Procédures modérées

4 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines rendues aveugles par un modèle de rétinite pigmentaire, elles reçoivent une injection intraoculaire d'un vecteur viral, subissent des examens répétés de l'œil sous anesthésie et une biopsie de la queue pour génotypage, avant prélèvement des yeux. Le porteur indique que l'injection peut provoquer de petites hémorragies oculaires et que l'anesthésie comporte un faible risque de défaillance cardio-respiratoire. Il affirme qu'il "n'existe pas de méthodes substitutives in vitro" et retient la souris pour la ressemblance de sa rétine avec celle de l'humain.

Objectifs

La rétinite pigmentaire (RP), forme la plus commune des dégénérescences rétiniennes congénitales, se développe en deux étapes successives. Au début de la maladie, les patients perdent uniquement leur capacité à voir en condition scotopique. Cette incapacité liée à la dégénérescence des photorécepteurs à bâtonnet, représente un handicap mineur puisque dans un environnement normal et bien éclairé, ces patients conservent leur vision, leur permettant une vie quasi normale. Cependant, la maladie progresse par la perte de fonction et la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Cette perte secondaire des cônes qui entraîne une perte de la vision centrale et une quasi-cécité chez les patients atteints de RP. Trouver des stratégies pour redonner la vision à des personnes l’ayant perdu est un enjeu crucial afin de permettre aux personnes touchées de rester autonome. Notre stratégie consistera à exprimer des protéines photosensibles dans des cellules de rétines aveugles de manière à les rendre sensibles à la lumière. Afin de trouver la stratégie thérapeutique la plus efficace possible, il nous faut comprendre comment les différents neurones qui forment le réseau rétinien travaillent ensemble pour traiter l’information visuelle. Dans la première partie, nous tenterons de comprendre le rôle des différents types cellulaires dans le traitement de l’information visuelle. Dans un second temps, nous tenterons de redonner la vision à un modèle de s souris aveugles ( modèle murin de la rétinite pigmentaire). Grâce aux progrès de la recherche en génétique, il est possible d’utiliser un vecteur viral pour introduire l’expression d’un gène d’intérêt dans une cellule cible. L’œil présente des caractéristiques favorables pour le transfert de gènes par des virus adéno-associés (AAV). Le virus adéno-associé est un virus non pathogène et non immunogène et permet un transfert de gène efficace dans les cellules in vivo Les animaux seront injectés par voie intraoculaire à l’âge adulte (8 semaines).

Bénéfices attendus

Ce projet conduira : - à l'identification de cibles thérapeutiques prometteuses pour les maladies dégénératives de la rétine, - les résultats de cette étude permettront d'approfondir les connaissances sur le rôle général des types cellulaires dans le codage de l’information dans la rétine. - cette étude pourra permettre le développement d’une nouvelle classe de thérapies géniques pour proposer des traitements aux personnes souffrant des maladies héréditaires de la rétine.

Procédures

Tous les animaux subiront une injection intraoculaire de la thérapeutique à évaluer effectuée sous anesthésie générale et locale (5 à 10 min). Par la suite, les animaux seront amenés à effectuer un examen de l’œil répétés, une fois par quinzaine (6 fois maximum par animal) sous anesthésie gazeuse (2 min). Enfin, les animaux seront euthanasiés selon deux méthodes réglementaires en fonction des prélèvements et analyses à réaliser.

Impact sur les animaux

L'injection intra-oculaire peut provoquer des lésions temporaires comme de petites hémorragies oculaires ; Ces dernières se résorbent rapidement, en général dans les 24 heures qui suivent l’injection. Au cours des anesthésies, un faible risque de défaillance cardio-respiratoire est à prévoir. Pour la caractérisation génétique de l'animal, nous devrons faire une biopsie de la queue. Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux peut causer de la douleur

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de récupérer les yeux des animaux et effectuer les analyses histologiques nécessaires à notre étude.

Remplacement

Nous étudions dans ce projet l’efficacité de l’expression de protéines sensibles à la lumière (optogénétiques) dans les cellules cibles de la rétine. L’induction ne peut être effectuée qu'in vivo puisque le circuit de la rétine doit être intact avant l’expression de la protéine optogénétique. Il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro. De plus de nombreuses barrières biologiques qui constituent de véritables obstacles pour les vecteurs de transfert de gène n’existent pas dans les modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est basé l’expérience du laboratoire dans des expérimentations similaires. Il sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Des outils statistiques adaptés seront utilisés pour l’analyse de nos résultats. Au total, 4000 animaux sont nécessaires à cette étude sur une période de 5 ans.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). - Ils bénéficieront d’une anesthésie générale fixe ou gazeuse selon le type d’expérimentation. Pour les injections intraoculaires, une anesthésie préalable de la cornée sera réalisée. - Application d'une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne en post-injection intraoculaire - les souris seront placées sur un tapis chauffant lors des injections intraoculaires pour éviter une hypothermie pouvant être induite par l’anesthésie . - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque type d’expérimentation - Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Nous avons sélectionné le modèle murin car la structure de sa rétine de la souris est semblable à celle de l’Homme. Nous utilisons dans cette étude : - Un modèle murin de rétinite pigmentaire - Des modèles murins transgéniques permettant une expression spécifiques de protéines dans des types cellulaires. -Les injections sont effectuées à l’âge de 8 semaines, âge auquel le circuit de la rétine des souris est mature.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un accident vasculaire cérébral provoqué par photothrombose du cortex, des tests sensori-moteurs de la graine, de la ficelle et du cylindre, puis une chirurgie d'isolement du nerf vague avec pose d'électrodes, avant prélèvement du cerveau. Le porteur indique une plaie au crâne et un affaiblissement musculaire partiel le plus souvent réversible, et présente la lésion comme ciblée et de très petit volume. Il affirme que ce mécanisme physiologique "hautement intégré" ne peut être reproduit in vitro ou in silico.

