiliser deux souches différentes de souris, est de pouvoir réaliser à la fois des tests à partir de cellules humaines de glioblastome mais également de pouvoir étudier le rôle de l’immunité qui n’est pas possible d'évaluer avec les modèles de glioblastomes humains. Les souris seront utilisées de 8 à 12 semaines car elles seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.

Pour tester le chauffage de tumeurs par nanoparticules sous laser ou champ magnétique, 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement. Elles subissent une chirurgie d'implantation de tumeurs des voies biliaires, des injections dans la tumeur et par voie générale, jusqu'à quatre séances de traitement de dix minutes sous anesthésie, des échographies de suivi et des prélèvements sanguins pratiqués sur animal vigile. Le porteur qualifie de légers et de courte durée le stress et la douleur liés à chaque geste, sans décrire ce que produit la croissance tumorale elle-même. Il indique développer en parallèle des cultures cellulaires en trois dimensions pour trier les molécules en amont, ce qui réduirait le nombre de souris, et conclut que ces cultures ne suffisent pas pour évaluer les effets indésirables ni la réponse immunitaire.

Objectifs

Les cancers des voies biliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA), sont difficiles à traiter. Le développement de nanoparticules permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements systémiques conventionnels. Le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'une thérapie anticancéreuse localisée par nanoparticules en association ou non avec une thérapie par voie générale et une exposition à un rayonnement Laser ou un champ magnétique. L’évolution du volume tumorale sera suivie par échographie. L’imagerie permettra aussi de suivre la diffusion et l’élimination des nanoparticules utilisées. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux les plus efficaces avec les meilleures diffusions et sans effet indésirable à long terme.

Bénéfices attendus

Les cholangiocarcinomes (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressifs. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche de traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposées seules ou en combinaison avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet a pour objectif de tester dans des modèles expérimentaux murins, le traitement par nanohyperthermie dans des tumeurs de CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral de la nanohyperthermie dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux locorégional applicable en santé humaine, permettant de réduire à la fois les doses de chimiothérapies et les effets secondaires de ceux-ci dans le cas d'un traitement combinatoire. Au-delà du CCA, la nanohyperthermie pourrait être également utilisée pour traiter d’autres cancers digestifs (péritoine, tubes digestifs, foie, pancréas).

Procédures

- Injections durée 10-20 secondes/animal - Traitement sur souris anesthésiées 10 minutes/souris, répété 4 fois max. - Anesthésie gazeuse durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins sur animal vigile, durée 5 min/souris.

Impact sur les animaux

-injections cutanées : stress et douleur légère de courte durée -anesthésie et chirurgie d'implantation de tumeurs : stress et douleurs modérée -Injections intratumorale et systémiques : stress et douleurs légères de courte durée - Prélèvement sanguin vigile : stress et douleur légères e de courte durée - Anesthésie Gazeuse : un stress légéer de courte durée.

Devenir

Les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Il n'est actuellement pas possible de simuler le développement d'un cancer avec tous ses aspects dans un modèle in vitro. Neanmoins, nous développons également des modèles cellulaires in vitro en 3 dimensions afin de sélectionner les molécules, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque l'effficacité de certaines molécules pourra être testée en amont. Cependant ces expériences menées sur ces modèles cellulaires ne sont pas suffisants et ne permettent pas de remplacer les animaux, notamment pour évaluer la réponse avec un système immunitaire ou pour évaluer les effets indésirables.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Compte tenu des données existantes et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique sera utilisé en pré-opréatoire et en post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence des expériences et études en cancérologie car elle permet de représenter le comportement d'une tumeur se développant chez le patient (réponse immune, diffusion des traitements dans l'organisme). La possibilité de disposer d'animaux de fond génétique défini permet limiter les variabilités biologiques et de mieux identifier les effets des thérapies. Les animaux seront utilisés à l'âge de 5 à 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection des cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop agées induirait un biais dans l'expérimentation.

Une chirurgie de trente minutes à une heure pour atteindre le cerveau, puis des injections répétées toutes les deux semaines par cathéter pendant six mois, voilà ce qui attend une partie des 2 075 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. D'autres reçoivent des injections sanguines hebdomadaires, également jusqu'à six mois, et peuvent être gardées six mois de plus après la dernière. Le travail cherche à réduire la production d'une protéine impliquée dans la maladie de Parkinson, chez des souris porteuses du gène humain entier. Les molécules retenues pourraient ensuite être testées dans de futurs essais cliniques, formulation que le porteur emploie deux fois, quand la douleur modérée, le risque d'infection et la perte de poids sont annoncés au présent.

Objectifs

Notre équipe travaille sur des traitements potentiels pour la maladie de Parkinson. Cette maladie peut parfois être liée à des changements dans certains gènes, qui perturbent le fonctionnement et la survie des neurones. Un de ces gènes joue un rôle important car il peut entraîner l’accumulation d’une protéine dans le cerveau, ce qui contribue au développement de la maladie. Notre approche consiste à trouver des futurs traitements capables de réduire la production de cette protéine, dans le but de ralentir ou limiter la progression de la maladie, et qui pourraient ensuite être testées dans de futurs essais cliniques.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de notre projet est d’identifier un ou plusieurs outils thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de la maladie de Parkinson. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules efficaces et qui pourraient ensuite être testées dans de futurs essais cliniques.

