Procédures modérées

Isolés dans des cages individuelles dès l'âge de 20 jours et jusqu'à la fin des procédures, 302 rongeurs diurnes de l'espèce Arvicanthis ansorgei passent deux électrorétinogrammes sous anesthésie, avant et après la période d'adolescence où l'équipe teste l'effet de la lumière bleue la nuit. Le protocole prévoit aussi sept tests comportementaux que le texte ne nomme pas, 15 à 20 jours d'obscurité constante, deux injections dans l'œil sous anesthésie, l'une pour tracer les voies de la rétine au cerveau, l'autre pour détruire les cellules à mélanopsine, et une chirurgie du cerveau de 30 à 45 minutes suivie d'une injection dans l'abdomen. Avec ces procédures, d'un niveau de souffrance modéré, l'équipe veut vérifier si la lumière bleue nocturne à l'adolescence favorise des troubles du rythme, de l'humeur et de la cognition à l'âge adulte, effets qu'elle dit attendre, "objet même de la question". Tous sont tués à la fin pour prélever leur rétine et leur cerveau.

Objectifs

Le cycle lumière/obscurité de 24 heures de l’environnement synchronise l’horloge biologique du cerveau. La lumière exerce à la fois des effets positifs et négatifs en fonction de ses caractéristiques (moment d’exposition, durée, intensité spectre, etc…). La littérature montre qu’une exposition aberrante à la lumière, c’est-à-dire une exposition la nuit notamment dans la région bleue du spectre, altère les rythmes de l’organisme, la cognition et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'Homme. Un candidat clé pour la médiation des effets de la lumière sont les cellules à mélanopsine localisées dans la rétine. En effet, la lumière pénètre dans l’organisme au travers la rétine, et est captée par un type de cellules particulier : les cellules photoréceptrices à mélanopsine. Ces cellules permettent la conversion du signal lumineux en un signal biochimique, transmissible alors à d’autres cellules. Ici, le signal sera transmis jusqu’aux structures du cerveau qui régulent les rythmes biologiques, l’humeur et la cognition. Les adolescents présentent un risque particulier à l’exposition nocturne à la lumière bleue car l'apparition de la plupart des maladies mentales surviennent avant l'âge de 25 ans et ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue la nuit pendant l'adolescence va contribuer au développement de troubles circadiens, affectifs et cognitifs à l'âge adulte. Afin de vérifier cette hypothèse, notre étude sera réalisée sur un modèle de rongeur diurne : Arvicanthis ansorgei. (La physiologie de l’homme étant diurne, l’utilisation de cette espèce de rongeur est plus pertinente que les rongeurs habituellement utilisés en laboratoire telle que les rats ou les souris, ayant une physiologie nocturne). Les objectifs sont de déterminer : 1) Impact de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur le système circadien, l'humeur et la cognition à l'aide de différents tests comportementaux validés. 2) Conséquences de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur la rétine, son fonctionnement et ses projections vers le cerveau. 3) Caractérisations des effets de la lumière bleue dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine, régulant le système circadien, l'humeur et la cognition. Cette analyse multidimensionnelle, allant de la cellule au comportement de l’animal, aura des résultats déterminants aux niveaux fondamental et clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l’adolescence sur le développement des troubles circadiens, affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Les données obtenues permettront d’élaborer de nouvelles stratégies pour limiter les effets délétères d’une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents.

Procédures

Afin de définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte 4 types d'interventions. La première est appelée l'électrorétinographie (ERG) et permet d'évaluer la fonction visuelle. Le test est identique à celui pratiqué chez l'homme, sauf que l'animal doit être endormi le temps des enregistrements. Les tests durent environ 45-60 minutes, et auront lieu à deux reprises : un ERG avant l'exposition à la lumière en guise de contrôle, et un second après l'exposition à la lumière, pour évaluer son impact. Ensuite, les animaux seront soumis à 7 tests comportementaux validés permettant d'étudier l'effet de la lumière sur leur système circadien, l'humeur et la cognition. La durée d'un test est variable et dépend du nombre d'animaux à faire passer. (Environ 5 minutes pour un animal) Afin d'étudier l'implication des cellules à mélanopsine de la rétine dans la médiation des effets induits par la lumière, les animaux seront soumis à différentes injections oculaires : une injection comportant une molécule appelée "traceur" permettant de marquer les voies de projections allant de la rétine jusqu'au cerveau, et une seconde comportant deux autres types de molécules, permettant d'une part leur fixation spécifique aux cellules à mélanospine (épargnant toutes les autres), et d'autre part, leur destruction. Ces deux injections oculaires se feront sous anesthésie générale et analgésie. Enfin, afin de vérifier l'implication d'une structure cible du cerveau impliquée dans la régulationd e l'humeur et de la cognition, nous allons réaliser une chirurgie sur animaux anesthésiés, dans laquelle nous injecterons des molécules pharmacologique pour moduler l'activité de cette structure d'intérêt. La durée totale de la procédure varie entre 30 et 45 minutes. Après récupération de l'animal, un activateur de ces molécules sera administré par injection dans la cavité abdominale, et permettra de d'inhiber le type de neurone dans la structure d'intérêt.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances listées ci-dessous : 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien, visuel, de l’humeur et de la cognition (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs, hébergés habituellement en groupe. 3) Afin d’évaluer les paramètres de leur système circadien (horloge biologique), les animaux seront placés pendant 15-20 jours à l’obscurité constante. Le placement de l’animal en obscurité constante est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien, ce qui n‘induira aucune nuisance chez l’animal. 4) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur et la cognition, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 5) Les animaux seront soumis à des anesthésies, des injections dans l'oeil, ainsi qu'à des chirurgies cérébrales susceptibles d’induire une douleur modérée, un risque infectieux et/ou inflammatoire, une perte de poids, etc. 6) Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…)

Devenir

Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière durant l’adolescence sur le système circadien, visuel, la cognition et l’humeur. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) et longitudinales (ERG) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification et baton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le choix de notre modèle animal s'est porté sur l'espèce de rongeur Arvicanthis ansorgei. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères d'une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents (P20), afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'homme. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (P20) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur le système circadien, l’humeur et la cognition au stade adulte (P40).

