Procédures modérées

150 macaques à longue queue vont être utilisés, réutilisés ensuite dans d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des administrations répétées par plusieurs voies, jusqu'à dix prélèvements de sang, un isolement en cage à métabolisme, et peut subir l'implantation chirurgicale d'une chambre vasculaire suivie de six à huit jours d'isolement post-opératoire, pour mesurer le devenir d'un candidat-médicament. Le porteur présente le primate comme "l'une des espèces les plus pertinentes" et affirme qu'aucune méthode de substitution ne suffit. Il présente comme bénéfice pour l'animal une "amélioration des connaissances scientifiques sur l'espèce utilisée".

Objectifs

Ce projet consiste à étudier le devenir d’une molécule, candidat-médicament, chez le primate lorsque cette espèce est utilisée au cours du développement préclinique de cette molécule (pharmacocinétique). Pour cela, des prélèvements sanguins sont réalisés chez le primate vigile ou anesthésié après l’administration du produit à tester et pourront être associé à des prélèvements d'autres liquides biologiques (ex: urines, liquide céphalo-rachidien). Ces prélèvements sont utilisés pour mesurer dans le temps la concentration du candidat-médicament administré et/ou de ses métabolites et éventuellement la concentration de différents marqueurs biologiques pertinents. L'étude pharmacocinétique est donc une étape importante, car une molécule peu absorbée ou rapidement éliminée a peu de chance de devenir un médicament. Entre 2 études du même projet, un conditionnement des animaux aux conditions d'hébergement et aux gestes techniques sera réalisé afin de maintenir un apprentissage régulier des animaux et de diminuer le stress que pourraient générer les différentes manipulations réalisées lors des études.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Du fait de la cible thérapeutique, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques sur l’espèce utilisée (Primate non humain) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux seront administrés avec les composés à tester par différentes voies (orale, souscutanée, transdermique, intranasale, intramusculaire ou intraveineuse) avec moins de 3 min par administration. Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’animal vigile au niveau de la veine céphalique ou veine saphène (2 minutes par prélèvement). Ces prélèvements seront en général de 0.5 à 4 mL, avec un maximum de 10 prélèvements et dans la limite de 15% du volume sanguin total sur 24h. Ces expériences (administration et prélèvements de sang pourront être réalisées sur animal anesthésie, sur une durée maximale de 4h. Les animaux pourront éventuellement être mis à jeun la veille de l’administration pour une durée qui est fonction du produit testé. Pour les recueils urinaires, les animaux seront placés en cage à métabolisme sur une durée de 24h maximum. Des prélèvements de liquides céphalorachidiens ou des tests d'hemostase pourront également être réalisés, sous anesthésie, sur une durée de 15minutes maximum après induction de l'anesthésie. Les animaux pourront également subir une chirurgie d'implantation d'une chambre vasculaire ou minipompe de perfusion (durée max=1.5h).

Impact sur les animaux

Les animaux de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture avant administration du produit et avant anesthésie, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration et de l'anesthésie, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h) pour la collecte d’urine et une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins. Les animaux pourront également subir une chirurgie d'implantation d'une chambre vasculaire ou minipompe de perfusion. Dans ce cas, les animaux seront isolés pendant la période de récupération post-opératoire (6 à 8j). Cet isolement engendrera un stress de durée moyenne et d'intensité modérée. Cependant en contrepartie, l'isolement permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale. Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échange avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet n'ayant pas un degré de sévérité sévère après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le primate non humain car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le primate est l’une des espèce de non-rongeur qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 3 à 6 animaux par groupe. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • La mise au point de procédures rigoureuses, • La formation du personnel, • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages.

Choix des espèces

Le primate non humain est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de pharmacocinétique ( cf guidelines ICH S3A) permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang et/ou les urines (lorsque le primate est utilisé au cours du développement préclinique de ce produit). Les primates présentent des similarités physiologiques et cliniques avec l'homme et peuvent developper des pathologies analogues aux pathologies humaines. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

1 850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections de tamoxifène, d'autres sont rendues obèses par un régime gras pendant quatre mois, avec des phases d'hébergement individuel, pour étudier l'inflammation cérébrale déclenchée par un repas gras. Le porteur qualifie l'obésité induite et l'isolement de nuisances sans "signes comportementaux" d'inconfort, en s'appuyant sur ses publications passées. Il affirme que la satiété et le dialogue entre organes ne sont pas modélisables in vitro.