Procédures

Chaque animal ne reçoit qu’un seul type d’injection (dans le sang ou le cerveaux) avec une seule molécule, pour voir si elle est efficace. Les injections dans le sang sont rapides (moins d’une minute) et peuvent être répétées toutes les semaines, jusqu’à 6 mois. Les injections dans le cerveau nécessitent une chirurgie qui dure entre 30 minutes et 1 heure. Elles peuvent aussi être répétées (durée d’environ 5 minutes, sans chirurgie grâce à un cathéter, ) toutes les deux semaines, pendant un maximum de 6 mois. Les souris pourront être gardées jusqu’à 6mois après la dernière injection.

Impact sur les animaux

Les injections dans le sang ou dans le cerveau peuvent induire une douleur modérée sur de courte période. Elles peuvent également entraîner un risque de faible perte de poids et de risque d’infection.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’analyser, au niveau des organes, les effets des molécules injectées.

Remplacement

La recherche en bioinformatique de candidats et les analyses réalisées sur modèles cellulaires permettent d’effectuer un premier criblage des molécules. Cependant, aucun modèle cellulaire ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est donc indispensable de mener ces études dans un modèle animal, qui permet d’évaluer l'efficacité de la molécule.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats représentatifs et fiables. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon les conditions réglementaires en vigueur. La fréquence des injections pourra être réduite si les résultats initiaux indiquent une efficacité suffisante de la molécule. De la nourriture en gelée sera mise à disposition dans les cages des individus fragiles ou ayant subi une procédure, afin de faciliter leur prise alimentaire. De plus, toutes les interventions douloureuses seront précédées de l'administration d’un antidouleur et se feront sous anésthésie. Un suivi, accompagné d’une grille d’évaluation, sera assuré tout au long de la procédure et des mesures seront prises afin d'éviter toute souffrance inutile (utilisation de points limites ou critère d’arrêt précoce).

Choix des espèces

L’utilisation de souris portant le gène humain entier nous permettra d’évaluer la capacité de nos molécules à diminuer l’expression de la protéine responsable de la progression de la maladie dans le cerveau. La souris étant l’un des modèles les plus utilisés et les mieux documentés en recherche préclinique, ce modèle est particulièrement pertinent pour ce type d’étude. L’objectif étant de diminuer l’expression de la protéine responsable de la progression de la maladie de Parkinson qui se développe chez l’adulte, les études seront réalisées à partir du stade jeune adulte chez la souris jusqu'à un âge plus avancé.

Pour tester des lymphocytes tueurs associés à des anticorps contre le cancer de l'ovaire, 2 160 souris vont être utilisées sur quatre ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est totalement immunodéficiente, dépourvue de toute cellule immunitaire, afin d'évaluer l'effet de la thérapie cellulaire seule. Toutes reçoivent une injection de cellules tumorales puis un traitement, 360 sont anesthésiées à l'isoflurane deux fois par semaine, et toutes subissent des prélèvements sanguins sous anesthésie. Elles sont tuées soit parce qu'elles ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur. Le porteur annonce une thérapie plus efficace et mieux tolérée pour des patientes, quand le résultat attendu du projet se limite à démontrer un effet sur des tumeurs greffées, et signale une perte de poids et une nécrose tumorale déjà observées lors d'études préliminaires.

Objectifs

En france, le cancer de l'ovaire touche environ 4500 femmes chaque année et entraîne près de 3000 décès ce qui en fait le cancer gynécologique le plus meurtrier. Dans le monde, il figure parmi les cancers féminins les plus fréquents et il est souvent diagnostiqué tardivement car les symptômes sont peu spécifiques. Résultats : les traitements arrivent à un stade avancé de la maladie. Les traitements actuels reposent sur la chirurgie et la chimiothérapie et permettent d’obtenir une rémission chez de nombreuses patientes mais les rechutes sont fréquentes et les effets secondaires importants. Il existe donc un besoin urgent de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées. Notre projet s’inscrit dans un effort de recherche visant à utiliser les défenses naturelles de l’organisme pour lutter contre le cancer. Il a pour objectif de développer une nouvelle thérapie qui permet de mieux cibler les cellules cancéreuses tout en limitant les effets sur les tissus sains. L’idée est de proposer à terme des traitements plus efficaces et plus sûrs pour les patientes. Nous nous intéressons à un type particulier de cellules du système immunitaire, que l’on peut considérer comme des « cellules tueuses » naturelles. Ces cellules ont plusieurs avantages : elles sont capables de reconnaître et de détruire des cellules cancéreuses sans modification particulière, elles peuvent être facilement multipliées à partir d’un simple prélèvement sanguin, et elles peuvent être utilisées chez différents patients, même lorsqu’elles proviennent d’un donneur. Un autre atout important est leur capacité à s’associer à des anticorps, c’est-à-dire des molécules qui reconnaissent très précisément les cellules cancéreuses. En combinant ces cellules tueuses avec des anticorps, nous pouvons les « guider » pour qu’elles ciblent spécifiquement les cellules tumorales, tout en épargnant les cellules saines. Pour tester cette approche, après les tests en laboratoire, nous utilisons des modèles de tumeurs chez l’animal qui reproduisent les tumeurs humaines. Cela permet d’évaluer plus précisément l’efficacité du traitement, et de vérifier toxicité et l’efficacité globale de la thérapie. L’originalité de notre projet repose sur la combinaison de deux approches innovantes : des anticorps de nouvelle génération, conçus pour mieux reconnaître les cellules cancéreuses, et l’utilisation de ces cellules tueuses « armées » pour les attaquer.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer, sur un modèle de tumeur primaire et métastsatique ovariennes que l’utilisation d’une thérapie cellulaire innovante basée sur des Lymphocytes en combinaison avec des anticorps thérapeutiques déjà utilisés en clinique permet d’améliorer les effets du système immunitaire tout en réduisant les effets secondaires. Cette approche a deux objectifs principaux : 1. Améliorer la spécificité du traitement. 2. Favoriser son efficacité.