484 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus Langat, subissent une petite incision de la queue chaque jour pendant quinze jours et sont exposées à des piqûres de tiques pendant plusieurs jours, pour étudier la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tiques. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, poil ébouriffé et paralysie des membres postérieurs, et affirme que les piqûres de tiques sont "indolores". Il conclut qu'il est "très difficile voire impossible" de reproduire cette transmission vectorielle in vitro.

Objectifs

Le virus de l’encéphalite à tique (TBEV) est présent dans les glandes salivaires de la tique avant d’être transmis par la salive de la tique lors du gorgement sur un hôte vertébré. Les tiques vectrices appartiennent à différentes espèces : Ixodes ricinus à l'ouest (sous-type européen) et Ixodes persulcatus (sous-types sibérien et extrême-oriental) Les humains sont des hôtes accidentels qui jouent un rôle insignifiant dans l'épidémiologie de la maladie. L'infection par le sous-type de l'Extrême-Orient peut être plus grave, 20 à 40 % des patients développant une maladie neurologique sévère avec un taux de létalité de 20 à 40 % pour ceux qui progressent. L'étude de la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tique par les tiques revêt plusieurs intérêts importants : 1. Prévention et sensibilisation : Comprendre la vitesse de transmission du virus TBE permet de sensibiliser les populations vivant dans des zones à risque et de leur fournir des informations précises sur les mesures de prévention. 2. Détection précoce : En comprenant combien de temps il faut pour que le TBEV soit transmis, les professionnels de la santé peuvent être mieux informés pour diagnostiquer rapidement les cas d'encéphalite à tique chez les personnes mordues par une tique infectée. 3. Développement de vaccins : L'étude de la vitesse de transmission du virus TBE peut aider à orienter la recherche et le développement de vaccins efficaces. 4. Évaluation des risques : L'analyse de la vitesse de transmission du virus TBE par les tiques peut aider à évaluer les risques associés à certaines régions géographiques ou à certaines espèces de tiques. Cela permet aux autorités sanitaires de mettre en place des mesures de surveillance et de prévention ciblées pour réduire la propagation de la maladie. 5. En résumé, étudier la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tique par les tiques est essentiel pour la prévention, le diagnostic précoce, le développement de vaccins et l'évaluation des risques.

Bénéfices attendus

Le risque d'infection par le virus de l'encéphalite à tiques (TBEV) après une morsure de tique reste largement inconnu. L’étude de la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tique par les tiques est essentielle pour la prévention, le diagnostic précoce, le développement de vaccins et l'évaluation des risques. Ces informations sont essentielles pour lutter contre l'encéphalite à tique et minimiser son impact sur la santé publique.

Procédures

Le virus sera injecté une fois en début de procédure. La durée de l’injection est de quelques secondes. Des prélèvements seront réalisés tous les jours à la queue après une petite incision pendant 15 jours consécutifs. Chaque prélèvement ne dure que quelques secondes. Un prélèvement final sera réalisé par voie rétro-mandibulaire juste avant la mise à mort (30 secondes). Les souris seront exposées à des piqûres de tiques pendant 4-5 j pour les larves et les nymphes et environ 7 jours pour les adultes. Les piqûres de tiques sont indolores pour l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux infectés peuvent présenter selon la dose de virus des symptômes qui peuvent consister en une perte de poids, un malaise se traduisant par un poil ébouriffé et une perte de vivacité, une atteinte neurologique se manifestant par une paralysie des membres postérieurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par un virus.

Remplacement

La transmission vectorielle est un phénomène complexe. Elle nécessite de bien comprendre les interactions entre le vecteur : la tique, le virus et l’hôte vertébré. La tique transmet l’agent pathogène lors d’un repas de sang au cours duquel le virus, une fois amplifié dans les glandes salivaires se transmet dans la salive de la tique. Or cette salive possède de nombreux rôles dont certains permettent de moduler la réponse immunitaire de l’hôte vertébré. L’agent pathogène est alors moins bien reconnu par le système immunitaire et peut donc mieux se développer. Il est donc très difficile voire impossible de mimer cette interaction in vitro sur des cellules. Le modèle animal est donc beaucoup plus pertinent.

Réduction

Nous envisageons lors de la première procédure de travailler sur un petit nombre d’animaux par groupe (8 animaux des deux sexes) afin de déterminer la dose de virus adaptée à notre expérience soit un sous-total (par expérimentation) de 108 individus répartis en 2 cages par groupe (4 individus de sexe différent par cage). Dans le cadre de la deuxième expérience, nous prévoyons d’utiliser de 20 à 24 individus par groupe. Dans le cadre de la troisième expérience, nous utiliserons 10 souris par groupe, soit un effectif total de 20 souris par expérience, ce qui nécessitera d’utiliser des tests statistiques non paramétriques. En prenant en compte un effet cage, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, des résultats significatifs pour effets forts à très forts.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques. Plusieurs points limites ont été définis. Lorsque le premier point limite sera atteint, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du gel hydrique sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement important ou bien si leur mobilité diminue. Les animaux seront mis à mort lorsque les points limites terminaux seront atteints. Des igloos en carton ou du coton seront mis à disposition dans chaque cage, afin que les animaux soient dans une ambiance confortable.

