Procédures modérées

Pour établir si des additifs alimentaires et des régimes déséquilibrés en fibres et en graisses favorisent l'implantation de bactéries Escherichia coli associées à la maladie de Crohn, 260 souris mâles porteuses d'un gène humain vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune suit un régime particulier pendant huit semaines dès le sevrage, reçoit par gavage les bactéries puis un traceur fluorescent, et subit deux prélèvements sanguins sous anesthésie, le second sans réveil. Les collectes de fèces imposent un isolement de dix minutes chaque semaine pendant six semaines, puis trois fois par semaine pendant deux semaines, et soixante souris reçoivent en plus quatorze gavages quotidiens de composés bactériens. Toutes seront tuées pour mesurer l'inflammation intestinale, l'épaisseur du mucus et la composition du microbiote, au service de traitements que le porteur présente comme contribuant au "bien-être" des patients, mot qu'il met lui-même entre guillemets.

Objectifs

Le microbiote intestinal joue un rôle clé dans le développement et l’entretien des pathologies inflammatoires chroniques de l’intestin telle que la maladie de Crohn. Certaines populations de bactéries dites ‘bénéfiques’ pour l’hôte sont diminuées au détriment de bactéries ‘agressives’ aux propriétés pro-inflammatoires. Une catégorie particulière de bactéries Escherichia coli adhérentes et invasives aux propriétés pro-inflammatoires, colonise anormalement l’intestin grêle de patients atteints de maladie de Crohn. La surexpression d’une protéine au niveau de la muqueuse de l’intestin grêle des patients favorise l’implantation de ces bactéries. Précédemment, il a été montré que l’expression de la protéine humaine au niveau de l’intestin grêle de souris favorise l’implantation de ces bactéries Escherichia coli, offrant un modèle d’étude précieux pour pouvoir tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif du projet est d’évaluer les effets de divers facteurs alimentaires sur le microbiote de l’intestin grêle et plus particulièrement sur ces bactéries adhérentes et invasives. Ce projet permettra de mettre en évidence la capacité de certains additifs alimentaires ou régimes alimentaires déséquilibrés en fibres et en graisses à favoriser l’implantation des bactéries Escherichia coli et à augmenter leurs propriétés agressives. La compréhension des mécanismes sous-jacents permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques visant ces bactéries. La finalité du projet est d’utiliser l’ensemble de ces connaissances pour proposer 2 candidats d’intérêt (microorganismes ou produits issus du microbiote) qui seront testés dans ce modèle murin pour leur capacité à lutter contre le développement des Escherichia coli adhérentes et invasives et ainsi aider à améliorer le bien-être intestinal en rétablissant l’équilibre du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Les investigations chez l’animal permettront de mieux comprendre les mécanismes qui permettent l’implantation des souches Escherichia coli adhérentes et invasives au niveau de la partie terminale de l’intestin grêle (leur zone de prédilection chez l’Homme) et leur répercussion sur l’écosystème intestinal et sur l’hôte de manière globale. Ce projet prend en compte également un facteur essentiel : l’alimentation. Ce projet permettra de mieux comprendre l’impact de certains régimes alimentaires et des additifs alimentaires sur le microbiote intestinal et sur les bactéries adhérentes et invasives. La finalité du projet est de proposer aux patients atteints de maladie de Crohn des stratégies thérapeutiques personnalisées, visant ces Escherichia coli. Ces options thérapeutiques personnalisées seraient proposées aux patients hébergeant ces bactéries délétères dans le but de maintenir les phases de rémission et/ou d’améliorer l’effet des traitements, contribuant ainsi à leur « bien-être ».

Procédures

Les procédures incluses dans ce projet, comprenant 260 souris, suivent toutes le même schéma expérimental incluant : -une administration de régimes alimentaires spécifiques sous forme de croquettes pendant 8 semaines à partir du sevrage -un prélèvement de fèces par semaine sur animal vigile pendant 6 semaines, puis 3 fois par semaine pendant 2 semaines (isolement des souris le temps de la collecte, maximum 10 minutes). -un gavage sur animal vigile avec les bactéries (préhension + geste = 10 secondes maximum) -un gavage sur animal vigile avec un traceur fluorescent (préhension + geste = 10 secondes maximum) -un prélèvement de sang (100-150µL) sur animal anesthésié -un prélèvement de sang (200-300µL) 7 à 10 jours après le dernier prélèvement de sang sur animal anesthésié, sans réveil. Une des procédure concernant 60 animaux inclut 14 gavages supplémentaires pour administrer les candidats thérapeutiques.

Impact sur les animaux

-Suite à l’infection des souris par les bactéries adhérentes et invasives, nous attendons un faible impact sur le poids, pouvant être dû à un stress post-gavage, et une inflammation au niveau intestinal en raison de l’implantation des bactéries. -Chez les animaux infectés par les bactéries Escherichia coli, certains régimes alimentaires peuvent favoriser l'implantation intestinale de ces souches, induisant une inflammation intestinale supplémentaire. -Deux prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie sur l'ensemble des animaux, et peuvent induire un stress chez l'animal en périodes péri-anesthésiques et au moment de la contention de quelques secondes de l'animal sous anesthésie. -Lors des prélèvements de feces, les animaux sont isolés le temps de la collecte (10 minutes maximum) une fois par semaine pendant 6 semaines, puis 3 fois par semaine pendant 2 semaines, ayant pour conséquence d'induire un stress chez l'animal en raison de l'isolement. -Les animaux vont recevoir des bactéries ou composés par voie orale (gavage). Ce geste impose une contention de l'animal pendant 2-3 secondes ce qui induit un stress. L'administration quotidienne par gavage de composés bactériens thérapeutiques pendant 14 jours dans une des procédures de ce projet peut induire un stress supplémentaire chez l'animal.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés lors de ces procédures (260 mâles) sera mis à mort à la fin des expérimentations. Il sera prélevé un ensemble d’échantillons biologiques chez l’animal à l’issu de l’expérience pour compléter les données issues des observations cliniques ou encore les données inflammatoires suite à des dosages dans les fèces des animaux : niveaux d’inflammation au niveau des tissus intestinaux, analyses histologiques, mesures de l’épaisseur de la couche de mucus, analyse de microbiotes.