Procédures

Au cours du projet, les souris seront soumises à plusieurs types d'interventions, réalisées sous anesthésies et avec prise en charge de la douleur lorsque nécessaire. L'ensemble des animaux (2160 souris) recevront une injection de cellules tumorales (15 secondes/souris) puis une injection de traitements médicamenteux (10 secondes par souris). Sur l'ensemble des animaux 360 seront anesthésiées par isoflurane deux fois par semaine (10 min/animaux). Une analgésie et une anésthésie générale sont systématiquement utilisées et les animaux sont surveillés après l'intervention jusqu'à leur réveil complet. À différents moments de l'étude, l'ensemble des animaux feront l'objet d'un prélèvement sanguin, réalisé sous anesthésie afin d'éviter toute douleur. Cette intervention dure en moyenne 20 secondes par animal. Ce prélèvement permet d'analyser la présence de cellules tumorales et d'ADN tumoral dans le sang.

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des souris. La douleur associée à l'injection de cellules est équivalente à celle d’une piqûre d’aiguille. Le développement des tumeurs et des métastases sera suivi par des mesures régulières ainsi leur développement ne devrait pas créer de contraintes particulières chez les souris. Concernant les nuisances associées aux traitements, des études préliminaires ont montré une perte de poids, nécrose de la tumeur, inflammation ; Aucune autre nuisance ni effet indésirable n’est prévisible.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments.

Remplacement

Comme évoqué précédemment, il est essentiel de démontrer l’efficacité de cette nouvelle thérapie cellulaire, notamment dans le cadre de l’utilisation d’anticorps en traitement du cancer. Cette preuve a déjà été obtenue en laboratoire (in vitro), mais elle doit maintenant être confirmée dans des modèles précliniques chez la souris, qui reproduisent des tumeurs solides proches de celles observées chez la femme. Ces modèles sont les seuls qui permettent d’évaluer à la fois l’efficacité de la thérapie sur la croissance des tumeurs, de valider cette nouvelle façon d’utiliser les anticorps, et de mieux comprendre les mécanismes de la réponse immunitaire contre le cancer. À ce stade du projet, il n’est plus possible de remplacer les modèles animaux par des modèles in vitro, car ces derniers ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre les cellules tueuses et les cellules tumorales. Les modèles précliniques sont encore peu développés dans le domaine des immunothérapies, en particulier pour ces cellules tueuses, qui sont rares et difficiles à étudier. Même si des premiers tests ont déjà été réalisés sans utiliser d’animaux, une étape chez l’animal reste indispensable pour valider la thérapie avant d’envisager des essais chez l’être humain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera au maximum de 2160 souris sur 4 ans. Ce nombre a été déterminé afin de permettre une évaluation complète de notre thérapie, à la fois sur son efficacité contre les tumeurs et sur les mécanismes biologiques impliqués.Le projet a été conçu pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Chaque étape expérimentale ne sera réalisée que si les résultats de l’étape précédente sont concluants, et des études pilotes seront mises en place avant les expériences principales.Le nombre d’animaux par groupe a été défini à l’aide de modèles mathématiques et d’outils statistiques, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire.Par ailleurs, notre expérience dans les modèles de cancer, notamment du cancer de l’ovaire, ainsi que notre expertise dans l’utilisation des cellules tueuses et dans les techniques expérimentales, nous permettent d’optimiser les protocoles et de limiter les pertes, contribuant ainsi à réduire encore le nombre d’animaux nécessaires. De plus grâce à notre maîtrise et à notre connaissance des gestes de greffe ou d’administration en sous- cutané et en intrapéritonéale, nous éviterons les artefacts et les pertes liées à l’expérimentateur.