Choix des espèces

Nous souhaitons posséder un modèle simple d’infection de tiques sur des souris. Il est nécessaire qu’il s’agisse d’un modèle proche de la réalité de la transmission par des vecteurs. L’utilisation de membranes de gorgement n’est pas satisfaisant car elle ne mime que très partiellement la transmission naturelle. Les souris sont des animaux déjà retrouvés infectés dans la nature par le virus de l’encéphalite à tique. Les souris seront des mâles et femelles âgés de 4 à 7 semaines car il a été montré à travers la littérature que les jeunes souris développaient une meilleure allure de la courbe de l’infection, à savoir, plus lente et progressive permettant ainsi de pouvoir avoir le temps d’apposer nos tiques et qu’elles se mettent en gorgement avant le pic de virémie. Par ailleurs, les souris seront observées pendant 15jours.

8 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une réutilisation ou un placement en retraite envisagé à l'issue. Ils subissent deux chirurgies dont une craniotomie de six heures, une stimulation transcrânienne par ultrasons, des enregistrements d'électrophysiologie et d'imagerie sur animal vigile, la tête fixée par un plot implanté, dans le cadre d'un contrôle hydrique pouvant provoquer une sensation de soif. Le porteur reconnaît que la stimulation peut induire une gêne et une "brûlure superficielle de la peau" et que les marges des implants sont des zones d'infection potentielle. Il affirme que les primates non humains sont "le seul choix possible" de modèle et prévoit huit animaux, ramenés à six "si tous coopèrent".

Objectifs

L’adaptation comportementale repose sur plusieurs processus importants: établir la valeur des stimuli de l’environnement, des buts à atteindre et des actions en fonction de l’état interne du sujet, sélectionner un comportement et évaluer ses conséquences. La nécessité d’agir dans un contexte sociale implique la prise en compte d’information relative aux valeurs et intentions d’autres agents biologiques. Notre objectif vise à mieux comprendre les interactions au sein de larges réseaux neuronaux dans la régulation flexible de nos comportements. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une region considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Pour cela, il est indispensable 1) d’identifier les relations anatomo-fonctionnelles entre les régions du lobe frontal et temporal, 2) d’étudier l’implémentation des mécanismes de l’adaptation comportementale au niveau neuronal et 3) de comprendre le rôle causal de ces différentes structures sur le fonctionnement intégré de ces réseaux. Ceci nécessite une combinaison d’approches d’imagerie et d’électrophysiogie, dont certaines invasives. Les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs, pour conduire le projet proposé. Ce projet sera réalisé dans 3 étab lissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Une caractéristique de notre survie dans le monde réel est notre capacité à faire preuve d'adaptation comportementale. Les primates en général et les humains en particulier sont très efficaces pour extraire rapidement les signaux informatifs de l'environnement social et non-social, et les intégrer aux conséquences de leurs actions, afin de maintenir ou de modifier si besoin leurs décisions. Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui vise à comprendre les mécanismes par lesquels les différentes régions du cortex frontal et temporal interagissent et comment elles contribuent aux comportements adaptifs en contexte social et non social. Le principal bénéfice attendu sera donc l’amélioration des connaissances scientifiques qui découleront de la réalisation des expériences de ce projet. 1. Le projet nous permettra de mieux d’identifier les circuits neuronaux et les mécanismes physiologiques qui supportent l’expression de comportements adaptatifs. 2. Le projet nous permettra de comprendre comment les perturbations de ces interactions préfronto-temporales conduisent à des altérations des processus cognitifs supportant les comportements adaptatifs Des bénéfices secondaires pourraient inclure des hypothèses en recherche clinique dans le domaine de la neuropsychiatrie. 3. Le projet nous permettra de mieux comprendre le couplage neuro-vasculaire Des bénéfices secondaires pourraient inclure une meilleure utilisation translationnelle des données d’électrophysiologie obtenues chez le singe aux données de neuroimagerie obtenues chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 actes chirurgicaux pour permettre la stimulation transcranienne par ultrasons et la collecte des données d'électrophysiologie et d'imagerie chez l'animal vigile. Les chirurgies seront réalisées après entrainement aux tâches comportementales. Une première chirurgie implantatoire permettra de réaliser les procédures de stimulation transcranienne et d'imagerie par résonance magnétique. Ce type de chirurgie dure en moyenne 4h. La seconde chirurgie sera réalisée à l’issue de la collecte des données d’imagerie fonctionnelle dans ces mêmes tâches. Elle est nécessaire pour la réalisation des procédures d'électrophysiologie et d'imagerie par ultrason. Ce type de chirurgie implantatoire nécessite la réalisation d’une craniotomie et sont plus longues (durée moyenne = 6h). Toutes les actes seront réalisés dans l'EU1, sauf la collecte de données CT préalable aux chirurgies qui sera réalisée dans l'EU3, et les chirurgies qui seront réalisées dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales pour les deux neurochirurgies et au moins un examen en neuroimagerie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d’une chambre d'enregistrement. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. Les marges des implants constituent des zones d’infection potentielle qui seront maitrisés par une surveillance régulière des implants et par l’administration de soins appropriés. Les singes travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis, ou en position dite du sphinx dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et plutôt bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les singes seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions. La stimulation ultrasonore peut induire une sensation de gêne lors de son application. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée. La stimulation ultrasonore peut induire une brûlure superficielle de la peau. Une modélisation au préalable des variations thermiques engendrées par la stimulation préviendra de cet effet négatif potentiel.

Devenir

La potentielle réutilisation des animaux en fin de protocole sera prise en accord avec la vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être utilisés, un placement en retraite sera considéré.

Remplacement

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une région cérébrale considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Sur la base de critères anatomiques et cognitifs, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal pour conduire le projet proposé. Il n'existe pas d’alternative qui permette d'obtenir des informations similaires à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, ou des modèles animaux non-primates.