Objectifs

L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (postprandial inflammatory response, ou PIR) systémique est maintenant bien documentée mais ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas. La PIR est exacerbée lorsque le repas est riche en graisses. Notre équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules inflammatoires spécifiques (les cellules microgliales) chez l’individu sain en réponse à un repas gras. La PIR cérébrale n’est pas déclenchée par un repas équilibré standard. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas gras. Elle se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Nous avons déjà identifié des effets bénéfiques de la PIR en montrant qu’elle contrôlait la prise alimentaire en favorisant la satiété et en limitant les apports caloriques futurs après consommation d’un repas hyperlipidique hypercalorique. Toutefois, les bases moléculaires de ce phénomène biologique sont encore totalement inconnues. Pour explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la PIR cérébrale et en comprendre les déterminants, nous allons étudier des souris transgéniques particulières permettant de recueillir des informations biologiques nouvelles, avec une très grande précision, au sein des cellules microgliales spécifiquement. Les animaux seront étudiés dans différentes phases prandiales : avant ou après un repas, et en fonction de la nature des repas consommés (standard ou gras), et en fonction de leur état métabolique (sain ou obèse). Après étude du comportement alimentaire, des analyses de biologie moléculaire seront faites post-mortem sur des biopsies cérébrales. Au total, 1850 souris seront utilisées dans ce projet.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes biologiques de la PIR cérébrale chez l’individu sain, et donnera des informations nouvelles sur processus cérébraux impliqués dans le contrôle de la satiété. Ainsi ce projet qui apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.

Procédures

L’obtention de souris mutantes A nécessite un traitement au tamoxifène durant 5 jours par une injection péritonéale quotidienne à l’âge de 5 semaines. La procédure 1 implique une mise en cage individuelle pendant 3 jours au maximum, afin de mesurer la prise alimentaire de chaque individu, ce qui peut engendrer stress et inconfort. Des contentions seront réalisées pendant les expériences afin de mesurer le poids corporel et en fin d’expérience afin d’anesthésier les animaux avant mise à mort. Une injection intrapéritonéale d’anesthésique durant 5 secondes sera réalisée avant la mise à mort sous sédation.

Impact sur les animaux

Le traitement par le tamoxifène des souris mutantes A peut induire des signes d’inconfort et de mal-être. Obésité nutritionnelle induite Les principales nuisances sont liées à la production de lots d’animaux obèses, dont l’obésité sera induite par exposition à un régime gras hypercalorique pendant 4 mois. Nous utilisons ce modèle depuis plus de 15 ans. Cela provoque une obésité associée chez certains individus à une résistance à l’insuline. Une accumulation de graisses ectopique peut être observée au niveau des muscles ou du foie. En revanche, il n’y a pas de signes particuliers comportementaux suggérant un inconfort, une douleur ou un mal-être. Hébergement individuel pendant 3 jours Pour assurer contrôler les prises alimentaires individuelles lors de ces études, les animaux seront placés en cage individuelle. Cette condition de vie imposée est brève et ne produit aucune gêne ni aucun changement hormonal visible, comme nous l’avons attesté et publié , mais reste un acte pouvant affecter le bien-être des souris. Contention et injection intrapéritonéale En fin d’expérience, la contention des animaux et les injections intrapéritonéales d’agent d’anesthésique avant la mise à mort représentent des nuisances potentielles. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal , l'ensemble de la manipulation durera 5 minutes.

Devenir

Les 1850 souris seront toutes mises à mort afin de prélever le cerveau en vue d’analyses de biologie moléculaire.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.

Réduction

La procédure décrite a été optimisée, standardisée et validée précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet de mener des études conformes sur des effectifs réduits.

Raffinement

Depuis la naissance des animaux dans l’animalerie, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux. Les animaux seront élevés dans un environnement calme, enrichi, et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h (cycle inversé permettant d’étudier les animaux pendant leur phase active, avec extinction des lumières à 10h30). L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidification et carrés de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Pendant les expériences, la surveillance quotidienne du bien-être animal sera assurée de manière visuelle, à travers les cages transparentes. De plus, lors des changements de conditions nutritionnelles à l’échelle d’un repas (induction des états prandiaux contrôlés sur 3 heures), une observation directe des animaux sera faite. L’induction des états prandiaux se fait en cohérence avec la physiologie des animaux (introduction des repas à l’extinction des lumières, en début de phase active).