Remplacement

L’effet des régimes alimentaires sur le microbiote intestinal sera étudié en amont de ce projet en systèmes in vitro, telles que des micro-fermenteurs ensemencés avec des selles de patients atteints de maladie de Crohn. Cela permettra de tester un ensemble de régimes et d’additifs alimentaires pour leurs effets sur la stabilité d’un microbiote complet, sain ou pathologique, et sur la virulence de certaines bactéries. Cependant, le but ultime du projet est de se positionner au sein de l’écosystème complet de l’intestin grêle, site de prédilection de certaines bactéries impliquées dans l’inflammation chez les patients atteints de maladie de crohn. Les études en micro-fermenteurs ont une limite : ils ne prennent pas en considération l’hôte : la muqueuse de l’intestin grêle et le mucus qui la recouvre ainsi que le système immunitaire. Or, l’interaction entre l’hôte et le microbiote est cruciale : la réponse immunitaire de l’hôte façonne le microbiote intestinal, et les microorganismes et les produits de leurs métabolismes influent également sur l’hôte en modulant sa réponse immunitaire. L’alimentation est un autre facteur qui peut jouer un rôle fondamental dans cet équilibre, de manière bénéfique ou au détriment de l’hôte. Il est donc nécessaire de travailler à l’échelle de l’organisme entier pour pouvoir étudier les effets de régimes alimentaires spécifiques sur la virulence des de certaines souches de bactéries, dont les Escherichia coli adhérents et invasifs, et sur le microbiote de l'intestin grêle pour pouvoir ensuite proposer des stratégies thérapeutiques participant à rééquilibrer ce microbiote.

Réduction

-Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet (260 souris) a été réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Précédemment, une étude publiée dans le même modèle murin a montré qu’un nombre de 6 souris par lot était suffisant pour analyser le comportement des bactéries Escherichi coli adhérentes et invasives au niveau de l'intestin. Les coefficients de variation des données de colonisation obtenues lors de cette expérience étaient acceptables pour une étude exploratoire (10-40% en log10). Le projet concerné par cette DAP implique d’étudier l’impact de régimes et d’additifs alimentaires sur ces bactéries adhérentes et invasives. Or, les réponses vis-à-vis de régimes peuvent varier selon les individus, en particulier en raison de la composition de leur microbiote intestinal. En effet, une variabilité inter-individu a été observé dans un autre modèle murin placé sous un régime riche en sucre et en graisse. Pour pallier à cette hétérogénéité de la réponse biologique, nous avons décidé d'augmenter le nombre d’animaux à 10 individus par lot pour l’ensemble du projet, afin d'espérer conserver un coefficient de variation équivalent à l'expérience exploratoire (10-40%), voire de le diminuer. -De plus, dans le but de diminuer encore le nombre d’animaux au strict nécessaire dans le cadre de ce projet, une des procédures ne sera réalisée que si les effets biologiques recherchés dans la procédure précédente sont notables.

Raffinement

L’expérimentation débutant par la mise à disposition d’un régime alimentaire spécifique pendant 8 semaines dès le sevrage, la période d’acclimatation est de ce fait, intégrée. Pendant cette période, le poids des animaux est mesuré une fois par semaine. Lors de ce contrôle, un prélèvement de fèces est réalisé afin de détecter d’éventuels troubles digestifs en réponse aux traitements et de doser l’inflammation au niveau fécal. Ce contrôle entraine/habitue l’animal à la présence de l’expérimentateur et à la préhension. Lors des 2 à 3 dernières semaines des procédures, après infection des animaux, la surveillance est renforcée : les animaux sont contrôlés 3 fois par semaine. Une grille de score est utilisée pour le suivi des animaux. En fonction de ce score, il faut soit renforcer les surveillances, soit prévoir un mode de soulagement, soit modifier le protocole expérimental. Il sera administré aux souris montrant des signes de souffrance un traitement analgésique pour réduire leur douleur. En fonction de l’évolution de l’état général de l’animal dans les heures qui suivent, un deuxième avis peut être demandé, mais en l’absence d’amélioration, l’euthanasie est considérée. L’animal est immédiatement sorti du protocole, anesthésié et mis à mort selon la réglementation en cours.

Choix des espèces

Le modèle choisi est la souris, modèle fréquemment utilisé dans l’étude de ce type de pathologie et qui dispose d’un grand nombre d’outil de diagnostic et d’analyses. Nous disposons d’un modèle de souris transgénique exprimant une protéine humaine servant de récepteurs pour les bactéries Escherichia coli adhérentes et invasives qui sont étudiées dans le cadre de ce projet. L'expression de cette protéine humaine au niveau de l’intestin grêle chez l’animal est nécessaire pour favoriser l’implantation de ces bactéries. Concernant le stade de développement, les animaux doivent entrer dans le protocole dès le sevrage (environ la 4ème semaine de vie) afin d'être placés sous régime alimentaire spécifique dès qu'ils commencent à s'alimenter par eux-mêmes et ce, pendant 8 semaines. En effet, le microbiote intestinal va subir un changement radical dans sa composition au sevrage en raison du changement d'alimentation. De ce fait, pour ne pas risquer de masquer les effets des régimes alimentaires spécifiques à étudier, il est préférable d'administrer directement ces régimes post-sevrage, sans passer par un régime alimentaire transitoire.

858 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles gestantes reçoivent six gavages de trente secondes, que le porteur décrit comme provoquant une douleur modérée et passagère, avec un risque de saignement vaginal et de perte de poids, et les souriceaux subissent deux injections, quatorze gavages et le prélèvement d'un à deux millimètres de queue pour le génotypage. Ceux qui développent la malformation des voies biliaires présentent une jaunisse et un retard de croissance, avant d'être tués à vingt-huit jours. Le bénéfice annoncé reste indirect, la création de lignées de souris sur lesquelles des cibles thérapeutiques pourront ensuite être testées, et le porteur affirme que les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer l'étude in vivo du développement de l'arbre biliaire.

Objectifs

l’objectif de ce projet est l'utilisation de souris pour l'étude de la malformation des voies biliaires lors du développement embryonnaire. Cela permettra d’étudier le développement de la maladie à des âges plus précoces par rapport aux publications précèdentes.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra le développement de nouveaux modèles génétiques de la malformation des voies biliaires chez la souris. Ils permettront d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes de la maladie. Cela permettra de valider les mécanismes moléculaires impliqués et de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourront être testés sur nos nouveaux modèles de souris par la suite.

Procédures

Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. Les nouveaux-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue de 1 à 2 millimètres sera prélevé pour le génotypage entre 7 et 10 jours après la naissance. 6 gavages de 30sec chez la femelle gestante entrainant une douleur modérée et passagère . 2 injections chez les nouveaux nés pendant 10sec sur les nouveaux nés engendrant une douleur légère et passagère. 14 gavage de 30sec chez les souriceaux.