Réduction

Contrairement à la neuroimagerie chez l’humain qui nécessite un grand nombre de sujet (n>20), les protocoles chez le primate non-humain bénéfient de la possibilité de répéter les sessions chez un même sujet. Chez le singe, 3 est également le nombre minimal d'animaux par étude sur lequel la communauté scientifique s'accorde. Dans le cadre du présent projet, il est important de prendre en compte le facteur social : dominants vs dominés. Nous travaillerons donc sur 2 groupes de 3 sujets. Cependant il arrive parfois que des animaux s’accommodent mal au travail en chaise de contention, ou ne tolèrent pas les implants. Nous envisageons le besoin de 8 animaux mais nous nous arrêterons à 6 si tous les animaux coopèrent, apprennent les tâches comportementales et tolèrent les implants.

Raffinement

Chaque animal reçoit un long pré-entrainement par renforcement positif pour l'habituer à la vie au laboratoire (nettoyage des volières, pesées régulières, etc.). Des protocoles d’enrichissement de l’environnement sont développés pour stimuler l’animal et lui permettre d’exprimer au mieux son répertoire comportemental en dehors des phases de collecte de données. L’utilisation de station de travail mobile permettra de réaliser certaines phases du conditionnement dans les volières des animaux. Un raffinement continu est également pratiqué pour développer des implants moins invasifs et moins sensibles aux infections. L’optimisation des techniques d’enregistrements électrophysiogiques permettra de réduire la phase de collecte des données. Tout sera mis en œuvre pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal grâce aux différentes mesures mises en place dans l’animalerie (hébergement en groupe social, enrichissement, etc.) et un suivi médical régulier de l’animal (perte de poids, alopécie), et des implants sera mis en œuvre (signes d’infections). Un suivi medical plus spécifique sera également mis en oeuvre post intervention chirugical.

Choix des espèces

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex préfrontal. Cette région est considérée comme une specificité de l’organisation cérébrale des primates. Les expériences présentees sont invasives. La combinaison des approches proposées permettront l’obtention d’informations fondamentales impossible à obtenir avec d'autres techniques, et impossible à réaliser chez l’humain. Notre recherche porte sur des animaux post-puberté (>4ans)

5 734 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur dans la moelle osseuse ou les ganglions, sont manipulées quotidiennement pour suivre la tumeur et, pour certaines, subissent une chirurgie d'imagerie de 30 minutes avant d'être maintenues sous anesthésie sans réveil, pour étudier l'action des immunothérapies dans les cancers du sang. Le porteur affirme que les souris "rencontrent peu d'effets indésirables" tant que le taux de cellules tumorales est maîtrisé. Il conclut que les tests in vitro "ne permettent pas de récapituler la complexité" des réponses immunitaires observées in vivo.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de s’appuyer sur l’imagerie d’animaux entiers afin (1) d’analyser l’organisation de la réponse immunitaire anti-tumorale et (2) d’identifier le mode d'action des traitements cancéreux ainsi que de leurs répercussions sur l’organisme. Pour cela nous tenterons d'identifier le rôle de chacune des populations cellulaires retrouvées au sein d'une tumeur (ex. les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes T). Nous tenterons d'évaluer leur contribution directe ou indirecte sur l’efficacité de l’immunothérapie. Enfin, nous souhaitons mettre en lumière les limitations de ces thérapies afin d’apporter de nouvelles hypothèses de travail pour l’amélioration des traitements. En résumé, ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’utilisation des immunothérapies dans les cancers du sang, au moyen/long terme, à l’amélioration de la prise en charge des patients en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettra d’apporter des connaissances essentielles sur le mode d’action d’immunothérapies actuellement utilisées en clinique ou en cours de développement pour le traitement des cancers du sang (lymphomes & leucémies) et pour lesquelles une majorité des patients rechutent ou ne répondent pas. Comprendre les raisons pour lesquelles ces immunothérapies guérissent seulement une petite fraction des patients est alors primordial afin d’en générer de nouvelles de plus grande efficacité ou d’identifier les patients à même de répondre positivement au traitement. A court terme, ce projet offrira des pistes de travail pour générer des immunothérapies capables de contourner les limitations que nous aurons identifiées et donc avec une meilleure efficacité. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles combinaisons thérapeutiques ou de nouvelles thérapies pour traiter la majorité des patients atteints de cancer solide et améliorer leur espérance de vie.

Procédures

La greffe de la tumeur consistera à une injection de quelques secondes au début de l’expérience. Les animaux seront ensuite manipulés quotidiennement pour mesurer la pousse de la tumeur. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30minutes pour effectuer de l’imagerie et seront ensuite maintenus endormis pendant 2 à 3h mais cette procédure sera sans réveil.

Impact sur les animaux

Notre projet propose d’étudier les immunothérapies anti-tumorales et nécessite donc la greffe de tumeur aux souris dans les organes immunitaires tels que la moelle osseuse ou les ganglions lymphatiques. Cet objectif sera atteint par l’injection des cellules. Le bien-être de chacune des souris sera contrôlé fréquemment. Notre connaissance précédente suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables tant que le pourcentage de cellules tumorales circulantes est maitrisé. Leur mobilité semble inchangée, elles ne perdent pas de poids, leur pelage reste soyeux et leur comportement demeure inchangé. L’injection des thérapies que nous proposons d’étudier dans ce projet pourra ne pas causer d’effets indésirables ou avoir un effet à court terme (24-72h) par exemple sur la température corporelle de l’animal liée à l’élimination des cellules tumorales. Des mesures pour soulager l’inconfort des animaux seront mises en place et sont décrites plus loin dans ce protocole.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales.

Remplacement

De nombreuses expériences seront validées au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires 2D ou des organoïdes (Structures 3D mimant les certains aspects des tumeurs solides in vivo) et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier le mode d’action de la thérapie in vivo. Différentes doses seront utilisées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier le mode d’action de la thérapie in vivo. Une telle approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieu in vivo. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action de certaines thérapies.