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, âgées de 9 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une dizaine d'injections et jusqu'à dix-huit prélèvements de sang, pour tester si la neutralisation d'une protéine circulante limite les effets du syndrome de Cushing. Le porteur décrit des nuisances "très limitées" et un inconfort "léger", tout en indiquant que les glucocorticoïdes peuvent induire obésité, résistance à l'insuline et ostéoporose. Il affirme que l'appétit et le comportement alimentaire ne sont pas modélisables in vitro et conclut au caractère "indispensable" de l'animal vivant.

Objectifs

Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim. Cette protéine agit comme un stimulateur de production de graisse (lipogenèse) et un stimulateur de l'appétit. L’augmentation de cette protéine accroît la prise alimentaire, réduit la glycémie, et encourage la lipogenèse à tous les niveaux. La neutralisation de cette protéine apparaît donc comme un candidat d'intérêt dans la lutte contre l’obésité. Or, l'exposition chronique à des niveaux excessifs de glucocorticoïdes entraine un syndrome de Cushing qui est caractérisé par le développement de l'obésité, une résistance à l'insuline, une perturbation des taux de graisses dans le sang, une faiblesse musculaire, une fragilité des os et des accidents vasculaires. L’objectif de ce projet est donc d’étudier et de déterminer si la neutralisation de cette protéine circulante peut empêcher/réduire les effets secondaires indésirables du Syndrome de Cushing.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique afin de limiter ou d’éradiquer le syndrome de Cushing (effets indésirables associés à une exposition importante aux glucocorticoïdes).

Procédures

Pour certains animaux 12 injections sous anesthésie locale par souris (durée quelques secondes) et 18 prélèvements de sang (durée quelques secondes à 1 minute) - Pour d'autres animaux: 10 injections par souris (durée quelques secondes) et 18 prélèvements de sang (durée quelques secondes à 1 minute) - Pour d'autres animaux, 11 injections par souris (durée quelques secondes), 18 prélèvements de sang (durée quelques secondes à 1 minute). Pour tous, 1 prélèvement de sang unique sous mandibulaire (100µL, 1 minute), à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

Les injections sous anesthésie locale induisent des nuisances très limitées au site. Les prélèvements de sang, très limités en volume, ne provoqueront qu'un inconfort léger, local et transitoire. La contention, les prélèvements et les injections peuvent stresser transitoirement les animaux. Les glucocorticoïdes peuvent induire l'obésité, la résistance à l'insuline, la dyslipidémie, la myopathie et l'ostéoporose.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible de modéliser, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Le nombre nécessaire d'animaux a été déterminé grâce à une analyse statistique préalable. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de détecter toute modification.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. -La souris est un animal très utilisé en laboratoire, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

24 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une sternotomie sous anesthésie générale pour la pose d'un implant sternal, six prélèvements sanguins, plusieurs transports entre deux sites, puis la mise à mort à trois ou six mois. Le porteur indique qu'avant l'euthanasie les brebis encore anesthésiées serviront à la formation chirurgicale d'internes, présentée comme une mesure de "réduction" du nombre d'animaux. Il justifie le choix de la brebis par la taille de son sternum proche de celle de l'homme.