Impact sur les animaux

Risque de saignement vaginal et perte de poids pour la femelle gestante. Lors des procédures le gavage est un mode d’administration entrainant une douleur modérée et passagère. l’injection entraine une douleur légère et passagère sur un nouveau-né. Dans le cas où les animaux développent la maladie les symptômes seront une jaunisse et un retard de croissance (poids moins élevés).

Devenir

Tous les nouveaux nés seront mis à mort à 28 jours d'âge car ils sont nécessaires pour notre étude et tous les animaux adultes des croisements seront également mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études in vivo pour l'étude du développement du foie et de la mise en place de la fibrose et de l'inflammation et l'étude de l'arbre biliaire lors de l'embryogénèse..

Réduction

Dans un souci de réduction des animaux nous utiliserons les deux sexes car nos études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour le développement de cette maladie. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Pour les nouveaux nés l’utilisation d’une lampe chauffante durant les pesées permettra de limiter la perte de chaleur des animaux. L’injection et le gavage seront réalisés avec des sondes et des aiguilles adaptées à la taille de l’animal seront utilisés. Des points limites spécifiques ont été établis.

Choix des espèces

Le choix de la souris est lié à la conservation des mécanismes de l'homéostasie métabolique physiologiques et physiopathologiques dans le foie entre l'humain et la souris. Elle a été confirmée par de nombreuses études. En particulier,le développement de l’arbre biliaire est similaire entre espèces. Par ailleurs, nous disposons également de nombreux outils spécifiques pour la souris. Animaux adultes et femelles gestantes entre 6-8 semaines d'âge. Souriceaux entre 1 et 28 jours après la naissance.

Deux gavages chez la femelle gestante, cinq injections chez les nouveau-nés, un bout de queue de un à deux millimètres prélevé au septième jour pour le génotypage : 884 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes les interventions étant réalisées sur animal vigile. Les souriceaux qui développent la maladie visée présentent une jaunisse et un retard de croissance, la biopsie de queue entraînant selon le porteur une douleur modérée et passagère. L'objet déclaré est de combiner la délétion d'un gène du foie avec des molécules toxiques pour les canaux biliaires, afin d'obtenir une malformation des voies biliaires à un âge plus précoce que dans les travaux publiés. Tous les souriceaux seront tués à vingt et un jours et les adultes des croisements à la fin de la procédure, sans autre raison donnée que le fait qu'ils sont "nécessaires pour notre étude".

Objectifs

L’objectif de ce projet est l'étude de souris dans des modèles environnementaux de la malformation des voies biliaires lors du développement embryonnaire en utilisant des molécules potentiellement toxiques pour les canaux bilaires couplé à la délétion d'un gène impliqué dans le fonctionnement hépatique. Cela permettra d’étudier le développement de la maladie à des âges plus précoces.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra le développement d’un modèle combinant la délétion génétique avec un facteur environnemental pouvant expliquer la cause de la maladie, c'est à dire des molécules pharmacologiques dans ce contexte. Il permettra également d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes précoces de la maladie et pourront être utilisés à l'avenir pour la découverte de nouveaux traitements.

Procédures

Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. 5 injections de 10sec chez les nouveaux nés. 2 gavage de 30sec chez la femelle gestante. Prélèvement d'un bout de queue 1 à 2 mm le 7ème jour post natal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances seront les injections sur les nouveaux nés et les gavages chez les femelles gestantes. Elles entrainent une douleur légère et passagère. Dans le cas où les animaux développent la maladie, les symptômes seront une jaunisse et un retard de croissance (poids moins élevés). Pour le génotypage un prélèvement d'un à deux millimètres de queue sera prélevé entre 7 jours après la naissance ce qui entraîne une douleur modérée et passagère.

Devenir

Tous les nouveaux nés seront mis à mort à 21 jours d'âge car ils sont nécessaires pour notre étude et tous les animaux adultes des croisements seront également mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Cette étude permettra de valider les mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Les cultures cellulaires ne peuvent pas complétement remplacer les études in vivo pour l'étude de la mise en place de la fibrose et l'étude du développement de l'arbre biliaire lors de l'embryogénèse.

Réduction

Dans un souci de réduction des animaux les deux sexes seront utilisés car les études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour le développement de cette maladie. De multiples paramètres seront analysés pour chaque souris. Afin de vérifier que les résultats sont statistiquements significatifs des tests adaptés seront utilisés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Afin de limiter le stress des animaux seul l’expérimentateur du projet sera amené à manipuler les animaux durant la période de croissance des nouveaux nés. Les manipulations seront effectuées le plus rapidement et calmement possible. Pour les nouveaux nés l’utilisation d’une table chauffante durant les pesées permettra de limiter la perte de chaleur des animaux. Des aiguilles adaptées à la taille et au poids (volumes adaptés) de l’animal seront utilisés pour les injections. Pendant toutes les procédures une grille de score avec des points limites spécifiques ont été établis. Notamment l’expérimentateur fait un suivi journalier pour les nouveaux nés.

Choix des espèces

Le choix de la souris est lié à la conservation des mécanismes de l'homéostasie métabolique physiologiques et physiopathologiques dans le foie entre l'humain et la souris. Elle a été confirmée par de nombreuses études. En particulier, le développement de l’arbre biliaire est similaire entre espèces. Les souris néonatales (P1 à P21) pour étudier le développement du foie et de l’arbre biliaire ainsi que des souris adultes gestantes (de 6 semaines minimum).

Un abord chirurgical de trente minutes sous anesthésie gazeuse pour injecter un produit directement dans les ventricules du cerveau, puis six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures sur souris vigiles, chacune maintenue en contention deux minutes. 324 souris mâles jeunes adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le produit dit positif est choisi parce qu'il détruit les cellules de Purkinje du cervelet, et le porteur écrit pourtant que les produits de référence "ne devraient pas induire de signes cliniques modérés ni marqués", les signes neuro-locomoteurs n'apparaissant selon lui que lors d'évaluations dédiées. Toutes les souris ayant reçu une injection sont tuées pour prélever leurs organes et chercher des marqueurs précoces de cette toxicité, seules celles écartées avant la chirurgie pouvant être transférées vers d'autres projets.