Réduction

L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dès que possible, les expériences de cytométrie et de dosage protéiques ou d’imagerie seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation. D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec des statisticiens, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. Selon les procédures, les paramètres évalués seront variables, cela entraine des nombres de groupes variables que nous avons optimisés et réduits au maximum pour obtenir des résultats significatifs tout en prenant en compte la variabilité de la croissance tumorale. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de cancer et auront reçu un traitement anti-tumoral. Enfin, si nos études de cytométrie ne donnent pas les résultats attendus, les autres expériences ne seront pas réalisées. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet seront réduits.

Raffinement

Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (poil ébouriffé, prostration, pourcentage de tumeur circulante) sont établis pour raffiner les procédures et soulager les animaux à l’aide d’antalgiques. Par ailleurs, ils seront mis à mort si la souffrance persiste. Pour la pousse de tumeur, le sang des animaux sera prélevé afin d’évaluer le pourcentage de cellules tumorales circulantes. Nous savons qu’un certain niveau de cellules circulantes dans le sang d’une souris immunocompétente peut servir de limite et correspond à une taille limite de masse tumorale dans la moelle osseuse avant impact de la tumeur sur le bien-être de l’animal. Après l’administration de l’immunothérapie, la température corporelle de l’animal sera mesurée afin de s’assurer d’une bonne tolérance au traitement. Concernant les interventions chirurgicales pour l’imagerie intravitale, l’animal sera administré en amont de l’opération avec une dose d’antalgique afin de minimiser la douleur. L’animal sera anesthésié sur plaque thermo contrôlée pour limiter la perte de chaleur corporelle. Pour les expériences non terminales, la cage sera supplémentée avec du gel hydrique et la litière pourra être remplacée par une litière en cellulose en post-chirurgie pour améliorer le confort de l’animal. Une injection d’antalgique sera renouvelée pendant les premières 48h.

Choix des espèces

La complexité du système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain. Tous les animaux utilisés dans ce projet de recherche seront adultes (>5 semaines). Notre étude s’effectue sur un système immunitaire adulte afin de se rapprocher au mieux de la clinique et des patients porteurs de ces cancers.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisses et en sucre pendant 23 semaines, six séances d'imagerie sous anesthésie avec injection d'un radiotraceur et des tests comportementaux d'activité motrice, de dépression et d'anxiété, pour étudier par imagerie l'atteinte cérébrale liée à une maladie du foie. Le porteur décrit comme effets attendus une prise de poids et un possible stress au réveil des anesthésies. Il affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour cette approche globale et présente le rongeur comme le "modèle de choix".

Objectifs

La NAFLD (acronyme anglais, non-alcoholic fatty liver disease) regroupe un large spectre de maladies hépatiques chroniques caractérisées par une accumulation excessive de graisses dans le foie (stéatose) sans lien avec l’alcool, et qui touchent environ 25% de la population générale et 80% des personnes en obésité morbide. Dans certains cas, la maladie évolue vers la stéatohépatite non alcoolique (NASH, acronyme anglais non-alcoholic steatohepatitis), une forme sévère et irréversible avec inflammation. Cette forme agressive de la maladie favorise l’accumulation de fibrose et peut évoluer vers la cirrhose et ses complications, principalement cardiovasculaires. Cette maladie hépatique est désormais reconnue comme un dysfonctionnement multisystémique, c’est-à-dire que le mauvais fonctionnement du foie entraine le mauvais fonctionnement d’autres organes, comme le cerveau. L’encéphalopathie hépatique est la complication la plus fréquemment décrite et des études ont mis en évidence l’impact de l’obésité et d’une mauvaise alimentation sur le fonctionnement cérébral et cognitif. Cependant, les mécanismes cérébraux sous-jacents restent inconnus à ce jour. L’imagerie fonctionnelle offre la possibilité d’explorer in vivo certains des mécanismes élémentaires qui affectent le fonctionnement cérébral tels que le métabolisme cérébral, la densité synaptique ou l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’objectif de ce travail est de mettre en œuvre ces méthodes d’imagerie déjà développées et appliquées dans notre laboratoire, à un modèle rongeur NAFLD/NASH bien caractérisé afin d’identifier les mécanismes physiopathologiques à l’origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans cette maladie hépatique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier les différents mécanismes physiopathologiques impliqués dans le dysfonctionnement cérébral observé dans la NAFLD/NASH, et d’établir un score de corrélation entre ces dysfonctionnements cérébraux et les comportements observés chez ces animaux. Cela permettra également d’identifier quelle(s) méthode(s) d’imagerie sera la plus pertinente pour continuer le développement de cette approche chez l’homme. A plus long terme, cela permettra d’envisager l’étude de cette pathologie in vivo chez des patients atteints par ces pathologies avec pour objectif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : -Administration d’un régime alimentaire enrichi en graisses et sucre, pendant 23 semaines. -Réalisation de sessions d’imagerie (6 par animale) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum,) -Injection d’un radiotraceur (1 minute) -Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux ( 5/animale) afin de mesurer l'activité motrice qui dure 30 minutes, la dépression qui dure 6 minutes et l’anxiété qui dure 5 minutes. -

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : - Accumulation de gras dans le foie (asymptomatique) et prise de poids - Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. - Stress possiblement induit par les tests de comportement

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédure afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’atteinte multisystémique d’une maladie hépatique. Un modèle animal est indispensable afin d’envisager cette approche globale de la pathologie. Le modèle rongeur NAFLD/NASH est le modèle de choix pour cette approche car déjà largement utilisé pour l’étude de cette maladie avec une atteinte cérébrale mise en évidence par certaines études. Le choix du rongeur est également adapté aux différentes expérimentations envisagées (imagerie et comportement) qui pourront être conduites aisément avec ces animaux.

Réduction

L’utilisation des différentes modalités d’imagerie permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, un même animal passera plusieurs examens d’imagerie sur plusieurs jours d’une même semaine (2 au maximum). Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique.