Raffinement

Le milieu est enrichi par une litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et une ouate coton pour le confort des animaux. Le comportement sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience. Ils seront reportés sur une fiche de suivi clinique. Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Les différentes molécules seront utilisées en administration locale en une seule administration dans un composé permettant leur diffusion dans le temps, permettant d’éviter tout effet secondaire et d’éviter des administrations répétées. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être utilisée.

Choix des espèces

Dans un premier temps nous utiliserons une espèce murine immunodéficiente dans notre étude. Cette dernière est la plus relevante pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence les effets de nos molécules sur le long terme. Ces souris, au contraire des autre lignées immunodéficientes, sont totalement immunodéficientes donc ne possèdent aucune cellule immunitaire ce qui nous permettra d’étudier l’efficacité seule de notre thérapie cellulaire. Dans un second temps l’étude portera sur des modèles murins immunocompétents afin d’étudier l’effet de notre thérapie sur des modèles plus complexes contenant tout le micro-environnement tumoral. L’âge des animaux utilisés dans cette étude est de 7 à 8 semaines, âge où l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité, et âge le plus approprié pour atteindre l’objectif scientifique de l’étude. En effet, le cancer de l’ovaire est une pathologie qui touche majoritairement des femmes adultes, avec un âge médian au diagnostic d’environ 63 ans. L’utilisation d’animaux à un stade adulte permet ainsi de se rapprocher au mieux des conditions physiopathologique observées chez les patients.

1 000 souris subissent une chirurgie abdominale de trente minutes pour l'injection de cellules cancéreuses dans le lobe hépatique gauche, une partie après douze semaines d'injections intrapéritonéales bi-hebdomadaires destinées à installer une cirrhose. 1 030 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une IRM une à deux fois par semaine sous anesthésie et des séances d'imagerie nucléaire pouvant durer deux heures. Le porteur écrit que les procédures d'imagerie "présentent la seule nuisance d'injecter le radiotraceur dans une veine de la souris", et décrit par ailleurs des péritonites, des lésions cutanées et un stress chronique possibles après les administrations répétées dans l'abdomen. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Le carcinome hépato-cellulaire est la cancer du foie le plus courant et représente le 6ème cancer en termes d’incidence mondiale et le 3ème cancer en termes de mortalité. Son pronostic est donc des plus sombres. De plus, les experts estiment que son indicence devrait doubler d’ici à 2050. Il représente donc un enjeu mondial de santé publique. Le diagnostic du carcinome hépato-cellulaire revêt un caractère primordial dans la prise en charge précoce du patient. Or, les outils actuels ne sont pas assez performants car soient trop invasifs soit pas assez spécifiques ou soient pas assez sensibles. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer différentes molécules associées à un atome radioactif (= radiotraceurs) en imagerie nucléaire pour améliorer le diagnostic. De plus, ces radiotraceurs peuvent aussi donner des informations essentielles aux médecins pour mieux prendre en charge le patient. Les modèles animaux sont primordiaux pour la réalisation de ce projet et doivent refléter au plus près les carcinomes hépato-cellulaire rencontrés en clinique humaine qui se développent généralement dans des contextes de foies cirrhotiques. Sur les modèles murins mis en place, plusieurs molécules ciblant les cellules du cancer du foie seront évaluées et comparées lors d’expérimentations en imagerie nucléaire.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier de nouveaux radiotraceurs pour imager les lésions cancéreuses dans le but d’améliorer la prise en charge des patients. Ces radiotraceurs ont pour but de combler un manque dans le diagnositc actuel de cette pathologie et d’apporter des informations supplémentaires sur les lésions hépatiques dans un but pronostique. Enfin, cette étude permettra d’étudier le potentiel de ces radiotraceurs dans le cadre d’une radiothérapie interne vectorisée.

Procédures

Prélèvements sanguins (1 min/souris) sur souris anesthésiées et en présence d'antalgique (1030 souris). Greffe de cellules cancéreuses dans le foie (30 min/souris) : souris anesthésiées + analgésiées. Chrirugie abdominale en condition d’aséptie. Injection des cellules tumorales dans le lobe hépatique gauche. Sutures des deux plans (1000 souris). Induction chimique d’une cirrhose (15 min/souris) : injection intrapéritonéale bi-hebdomadaire pendant 12 semaines maximum. Imagerie par raisonnance magnétique (IRM) (15 min/souris) : souris anesthésiées et après application d’un gel de protection oculaire. Imagerie 1 à 2 fois par semaine (1030 souris). Imagerie nucléaire (entre 10 et 120 minutes/souris) : injection du radiotraceur dans la veine de la queue sur animal vigil puis imagerie sur souris anesthésiées et après application d’un gel de protection oculaire (800 souris).

Impact sur les animaux

Les procédures visant à imager les animaux présentent la seule nuisance d'injecter le radiotraceur dans une veine de la souris. Des nuisances plus importantes sont envisagées lors de l’induction et de l’installation des cirrhoses hépatiques et lors de la chirurgie mise en place pour la greffe des cellules du cancer du foie dans un lobe hépatique. Le développement des tumeurs peut également engendrer des nuisances. La douleur liée à la chirurgie sera gérée par un traitement analgésique préventif et post-opératoire adapté. L’administration répétée dans l'abdomen de la souris peut engendrer des complications (stress chronique, lésions cutanées, péritonites). L’évolution de la cirrhose peut éventuellement induire des douleurs. Pour toutes ces nuisances et effets indésirables, l’état général sera contrôlé quotidiennement selon une grille de score permettant d’évaluer les différents pallier de douleur. L’administration d’analgésique sera en accord avec les palliers de douleur.