Objectifs

Les lésions cérébrales résultant d'un accident vasculaire cérébral (AVC) sont la principale cause de handicap neurologique acquis. En dehors de la rééducation physiothérapeutique, il n'existe pas de traitement efficace et standardisé pour amplifier la restitution des circuits neuronaux détruits par la lésion. L'identification de nouvelles stratégies de "neuroréparation" efficaces et cliniquement crédibles constitue un défi majeur. Une solution émergente est la stimulation du nerf vague (SNV). De manière surprenante, l'envoi d'impulsions électriques indolores à travers ce nerf crânien améliore la récupération fonctionnelle des patients sans provoquer d'effets secondaires majeurs. Cependant, le mécanisme par lequel cette méthode améliore la neuroplasticité n'est pas connu. La SNV est donc utilisée de manière empirique, sans standardisation. Pour mieux appréhender son potentiel thérapeutique, il est essentiel de comprendre comment la SNV, appliquée pendant la période critique de la récupération suivant l'AVC, peut améliorer la plasticité cérébrale. Sur la base des concepts récents de plasticité post-AVC, nous suggérons que la SNV normalise l'activité corticale de la région péri-lésionnelle, en périphérie du tissu nécrosé suite à l’AVC. Cette correction permettrait ainsi d'optimiser la plasticité cérébrale afin de reconstruire des réseaux neuronaux fonctionnels, nécessaire au réapprentissage du geste perdu. Nos précédents travaux mettent en évidence un défaut d'activité lié à l'équilibre entre l'excitation et l'inhibition. Ainsi, notre premier objectif sera de caractériser les modulations de l’activité corticale en réponse à un traitement par stimulation du nerf vague aigu chez la souris ischémiée anesthésiée. Ensuite, notre second objectif consistera à tester l'effet de la SNV sur les potentiels évoqués somato-sensoriels (PES) déclenché par une stimulation tactile de la patte avant de la souris. Ces travaux s’inscrivent dans une volonté de caractériser les mécanismes d’action de la SNV afin de raffiner les protocoles actuellement pratiqués en clinique, et dans l’espoir d’en faire la prochaine génération de traitement de réadaptation post-AVC.

Bénéfices attendus

Même si les premiers essais cliniques ont rapporté des résultats encourageants, cette nouvelle thérapie assez surprenante, ne se développera pas sans une compréhension convaincante de son mécanisme d’action de base. Nos hypothèses découlent de plusieurs années de recherche dans le domaine de l’AVC et nos données préliminaires suggèrent que nous sommes sur la bonne voie. Si nos hypothèses sont correctes, le résultat de ce travail viendra guider la pratique clinique. Comprendre dans quelle mesure un traitement de SNV, améliorant la récupération post-AVC chez la plupart des sujets selon la littérature, peut corriger l’activité corticale péri-lésionnelle est essentiel pour comprendre pourquoi ce traitement échoue ou fonctionne chez un patient donné. De plus, l’étude de la coïncidence temporelle entre la SNV et un stimulus tactile sur la correction de l’activité cérébrale permettra notamment de guider sur la temporalité du traitement au cours des séances de réhabilitation, dont le déroulement reste encore très empirique. Nous pensons que notre équipe peut apporter des avancées significatives pour développer cette thérapie.

Procédures

Nous utilisons un modèle de lésion photothrombotique du cortex (à la surface du cerveau), chez la souris pour simuler un AVC. L'induction de l'ischémie photothrombotique chez les souris se fait par injection d'un colorant, le rose bengal (tous les groupes, n = 78), suivie d’une illumination du crâne avec un laser pour créer une lésion ciblée dans le cortex moteur de la patte avant (Groupes 2, 5 et 6) (Durée d’anesthésie : 50 min). Durant toutes les procédures chirurgicales, les souris sont anesthésiées, leur bien-être et leur réaction à l'analgésie sont attentivement surveillés, et une température constante est maintenue pendant toute la procédure. Les souris témoins sham (Groupe 1 et 3) subiront toute la procédure chirurgicale sans illumination par le laser, et donc sans réaction oxydante du rose bengal. Afin d’évaluer un déficit fonctionnel, l’ischémie photothrombotique est précédée si nécessaire (Groupe 3 à 6) d’un apprentissage aux tests sensori-moteurs de la graine, de la ficelle et du cylindre. La performance à ces tests est évaluée à J7 (Groupes 5-6, n = 24) et /ou J14, J21 et J28 (Groupes 3-4, n = 32) pour mesurer le déficit moteur et la récupération fonctionnelle de la patte avant lésée des souris. Ces tests reposent sur la dextérité, la coordination motrice et de la préférence motrice des animaux, altérées après l’AVC. L’activité cérébrale basale et ses modulations en réponse à la stimulation du nerf vague seront évaluées à la surface et en profondeur du cortex, sous anesthésie, selon deux modalités. D’une part, l’activité corticale évoquée par des stimulations vibro-tactile sera évaluée avec et sans SNV à J14 (Groupes 1-2, n = 22). D’autre part, l’activité spontanée du cortex péri-lésionnelle sera mesurée à J7 (Groupes 5-6, n = 24) et /ou J14 et J28 (Groupes 3-4, n = 32). La chirurgie se compose d’une partie active (Isolation du nerf vague, pose de l’électrode de stimulation et insertion de l’électrode d’enregistrement) (Durée : 2h30), suivi d’une partie où l’expérimentateur n’intervient plus, sous anesthésie plus légère (Durée : 1h30). L'efficacité de la SNV est vérifiée en observant une bradycardie transitoire en réponse à chaque stimulation. À la fin de l'expérience, les souris sont profondément anesthésiées et mises à mort. A cela s'ajoute les animaux nécessaires à l'entraînement chirurgicale d’un nouvel opérateur, à la fois pour l’induction de l’ischémie et l’enregistrement électrophysiologique corticale (n = 30)