Raffinement

Les souris, âge de 4 semaines, seront hébergés par groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Une semaine d’acclimatation est prévue au début de leur séjour et avant de débuter le régime alimentaire HFHSD. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Les animaux traités par le régime HFHSD feront l’objet d’une surveillance journalière et d’un suivi hebdomadaire du poids au cours du traitement. Toutes les interventions invasives (injections intraveineuses) sont réalisées sous anesthésies générales par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. .

Choix des espèces

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact sur le cerveau d’affections hépatiques. La souris est l’animal de choix car plusieurs modèles ont déjà été développés sur cette espèce pour reproduire des dysfonctionnements observés dans cette pathologie. Cette espèce présente également l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP et IRM ainsi qu’à l’étude comportementale. Les souris utilisées seront au stade adulte quand le cerveau a atteint sa maturité et son développement complet (5 semaines à 8 semaines).

382 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées, jusqu'à 33 injections intrapéritonéales et plusieurs prélèvements de sang, une infection par le cytomégalovirus murin et un traitement anti-rejet pouvant provoquer une toxicité rénale, pour étudier la réponse immunitaire au virus dans un contexte de greffe. Le porteur indique que l'infection peut causer perte de poids, prostration, hépatite ou colite chez les souris sous traitement anti-rejet. Il affirme que ce projet "ne peut être mené sans" animaux, la réponse immunitaire ne pouvant selon lui se reproduire in vitro.

Objectifs

Suite à une transplantation d'organe, les patients sont à risque de faire un rejet de l’organe transplanté. Pour prévenir le rejet, ils doivent prendre un traitement anti-rejet pendant toute la durée de leur transplantation. Ce traitement affaiblit l’ensemble de leur système immunitaire, les exposant à faire des infections plus nombreuses et plus graves. L’infection virale la plus fréquente après une transplantation est l’infection au cytomégalovirus. Le cytomégalovirus est un virus très commun dans la population générale. Lorsque l’on s’infecte pour la première fois avec ce virus quand on est en bonne santé, on a peu ou pas de symptômes car une réponse immunitaire anti-virale efficace se développe rapidement pour limiter la multiplication du virus. Le virus devient alors dormant (c’est-à-dire à l’état de latence) pendant toute notre vie dans différents organes comme les reins, le foie, le cœur, les poumons. Quand un patient n’ayant jamais rencontré le cytomégalovirus est transplanté avec un organe d’un donneur chez qui le virus est présent, le patient n’est pas toujours capable de monter une réponse immunitaire efficace contre le virus du fait des traitements anti-rejet. L’infection au cytomégalovirus peut alors conduire à des complications graves et peut avoir des répercussions sur le fonctionnement et la survie du greffon. L’objectif de ce projet est d’étudier la réponse immunitaire dirigée contre le cytomégalovirus dans un contexte similaire à la transplantation. Nous nous interesserons en particulier à l’impact des différents traitements anti-rejet sur cette réponse ainsi que des différences génétiques entre donneur et receveur. Pour atteindre ces objectifs, il est prévu de développer un modèle dans lequel des cellules provenant d’organes de souris "donneuses" infectées de manière latente par le cytomégalovirus murin seront injectées à des souris "receveuses", traitées ou non par un traitement anti-rejet et n’ayant jamais été en contact avec le virus. Nous utiliserons des souris donneuses génétiquement différentes des souris receveuses afin de mimer au mieux ce qui se passe après une transplantation d’organe lorsque le receveur reçoit un organe infecté par le cytomégalovirus provenant d’un donneur génétiquement différent. La réactivation et la dissémination du virus seront étudiées dans les différents organes de la souris receveuse. Nous monitorerons aussi la réponse immunitaire dirigée contre le cytomégalovirus dans ce contexte particulier.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre comment le cytomégalovirus est transmis au receveur lors d’une transplantation d’organes et le rôle des différents acteurs immunitaires et leur importance respective dans la résolution de l’infection à cytomégalovirus chez les patients transplantés. Ces données nous aideront à savoir comment moduler cette réponse afin de la rendre efficace sans surrisque de rejet. Nous pourrions ainsi limiter la morbi-mortalité du cytomégalovirus et ainsi certainement prolonger la durée de vie des greffons.

Procédures

Sur les 382 animaux maximum prévus dans ce projet : - 46 animaux au maximum seront soumis à 1 seule injection intrapéritonéale sur animal virgile. - 129 animaux au maximum seront sourmis à 1 injection intrapéritonéale sur animal vigile en début de procédure, et 1 prélèvement sanguin total sous anesthésie générale profonde (suite à une injection intrapéritonéale d'anesthésiant) en fin de procédure suivie d’une mise à mort. - 27 animaux seront soumis à 1 injection intraveineuse sous anesthésie générale gazeuse, des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie locale (soit 4 prélèvements sur une durée de 28 jours pour 1/3 de ces animaux, ou 8 prélèvements au total sur 60 jours pour 2/3 d'entre eux), et enfin 1 prélèvement sanguin total sous anesthésie générale profonde (suite à une injection intrapéritonéale d'anesthésiant) en fin de procédure suivie d’une mise à mort. - 180 animaux au maximum seront soumis à 1 injection intraveineuse sous anesthésie générale gazeuse, des injections intrapéritonéales répétées tous les 2 jours sur animal vigile (soit au maximum 33 injections intrapéritonéales sur une durée de 67 jours maximum), des prélèvements sanguins hebdomadaires effectués sous anesthésie locale (soit jusqu'à 8 prélèvements sanguins maximum sur une durée de 60 jours maximum), puis enfin 1 prélèvement sanguin total sous anesthésie générale profonde (suite à une injection intrapéritonéale d'anesthésiant) en fin de procédure suivie d’une mise à mort. Les injections intrapéritonéales ou intraveineuses durent moins d’1 minute, un prélèvement de l’ordre de 30 secondes (contention comprise). Les anesthésies durent environ 1 heure.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales, intraveineuses, et les prélèvements sanguins répétés sont susceptibles de générer une nuisance, une douleur légère lors de l'injection/prélèvement, ainsi que de générer du stress chez l'animal. L’un des traitements anti-rejet que nous utiliserons peut engendrer une toxicité rénale chez les patients ; chez la souris, une toxicité rénale est généralement associée à une perte de poids. Ce traitement durera 2 mois au maximum. L'infection au cytomégalovirus, aux doses utilisées ici, n'engendre pas de symptômes chez les animaux immunocompétents (c'est-à-dire non traités avec les traitements anti-rejet). Néanmoins, pour les souris traitées sous traitement anti-rejet, l'infection peut causer l'apparition de signes généraux telles qu'une perte de poids ou une prostration, ou encore une hépatite (inflammation du foie non douloureuse) ou une colite (associée à des diarrhées). Cette infection au cytomégalovirus durera 2 mois maximum.