Objectifs

Les troubles neurologiques constituent la première cause de handicap et de morbidité mondiale, touchant plus de 3,4 milliards de personnes. Face à l'absence de traitements curatifs pour ces pathologies graves affectant le cerveau et la moelle épinière, la Recherche et Développement accélère le déploiement de thérapies innovantes, notamment les oligonucléotides antisens (ASO). Cette stratégie thérapeutique bloque la production de protéines toxiques avant l’apparition de lésions cérébrales. Le principal obstacle réside dans la difficulté pour ces thérapies de franchir la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre protecteur qui isole le cerveau de la circulation sanguine. Pour contourner ce problème, les médicaments sont injectés directement au niveau des lombaires entre les méninges chez l'Humain. Chez la souris, cette méthode n'est pas possible en raison de sa petite taille, et les médicaments sont administrés directement dans le cerveau par la voie intra-cérébroventriculaire dite ICV. Cependant, l’administration de certains ASOs par voie ICV chez la souris peut provoquer des effets indésirables structurels, notamment la perte de cellules de Purkinje (type de neurones du cervelet, crucial pour le contrôle moteur fin). Ces modifications anatomiques, souvent asymptomatiques au début, peuvent altérer gravement les fonctions neurologiques à terme. L’enjeu de ce projet est d’identifier des biomarqueurs précoces de cette toxicité retardée à la suite de l’injection par voie ICV de produits de référence (provoquant une perte des cellules de Purkinje) chez la souris. C’est un modèle présentant une forte homologie physiologique avec l’Humain et pour lequel cet effet indésirable a déjà été observé. Un suivi de deux semaines maximum post-injection, incluant des prélèvements biologiques à différents temps sont programmés pour effectuer des analyses approfondies. L'objectif scientifique de ce projet est donc de caractériser ces anomalies en intégrant une recherche de biomarqueurs précoces prédictifs d’une potentielle toxicité cérébrale avant même l'apparition de lésions irréversibles telles que la perte de cellules de Purkinje et l’apparition de signes cliniques. L’exploitation des résultats de ce projet pourra être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments (ASOs), dans le cadre d’un autre projet. En identifiant ces signaux d'alerte dès les phases non cliniques, cela permettra de garantir la sécurité des patients lors des futurs essais cliniques.

Bénéfices attendus

Ces études s’inscrivent dans l’optique d’accélérer la mise à disposition de thérapies innovantes pour le traitement de pathologies neurologiques et d’offrir de meilleures perspectives aux patients touchés par ces maladies. Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. A court terme il permettra la détection de biomarqueurs précoces susceptibles de prédire les effets potentiellement toxiques (anomalies cérébrales) des produits de référence. L’exploitation des résultats de ce projet pourra ensuite être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments en développement (à moyen terme) pour renforcer leur profil de sécurité dans le cadre d’un autre projet. A plus long terme, le bénéfice sera de sécuriser l’utilisation de ces thérapies chez les patients

Procédures

• injection unique du produit de référence/véhicule dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et une couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ) • injection d’analgésique en pré, péri et post opératoire (maximum 2 fois par jour pendant 2 jours) et avant l’euthanasie (moins de 10 sec) • prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum durant l’étude, contention de 2 minutes maximum, durée du prélèvement de moins de 30 sec.

Impact sur les animaux

• injection unique du produit de référence ou du véhicule dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et une couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ), la phase d’induction de l’anesthésie gazeuse peut générer un stress léger et de courte durée. La phase de réveil post-opératoire peut générer une douleur modérée • Injection de l’analgésique pré et post opératoire (maximum 2 fois par jour pendant 2 jours) et lors de l’euthanasie (moins de 10 sec) douleur légère et de courte durée à l’injection • A des prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum durant l’étude, contention de 2 minutes maximum, générant une douleur légère au moment de la ponction de moins de 30sec et stress lié à la contention nécessaire. - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : • Les produits de référence administrés pourraient induire une perte de cellules de Purkinje débutante (produit positif) mais ne devraient pas induire de signes cliniques modérés ni marqués. Toutefois des signes neuro-locomoteurs légers peuvent déjà être observées précocement et uniquement lors d’évaluations comportementales et neuro-locomotrices dédiées pouvant provoquer un inconfort léger pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un produit de référence ou d’un véhicule seront euthanasiés à l’issue de ce projet pour l’analyse de biomarqueurs et d’organes pour examen de leur structure (analyse histologique) ou analyse de l’activité des gènes (transcriptomique) et des protéines produites dans ces tissus (protéomique)selon les groupes. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les souris pour lesquelles au moins une première administration d’analgésique en préparation de la chirurgie a été réalisée et qui n’ont pas été opérées et n’ont donc pas reçu de produit de référence ou véhicule. Ce cas peut se produire dans de rares cas suite à une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre animal traité du même groupe par exemple. Ces animaux ayant déjà reçu au préalable une injection d’analgésique avant la chirurgie pourront dans ce cas être réutilisés dans d’autres projets.

Remplacement

Ce projet a pour but d’identifier des biomarqueurs précoces prédictifs d’une toxicité retardée post administration de produits de référence induisant ou non une perte de cellules de Purkinje. Cette approche permet d’identifier de potentiels marqueurs précoces de cette toxicité pouvant être observée avec les ASOs administrés dans le système nerveux. Actuellement, il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux tout comme il n’existe pas de modèle vitro suffisamment complet, pour permettre l’identification de biomarqueurs prédictifs de l’apparition d’une toxicité retardée suite à l’injection de ces produits de référence (ASOs). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et la souris est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (toxicité observée dans cette espèce, processus physiologiques très proches de l’Humain).

Réduction

Les produits de référence sont sélectionnés à l’aide de screening vitro et/ou silico et des études vivo de sécurité avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux prévu par étude est de 9 par temps de prélèvement (3 temps envisagés au total par produit de référence/véhicule). Ce choix est dicté par la nécessité de garantir la robustesse des données face à plusieurs sources de variabilité. Par groupe, 5 animaux seront nécessaires pour les analyses biochimiques, analyse de l’activité des gènes et de la synthèse des protéines et 4 pour l'examen des tissus. Ce nombre est nécessaire pour obtenir des résultats robustes pour les analyses complexes ex vivo envisagées et permet de compenser l’hétérogénéité liée à l’injection intra-cérébroventriculaire (diffusion du produit variant d’un sujet à l’autre) et les variabilités interindividuelles. Ainsi le nombre d’échantillons produit permettra d’assurer des données exploitables lors des analyses en laboratoire. Cette approche permettra de détecter avec certitude des signaux d'alerte (biomarqueurs) qui prédisent une toxicité retardée, garantissant ainsi la robustesse de nos conclusions. C’est une approche efficace afin d’atteindre les objectifs de la procédure, générer des données consolidées pour les études ultérieures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible. Le choix de ce nombre est basé sur la littérature et sur l’expérience interne (chaque équipe effectuant les analyses ex vivo ayant une bonne connaissance de la variabilité observée chez la souris et spécifique à son type d’analyse). Les études de ce projet permettent la mesure de nombreux paramètres sur un même animal, grâce à différents examens cliniques et paracliniques peu invasifs (observations cliniques, poids) ou terminaux (prélèvement d’organes…) et des cinétiques complètes sur un même animal. Le design expérimental de ce projet est optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus, la sélection préalable des produits de référence qui seront utilisés dans ces études (produit positif induisant des anomalies cérébrales, produite négatif ne présentant pas de toxicité retardée) permet d’explorer dans les meilleures conditions les biomarqueurs prédictifs de toxicité.