Devenir

Pour toutes les procédures les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

L’imagerie nucléaire s’intéresse à la pharmacocinétique d’un radiotraceur dans un organisme complexe. Il s’agit d’étudier le comportement de molécules radiomarquées une fois injectées dans un organisme. Cela met en jeu tous les organes et de ce fait, ne peut pas être remplacée par des modèles in silico ou in vitro. De plus, les pathologies telles que les carcinome hépato-cellulaire impliquent des processus physiologiques complexes mettant en jeu de nombreuses intéractions entre les différentes cellules de l’organisme.

Réduction

Les radiotraceurs seront d’abord testés in vitro avant d’être injectés chez la souris. Une même souris pourra recevoir plusieurs radiotraceurs permettant ainsi de réduire le nombre de souris nécessaire. Cela sera possible seulement pour les radiotraceurs qui porteront un atome dont la demi-vie radioactive est très courte comme le fluor-18 (110 min ou le gallium-68 (68 min). En revanche, pour les atomes radioactifs à demi-vie plus longue comme le cuivre-64 (12.7h) ou le zirconium-89 (78h), ce multiple emploi ne pourra pas être effectué. Pour chaque étude, le nombre d’animaux utilisés sera réduit à un minimum acceptable pour obtenir des informations robustes et statistiquement pertinentes. Les statistiques seront réalisées sur un logiciel dédié selon un T-test non paramétriques pour les analyses intergroupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par 3 ou 5 avec des frisottis pour pouvoir faire un nid, avec un libre accès à l'eau et la nourriture adaptée. Chaque cage contient un tunnel de préhension, pour pouvoir manipuler l'animal sans stress. Pour chaque procédure, les souris bénéficient d'une période d'acclimatation d'une semaine. Lors de la chirurgie, les souris seront anesthésiées et se verront administrer des antalgiques avant et après l'acte chirurgical. L'ensemble de la chirurgie se déroule sur tapis chauffant et dans des conditions d'asepsie (champs, gants, manchettes, instruments et seringues stériles). Pendant la chirurgie, l'hydratation des souris est maintenue par l'injection de sérum physiologique tiédi à 37°C. Les souris feront l’objet d’une surveillance accrue dans les 24h après la chirurgie. Cette surveillance sera relâchée si la récupération est complète. D’autre part, les animaux seront pesés régulièrement et un suivi quotidien de leur état général sera mis en place selon une grille de score comportant 4 palliers (0 : absence de douleur, 3 : douleur sévère). L’évaluation quotidienne permettra d’ajuster le traitement analgésique. Suite aux greffes et induction de cirrhose, l’imagerie par IRM permettra de bien contrôler l’état du foie et la progression tumorale. Lors de l'étape de greffe des cellules tumorales, les souris sont préalablement analgésiées 30min avant l’intervention.

Choix des espèces

Les dispositifs d’imagerie dont nous disposons dans le laboratoire sont seulement adaptés aux souris ce qui restreint notre choix aux souris. Enfin, des modèles similaires sont rapportés dans la littérature scientifique, des protocoles éprouvés et publiés pourront servir de base pour la mise en place de nos modèles. Les souris seront utilisées à partir de 7 semaines après leur naissance, lorsque les souris ont atteint l’âge adulte, le carcinome hépato-cellulaire ne touchant que les adultes. Pour les souris saines greffées, le suivi de la pathologie par IRM se fera sur 6 semaines maximum après la greffe. Pour les souris cirrhotiques greffées, le protocole nécessite 12 semaines d’injection bi-hebdomadaire de TAA avant la greffe des cellules tumorales. Après cette greffe, le suivi de la pathologie par IRM se fera sur 6 semaines maximum.