Devenir

Les souris seront mises à mort avec une méthode réglementaire en fin de procédure afin de récupérer différents organes (poumons, foie, coeur, reins, organes lymphoïdes et glandes salivaires). La mise à mort des animaux est donc nécessaire pour toutes les analyses biologiques et biochimiques. Toutes les souris ayant atteint un point limite avant la fin de la procédure seront également mises à mort avec une méthode réglementaire.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent à la réponse immunitaire dirigée contre le cytomégalovirus ne peuvent avoir lieu qu’au sein d’un organisme vivant complet, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Dans certains cas, la génération du stock de virus pourrait être remplacée par amplification sur lignées de cellules in vitro. Cependant, ceci a pour effet de diminuer la virulence du virus, contrairement au virus amplifié in vivo et isolé à partir des glandes salivaires. Etant donné que, dans notre cas, nous souhaitons utiliser une souche de virus non modifée et peu virulente afin d'étudier la réponse physiologique de certaines cellules immunitaires en particulier (ce qui n'est pas possible avec les autres souches de virus modifiée plus virulentes) et que ce virus doit être suffisamment virulent pour infecter des hôtes immuno-compétent et obtenir une infection latente (virus en état de dormance), une amplification initiale du virus in vivo (au niveau des glandes salivaires de la souris) est donc une étape nécessaire et non remplaçable par une amplification in vitro.

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs. Les procédures dites « pilotes » permettront d’établir les conditions/protocoles optimaux pour les procédures suivantes, afin de réduire également le nombre de groupe. Pour certaines expériences, les groupes contrôles seront réduits à 3 animaux alors que les groupes expérimentaux seront au nombre de 5.Pour une des expérences qui a pour but de vérifier la possibilité de transmettre l'infection au cytomégalovirus via des cellules isolées d'un organe infecté de manière latente, nous avons choisi de réduire autant que possible le nombre d'animaux (n=3 pour tous les groupes, contrôles et expérimentaux), de limiter le nombre de groupes contrôles et de ne réaliser qu'une seule fois cette procédure (pas de duplicat prévu pour cette procédure). Pour les autres expériences, nous prévoyons des duplicats expérimentaux qui seront réalisés si besoin pour re-générer un nouveau stock de virus si ce dernier se retrouve insuffisant pour refaire certaines expériences, pour approfondir certaines analyses par des techniques plus poussées, ou pour valider la reproductibilité des résultats.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances et douleurs liées aux injections intrapéritonéales et aux prélèvements sanguins réguliers, nous alternerons régulièrement des sites d’injection intrapéritonéale et les sites de prélèvement (voie rétro-orbitale en alternant les deux yeux et voie submandibulaire). Un analgésique local sera utilisé pour les prélèvements sanguins au niveau rétro-orbital pour limiter la douleur. De même, une anesthésie générale sera réalisée avant l’injection intraveineuse (anesthésie gazeuse) et avant la mise à mort des souris (anesthésie gazeuse ou profonde par injection intrapéritonéale d'anesthésiants). L'infection au cytomégalivirus des animaux traités sous traitement anti-rejet étant susceptible de causer des symptômes spécifiques comme une inflammation du foie ou du colon, un monitoring spécifique sera réalisé afin de doser des enzymes du foie de façon habdomadaire, et nous surveillerons la survenue de diarrhées. Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement, aspect général). Les animaux seront pesés une fois par semaine et cette fréquence sera augmentée à 2 fois par semaine en cas de perte de poids supérieure à 10%. Des points limites ont été définis pour les différentes procédures afin d'intervenir en cas de nécessité afin de limiter la souffrance de l'animal. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Du fait de sa similarité avec l’Homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire anti-virale dans le contexte allogénique. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées afin qu’elles aient un système immunitaire mature capable de répondre à l’infection.

2 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur puis des injections locales de vecteurs lentiviraux et des prélèvements de sang par ponction rétro-mandibulaire, pour modifier le microenvironnement tumoral au profit d'une réponse anti-tumorale. Le porteur décrit comme effets attendus des lésions cutanées, une ulcération et des troubles du comportement liés à la croissance de la tumeur, et fixe un point limite à une taille de tumeur jugée trop gênante. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle non-animal" reproduisant la complexité du microenvironnement tumoral et présente la souris comme un "modèle de prédilection".

Objectifs

Le concept du projet est de modifier le micro-environnement tumoral afin de favoriser une réponse cellulaire anti-tumorale en se basant sur une injection locale de vecteurs lentiviraux exprimant une ou plusieurs protéines modulant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le laboratoire se concentre sur le développement de vaccins anti-tumoraux contre des antigènes viraux oncogéniques (issus du papillomavirus) ou des néo-antigènes (prostate, colon, pancréas). L’ensemble de ces cancers développent des tumeurs solides chez l’homme avec un micro-environnement défavorable à l’entrée et la fonctionnalité des cellules T effectrices générées par vaccination thérapeutique. La stratégie envisagée permettra un reconditionnement du foyer tumoral vers un environnement favorable à l’action de la réponse cellulaire induite. Si cette stratégie se révèle efficace chez l’animal, il sera possible d’envisager son utilisation pour induire un traitement des foyers primaires chez l’homme en parallèle à d’autres traitements immunothérapeutiques.