Objectifs

Objectif principal : Observer chez la brebis l'intégration par le tissu hôte de 2 types d’implant sternal (stabilisant le sternum) : -Groupe témoin : implant en alumine poreuse revêtue d'hydroxyapatite ne contenant pas d'Antibiotiques - Groupe expérimental : implant en alumine poreuse revêtue d'hydroxyapatite contenant des Antibiotiques (gentamicine et vancomycine) / Objectifs secondaires : - doser la concentration locale (dans le drain) en antibiotiques chez les brebis opérées avec un implant chargé en antibiotiques - Evaluer la cinétique de concentration systémique en antibiotiques chez les brebis opérées avec un implant chargé en antibiotiques. - Documenter par imagerie l’intégration des 2 types d’implant par du tissu hôte de nature osseuse. Le projet se déroule sur 2 sites : un site où les interventions et suivi post opératoire immédiat auront lieu (site n°1) et un site où le soin de suite sera réalisé (site n°2). Puis les brebis retourneront sur le site n°1 pour la mise à mort et réalisation des prélèvements.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de documenter la colonisation de l’implant par le tissu hôte ("l'ostéo-intégration" de l’implant sternal) qui est une propriété fondamentale pour un implant de réparation/remplacement sternal (tolérance à long-terme, résistance à l’infection). Ce processus dure plusieurs semaines à plusieurs mois. Grâce à l'explantation du bloc sternum-implant à l'issue de la procédure (à 3 mois et 6 mois), ce projet permettra de réaliser une évaluation anatomopathologique du processus d’ostéo-intégration de l’alumine poreuse revêtue d'hydroxyapatitevia des analyses macroscopiques (des photographies seront réalisées), microscopiques et histologiques des pièces opératoires. De plus, certains implants étant chargés en antibiotiques, ce projet permettra d'observer d’éventuels effets sur ce phénomène de la diffusion locale initiale de gentamicine et de vancomycine. L'imprégnation de l'implant en antibiotiques permet leur diffusion locale dans des tissus inflammatoires et remaniés. Cela permet une action antibactérienne locale plus difficilement accessible par voie orale ou par injection. Dans ce sens l'implant sternal imprégné d'antibiotiques permet de répondre aux deux problématiques de l'ostéite sternale post sternotomie à savoir la stabilisation de la cage thoracique après exérèse large et complète de tissus infectés et nécrosés ainsi que l'implantation d'un matériau résistant à l'infection, dans un milieu septique, permettant de traiter une éventuelle colonisation bactérienne résiduelle. Les dosages en antibiotiques dans le drain et le sang veineux des lots expérimentaux les premiers jours post-implantation permettront de s'assurer de la diffusion locale à haute concentration de gentamicine et de vancomycine et vérifier l'absence de diffusion dans l'ensemble du corps

Procédures

Les animaux auront tous une procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée estimée à 1h). Puis 6 prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile (H3-H6-H12-H24-H48-H72), estimé à 10 minutes chacun. Le jour de la fin de procédure (soit à 3 mois ou à 6 mois selon le lot) et donc de mise à mort, les animaux toujours sous anesthésie générale pourront être utilisés à des fins de formation des internes de chirurgie via la réalisation d’une procédure chirurgicale, encadrée par un médecin sénior. Le projet se déroule sur 2 sites, les brebis seront donc déplacées pour 3 trajets (30 minutes). Sur le premier site (appelé animalerie n°1) auront lieu la chirurgie, le suivi post-opératoire immédiat (jusqu'au jour 4 environ, ou plus selon l'état de santé de l'animal) puis la mise à mort. Le second site (appelé animalerie n°2) est le fournisseur des animaux. Après avoir été opérées et surveillées en post-opératoire au sein de l’animalerie n°1, les brebis retourneront vers l'animalerie n°2 pour tout le temps du suivi (soit de 3 mois à 6 mois selon les lots). Elles seront réacheminées sur l'animalerie n°1 pour la mise à mort.

Impact sur les animaux

Un stress modéré peut être engendré lors de chaque manipulation : tonte avant les anesthésies, lors des prises de sang et lors des transports et changements de lieu. La présence d’un drain de Redon (sur 3 jours), avec un flacon plastique maintenu sur le dos par un bandage, peut gêner l’animal dans ses déplacements. Du fait de l'intervention chirurgicale, des douleurs post-opératoires sont possibles (prises en charge selon le protocole prévu).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure (même ceux utilisés dans le cadre de formation d’internes en chirurgie, décrit dans un dossier particulier), le prélèvement de la pièce anatomique étant nécessaire pour effectuer des analyses sur l’implant, et n’étant pas compatible avec le réveil de l’animal.

Remplacement

L’objectif de l’étude est de pouvoir réaliser des analyses histologiques de la colonisation de l’implant sternal par le tissu hôte : cela nécessite impérativement le prélèvement de l’implant après colonisation, qui n’est pas possible in vitro ou chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à son minimum par lot (3 par lot). En cas de données insuffisantes, l’expérimentation pourra être renouvelée une fois. Par ailleurs, dans l’objectif de réduction du nombre d’animaux, et sur les recommandations du conseil scientifique de la plateforme, les animaux, lorsqu’ils seront sous anesthésie générale pour les prélèvements de fin de procédure (à 3 mois ou à 6 mois selon les lots), ne seront pas directement euthanasiés mais utilisés à des fins de formation des internes de chirurgie pour une à deux procédures expérimentales supplémentaires, sous anesthésie générale, avant l’euthanasie (projet ayant une autorisation APAFiS distincte).