Raffinement

Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Le jour de la chirurgie, l’ensemble des animaux sera suivi grâce à une grille de scoring comportemental effectué 1h/3h et 24h (si applicable) post-opératoire. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, une prescription de soins ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base sur le score d’une grille éthique de points limites spécifique à l’espèce étudiée et au projet, mise en place dès l’apparition de signes cliniques marqués. L’utilisation des produits de référence dans ce projet ne devrait pas induire de signes cliniques modérés ni marqués sur la durée de l’étude. Cependant, des signes légers ont déjà pu être observés précocement avec ces produits de référence lors des évaluations hebdomadaires comportementales et neuro-locomotrices dédiées. Par mesure de précaution, la grille éthique dédiée à ce projet pourra être utilisée si jugée nécessaire. L’administration par voie ICV est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire. Les administrations ICV se font de manière séquentielle afin de s’assurer du bon déroulement de la chirurgie et de ne pas inclure l’ensemble des animaux dans la procédure si des signes cliniques venaient à survenir, bien que les produits de référence soient injectés à une dose précédemment évaluée et ne devant pas induire de signes cliniques. Les animaux sont régulièrement manipulés par l’ensemble du personnel technique formé pour permettre un renforcement positif afin de générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Tous les animaux sont hébergés dans des conditions strictes de confinement avec à disposition un enrichissement spécifique (tunnel, éléments de nidification) et manipulés par du personnel formé au bien-être animal. Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Ce projet est réalisé chez la souris car : - La souris présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Humain et ainsi une forte valeur translationnelle. - La perte des cellules de Purkinje, qui constitue une toxicité potentielle liée à l’administration d’ASOs dans le système nerveux, a été observée dans cette espèce (et dans l’espèce Primate également) et doit être investiguée afin d’éviter que cet effet indésirable ne survienne chez l’humain en clinique. Les souris utilisées sont des jeunes adultes mâles et correspondent au sexe et à l’âge des animaux utilisés chez lesquels cette toxicité retardée a été observée avec les produits de référence.

À partir de huit semaines, 30 souris, dont douze nourries d'une alimentation enrichie en fer, sont suivies pendant environ douze mois et pesées toutes les deux semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit cinq examens d'IRM sous anesthésie gazeuse, de deux heures au maximum, précédés d'un jeûne d'une heure, avec un risque d'hypothermie, de sécheresse oculaire et, exceptionnellement, de décès sous anesthésie. Le porteur écrit qu'un passage en clinique exige des preuves obtenues in vivo "sur un modèle animal pertinent tel que la souris". Huit souris seront tuées en cours d'étude pour prélever leur foie, leur cœur, leurs reins et leur rate, les deux couples reproducteurs après quinze mois, et le sort des vingt-deux dernières, âgées de quatorze mois, reste suspendu à un avis vétérinaire, entre maintien en vie et mise à mort.

Objectifs

La surcharge en fer correspond à une accumulation excessive de fer dans l’organisme pouvant avoir différentes origines. Son importance dépend de la cause sous-jacente et de la durée d’évolution sans traitement. Souvent peu symptomatique au début, elle est généralement diagnostiquée tardivement. Le foie est l’un des premiers organes touchés. L’excès de fer peut entraîner des lésions hépatiques progressives, notamment une fibrose hépatique, caractérisée par une accumulation anormale de tissu cicatriciel. L’évaluation de cette fibrose est essentielle pour suivre l’évolution de la maladie et adapter la prise en charge des patients. La biopsie hépatique constitue actuellement l’examen de référence pour évaluer la fibrose. Cependant, elle est invasive, douloureuse et peut souffrir d’un biais d’échantillonnage, le prélèvement n’étant pas toujours représentatif de l’ensemble du foie. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir des informations anatomiques, structurelles, fonctionnelles et biomécaniques sur les tissus. Parmi les techniques disponibles, l’élastographie par résonance magnétique (ERM) fournit une cartographie non invasive de la rigidité hépatique, paramètre étroitement lié au degré de fibrose. Toutefois, la présence d’une forte concentration de fer dans le foie constitue une limite importante de cette technique. Le taux d’échec de l’ERM augmente avec la quantité de fer présente, rendant difficile, voire impossible, l’évaluation de la fibrose chez les patients souffrant de surcharge ferrique. L’objectif de ce projet est de valider une méthode d’imagerie alternative (ERM-alt), développée au sein du laboratoire, permettant d’évaluer la fibrose hépatique même en présence de fer. La faisabilité de cette approche a déjà été démontrée sur des objets tests puis in vivo chez des souris saines. Il est désormais nécessaire de la valider chez des souris présentant différents niveaux de surcharge ferrique afin de confirmer sa robustesse et d’envisager son transfert vers la clinique. Ce projet porte ainsi sur la validation expérimentale d’une méthode innovante destinée à améliorer le diagnostic non invasif de la fibrose hépatique chez les patients atteints de surcharge en fer.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche translationnelle permettra : 1. De comparer les teneurs en fera quantité de fer dans le foie hépatique mesurées par IRM avec les valeurs histologiques (technique de référence) sur des cohortes de souris malades. 2. De comparer laes rigidité du foies hépatiques mesurées par IRM avec les stadifications stade de fibrose hépatiqueréalisées par obtenue par analyse histologiquee sur des cohortes de souris malades. 3. De déterminer les seuils de fer hépatique compatibles avec les techniques IRM et dDe montrer que la technique IRM (ERM-alt) développée au laboratoire permet de surmonter les problèmes limitations de la méthode classiquesoulevés par la présence importante de fer. Les résultats positifs sur souris serviront alors de base pour une étude clinique chez l’humain sur sujets sains dans un premier temps puis sur patients souffrant de surcharge ferrique. La méthode proposée sera et ainsi offrir clé pour pouvoir faire une solution non-invasive pour stadifier la stadification non-invasive de la fibrose hépatique chez ces patients, ce qui n’est pas possible aujourd’hui évitant ainsi une biopsie du foie.