Impact sur les animaux

Nuisances : - La microchirurgie au niveau du crâne et la suture de la peau le recouvrant entraînera une plaie sur 1,5 cm, qui sera traitée. - La coagulation locale des vaisseaux du cortex moteur primaire droit (par illumination d'une zone de 1mm carré) induira un déficit partiel de la force musculaire du côté opposé à la lésion, le plus souvent réversible au cours des 3 semaines qui suivent. Cette procédure d'ischémie est peu invasive (pas d'ouverture du crâne), et n'est pas connu pour occasionner une douleur autre que celle liée à la suture de la peau du crâne. La lésion étant très focalisée (microlésion uniquement corticale), elle n'occasionnera d'handicap lourd et pas de perte de poids significative. - La pose de l'électrode autour du nerf vague et la suture de la peau à ce niveau (cou) entraînera une plaie sur 1,5 cm. Les muscles et les organes ne seront pas endommagés. Les glandes salivaires seront préservées. Au total, notre expérience de plusieurs années sur des modèle modéré d'AVC montre que les animaux supportent ces procédures sans complication et sans manifester une douleur ou une détresse que nous ne puissions traiter. - La stimulation du nerf vague, à l'intensité choisie, n'entraîne pas d'inconfort, de douleur ou de perturbation métabolique ou physiologique nuisible. Tout au contraire, il s'agit d'une stimulation employée chez l'animal et chez l'homme pour réduire les symptômes de dépression, pour limiter l'épilepsie ou pour inhiber la douleur. Le retour sur les précédant projets autorisés utilisant ces mêmes procédures ont montré que le seuil des points limites n'a jamais été franchi. Nous sommes donc confiant que le présent projet n'occasionnera pas d'effets inattendus.

Devenir

Les animaux devront être mis à mort puisque leur cerveau et leur nerf vague seront prélevés pour des exploitations histologiques (analyses histopathologique et immunohistochimique).

Remplacement

Ce projet permettra d’analyser un mécanisme physiologique hautement intégré qui ne peut pas être reproduit de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. Les paramètres physiologiques concernés n'existent que dans la situation "in vivo''. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante (78 souris adultes + 30 d’entrainement), en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience. Le nombre d’animaux nécessaire a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études et de la littérature en vigueur.

Raffinement

Nous avons développé un modèle de lésion photothrombotique, sans craniotomie, générant une lésion corticale (surface du cerveau), ciblée et de très petit volume (~4 mm3, soit ~0,6% du volume cérébral), de manière à préserver au maximum le bien-être de l’animal. Cet effort de raffinement est compatible avec la proposition d’une procédure de classe modérée. En effet, le déficit fonctionnel occasionné n’est détectable que par des analyses cinématique du mouvement. A l'œil, il est généralement impossible de distinguer le comportement d'une souris ischémiée d'une souris non ischémiée (sham). Par ailleurs, les souris seront systématiquement anesthésiées lors des procédures invasives. Seul du personnel qualifié se chargera de réaliser les expériences, en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Des points limites sont définis au préalable. Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux bi-quotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuellement en vigueur (Directive 2010/63/UE). Pour limiter le stress des animaux, les cages seront isolées dans une pièce dédiée, à l'abri du bruit extérieur. Les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum et ils seront sous surveillance constante après le déclenchement de l’AVC expérimental. Enfin, le bien-être animal sera au cœur de nos préoccupations. Toute angoisse, douleur ou souffrance animale occasionnées pendant le projet sera prise en charge et réduite autant que possible. De l’acquisition de l’animal jusqu’à sa mort, tout sera mis en œuvre dans l’optique de respecter les principes éthiques et de raffiner nos travaux autant que possible.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est le mammifère non-primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé, autant sur le plan cellulaire qu’au niveau de la récupération fonctionnelle. De fait, la souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser l’ischémie cérébrale. De plus, le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux central et la physiologie vasculaire assez similaire à celle de l’Homme en font un très bon modèle pour cette pathologie. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifère (autres groupes de vertébrés ou invertébrés) ne permettrait pas d’obtenir des données aussi pertinentes et exploitables par la communauté scientifique et médicale. Les animaux seront âgés de 8-15 semaines en début du protocole, ce qui correspond à la maturité cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC. De plus, chez l’Homme, les AVC surviennent très majoritairement chez l’adulte.

6 animaux non-humains, trois chiennes et trois mini-porcs déjà utilisés dans une étude antérieure, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans être tués à l'issue. Ils subissent de nombreuses prises de température rectales répétées, jusqu'à vingt et une pour les chiennes, ainsi qu'une anesthésie menée volontairement sans support chauffant, et les chiennes une ovariectomie. Le porteur indique des risques de lésions, saignements et inflammation de la muqueuse rectale et une possible hypothermie. À l'issue, les chiennes sont proposées à l'adoption et les mini-porcs réutilisés, le projet visant à valider une puce de mesure présentée comme un "raffinement".

Objectifs

L’objectif de cette étude est de vérifier si l’implantation d’un transpondeur d'identification RFID (radio frequency identification) équipé d'un capteur de température, permet lorsqu'il est implanté en sous-cutané au niveau interscapulaire d’obtenir des mesures représentatives de la température corporelle et équivalentes ou corrélées à celles obtenues par voie rectale. Pour in fine utiliser le transpondeur RFID comme alternative à la mesure par voie rectale. Il s’agit d’une étude pilote qui sera réalisée sur deux modèles animaux, le chien et le mini-porc.

Bénéfices attendus

La validation du dispositif de mesure permetterait le raffinement des protocoles de mesures de températures qui sont réalisés en routine par la voie rectale chez le chien et le mini-porc. Permettant une amélioration du confort de l’animal sur la procédure de prise de température au cours d’études précliniques et cliniques mais aussi, une diminution des risques liés à la contention pour les techniciens et les animaux.

Procédures

Jour 1 : Un total de 6 prises de températures par individu (vigile) pour le protocole de mesure à l'état basal au cours de la journée (mini-porc et chien) Jour 2 : Un total de 5 prises de températures par individu (vigile) pour le protocole de mesure lors de la mise en excercice (chien) Jour 3 : Un total de 9 prises de températures par individu (vigile) pour le protocole de mesure post-prandial (mini-porc et chien) Jour 4 : Anesthésie et chirurgie d'ovariectomie pour les chiennes et prises de températures au cours de l'anesthésie et avec un prélèvement vigile avant induction de l'anesthésie et avec un prélèvement vigile avant induction de l'anesthésie. Jour 5: Anesthésie pour les mini-porcs et prises de températures au cours de l'anesthésie. Ce qui fait un total de 21 prélèvements vigiles par animal pour les chiens et 16 prélèvements vigiles par animal vigile pour les mini-porcs.