Raffinement

Les brebis proviennent d’un éleveur agréé (site n°2) et seront acheminées vers la plateforme (site n°1) a minima 5 jours avant l’implantation (période d’acclimatation). La procédure d’implantation de l’implant sternal se déroulera intégralement sous anesthésie générale avec apport d’analgésie préopératoire et un ajustement des doses en cas d’apparition de signes de douleur ou de réveil (modification de la fréquence respiratoire). Les brebis seront surveillées en postopératoire immédiat sur le site n°1 puis seront transférées dans l’établissement fournisseur, également agréé (site n°2). Ces déplacements sont assurés par le site n°2, via un véhicule agréé au transport des ovins. Les animaux ne seront ramenés dans la structure n°1 pour la fin de procédure que quelques jours avant pour les maintenir au maximum dans cet environnement. Les animaux seront suivis quotidiennement quel que soit leur lieu d’hébergement. Une convention, précisant les attendus respectifs, sera signée entre les deux parties avant le début du projet. Une grille de scores est établie avec une vigilance sur l’atteinte de points limites.

Choix des espèces

Le modèle brebis a été choisi en fonction de la taille du sternum proche de celle de l’Homme. Des brebis adultes sont nécessaires afin d’avoir un stade de développement et une croissance maximale atteinte.

38 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : chacune reçoit une fois de la Listeria dans l'œil, et 20 d'entre elles subissent ensuite, éveillées et sous contention, une prise de sang par semaine pendant quatre semaines et des prélèvements vaginaux répétés. Les 18 autres passent par une étude pilote qui compare trois doses, pour trouver la plus faible qui installe la bactérie sans symptôme. Le porteur écrit que l'instillation va "certainement induire" une infection de l'œil et une inflammation de quelques jours, et que la bactérie peut provoquer fièvre, prostration, diarrhée, voire des complications neurologiques. Les résultats doivent fournir une "preuve de concept" pour analyser l'endomètre de femmes qui font des fausses couches à répétition, et un projet suivant sur la gestation des lapines est déjà annoncé.

Objectifs

La Listeria monocytogenes est une bactérie qui peut contaminer l’alimentation et induire chez la femme enceinte un accouchement prématuré ou une fausse couche. Il a été découvert ces dernières années, que la bactérie pouvait persister dans les cellules sans être détectable (dormance de la bactérie) par des méthodes classiques de bactériologie. Les objectifs du projet sont de mettre au point des outils et méthodes de détection de ces bactéries en dormance lorsqu’elles sont cachées dans les cellules en utilisant un modèle biomédical, ici la lapine. L’objectif est de définir la dose de Listeria, qui induit le portage de la bactérie mais sans symptôme de façon à tester les nouveaux outils de détection. Les résultats de cette étude, effectuée sur des lapines, permettront de valider les outils de détection de la Listeria et apporteront une meilleure connaissance des stratégies adaptatives développées par Listeria pour se cacher chez son hôte sans symptôme clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure connaissance des stratégies d’adaptation développées par Listeria monocytogenes pour se cacher (dormance) pendant plusieurs semaines, chez son hôte. Ces résultats serviront de preuve de concept pour étudier les échantillons d’endomètre humain prélevés chez des femmes présentant des fausses-couches à répétition.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure d’instillation oculaire (38 animaux, 1 seule fois, environ 3 minutes), prise de sang (2 ml, 1 fois par semaine pendant 4 semaines sur 20 animaux, environ 3 minutes) sur animal vigile, sous contention légère; à des prélèvements vaginaux (à 72h puis 1 fois par semaine sur 20 animaux), sur animal vigile, sous contention légère.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux liés à la Listeria qui peut induire comme signes cliniques : de la fièvre, une prostration, une perte d’appétit, des toubles digestifs (plutôt diarrhée) voire des complications neurologiques. Ces signes peuvent potentiellement apparaître dans un pas de temps limité dans la mesure où les doses de Listeria choisies ne doivent pas induire de symptomes cliniques. Cependant l’instillation oculaire de la Listeria va certainement induire localement, au niveau des yeux, une infection et une zone inflammatoire transitoire (quelques jours). Concernant les prélèvements, des prélèvements vaginaux et une prise de sang seront réalisées, nécessitant une contention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour plusieurs raisons : - infection à une souche de Listeria infectant l’espèce humaine - nécessité de prélever les tissus pour rechercher la Listeria entrée en dormance

Remplacement

Le recours à l’animal est indispensable puisqu'il s'agit d’étudier si le portage asymptomatique (hébergement sans exprimer de symptome de la maladie) de la Listeria est possible dans différents tissus, il peut donc y avoir des bactéries dans les tissus sans manifestation de signe clinique donc cela necessite de travailler sur organisme entier vivant pour prendre en compte la complexité des processus physiologiques engagés. Il n'est donc pas possible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou un modèle de simulation informatique.