Procédures

Un groupe recevra une alimentation enrichie en fer pendant environ 12 mois, tandis que l’autre groupe suivra une alimentation standard. À partir de l’âge de 8 semaines, les souris seront suivies pendant environ 12 mois. Elles seront pesées toutes les deux semaines afin de vérifier leur état de santé et le bon suivi du régime alimentaire. Les animaux seront soumis à 5 examens. Chaque examen durera au maximum 2 heures et sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. Avant chaque examen d’IRM, les animaux seront soumis à un jeûne d’environ 1 heure afin de standardiser les conditions d’imagerie.

Impact sur les animaux

Certaines souris auront une modification génétique entraînant une accumulation progressive de fer dans l’organisme. Un groupe de 12 souris recevra une alimentation enrichie en fer afin d’augmenter cette accumulation au niveau du foie, ce qui devrait entraîner des modifications modérées de la rigidité du foie correspondant à un stade précoce de fibrose. Le retour à une alimentation standard devrait permettre une réduction du niveau de fer hépatique et une régression de la fibrose. Les animaux seront âgés de 14 mois à la fin du projet, ce qui pourrait induire des problèmes de santé liés simplement à la vieillesse. Pendant le transport entre l’établissement hébergeur et le laboratoire les animaux peuvent subir un stress temporaire. Pendant l’anesthésie et l’examen d’IRM, les animaux peuvent présenter une baisse de la température corporelle et une sécheresse oculaire. Les examens seront répétés plusieurs fois au cours de l’étude, ce qui peut entraîner un stress modéré supplémentaire lié aux manipulations répétées. Comme pour toute procédure réalisée sous anesthésie, un risque très faible de décès pendant l’examen existe, bien que cela reste exceptionnel au regard de notre précédente expérience d’imagerie chez des souris saines.

Devenir

Huit animaux seront euthanasiés au cours de l’étude afin de prélever certains organes (foie, cœur, reins et rate) nécessaires à la réalisation d’analyses histologiques permettant d’évaluer l’accumulation de fer et les lésions hépatiques. Les deux couples reproducteurs utilisés pour la constitution de la colonie seront également euthanasiés à l’issue de la période de reproduction, soit environ 15 mois après le début du projet. Les 22 autres animaux (8 du groupe 1, 8 du groupe 2 et 6 du groupe 3) auront environ 14 mois à la fin de l’étude. Leur devenir sera évalué en concertation avec la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire référent de l’établissement. En fonction de leur état de santé et de leur âge, ils pourront soit être maintenus en vie pour d’éventuels projets compatibles, soit être euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

De plus, pour pouvoir passer à une étude clinique, il est demandé des preuves de l’applicabilité de la méthode IRM développée (ERM-alt) in vivo sur un modèle animal pertinent tel que la souris.La fibrose hépatique est une maladie complexe qui se développe sur plusieurs années. Elle implique des interactions entre différentes cellules et une organisation très précise du tissu hépatique. Aujourd’hui, avec les technologies disponibles (comme les cultures de cellules ou les organoïdes en laboratoire), il est impossible de reproduire fidèlement tous ces mécanismes. Comme cette étude vise à valider une nouvelle méthode d’imagerie médicale par IRM pour évaluer la fibrose du foie, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, comme la souris, car ils permettent de reproduire les processus biologiques réels de la maladie. Enfin, avant de tester cette méthode sur l’humain, il faut d’abord prouver son efficacité et sa faisabilité in vivo, ce qui n’est possible qu’avec des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum au maximum pour chaque groupe sans compromettre l'interprétation des résultats suite à une analyse robuste des résultats par des tests statistiques non paramétriquespour garantir des résultats fiables en termes de significativité statistique. Cette estimation tient compte des prélèvements d’organes réalisés à des fins depour les biopsies et d’une éventuelle mortalité au cours du protocole. Cela permet de garantir que les objectifs scientifiques pourront être atteints sans avoir recours à des animaux supplémentaires ni d’interrompre l’étude en cours faute d’animaux en nombre suffisant. Le groupe contrôle (G3) est également constitué du stricte minimum (3 mâles et 3 femelles) permettant de comparer les résultats entre les groupes tout en respectant les différences liées au sexe.d’avoir des résultats comparatifs avec les groupes 1 et 2 en fonction du sexe. Enfin, pour éviter d’utiliser davantage d’animaux, les mêmes animaux seront suivis au cours du temps. Cela permet de suivre l’évolution de la maladie, sans avoir besoin d’une quantité élevée d’animaux.

Raffinement

Les souris du groupe 1 auront une alimentation riche en fer pour qu’elles développent une surcharge de fer dans le foie. Cette solution permet d’obtenir le modèle expérimental sans nécessité d’acte invasif. Les examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse par isoflurane) et pourront durer jusqu’à 2 heures. Une goutte d’Ocrygel sera instillée dans chaque œil juste après l’installation de l’animal sur le lit IRM afin de limiter le dessèchement oculaire. Une couverture chauffante sera utilisée pour maintenir la température de l’animal tout le long de l’examen. Cette température ainsi que la respiration de la souris seront suivies pendant toute la durée de l’examen. L'apport en isoflurane sera couplé à un concentrateur d'oxygène pour favoriser la respiration de l'animal et sa récupération au réveil. En fin de procédure, si l'animal a été anesthésié plus de 2 heures, il recevra une injection sous cutanée de 0,5mL de sérum glucosé chauffé à température corporelle pour recevoir une réhydratation rapide et éviter une possible hypoglycémie. La phase de réveil se fera en isolement dans une cage à part, l’animal sera déposé sur un tapis chauffant évitant une hypothermie. Des points limites prédictifs et spécifiques de ce projet ont été établis afin d'anticiper tout effet dommageable sur les animaux, avec une surveillance adaptée à chaque étape de la procédure jusqu’à la mise à mort des animaux en fin de procédure.