Impact sur les animaux

Sévérité légère : La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la prise de température répétée au niveau rectal, avec l'apparition d'éventuelles lésions, saignements ou inflammation de la muqueuse rectale pouvant entrainer des douleurs lors de l'insertion du thermomètre. De plus pour les besoins de l'étude la procédure d'anesthésie se fait sans apport d'un support chauffant, pouvant conduire à une forte hypothermie qui pourrait être à l'origine d'une augmentation des risques post-anesthésiques chez les animaux. Si une diminution de la température centrale sous le seuil des 36°C est atteinte pour les deux modèles, une couverture chauffante sera employée pour éviter une hypothermie sévère.

Devenir

Les animaux vont suivre l'ensemble des procédures mentionnées au cours d'une seule semaine d'expérimentation. Les chiennes seront par la suite inscrites pour les procédures d'adoption après avis vétérinaire confirmant leur bon état clinique. Quant aux mini-porcs, ils seront réutilisés par la plateforme.

Remplacement

En amont de la phase in vivo, une phase in vitro de métrologie à l'aide d'un bain marie sera réalisée afin de déterminer la précision et la calibration des puces et sondes rectales. Cette phase in vitro permet ainsi de remplacer une phase in vivo de test.

Réduction

Au total, six animaux (trois chiens et trois mini-porcs) ayant déjà participé à une précédente étude, de gravité modérée, seront utilisés dans cette étude pilote. Il ne sera pas nécessaire de mettre en place un groupe témoin, car chaque animal constitue sa propre référence..

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des boxs sur caillebottis par groupe 3 individus (permettant des intéractions sociales) avec un enrichissement environnemental (jouets et objets à macher). Une phase d’habituation au thermomètre rectal sera mise en place grâce à un renforcement positif (récompense alimentaire). Du Tronothane (anesthésique local utilisé pour le traitement des douleurs rectales) sera appliqué sur la muqueuse avant chaque mesure et le thermomètre sera préalablement enduit d'un lubrifiant vétérinaire.

Choix des espèces

L'établissement utilisateur emploie ces 2 modèles lors de ces études. Les chiens et mini-porcs ont été choisis pour cette étude pilote car le transpondeur est destiné à être utilisé plus tard sur ces deux modèles en particulier dans le cadre des études précliniques. Les animaux utilisés dans l'étude sont adultes (2 ans pour les chiens et 1 à 2 ans pour les miniporcs). D'une part car les animaux adultes possèdent un système thermorégulateur mature et d'autre part, ceux-ci sont issus de précédentes manipulations d'où leur maturité.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour un enseignement et l'entraînement de doctorants et de personnels. Ils sont d'abord soumis à des tests cognitifs de détection de la nouveauté et de localisation, puis utilisés pour l'apprentissage par tutorat d'injections et de chirurgies stéréotaxiques du crâne. Le porteur indique que la chirurgie stéréotaxique peut provoquer douleur et hébergement en cage individuelle, avant la mise à mort pour prélèvement du cerveau. Il affirme que l'acquisition de ces gestes techniques est "nécessaire" et ne peut se faire que sur des rats.

Objectifs

Ce projet constitue la partie pratique d’un enseignement portant sur les méthodes d’études de capacités cognitives cher le rat. Ces capacités sont illustrées dans deux tâches comportementales, une tâche de détection de la nouveauté et une tâche de localisation d’un lieu. Ces animaux pourront ensuite être utilisés pour la formation par tutorat de doctorants, post-doctorants et personnels statutaires ayant suivi les formations réglementaires, conformément à l’arrêté du 1er février 2013, afin d’acquérir les gestes techniques requis pour la réalisation des procédures expérimentales des projets de recherche dans lesquels ils seront impliqués. Cette formation par tutorat pourra porter sur la pratique d'injections périphériques et d'interventions chirurgicales stéréotaxiques. Elle sera assurée par des personnels experts de ces domaines au sein du laboratoire et validée par la responsable du suivi des compétences.

Bénéfices attendus

En permettant aux étudiants d’assister à la passation de tests comportementaux dans les conditions réelles d’un laboratoire, ce projet contribue de manière essentielle à leur formation et à leur sensibilisation aux bonnes pratiques en matière d’utilisation des animaux à des fins scientifiques. La formation par tutorat est nécessaire à l’acquisition des gestes et au maintien des compétences requises pour la réalisation des procédures expérimentales.

Procédures

Les animaux qui seront utilisés pour la formation par tutorat seront soumis au maximum à une injection pendant cinq jours consécutifs, une intervention chirurgicale et une injection pour leur mise à mort.

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique peut induire de la douleur et une altération de l’état de santé des animaux. Elle peut également nécessiter un hébergement temporaire en cage individuelle.

Devenir

La mise à mort des animaux de la procédure est nécessaire au prélèvement de leur cerveau.

Remplacement

Les objectifs du projet ne peuvent être atteints qu’en utilisant des animaux (évaluation de fonctions cognitives ; acquisition de gestes techniques ou maintien de compétence sur le modèle rat).

Réduction

Le nombre d’animaux (24 par an) a été déterminé de manière à permettre d'assurer cet enseignement pour 12 binômes/trinômes d'étudiants par an.

Raffinement

A leur arrivée au laboratoire, l’état général des animaux est rapidement évalué au sortir de la boîte de transport, ils sont pesés puis placés en binômes dans des cages enrichies avec deux bâtonnets de bois à ronger. Après deux semaines d’acclimatation, ils sont pesés régulièrement et familiarisés à la manipulation par les porteurs du projet. La diffusion d’un bruit de fond dans l’animalerie (station musicale pendant la phase lumineuse) permet de diminuer leur réactivité aux bruits soudains auxquels ils sont sensibles et qui peuvent accompagner par exemple le changement des cages. La visite quotidienne permet de détecter rapidement des signes de mal-être et une prise en charge adaptée (alerte au responsable de projet et à la Structure Bien-Etre Animal et sollicitation du vétérinaire désigné si nécessaire). Des points limites adaptés à chaque étape du projet ont été définis. La chirurgie stéréotaxique est réalisée sous anesthésie générale avec une couverture analgésique systémique et locale. Pendant la semaine qui suit la chirurgie, le suivi quotidien est renforcé.