500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie pour prélèvement des reins. Chaque souris boit une eau sucrée contenant une molécule qui active ou inactive un gène, subit une surcharge en acide ou en bicarbonate pendant sept jours, des prélèvements sanguins, et jusqu'à cinq jours en cage métabolique, isolée de ses congénères sur une grille de collecte d'urine. L'objet du travail est le rôle d'une protéine dans la régulation de l'équilibre acido-basique du rein, des cultures cellulaires ayant déjà suggéré son implication. Le porteur annonce un effectif maximal de 500 souris tout en indiquant qu'il est certain que le nombre réel sera inférieur, et écrit vouloir "valoriser au maximum les animaux utilisés" en constituant des banques de matériel biologique.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment des cellules rénales, régulent l’équilibre acido-basique de l’organisme. Cet équilibre est essentiel pour le bon fonctionnement des organes et des réactions biochimiques. Les reins jouent un rôle clé en ajustant la quantité d’acide ou de base excrétée dans l’urine, en réponse aux variations de l’alimentation ou du métabolisme. Nous étudierons spécifiquement le rôle d’une protéine en réponse à une surcharge de base. Des résultats préliminaires dans des cellules en culture suggèrent que cette protéine est impliquée dans la réponse des cellules du rein aux bases et plus généralement dans la régulation de l’équilibre acido-basique. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées, dont le gène codant pour cette protéine est inactivé. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent cet équilibre, et pourrait identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les troubles acido-basiques qui peuvent survenir dans certaines maladies rénales ou métaboliques. Le projet se déroule dans 2 animaleries distinctes.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet améliorera la compréhension des mécanismes régulant l’acidité du sang, un processus vital pour la santé. D’autre part, ils pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les désordres de l’état acido-basiques visibles chez un nombre important de patients en réanimation, chez des malades sous dialyse ayant une maladie chronique du rein. Ces prises en charge représentent un coût important pour la société en raison des hospitalisations prolongées, des traitements lourds et de la diminution de la qualité de vie des patients. À plus long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait contribuer au développement de traitements plus efficaces, permettant de réduire les complications médicales, d’améliorer la qualité de vie des patients et de diminuer les dépenses de santé associées. Ces résultats contribueront également à la recherche fondamentale sur le fonctionnement du rein et et le maintien de l’équilibre des ions dans l’organisme.

Procédures

Nombre total d’animaux : 500 souris (adultes, mâles et femelles). Les souris seront soumises aux interventions suivantes : -> 84 souris vigiles subissent une injection (durée de l’injection quelques secondes) ainsi qu’un prélèvement de sang (30 secondes) sous anesthésie générale chimique (durée 10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 56 souris vigiles subissent un traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours, un prélèvement de sang (30 secondes) sous anesthésie générale chimique (durée 10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 64 souris transgéniques vigiles subissent l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson (5 ou 10 jours) (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 128 souris transgéniques vigiles auront l’ensemble des manipulations suivantes : (EU 2/2 ou EU 1/2) - administration d’une molécule dans l’eau de boisson pour inactiver un gène - injection d’une solution (quelques secondes) suivie d’un prélèvement sanguin (3minutes) sous anesthésie locale. - Après une récupération de 10 jours, une surcharge plus longue (7 jours) en bicarbonate est entreprise. Des mesures urinaires en cages métaboliques pendant 5 jours et prise de poids quotidienne sont réalisées. Un prélèvement sanguin (3minutes) sous anesthésie locale est ensuite réalisé à la fin de cette période. -> 168 souris transgéniques vigiles auront l’ensemble des manipulations suivantes : (EU 2/2 ou EU 1/2) - administration d’une molécule dans l’eau de boisson ou par lors d’une injection (quelques secondes) pour activer un gène. - une surcharge en acide ou bicarbonate (7 jours) sera entreprise. Toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale chimique (10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2)

Impact sur les animaux

Le stress est modéré lors des prélèvements sanguins, atténué par l’utilisation d’anesthésiques locaux (collyre) ou lors d’une anesthésie générale. L’inconfort est transitoire après des prélèvements sanguins, avec surveillance post-opératoire pour détecter tout signe de souffrance (prostration, perte de poids importante). La perte de poids lors de l’habituation aux cages métaboliques est temporaire et limitée. De plus, les souris sont isolées de leurs congénères dans ces cages et placées sur une grille permettant la collecte quotidienne d’urine. La molécule permettant l’inactivation du gène ou la stimulation d’un autre gène est mélangée à une eau légèrement sucrée pour que les souris la boivent sans difficulté. La pesée des souris pour le suivi de leur poids ou avant une anesthésie n’induira qu’un stress minime. Une anesthésie générale est réalisée par du personnel expérimenté, la douleur générée est modérée au point d’injection.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de chaque procédure. Un prélèvement des tissus rénaux pour plusieurs types d’analyses est effectué pour l’ensemble des animaux de chaque procédure. Aucune réutilisation, adoption ou remplacement n’est possible, car les prélèvements nécessitent la mise à mort de l’animal. Les prélèvements de tissus (rein) et sanguins sont nécessaires pour analyser l’impact des traitements sur l’équilibre acido-basique et l’implication de la protéine que nous étudions.

Remplacement

Ce projet nécessite l'utilisation d'animaux car il est actuellement impossible de reproduire la complexité des interactions cellulaires dans le rein, ni la réponse systémique à une surcharge alcaline et à la perturbation de l’état acido-basique.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 500. Ce nombre maximal a été calculé afin d’obtenir une puissance statistique suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives entre les groupes expérimentaux. Cet effectif permet également de comparer les effets chez les mâles et les femelles. Néanmoins, il est certain que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions biologiques sur ces mêmes modèles et en réalisant une étude statistique de nos résultats.