Choix des espèces

Les modèles de souris restent accessiblessont et compatibles bien adaptées à une analyse surpour la recherche dans le domaine de l l’imagerie’IRM préclinique, notamment en IRM, à haut champ magnétique de 7T (plusieurs papiers références) . Les techniques IRM mise en œuvre dans cette demande de projet sont couramment pratiquées au sein du laboratoire sur des souris saines. La proximité génétique entre les souris et l’homme permet d’étudier des mécanismes biologiques comparables. L’utilisation de souris génétiquement modifiées déficientes en hepcidine1 permettra de se rapprocher au mieux des modifications physiopathologiques observées chez l’homme dans le cadre de pathologies caractérisées par une accumulation excessive de fer dans le foie (hémochromatose) pouvant mener à la formation de tissus cicatriciel au niveau du foie (fibrose hépatique). car elles présentent des similitudes biologiques avec l’homme, ce qui permet d’étudier des maladies du foie proches de celles observées chez les patients, notamment l’accumulation excessive de fer (hémochromatose) et le développement d’une fibrose hépatique Les souris des trois groupes suivront le protocole d’imagerie IRM à partir de 8 semaines afin de s’assurer que le système immunitaire soit mature et que le foie ait également atteint une rigidité stabiliséeLes examens d’IRM commenceront lorsque les souris auront 8 semaines. À cet âge, leur organisme est suffisamment développé et le foie a atteint un état stable (démontrée lors d’une étude antérieure sur une petite cohorte). Pour le groupe recevant une alimentation riche en fer, ce régime débutera également à partir de la 8ᵉ semaine afin de coïncider avec le début du suivi par IRM. Le suivi par imagerie durera 12 mois afin d’observer progressivement différents niveaux d’accumulation de fer dans le foie selon les groupes étudiés, ainsi que les premiers stades de fibrose hépatique, sans provoquer d’atteintes sévères chez les animaux.

Répartis en 18 lapins, 18 chats, 6 chiens et 6 bovins, 48 animaux non-humains sont utilisés pour nourrir des élevages de phlébotomes, de moustiques, de stomoxes et de puces, et pour fournir du sang aux travaux pratiques d'étudiants vétérinaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque lapin peut subir jusqu'à 78 infestations d'une heure par 80 phlébotomes ou moustiques posés sur ses oreilles, chaque chat jusqu'à 160 infestations de vingt puces qui piquent jusqu'à une dizaine de fois par jour, chaque chien jusqu'à 260 prises de sang en cinq ans et chaque bovin jusqu'à 90. Les chats et les lapins passent leurs nuits en cage individuelle pour permettre le recueil des œufs de puces ou des fèces, le porteur précisant que pour les chats ces cages sont plus petites que les normes standard d'hébergement. Le porteur écrit que ces lapins, chats, chiens et bovins sont maintenus en vie et pourront être réutilisés ou proposés à l'adoption, sans mentionner les huit mises à mort que le décompte structuré du résumé fait apparaître.

Objectifs

L’objectif de ce projet est l’entretien d’un insectarium maintenant en élevage de laboratoires des phlébotomes, des moustiques, des stomoxes et des puces dans l’établissement, afin de pouvoir réaliser des études de développement de médicaments antiparasitaires, ainsi que la formation des étudiants vétérinaires à la réalisation d’examen complémentaires (frottis sanguins) en parasitologie. Les parasites externes des carnivores domestiques (insectes ou acariens : phlébotomes, moustiques, puces, tiques) et des animaux de production (mouches piqueuses hématophages) peuvent causer diverses nuisances aux animaux (prurit, douleur, allergies…) et transmettre des maladies vectorielles qui sont, pour certaines, des zoonoses. La leishmaniose par exemple, transmise par la piqûre des phlébotomes, est une des maladies vectorielles les plus importantes en Europe chez le chien. Présente dans 80 pays du monde et en extension, cette maladie transmissible à l'homme peut provoquer chez le chien des signes cutanés et viscéraux, qui sans traitement conduisent à la mort de l’animal. Tout chien infecté le reste à vie et représente une source de parasites pour l’homme. Les stomoxes, quant à eux, sont des mouches piqueuses harcelantes des bovins, à l’origine de nuisances directes (perturbation du bien-être, piqures douloureuses, spoliation sanguine) et indirectes (transmission d’agents pathogènes : bactéries, parasites, virus, tel que celui de la dermatose nodulaire contagieuse). Elles sont également à l’origine de pertes économiques importantes pour les éleveurs. Le développement d'antiparasitaires externes ayant pour but de protéger les animaux contre ces parasites est donc un enjeu de santé animale et humaine. Pour évaluer un nouveau produit ou pour obtenir une autorisation de mise sur le marché d'un nouveau médicament vétérinaire, différentes études sont obligatoires et nécessitent de disposer des insectes ou acariens ciblés. Ceux-ci ont besoin d’être nourris régulièrement avec du sang de mammifères afin de pouvoir se reproduire et certaines de leurs larves sont nourries avec un aliment dont la préparation nécessite des fèces des lapins. Il est par ailleurs essentiel que les étudiants vétérinaires soient formés au diagnostic de ces maladies vectorielles au cours de leur cursus de formation et l’apprentissage de la réalisation de frottis sanguin fait partie des travaux pratiques en parasitologie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont, à court terme, la formation des étudiants en parasitologie, ainsi que la pérennité de l’insectarium et la reproduction des insectes, permettant de disposer des parasites nécessaires aux tests d’efficacité d’antiparasitaires vétérinaires, et à moyen terme, la mise sur le marché de ces médicaments. Ces insectes servent également à des projets de recherche permettant de mieux comprendre les modalités de transmission vectorielle et les mécanismes de résistance aux insecticides. A plus long terme, les produits développés et testés au sein de l’établissement utilisateur ont pour objectifs de prévenir la transmission des maladies vectorielles à l’animale et pour certains à l’homme. Une meilleure compréhension des mécanismes de transmission des agents infectieux vectorisés et de la résistance aux insecticides permettra respectivement de proposer des méthodes de lutte adaptées pour la prévention des maladies et contourner la résistance