Réduction

Lors de la conception du protocole expérimental, nous avons déterminé le nombre minimum d'animaux à utiliser. Pour cette raison, nous avons prévu une étude pilote pour définir la plus faible dose permettant d’induire un portage asymptomatique de la Listeria (3 doses testées, 18 animaux en tout). Ensuite, la plus faible dose retenue permettant un portage asymptomatique de la Listeria sera testée sur 20 animaux de façon à collecter tous les tissus et valider les tests de détection de la listeria. Nous avons prévu un maximum de 20 lapines pour pouvoir valoriser ces données. L’hypothèse du portage asymptomatique a été validée in vitro sur plusieurs types cellulaires en culture, toutefois la littérature n’a pas de recul sur la proportion de lapines chez lesquelles Listeria sera soit complètement éliminée (lapines guéries) ou soit entrée en dormance chez des individus asymptomatiques après cette infection, cas de figure recherché, ou encore mortelle (non attendu). Un premier lot de lapines sera exposé, en fonction de la réponse de ces lapines et si nécessaire, un 2nd lot sera exposé pour conforter les premiers résultats et compléter les effectifs.

Raffinement

Les lapines seront hébergées en cage individuelle mais avec un contact visuel avec les autres lapines. Ces cages disposent de plateformes pour se mettre en hauteur ou, dessous, de se cacher, des jouets en plastique, des cubes de foin ou des batons de bois à ronger, du papier kraft ciselé sont également mis à disposition. Les paramètres d'ambiance de l'animalerie sont contrôlés. Une acclimatation d’une semaine sera réalisée pendant laquelle les lapines seront habituées à la présence humaine, au change des cages et aux manipulations par le personnel. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé. Ce suivi inclura l’observation du niveau d’activité, le comportement, la posture au repos, l’apparence (pelage), l’alimentation, les mouvements à la sollicitation et la manipulation d’une zone douloureuse. De plus, l’évaluation de l’état de l’œil, à savoir si l’œil est propre et brillant, sera suivie. Si la lapine présentait une douleur élévée alors une décision serait prise en concertation avec le vétérinaire quant à un recours à la mise à mort de cet animal. Des points limites reposant sur une grille de score intégrant ces différents paramètres ont été établis. Ainsi l'ensemble de ce suivi nous permettra d’intervenir rapidement et de manière graduelle si des signes de souffrance apparaissaient.

Choix des espèces

L'objectif est de reproduire des expériences anciennes de contamination par la Listeria chez la lapine, par conséquent seule cette espèce peut être utilisée pour en explorer les mécanismes. A la suite de ce projet, notre objectif est d’explorer les effets de la Listeria rentrée en dormance sur la gestation. Or ce modèle est pertinent pour étudier le placenta dont la structure est plus proche de l’homme que celle des modèles rongeurs. Nous nous appuyerons sur ces résultats pour le futur projet, le cas échéant. Seules des lapines adultes seront utilisées car l’objectif est d’évaluer le portage asymptomatique de la Listeria chez des lapines pubères.

89 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est infecté par un virus de la maladie de Marek, hébergé en isolateur, puis subit des prélèvements répétés de sang et de plumes, pour étudier la réplication du virus dans la peau et les plumes. Le porteur indique que la maladie est "hautement contagieuse et fatale" et que certains oiseaux peuvent développer paralysie, lymphomes ou détresse respiratoire avant l'échéance prévue. Il justifie le recours à l'animal entier par la spécificité du follicule plumeux, qu'aucune méthode ne reproduit à ce jour.

Objectifs

Ce projet vise à étudier la biologie des virus virulents ou de virus vaccinaux de la maladie de Marek dans leurs tissus cibles, en particulier la peau et les plumes (associées ou non à leur follicule plumeux). Pour cela, nous utiliserons des virus mutants. Nous avons plusieurs objectifs scientifiques : (i) identifier les partenaires protéiques de protéines virales, (ii) identifier les cellules véhiculant le virus dans les follicules plumeux et décrire la formation des particules virales dans l’épithélium de ce tissu, (iii) identifier des cellules du follicule plumeux pouvant contribuer à la persistance du virus dans ce tissu, et (iv) développer d’une nouvelle méthode afin de vérifier la prise vaccinale à l’aide de prélèvements biologiques, comme les plumes. Ce projet a la particularité d’utiliser des méthodes innovantes de protéomique ou d’imagerie in situ.