Choix des espèces

Le rat est l’une des espèces les plus utilisées en neurosciences comportementales et l'une des espèces utilisées au laboratoire. Les animaux, peu réactifs vis-à-vis de l’homme, se familiarisent très rapidement aux manipulations nécessaires à la passation d’un test comportemental. Leur coopération, associée à la richesse de leur répertoire comportemental, en fait des sujets particulièrement adaptés à l’enseignement. A leur arrivée au laboratoire, les rats sont âgés de 4-5 semaines, un âge auquel notre expérience montre que les binômes constitués cohabitent très bien à l’âge adulte. Les tests comportementaux sont réalisés lorsqu’ils sont âgés de 10-12 semaines, ce qui correspond à un âge auquel leur système nerveux est complètement développé. Les animaux sont mis à mort au plus tard à l’âge de 6 mois, un âge auquel ils ne présentent qu’exceptionnellement des pathologies

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses humaines puis de lymphocytes modifiés, avec suivi de la croissance tumorale par imagerie sous anesthésie, pour tester des cellules CAR-T contre des tumeurs. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer détresse respiratoire ou paralysie des membres postérieurs, les souris concernées étant alors mises à mort. Il affirme que les études précliniques sur l'animal sont "incontournables" et que la souris est un "modèle de référence" en cancérologie.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Malgré son efficacité dans le traitement de cancers sanguins comme la leucémie, le succès de cette thérapie dans le traitement des tumeurs solides reste encore très limité. Ce projet vise donc à étudier l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient contribuer à améliorer les immunothérapies dans le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a pour objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant des cancers agressifs. Nos résultats préliminaires in vitro ont d’ores et déjà démontré que les cellules CAR-T diminuent la prolifération de plusieurs cellules cancéreuses (lymphome, cancer du pancréas et cancer du poumon). Les résultats qui découleront de ce projet permettront d'accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Aucun prélèvement sera fait et non plus de procédures chirurgicales. Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée (s.c) ou intraveineuse (i.v) de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue. Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A ce moment, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Le traitement par injection i.v de lymphocytes humains sera administré dans les mêmes conditions. Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Lors du suivi de croissance tumorale par imagerie, les souris seront sous anesthésie gazeuse et placées sur un tapis chauffant pour maintenir leur température corporelle et surveillées au réveil.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée et intraveineuse peuvent occasionner des dommages dans la queue si les animaux venaient à bouger avec la conséquente angoisse. Les injections se feront donc sous anesthésie à l’isoflurane. D’autres nuisance pourront apparaitre si la taille de la tumeur est très grande (plus de 300 mm2 pour les tumeurs sous cutanées), il y a apparition de détresse respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) ou une paralysie des membres arrière est observée (pour la tumeur Raji). Si ces signes sont observés souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Lorsque l’effet thérapeutique (disparition ou diminution de la tumeur) est observé, ce qui devrait arriver au plus tard à la quatrième semaine, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront aussi mis à mort sous anesthésie préalable. En effet, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, et même si des régressions tumorales pourront être observées, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’efficacité de la thérapie CAR-T dans notre modèle et son potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats, nous devons passer dans un modèle de souris afin d’étudier notre hypothèse dans l’environnement tumoral. En effet, les études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier l’efficacité in vivo mais aussi les effets indésirables potentiels des traitements.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une force statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permet d’avoir une réelle puissance statistique. Nous avons choisi de mesurer les tumeurs par bioluminescence, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux tout en conservant une puissance statistique suffisante. Les expériences ne seront réalisées que deux fois, les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées tous les deux jours pour surveiller leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections se feront sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour limiter le stress. Des analgésiques seront utilisés en cas de douleur (ex : analgésiques locaux type Lidocaïne au point d’injection à la queue ; et/ou antalgiques type AINS). De plus, les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également, des points limites spécifiques seront appliqués. Pour le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs (500 mètres environ), nous transporterons à pied les souris dans des cages filtrées et dans l’obscurité pour limiter le stress causé par le transport. A leur arrivée dans l’établissement utilisateur 2/2, les cages des souris seront changées et placées sur portoir ventilé pour protéger les souris immunodéprimées (phénotype dommageable). Les souris ne seront déplacées qu’une seule fois pour limiter le stress du transport. Ces mesures assureront ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Il est impossible à nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Etant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité des cellules CAR-T en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.

96 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 81 tués pour prélèvement du cerveau et 15 proposés pour servir à des formations à l'expérimentation animale. Ils sont isolés et soumis pendant 21 semaines à une alcoolisation volontaire, à quatre prélèvements sanguins sous anesthésie et à des sessions où la prise d'alcool est associée à un événement aversif. Le porteur indique que l'isolement et ce modèle augmentent l'anxiété des rats, et reconnaît que 15 d'entre eux ne développeront pas l'appétence pour l'alcool attendue. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants ne permet d'évaluer un comportement d'addiction à l'alcool.

Objectifs

Le métabolisme cérébral est profondément altéré suite à une prise excessive et répétée d'alcool. L'objectif ici est donc de démontrer qu'en corrigeant le métabolisme cérébral en changeant certains apports alimentaires chez le rat, l'on peut modifier des comportements associés à l'addiction à l'alcool.

Bénéfices attendus

Comprendre les altérations métaboliques en lien avec l'addiction à l’alcool et les façons d'intervenir de manière efficace pour les corriger pourraient permettre à terme le développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces contre cette maladie psychiatrique.