Procédures

- Les lapins seront soumis à des piqures d’insectes (80 phlébotomes ou moustiques) au niveau de leurs oreilles uniquement, sur animal vigile, pendant 1h maximum, toutes les 2 semaines maximum, soit un maximum de 78 infestations d’une durée d’1h pendant toute la durée du projet. Chaque insecte pique généralement une seule fois à chaque infestation. La piqure est très brève (environ 1 seconde), puis l’insecte reste fixé le temps de son repas sanguin 3 à 5 minutes avant de se détacher. Les lapins sont également utilisés pour des recueils de fèces permettant de préparer l’aliment des larves de phlébotomes. Pour cela, ils doivent ponctuellement, 2 à 3 nuits par mois, être placés en cages individuelles sur grille pendant la nuit (15h maximum). - Les chats seront soumis à des piqures de puces sur animal vigile avec 20 puces par infestation hebdomadaire, pendant une durée de 2 mois, tous les 3 mois maximum, soit un maximum de 160 infestations (dépôt de 20 puces sur leur pelage) pendant toute la durée du projet. Chaque puce peut piquer jusqu’à une dizaine de fois chaque jour. La piqure de puce est très brève (environ 1 seconde), puis la puce reste fixée le temps de son repas sanguin 3 à 5 minutes avant de se détacher. Les chats recevront également un comprimé d’antiparasitaire externe par voie orale tous les 3 mois maximum soit 20 administrations maximum pendant toute la durée du projet. Chaque administration dure 2 minutes. Pendant les périodes d’infestation, les animaux sont isolés chaque nuit (15h maximum) dans une cage individuelle de 1 m2 permettant de recueillir les œufs de puces qui tombent de leur pelage afin de maintenir l’élevage d’insectes. - Les chiens seront soumis au maximum à une prise de sang par semaine, d’une durée de 3 minutes maximum, sur animal vigile, pendant toute la durée du projet, soit au maximum 260 prises de sang sur 5 ans. - Les bovins seront soumis à une prise de sang toutes les 3 semaines, d’une durée de 15 minutes maximum, sur animal vigile, pendant toute la durée du projet, soit au maximum 90 prises de sang sur 5 ans.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles pour les animaux sont : - une douleur, un prurit excessif ou le développement d’une allergie liés aux piqures d’insectes - une douleur ou une phlébite liée aux prélèvements sanguins répétés - un isolement temporaire en cage individuelle au cours de la nuit pour les chats et les lapins. Pour les chats, les dimensions de ces cages individuelles sont inférieures aux normes standard d’hébergement.

Devenir

Pendant toute la durée du projet, les animaux sont maintenus en vie, ont un suivi vétérinaire régulier et restent dans la colonie de l’établissement utilisateur. A la fin de ce projet, ou en cas d’exclusion de ce projet, ils pourront soit être utilisés dans un autre projet (après évaluation vétérinaire), soit être proposés à l’adoption.

Remplacement

Les nourrisseurs artificiels permettent de remplacer partiellement l’exposition directe d’animaux aux piqures d’insectes. Des essais ont préalablement été réalisés pour essayer des solutions nutritives artificielles afin de nourrir les insectes, mais elles ne permettent pas leur reproduction en quantité suffisante pour l’entretien d’un insectarium. Le développement de solutions adaptées reste une alternative potentielle pour l’avenir mais ne peut pas encore actuellement être mis en œuvre. De plus, les insectes sont principalement élevés pour réaliser des tests d’efficacité d’antiparasitaires sur animaux. Or, lorsqu’ils sont exclusivement nourris sur des systèmes artificiels, ils perdent progressivement leur attraction naturelle vers l’animal, ce qui les rend inutilisables pour cet objectif scientifique. Enfin, lorsqu’il s’agit de sélectionner des puces résistantes à certains antiparasitaires spécifiques, il n’est pas possible de reproduire artificiellement la peau d’un animal traité. Du sang animal reste donc nécessaire pour remplir ces nourrisseurs et ces dispositifs ne permettent qu’une substitution partielle des infestations directes sur animal. Des fèces de lapin restent également nécessaires pour la préparation de l’aliment des larves de phlébotomes, ainsi que du sang animal pour l’apprentissage de la réalisation de frottis sanguins à des fin de diagnostic vétérinaire, sans méthodes alternatives existantes.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d'animaux de chaque espèce pour réaliser en continu les travaux pratiques de parasitologie et l’entretien de l’élevage en adaptant les prélèvements et infestations aux besoins strictement nécessaires.

Raffinement

Tous les animaux disposent d’élément d’enrichissement adaptés à l’expression de leur comportements naturels dans leurs hébergements et ont un programme de sorties, de jeu et/ou de manipulation : Les chiens disposent de balles, jouets en caoutchouc, plateformes de repos, et sont sortis quotidiennement dans le couloir de l’hébergement pour une courte activité de jeu avec le personnel. Ils sont également sortis dans un parc extérieur de détente ou promenés en laisse une fois par semaine (sauf conditions météo défavorables). Ils sont régulièrement habitués à monter sur la balance, être brossés et amenés en salle d’examen et récompensés à chaque occasion. Les chats disposent de paniers maisonnettes, griffoirs, jouets, tablettes surélevées et d’arbre à chats, ils sont sortis dans le couloir de l’hébergement une fois par semaine. Ils sont également régulièrement habitués à être pesés, brossés et amenés en salle d’examen et récompensés à chaque occasion. Les lapins disposent de maisonnettes, d’éléments à ronger et sont régulièrement caressés et manipulés. Ils sont également sortis dans le couloir de leur hébergement pendant le nettoyage de leur enclos. Les bovins sont hébergés en extérieur et sont régulièrement manipulés, habitués au licol et récompensés à chaque occasion. Le nourrissage des insectes sans infestation directe des animaux est préférentiellement pratiqué quand cela est possible. Lorsque des infestations sont pratiquées sur les lapins, une crème antiprurigineuse est systématiquement appliquée localement. Lorsqu’ils ne sont plus utilisés, les animaux sont tous proposés à l’adoption.

Choix des espèces

Ces espèces répondent aux critères biologiques naturels des insectes hématophages (attractivité, compatibilité physiologique) et aux contraintes pratiques nécessaires. Les lapins sont utilisés pour les infestations par les phlébotomes et moustiques, leur taille et leur docilité permet de réaliser des infestations sur animal vigile, en exposant seulement leurs oreilles, qui offrent une grande surface cutanée facile d’accès permettant aux insectes de se nourrir efficacement. Leurs fèces sont pertinentes pour le nourrissage des larves de phlébotomes. Les chats sont pertinents pour le nourrissage et la reproduction des puces, car ce sont les hôtes préférentiels de ces parasites et ils les supportent naturellement. Les chiens sont utilisés pour les prélèvements de sang utilisés lors des travaux pratiques de parasitologie car ils sont représentatifs des carnivores domestiques soignés en clientèle. Les chiens sont également utilisés, de même que les bovins, pour obtenir le sang nécessaire à l’entretien des élevages de stomoxes et pour les nourrisseurs artificiels : les prélèvements sont faciles à réaliser et ils peuvent fournir en quantité suffisante le sang nécessaire pour alimenter les insectes. Des animaux adultes, sans préférence d’âge sont nécessaires. Nous prévoyons de travailler sur des animaux âgés de plus de 6 mois.