Procédures

Ce projet comprend les 4 expériences suivantes : 1ère expérience : Les animaux seront soumis à 1 injection en sous cutanée sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intra-tumoral sous anesthésie gazeuse (5min) ou 1 injection en intraveineux sur animal vigile (5min) et 3 prélèvements de sang par ponction rétro mandibulaire espacés de 7 jours sur animal vigile (inférieur à 1min). 2ème expérience : Les animaux seront soumis à 1 injection en sous cutanée sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intra-tumoral sous anesthésie gazeuse (5min). 3ème expérience : Les animaux seront soumis à 1 injection en sous cutanée sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intra-tumoral sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intramusculaire sur animal vigile (5min) et 3 prélèvements de sang par ponction rétro mandibulaire espacés de 7 jours sur animal vigile. 4ème expérience : Les animaux seront soumis à 1 injection en sous cutanée sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intra-tumoral sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intraveineux sous anesthésie gazeuse (5min) et 3 prélèvements de sang par ponction rétro mandibulaire espacés de 7 jours sur animal vigile (inférieur à 1min).

Impact sur les animaux

Notre stratégie se base sur l’utilisation de vecteurs lentiviraux pour exprimer modérément et de manière stable des protéines pro-inflammatoires en local. En principe, l’expression de ces protéines devrait se cantonner au site d’injection mais une possible diffusion en systémique est envisageable et sera monitorée par des prises de sang régulières et une observation visuelle des animaux tous les 3-4 jours. Au niveau de la croissance tumorale, les modèles sont largement décrits et les effets adverses de la croissance sont connus et seront monitorés : lésions cutanées, ulcération, capacité au déplacement des animaux, modification du comportement (isolation, tremblement, prostration, absence de toilettage).

Devenir

Pour toutes les expériences l’issue est identique : Le développement des tumeurs étant irréversible, les animaux seront mis à mort dans toutes les expérimentations selon les points limites établis. Si les animaux atteignent une régression totale de la tumeur, les animaux seront mis à mort au bout de 90 jours maximum après la fin du traitement car ils ne peuvent pas être réutilisé pour d’autres expérimentations. La stimulation du système immunitaire induite par l’implantation de la tumeur peut induire des biais importants pour toutes autres études. Les animaux d’élevage à fin d’expérimentation ne peuvent pas être adoptés.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de modèles expérimentaux non-animal permettant de mimer efficacement la complexité du micro-environnement tumoral. La souris est un modèle de prédilection pour ce type d’étude par rapport aux autres animaux de par sa facilité d’élevage, de l’existence d’outils permettant une analyse en détail du système immunitaire et des corrélats pouvant être réalisées avec les tumeurs chez l’homme. Un maximum d’étapes de validation de l’efficacité des produits développés dans le laboratoire seront effectués in vitro sur des lignées cellulaires ou des cellules primaires avant injection chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience est déterminé en prenant en compte que le développement d’une tumeur et son interaction avec le système immunitaire comporte une large variabilité inter-individu, comme chez l’homme. En choisissant des animaux de même sexe et âge, il est possible de réduire au maximum cette variabilité. En s’appuyant sur des résultats antérieurs obtenu par notre groupe et une approche statistique, il a été possible d’anticiper le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables et répétables sur les différents paramètres de l’étude. Le projet implique l’évaluation de plusieurs protéines immuno-régulatrices capable d’influencer le micro-environnement. La sélection rapide des meilleurs candidats dans un premier temps permettra de poursuivre leur caractérisation avec un minimum de groupes et donc d’animaux.

Raffinement

La croissance tumorale peut avoir un effet néfaste sur la santé de l’animal. Le site d’injection (flanc droit) a été choisi pour avoir un impact minimal sur les capacités motrices de l’animal et assurer un suivi visuel simple et régulier (3-4 jours) du développement de la tumeur (mesure de la taille de la tumeur au pied à coulisse) et une prise de décision rapide en cas d’apparition d’un trouble chez l’animal. Ces troubles peuvent être physiques (difficulté de se déplacer, lésion sur le corps) ou comportementaux (isolation, prostration). Grace à une documentation importante des modèles tumoraux utilisés chez la souris, il est possible d’identifier, de prévenir une partie de ces troubles (lésions cutanées légères nécessitant un traitement aseptisant) ou d’intervenir (surveillance accrue ou mise à mort) si une aggravation (ulcération au site d’injection, modification du comportement) est observée et non réversible. La majorité des procédures implique une mise à mort précoce de l’animal afin d’étudier la tumeur et son système immunitaire mais, dans certaines procédures, les animaux sont conservés pendant une plus grande période impliquant le développement de tumeurs de tailles importantes. Le point limite a été défini à un stade de taille de tumeuroù la gêne chez l’animal devient trop importante.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe de nombreux modèles de tumeurs qui peuvent être utilisés chez la souris pour tester nos stratégies anti-tumorales. De plus, des études précédentes montrent que les vecteurs lentiviraux sont immunogènes chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire. Les expériences seront effectuées sur des femelles car celles-ci présentent un phénomène de dominance moins marqué que les mâles. Chaque expérience n’impliquera que des individus d’un même sexe, ce qui permettra de s’affranchir de la variabilité inter-sexe.. Les modèles tumoraux choisis n’étant pas spécifiques d’un sexe en particulier (cancers du colon, du foie et de la prostate). Il a été jugé que la possible variabilité dans le développement de la réponse immunitaire antitumorale liée au sexe n’aura pas d’effet sur la portée de l’étude.