Bénéfices attendus

Ce projet regroupe des approches innovantes afin de répondre à plusieurs questions de recherche relative à la biologie du virus de Marek et à ses vaccins, en particulier leur transmissibilité via les particules virales matures produites en quantité et excrétées, exclusivement au niveau des follicules plumeux. Les bénéfices sont donc à répartir sur plusieurs niveaux : (i) Maladie de Marek : Meilleure compréhension de la physio-pathologie de la maladie ; (ii) Protéomique : Établissement d’un protocole pour utiliser la technique de biotinylation de protéines à proximité (bioID) in vivo chez la poule, une méthode dont la faisabilité n’a jamais été décrite chez les oiseaux ; (iii) Virologie : Étude des mécanismes d’entrée et de persistance des virus aviaires dans la peau et les plumes ; (iv) Vaccinologie : Intérêt d’un vaccin DIVA contre la maladie de Marek afin d’évaluer la prise vaccinale.

Procédures

Injection du virus sur animaux vigiles par voie intramusculaire dans le bréchet, 1 fois. Prélèvements sanguins sur animaux vigiles = 2 fois. Prélèvements de plumes sur animaux vigiles = entre 2 à 5 fois selon l'expérience. Injection de substrat par voie sous-cutanée : 7 fois. Chaque injection dure entre 2 et 5 sec. Chaque prélèvement sanguin dure au maximum 5 sec. Les prélèvements de plumes dure 1s par plume.

Impact sur les animaux

1/Hébergement : L’hébergement des animaux en isolateurs est nécessaire dans le cadre des recherches portant sur le virus de la maladie de Marek. Cependant, l’hébergement en isolateurs peut induire une compétition sur les ressources alimentaires en fonction de la fréquence des nourrissages. Ce type d’hébergement réduit également considérablement la liberté de mouvement des animaux. 2/ Le développement de tumeurs induites par le virus de la Maladie de Marek (MDV) : La maladie de Marek est une maladie virale hautement contagieuse et fatale pour la majorité des animaux infectés. Il est possible même si rare, que des animaux développent les 1ers signes de la maladie de Marek un peu avant 28 jours. Parmi les symptômes possibles : fièvre, paralysie, mort subite, lymphome, perte de poids, perte de plumes, difficultés respiratoires, ailes pendantes, boiterie. 3/ Les injections intramusculaires et sous-cutanées peuvent entrainer une douleur au niveau du site d’injection. 4/ Les prises de sang et prélèvements de plumes entraineront un stress récurrent chez les animaux concernés. Ces manipulations entraineront également des douleurs ponctuelles. Les prises de sang peuvent être sources d’hématomes au site de prélèvement. Enfin, un animal dont la contention serait mal assurée pourrait se faire mal ou se blesser.

Devenir

les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de rélaiser des prélèvements sanguins et de tissus.

Remplacement

Le projet vise à étudier la biologie de Maladie de Marek avec des virus virulents ou de virus vaccinaux à partir de virus mutants dans les tissus animaux (sang, organes et plumes associées ou non aux follicules plumeux). Ce projet nécessite donc l'animal dans son entier aussi bien pour étudier des partenaires protéiques de protéines virales, que pour celle de la morphogenèse virale dans le follicule plumeux ou encore pour le développement d’une nouvelle méthode afin de vérifier la prise vaccinale à l’aide de prélèvements biologiques. Du fait notamment de l’unique spécificité du follicule plumeux pour la morphogenèse du virus, il n'existe aucune alternative de remplacement pour répondre à ce type de question scientifique à ce jour. De plus, les résultats de ces expériences serviront de référentiel en vue de développer des méthodes alternatives d’infection de follicules plumeux en culture ex vivo qui permettront de grandement limiter le nombre d’animaux requis pour les expériences concernant la morphogenèse virale dans la peau.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque lot a été établi afin d’être en conformité avec le principe de réduction des règles de bien-être animal et de manipuler un nombre d’échantillons suffisants et/ou pour établir si les différences mesurées entre lots sont statistiquement significatives et donc non dus au hasard. Les meilleurs tests statistiques seront appliqués dans les comparaisons des différents groupes pour permettre un traitement optimal des données. Pour l’expérience 1: Au minimum 2 animaux seront inoculés, même quand 1 seul animal aurait suffi ; étant interdit d’héberger 1 animal seul. Pour l’expérience 2 : Quand une cinétique sera effectuée, 1 animal sera requis par point, sauf pour le dernier point où 2 animaux seront requis pour respecter l’interdiction d’avoir un animal seul. Pour les expériences 4 et 5 : 3 animaux seront infectés par virus, ce qui est le minimum requis pour avoir des expériences interprétables, compte tenu des analyses de protéomique effectuées avec les échantillons collectés. Pour les expériences 6 et 7 : 10 animaux par lot est le minimum requis pour voir des différences statistiques entre virus WT et mutant.