Raffinement

Les 500 souris seront pesées au moment de leur arrivée à l’animalerie. Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Pour minimiser leur stress, les souris sont progressivement adaptées aux cages métaboliques pour limiter la perte de poids (pesée quotidienne). Un enrichissement de l’environnement dans ces cages limite l’inconfort des souris. Une anesthésie chimique locale est réalisée pour certains prélèvements sanguins. D’autres prélèvements sont réalisés sous anesthésie chimique générale. Une analgésie adaptée sera systématiquement mise en œuvre pour les procédures susceptibles d’entraîner de la douleur ou de l’inconfort. Des collectes d’urine non invasives seront réalisées chez un maximum de 268 souris afin de limiter le recours aux cages métaboliques, qui peuvent être source de stress pour les animaux. Selon la nature des prélèvements sanguins réalisés, une anesthésie locale ou une anesthésie générale sera utilisée. Lorsque certains traitements sont administrés dans l’eau de boisson, un agent sucrant pourra être ajouté afin d’améliorer l’acceptabilité de l’eau traitée et de maintenir une consommation normale. Lorsque les objectifs scientifiques le permettent, la perfusion des tissus sera réalisée après la mort de l’animal plutôt que sous anesthésie terminale avant le décès, afin de réduire les interventions pratiquées sur l’animal vivant.

Choix des espèces

Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier le fonctionnement du rein. Cette espèce possède un fonctionnement du rein proche de celui de l'Homme et permet d'étudier cette fonction par les mêmes techniques, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. De plus, ce projet inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris et permettant l’inactivation d’un gène. Cette inactivation sera déclenchée à deux âges différents car l’efficacité de cette méthode peut varier selon le stade de développement de la souris. Tester deux périodes permettra de déterminer les conditions les plus adaptées pour obtenir une inactivation efficace du gène dans les cellules rénales étudiées. Nous explorerons la fonction rénale chez des souris âgées minimum de 11-12 semaines pour lesquelles le rein est complètement développé.

Capturés par pêche électrique, anesthésiés trois à cinq minutes, mesurés et pesés, 900 poissons subissent une incision ventrale de 3 à 5 mm pour l'implantation manuelle d'une puce électronique dans la cavité abdominale. Truites, blageons, chabots et vairons sont maintenus hors de l'eau entre trente secondes et une minute pendant l'opération, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié des individus pêchés en amont des ouvrages en bois sont transportés en aval avant d'être marqués, pour retenir ceux qui seront enclins à remonter. Le porteur signale que certains poissons perdent leur puce dans les semaines suivantes et que des femelles peuvent l'expulser lors de la reproduction. Tous sont replacés dans la rivière après réveil en vivier, aucun n'est tué.

Objectifs

Dans de nombreux cours d’eau dégradés, la mise en place d’ouvrages en bois, dits castor mimétiques, constitue une nouvelle opportunité de restaurer leur fonctionnalité écologique par des moyens peu coûteux et bas carbone. La présence de ces ouvrages modifie les conditions locales d’écoulement et pose ainsi des questions sur la capacité des poissons à maintenir leurs migrations naturelles et accéder à leurs habitats de reproduction ou de croissance. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer la franchissabilité de ces ouvrages castors en suivant précisément le passage des poissons au travers de ces aménagements, pour plusieurs espèces distinctes, différentes classes d’âge et différentes conditions de débit. Pour cela, un panel de poissons représentatif des peuplements du cours d’eau est capturé par des techniques adaptées (pêche électrique). Sous anesthésie générale, chaque individu est mesuré, pesé, examiné, puis équipé d’une puce électronique (PIT‑tag) de taille adaptée, implantée dans la cavité abdominale selon un protocole chirurgical respectant les exigences de bien‑être animal. Les poissons sont ensuite remis à l’eau sous surveillance jusqu’à leur réveil complet, puis relâchés à proximité des ouvrages. Les poissons ainsi marqués peuvent être détectés lorsqu’ils franchissent les ouvrages castors, grâce à des antennes de détection disposées stratégiquement dans le lit du cours d’eau. L’enregistrement de ces passages permet de vérifier si les ouvrages castors restent perméables aux déplacements piscicoles, d’identifier les trajectoires privilégiées et, le cas échéant, de repérer des situations de blocage ou de retard qui pourraient justifier des ajustements de gestion.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de vérifier les conditions de franchissabilité des ouvrages castors par les peuplements piscicoles en présence. Il est indispensable de réaliser ce type de suivi biologique en milieu naturel pour vérifier s’il est nécessaire de réaliser des modifications de conception de ces ouvrages castors pour que les poissons puissent librement circuler.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et une puce électronique sera implantée manuellement sur 900 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress modéré sur les animaux. Il existe également un risque de douleur légère post-anesthésie suite à l’incision.

Devenir

Tous les individus seront replacés dans leur habitat naturel

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement d’un aménagement (ici un ouvrage bois castor mimétique) doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées.