Procédures

Les animaux suivront une procédure comportementale avec alcoolisation volontaire sur une période de 21 semaines maximum. Au cours de celle-ci, ils auront de manière espacée (deux semaines d'écart minimum), 4 prélèvements sanguins à la queue sous anesthésie générale (durée inférieure à 15 minutes) ; deux fois, espacé de deux semaines, 6 sessions de comportement de 30 minutes/jour avec prise d'alcool associée à un événement aversif modéré (pour reproduire le symptôme pilier de l'addiction qui est de persister dans la recherche et la prise de la drogue en dépit des conséquences négatives) ; ainsi qu'un régime alimentaire modifié et contrôlé pendant un mois. A l’issue de l'étude, les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés pour des analyses biochimiques ultérieures.

Impact sur les animaux

L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’isolement des animaux nécessaire pour cette expérimentation ont un impact d’ordre modéré sur l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances modérées sont également attendues lors des sessions comportementales associées à un événement aversif. Des nuisances légères sont attendues pour ce qui est des injections sous-cutanées des traitements antalgiques potentiels. Nous n'anticipons pas d'effets indésirables des régimes alimentaires modifiés, sur la base des protocoles et des produits publiés qui vont être utilisés.

Devenir

Les animaux ayant suivi l'ensemble des procédures auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses biochimiques. Cependant, il est estimé sur la base de protocoles comportementaux similaires que 15 animaux sur le total ne satisferont pas au critère comportemental d'appétence pour l'alcool nécessaire à la poursuite de l'étude. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire référent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Etre des Animaux.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement caractéristique de l'addiction à l'alcool.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base de procédures similaires réalisées auparavant. Le suivi longitudinal des animaux pendant plusieurs mois permettra également de renforcer l'analyse statistique, et donc de réduire le nombre d'animaux par condition.

Raffinement

Les animaux seront herbergés dans les conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Nous serons cependant obligés de les isoler par rapport à l'étude pour suivre leur consommation individuelle d'alcool, mais avec des cages avec grilles en portoirs ouverts, proches les unes des autres, permettant ainsi le maintien d’un certain nombre d’interactions sociales entre les animaux, ce qui limitera toute nuisance associée à un isolement plus strict. Ils seront hebergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils seront manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux contentions et aux manipulations. Pour les prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésique gazeux. Le suivi et les pesées au quotidien des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et des points limites adaptés. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Un antalgique pourra également être injecté en utilisant des aiguilles courtes et fines.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, ainsi qu'au niveau du métabolisme. Les registres comportementaux explorés (associés à l'alcool) sont également facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 10 à 12 semaines, de 220 à 280 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, tout au long de l'étude qui prendra plusieurs mois.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'implantation chirurgicale d'une tumeur colorectale sur le côlon sous anesthésie, puis des séances d'IRM sous anesthésie et des injections répétées de traitement, avant prélèvement des tumeurs. Le porteur indique une douleur post-chirurgicale et une gêne liée à la croissance tumorale, sans présenter les points limites comme systématiquement atteints. Le projet vise à proposer à l'industrie pharmaceutique un service de suivi tumoral par IRM, le porteur invoquant la nécessité d'observer la tumeur dans "l'organisme entier".

Objectifs

Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Il vise à démontrer l'intérêt et la valeur ajoutée de l'utilisation de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) pour étudier l'efficacité de nouveaux composés en cancérologie sur des souris porteuses de cancer. L'IRM est une technique d'analyse de tumeurs implantées chez l'animal qui est non invasive, précise et utilisée chez le patient. Il est attendu de l'IRM qu'elle permette à terme d'améliorer et d'optimiser les études en cancérologie sur animaux, en travaillant avec des modèles de cancers implantés directement dans l'organe d'origine du cancer pour mimer au plus proche ce qu'il se passe chez le patient. Ce projet porte sur le suivi par IRM d'un modèle de cancer colorectal implanté directement au niveau du colon chez la souris. Ce modèle de cancer présente un intérêt fort pour évaluer l’efficacité thérapeutique de potentiels traitements anticancéreux, mais ne peut pas être étudié avec des techniques de suivi de volumes tumoraux classiques : mesures à la main quand les tumeurs sont implantées directement sous la peau. En effet, après l'implantation de la tumeur directement au niveau du colon, il est impossible de mesurer et de suivre l’évolution de la tumeur celle-ci se développant au niveau de l’organe et donc d’observer l’effet d’un traitement. Ce projet vise donc à créer une expertise en oncologie centrée sur l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour la recherche biomédicale. Cette collaboration permettra d’offrir à l’industrie pharmaceutique le service requis pour l’évaluation in vivo chez l’animal de l’efficacité des molécules anticancéreuses développées avant leurs tests en phases cliniques chez le patient.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra de mettre en place un protocole de suivi tumoral capable d'étudier l’efficacité de potentiels traitements anticancéreux dans des modèles implantés directement dans l'organe, qui sont non mesurables avec les techniques classiques. Ceci permettra de simplifier l’utilisation de ces modèles de cancer qui miment la pathologie chez les patients et donc d’ouvrir potentiellement l’accès à de nouveaux traitements pour ces types de cancer. Il permettra aussi d'obtenir des données scientifiques afin de promouvoir l'utilisation d'une technique non invasive (l'IRM), technique dont la précision permettra à terme de réduire et raffiner nos études utilisant des animaux.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur : implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs au niveau de la couche extérieure du colon, 20 minutes maximum. Dans le second établissement utilisateur : anesthésie fixe durant l’IRM maximum 30 minutes - traitement par voie intrapéritonéale 30 secondes 10 injections pour les animaux traités au composé expérimental et 2 pour les contrôles et ceux traités - traitement par voie intraveineuse 30 secondes durant 6 séances

Impact sur les animaux

Potentielle perte de poids, une douleur sur plusieurs heures liée à l'implantation par chirurgie de tumeurs par ouverture de la cavité abdominale au niveau du côlon, contrôlée par de l'analgésie et réalisée sous anesthésie gazeuse. Une gêne dûe à une croissance de tumeurs au niveau du colon, du stress dû aux contentions pour les traitements, une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille suite aux injections à la seringue en intrapéritonéal pour les traitements, une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille suite à l'injection à la seringue à la queue en intraveineuse pour l'agent de contraste et un stress dûe à l'anesthésie gazeuse pour l'IRM.