Raffinement

Une visite des animaux est effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié afin de détecter l’apparition de signes anormaux liés à la santé et au bien-être des animaux, voire de maladie de Marek entre 21 et 28 jours, même si le développement de la maladie est rare avant 28 jours post-infection. Les animaux présentant des symptômes légers feront l’objet d’une surveillance accrue pour détecter l’apparition de nouveaux symptômes. Des points limites adaptés ont été définis pour la maladie de Marek. L’ensemble des gestes techniques est assuré par du personnel formé et compétent, ce qui limitera le stress des animaux. La contention est effectuée en douceur et les prélèvements sont le plus rapide possible. Les prélèvements de plumes et de sang sont réalisés simultanément pour limiter le stress. Le nombre de prélèvements sur animaux vigiles a été réduit au minimum pour limiter la manipulation et la souffrance liées aux prélèvements répétés. Dans le cas des prélèvements de plumes, de petites plumes en croissance seront prélevées, ce qui limite la douleur par rapport aux prélèvements de plus grosses plumes. Afin de limiter la douleur lors de l’inoculation du virus, nous utiliserons des seringues avec des aiguilles fines et courtes. Les injections seront réalisées sous PSM (poste sécurité microbiologique) avant l’entrée des animaux dans les isolateurs afin de faciliter la manipulation, notamment la contention des animaux et ainsi rendre l’injection plus simple et moins stressante pour les animaux.

Choix des espèces

La maladie de Marek est une maladie des Phasianidés, d'importance principalement dans l'espèce Gallus gallus (poule). Chaque année, des millions de doses de vaccins sont administrées aux poules dans le monde pour les protéger de la maladie, mais également contre d’autres maladies, car les souches de mardivirus (et notamment HVT) sont des vecteurs vaccinaux. Pour chaque expérience, les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à un âge maximum de 5 semaines.

160 cochons vont être utilisés, réutilisés ensuite dans d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir l'implantation chirurgicale d'une chambre vasculaire ou d'un cathéter, l'administration d'un candidat-médicament, des prélèvements de sang, d'urine et de biopsies, puis un isolement de 24 à 48 heures en cage à métabolisme. Le porteur décrit l'étude pharmacocinétique comme une étape "indispensable" avant l'administration à l'homme et affirme qu'aucune méthode de substitution in vitro ou in silico ne suffit. Il présente comme bénéfice pour l'animal une "amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée".

Objectifs

Le projet consiste à évaluer le profil pharmacocinétique d'un candidat médicament chez le porc grâce à des prélèvements répétés dans le temps d'échantillons sanguins et/ou d'urine et/ou de biopsies (par exemple de peau) chez le porc vigile, après administration du produit à tester. Le but est de mesurer la concentration du produit dans le sang et/ou l'urine et/ou dans les organes, et d'éventuels marqueurs biologiques après administration.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (porc) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Au maximum, un porc aura une implantation (chambre vasculaire ou cathéter central, chirurgies de moins de 2h) avec administration du produit à tester (

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échange avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les porcs de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture avant la chirurgie, un stress lié à l'anesthésie/sédation, un stress post-opératoire, un stress lié à la contrainte du cathéter veineux central ou de la chambre vasculaire, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h à 48h) pour la collecte d’urine, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le porc car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le porc est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 3 ou 4/ par groupe. Pour obtenir un nombre suffisant de données scientifiques, le nombre d’animaux qui sera utilisé est notifié dans le paragraphe portant sur le nombre estimé d'animaux utilisés. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole d'analgésie adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Animaux sevrés en croissance et animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.