Réduction

L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements des poissons par espèce et par stade, et évaluer la franchissabilité des ouvrages castors. Il est adapté au gabarit du milieu (rivière de tête de bassin versant) et à la diversité spécifique et la densité de population. L’effectif tient compte de plusieurs facteurs, pour garantir un certain nombre de détections : - L’implantation des puces ne génère en principe pas ou très peu de mortalité post-opératoire en respectant les préconisations de tailles minimales. Toutefois, certains individus peuvent perdre leur puce dans les semaines suivant l'implantation. - Certaines femelles peuvent également expulser la puce lors de la reproduction. Tous les individus d'une même espèce ne vont pas forcément migrer. Les individus pêchés en amont des ouvrages castors (50%), seront transportés en aval, où ils seront pucés puis relâchés, de manière à privilégier l'étude sur des individus enclins à migrer et in fine réduire le nombre d'individus marqués. Il n'est pas prévu d'analyses statistiques dans le cadre de cette étude comportementale menée en milieu naturel, en-dehors des statistiques descriptives (taux de franchissement, voies de passage, durée moyenne de franchissement).

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront stockés dans des viviers placés directement dans la rivière. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. La solution d'anesthésie sera renouvelée toutes les 30 minutes, pour éviter que la température du bain n’augmente et soit toujours suffisamment fraiche pour éviter le stress des poissons et l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie, sachant que les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière. L’application de points limites stricts et spécifiques du projet limitera les risques de douleur tout au long de la procédure.

Choix des espèces

4 espèces de poissons sont ciblées et sont caractéristiques de la rivière et du territoire concerné : truite, blageon, chabot, vairon. 1 stade de développement est retenu : subadultes-adultes.

Les souris utilisées sont génétiquement modifiées, seule façon selon le porteur d'identifier les fibroblastes associés aux cellules B. 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, adultes et nouveau-nés. Chacune subit des injections tous les trois jours pendant trois semaines, trois gavages, une injection sous-cutanée dans la patte arrière sous anesthésie et des prélèvements sanguins pratiqués sur animal vigile. Les souriceaux sont séparés de leur mère pendant dix minutes au maximum pour être injectés et génotypés par biopsie de tissu. Toutes sont tuées en fin de projet pour l'analyse post-mortem de leurs ganglions lymphatiques.

Objectifs

Les anticorps protègent contre des pathogènes mais provoquent aussi l’autoimmunité, comme la maladie de Sjögren ou l’arthrite rhumatoïde. La production d’anticorps implique les cellules B, productrices d’anticorps, et des fibroblastes qui sont en contact directe avec les cellules B. Dans cette étude nous cherchons à comprendre comment ces fibroblastes se différencient et comment ils participent à la réponse immunitaire. Ce savoir pourrait avoir des implication dans la vaccination contre des infections ou pour le traitement de maladies autoimmunes.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la formation des fibroblastes associés au cellules B et leur implication dans la réponse immune. Ces résultats pourraient avoir des retombées à moyen terme sur une nouvelle application en découvrant des nouveaux médicaments contre des maladies impliquant le système immunitaire comme l’auto-immunité.

Procédures

Des souris vigiles sont soumises à des injections tous les trois jours (durée < 1 min) pendant 3 semaines. Les souris vigiles sont gavées 3 fois (durée < 1 min). Les souris anesthésiées sont soumises à une injection d’un agent induisant une réponse immunitaire (durée < 1 min). Des prélèvements de sang sont effectués sur animal vigile (durée du prélèvement quelques secondes).

Impact sur les animaux

Pour les injections des souriceaux et leur génotypage, une séparation de la mère et de sa portée pendant quelques minutes (10 au maximum), ainsi qu’une contention légère pour chaque animal sont nécessaires. Cela peut être une source de stress pour les animaux. Une douleur légère de courte durée peut être ressentie par l’animal lors de la biopsie de tissu. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent être source de stress et de l’anxiété tout comme une douleur légère de courte durée pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation peut conduire à une inflammation au site d’injection.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites et la fréquence des interventions ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible stress ou inconfort sont entrepris. Aucune habituation n’est prévue pour les nouveau-nés ou animaux juvéniles. Il n’y pas d’acclimatation nécessaire. L’anesthésie est prévue pour les injections par voie sous-cutanée dans la patte arrière afin de cibler spécifiquement les ganglions poplités et inguinaux. Les sites de prélèvement sous-mandibulaires sont alternés. Le bien-être de l’animal est évalué tous les jours par un personnel expérimenté, prenant en compte une surveillance des lieux de d’injection, le poids, l’apparence, le comportement et la locomotion. Les critères sont notés sur une fiche de score. Lorsque qu’une anomalie est observée l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. Si le point limite est atteint l’animal est mis à mort. Les souris sont hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis par cage.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour connaitre plus sur le mécanisme de la formation et la fonction des cellules du ganglion lymphatique. Ce projet nécessite alors une bonne connaissance des organes lymphoïdes où se trouvent ces cellules et une souris génétiquement modifié qui permet d’identifier ces cellules. Il n’existe aujourd’hui aucun autre moyen pour les identifier. Les souris sont étudiées à un âge où le système immunitaire est mature. Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux étudier le développement du système immunitaire impliquant la formation de ces cellules. La souris génétiquement modifiée est justifiée par être le seul moyen d’identifier les fibroblastes associés aux cellules B.