Devenir

Suite à la procédure, les animaux seront mis à mort deux semaines après début du traitement pour les prélèvements de tumeurs fraîches.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude par IRM du développement d’une tumeur ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.

Réduction

Le projet sera fait sur le nombre d’animaux nécessaires afin de conclure de façon fiable statistiquement avec le test approprié (comparaison de moyennes et analyse de courbes d’espérance de vie) à l’efficacité du traitement tout en ayant une bonne prise tumorale. 32 souris seront utilisées et réparties en quatre groupes de 8 souris. Pour cette étude d’efficacité de nouvelles molécules sur un modèle de cancer colorectal complexe de part son implantation directement au niveau de l'organe, un effectif de 8 souris par groupe sera utilisé afin de pouvoir être capable d'observer une efficacité d'inhibition du volume tumoral de 25% du composé si cela vient à se passer. Pour chaque groupe, les volumes de tumeurs prélevées à la fin de la procédure seront analysées afin de confirmer les données obtenues par IRM et limiter les anomalies d’analyses pour des études futures utilisant l’IRM. Le recours à l’imagerie pour le suivi tumoral évite l’ouverture ou la mise à mort de l’animal pour visualisation direct de la tumeur, et donc une diminution du nombre d’animaux expérimentés.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas d'amaigrissement. Des prélèvements de tumeurs en point final seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Concernant l’acte de chirurgie, les animaux seront traités avec un antidouleur avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse moins invasif et pour un réveil moins difficile. Le personnel est formé à la chirurgie quant à la mise en place du modèle et notre partenaire quant à la réalisation de l’IRM et l’administration des traitements. Afin d’éviter des transports réguliers tous les deux jours minimum des souris, les animaux seront transportés une fois avoir récupérés de la chirurgie pour une période d’acclimatation.

Choix des espèces

La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Les souris seront âgées de 6 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour un récepteur, elles subissent jusqu'à neuf tests comportementaux sur quatre semaines évaluant l'anxiété, la dépression et la sociabilité, certains imposant un isolement nocturne de quelques heures ou une mise à jeun. Le porteur indique que ces tests exposent les souris à des stress légers à modérés pouvant provoquer des réactions d'évitement ou de peur. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut évaluer ces paramètres comportementaux, jugeant "nécessaire" l'étude sur l'animal vigile.

Objectifs

Nous avons montré dans une précédente étude qu'une protéine était impliquée dans la dépression. Dans ce projet, nous voulons confirmer que cette protéine a aussi un impact sur les troubles émotionnels. C’est pourquoi nous testerons des souris transgéniques pour lesquelles le gène de cette protéine a été inactivé dans un large éventail de tests comportementaux. En comparant ces souris transgéniques à des souris contrôles, nous évaluerons les performances émotionnelles, mais aussi de sociabilité, ou l’état de bien-être, d’anxiété et/ou dépressif. Les souris adultes mâles et les femelles seront utilisées pour éventuellement mettre en évidence des effets dépendants du sexe.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans les troubles émotionnels. Il pourrait aussi permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la prévention et le traitement de l’anxiété et/ou de la dépression.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests comportementaux servant à évaluer les performances sociales et émotionnelles. Chaque test dure durant de 3 à 10 minutes par jour répartis sur 1 à 4 jours. 48h au minimum sépareront ces tests. Certaines cohortes d’animaux réaliseront aux maximum 9 tests répartis sur 4 semaines alors que d'autres effectueront 4 tests répartis sur 3 semaines.

Impact sur les animaux

D’après les premières études préliminaires, l’inhibition génétique de la protéine d’intérêt ne semble pas induire de phénotype délétère. Elle pourrait toutefois induire potentiellement des altérations des niveaux d’anxiété et/ou de dépression, ce que nous pourrions mettre en évidence dans cette étude si tel est le cas. Les animaux seront soumis à des sessions de tests comportementaux entre 5 et 10 minutes maximum, avec au moins 48h minimum de repos entre chaque test ou session. Lors de ces tests, les animaux sont soumis à des stress légers à modérés pouvant induire des réactions d’évitement ou de peur. Deux de ces tests nécessiteront d’isoler les animaux pendant quelques heures en phase nocturne et un test nécessitera une mise à jeun.

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort car ce sont des animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés dans des projets ultérieurs.

Remplacement

Nous ne pouvons pas avoir recours à des méthodes alternatives pour réaliser un tel projet. Il est nécessaire d’évaluer les différents paramètres comportementaux sur l’animal vigile. En effet la plupart des tests comportementaux réalisés dans le cadre d'un criblage comportemental impliquent une réponse motrice et mais également intégrée de l’animal. Il nous est donc impossible pour cette étape de travailler sur un modèle autre que l’animal.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats fiables et robustes tenant compte de la variabilité interindividuelle, des animaux génétiquement modifiés et du sexe. Un maximum de test est réalisé sur un même groupe d'animaux tant que cela n'entrave pas la fiabilité des résultats expérimentaux et le bien-être animal.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées groupées. Elles font l’objet d’observations régulières tout au long de l'expérience. De l'enrichissement (carrés de coton pour favoriser la nidation, barreaux de bois à ronger et tunnel) est systématiquement disposé dans toutes les cages. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux entreront en procédure doucement après habituation à l'expérimentateur et à la manipulation. Des points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de signe de mal- être (prostration, apathie, réactions anormales), des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut.

Choix des espèces

Nous ne pouvons pas utiliser un autre modèle que la souris car les souris sont génétiquement modifiées pour la protéine d'intérêt. Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte (âge au moins 8 semaines) avec un système nerveux ayant atteint sa pleine maturité fonctionnelle.

45 xénopes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à six laparotomies sous anesthésie pour prélever des fragments d'ovaires, à deux mois d'intervalle, pour étudier des protéines membranaires du lysosome dans les ovocytes. Le porteur reconnaît que chaque laparotomie "provoque un traumatisme à l'animal" même sans signe comportemental visible, et indique que les xénopes seront tués faute de pouvoir être relâchés, l'espèce étant classée envahissante. Il affirme que l'ovocyte de xénope est "nécessaire" quand les lignées cellulaires ne suffisent pas à détecter l'activité étudiée.

Objectifs

Ce projet de biologie cellulaire fondamentale concerne le lysosome, un compartiment interne de la cellule dont le rôle principal est de dégrader les constituants cellulaires obsolètes. Cette dégradation permet, d'une part, d'éviter que les macromolécules et les compartiments cellulaires vieillissants deviennent toxiques pour la cellule et, d'autre part, de recycler les composants simples pour fabriquer de nouvelles macromolécules ou alimenter le métabolisme. Par ailleurs, il a été récemment montré que le lysosome joue un rôle essentiel comme senseur de l'état nutritionnel de la cellule et la régulation de la croissance cellulaire. L'importance du lysosome est montrée par l'existence d'une cinquantaine de maladies génétiques, les maladies lysosomales, qui sont la conséquence de mutations de gènes impliqués dans la biologie du lysosome. Cette problématique est importante car on sait que les dysfonctions du lysosome au niveau du système nerveux central peuvent être associées à des pathologies graves, en particulier, neurodégénératives. Les protéines intralysosomales, qui réalisent la dégradation des composés obsolètes, sont relativement bien caractérisées. En revanche, les protéines de la membrane du lysosome restent peu étudiées bien que certaines d'entre elles soient mutées dans des pathologies humaines. Notre projet consistera à étudier l'activité de protéines membranaires du lysosome, en particulier des transporteurs qui évacuent les produits de dégradation à travers cette membrane et qui permettent leur recyclage dans la cellule.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra d’identifier et d'étudier l’activité de transporteurs pour mieux comprendre la biologie du lysosome, la physiopathologie des maladies associées, et éventuellement de proposer de nouveaux traitements.

Procédures

Les animaux subiront une procédure chirurgicale consistant à ouvrir l'abdomen pour prélever des fragments d'ovaires. La procédure chirurgicale dure une vingtaine de minutes. Chaque animal subira un maximun de 6 opérations.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront plusieurs fois (six fois maximum) une chirurgie consistant à ouvrir l'abdomen pour prélever des sacs ovariens ce qui est susceptible de générer de la douleur. Ces chirurgies de courte durée (15-20 min) sont réalisées sous anesthésie et un intervalle de deux mois minimun est respecté entre deux opérations sur un même animal. Les animaux seront isolés pendant les 4 jours suivants la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au plus tard lors du sixième prélèvement que nous avons défini comme étant le nombre maximal de laparotomies que peut subir un même animal. Plusieurs opérations sur le même animal peuvent être envisagées car la procédure est rapide, l'organe prélevé est très proche de la peau ce qui a peu d'impact sur les autres organes abdominaux et les animaux récupèrent rapidement (reprise de la prise alimentaire et d'une activité normale). Cependant, il faut considérer que, bien qu'aucun signe comportemental visible de souffrance chez le xénope ne soit observé et que les ovaires se régénèrent, chaque laparotomie provoque un traumatisme à l'animal. Le nombre de prélèvements varie selon les établissements entre 3 et 6 . Nous prélevons un faible pourcentage d'ovaire à chaque opération, nous alternons les côtés de l'abdomen en maximisant le temps entre deux opérations ce qui permet dans la majorité des cas de réaliser 6 prélèvements. Les animaux seront mis à mort car ils ne pourront ni être relachés dans la nature, ni replacés. Il est interdit de les relacher dans la nature car le xénope est une espèce envahissante vecteur de maladies comme la chytridiomycose et il sera inscrit en 2024 sur la liste des espèces exotiques envahissantes préoccupantes de l'Union Européenne. Son replacement est difficilement envisageable car la détention d'individus étant soumise à autorisation préfectorale et possession d'un certificat de capacité, il existe peu de possibilités en dehors des laboratoires de recherche.

Remplacement

Quand c'est techniquement possible, nous utiliserons des lignées cellulaires pour les études fonctionnelles des protéines membranaires d'intérêt. Les ovocytes de xénopes seront nécessaires 1- si une activité endogène présente dans les lignées cellulaires masque l'activité de la protéine recombinante étudiée 2- si un très fort taux d'expression de la protéine recombinante est nécessaire pour détecter son activité 3- pour étudier l'activité par électrophysiologie .

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, nous organiserons les expériences pour qu'un même prélèvement d'ovocytes fournisse du matériel pour plusieurs manipulations (caractérisation de deux transporteurs différents ou d'un même transporteur par deux approches expérimentales différentes). Le nombre d'animaux a été calculé pour réaliser un prélèvement par semaine, en effectuant un maximum de six prélèvements par animal et en respectant un délai d'au moins deux mois entre deux prélèvements.

Raffinement

Les xénopes sont hébergés en groupe de douze animaux maximum dans des aquariums en verre. La température et la quailté de l'eau sont rigoureusement controlées. Afin de réduire le stress des xénopes, les parois des aquariums exposés vers l'intérieur de la pièce sont couverts de plastique foncé opaque et des feuilles de nénuphars en plastique flottent à la surface. Cela permet aux xénopes de se cacher comme ils le font dans la nature pour se protéger des prédateurs. Le prélèvement des sacs ovariens est réalisé sous anesthésie générale et la récupération des animaux après la chirurgie est surveillée étroitement pendant les quatre jours qui suivent le prélèvement. Des points limites spécifiques ont été définis. Un maximum de six prélèvements sera effectué par animal avec un délai d'au moins deux mois entre chaque prélèvement.

Choix des espèces

Le xénope commun est le seul animal à produire en grande quantité des cellules géantes, avec peu de protéines endogènes à la membrane plasmique et dans lequelles on peut exprimer des protéines recombinantes en abondance par injection d'ARN synthétique. Les animaux seront agés de 18 mois minimum car ils doivent avoir atteint la maturité sexuelle