Procédures modérées

5 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Le projet crée des lignées privées d'un gène mitochondrial dans le cœur, les muscles ou les neurones, animaux qui développent une maladie cardiaque grave ou des crises d'épilepsie mortelles, puis teste une thérapie génique par injections, y compris chez des nouveau-nés anesthésiés par hypothermie. Chaque souris subit échocardiographies, prélèvements sanguins hebdomadaires et injections intrathécales, les tests comportementaux étant évoqués sans être précisés. Le porteur affirme ne pas pouvoir prédire sur cellules la quantité de protéine produite dans un organisme vivant et conclut à la nécessité du modèle murin, la thérapie pour les patients restant renvoyée à d'éventuels essais futurs.

Objectifs

Les mutations du gène d'intérêt sont responsables de maladies rares qui peuvent être graves. Ces maladies se manifestent souvent dès l'enfance et peuvent affecter plusieurs parties du corps, comme le cerveau, le coeur et le foie. Malheureusement, il n'y a actuellement aucun traitement pour ces maladies, et les traitements existants visent uniquement à soulager les symptômes sans arrêter la progression de la maladie. Ce gène d'intérêt est responsable de la production d'une protéine essentielle pour notre corps, en particulier pour produire de l'énergie dans nos cellules. Cependant, lorsque ce gène est altéré par des mutations, il provoque des problèmes dans la production d'énergie, ce qui peut être très dommageable. Notre projet vise à atteindre trois objectifs principaux : 1. Nous allons créer deux modèles de souris malades en les privant du fonctionnement du gène d'intérêt, soit dans le coeur et les muscles, soit dans les neurones. Nous pensons que ces souris développeront des problèmes similaires à ceux que l'on observe chez les humains. 2. Nous allons développer des virus spéciaux pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. Ces virus agissent comme des petits véhicules pour réparer le gène défectueux. 3. En utilisant ces modèles de souris, nous espérons développer un traitement pour les maladies liées aux mutations du gène d'intérêt en utilisant la thérapie génique. En injectant ces virus dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés. Parce que c'est difficile de faire en sorte que ces virus atteignent le cerveau, nous allons d'abord utiliser des souris où le gène d'intérêt est éteint dans le coeur et les muscles, comme modèle alternatif pour développer notre approche thérapeutique. Avant de tester ces virus sur des souris malades, nous allons d'abord effectuer des tests sur des souris en bonne santé pour comprendre comment le gène étranger fonctionne dans les organes affectés. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Jusqu'à présent, il n'existe aucun traitement pour guérir ou contrôler l'évolution des maladies causées par les mutations du gène d'intérêt. Pour remédier à cette situation, nous travaillons sur la création de modèles de souris qui reproduisent ces maladies. Ces souris nous permettront d'évaluer en toute sécurité et sur le long terme l'efficacité des virus spéciaux conçus pour réparer le gène d'intérêt défectueux. Si ces tests sur les souris réussissent, cela signifie que nous pourrions éviter d'entreprendre des essais inutiles sur des humains, réduisant ainsi leurs souffrances. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques. Notre objectif principal est de développer des traitements pour les personnes atteintes de ces maladies en utilisant des virus adaptés à l'injection chez les humains. Cela pourrait apporter un grand espoir à ceux qui sont touchés par ces maladies.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les souris subiront les gestes suivants: 1. Échocardiographie : Un examen échographique du coeur qui dure 20 minutes par souris. Il sera effectué une fois par semaine à partir de l'âge de quatre semaines lors de la création, et l'étude des souris malades ou une semaine avant l'injection lors de la sélection, de l'optimisation et du développement du traitement. La durée sera jusqu'au point limite adapté pour les souris contrôles malades, ou 12 semaines après ce point pour celles qui ont reçu des injections et présentent une amélioration de leur état de santé lors du développement et de l'optimisation du traitement. 2. Tests comportementaux durent de 5 à 30 minutes par souris. Ils seront réalisés une fois par semaine à partir de l'âge de quatre semaines ou une semaine avant l'apparition de problèmes comportementaux, et se poursuivront jusqu'au point limite prédéterminé. 3. Injections : a) Injections dans la veine temporale dureront environ 5 minutes par souriceau et seront effectuées une fois, sous anesthésie par hypothermie. b) Les injections intrathécales, sous anesthésie générale (environ 40 min par souris), et dans la veine caudale (5 min par souris) seront réalisées une fois. 4. Le prélèvement de sang au niveau de la veine maxillaire, dure ~1 min par souris et sera effectué une fois par semaine. a) Pour les souris injectées par voie intrathécale et dans la veine caudale, les prélèvements de sang commenceront une semaine avant l'injection, puis 72 heures après l'injection, et se poursuivront une fois par semaine jusqu'à la limite prédéterminée ou jusqu'à 12 semaines après cette limite. b) Pour les nouveau-nés, les prélèvements commenceront à l'âge de trois semaines et se poursuivront une fois par semaine jusqu'à la limite prédéterminée ou jusqu'à 12 semaines après cette limite. Les tests comportementaux, les injections et le prélèvement de sang auront lieu dans un établissement n°1, et seulement l’échocardiographie sera réalisée dans un établissement partenaire n°2.

Impact sur les animaux

Les souris où l'expression du gène d'intérêt est supprimée dans les neurones naîtront sans signe de problème, mais elles développeront progressivement des difficultés de marche et de coordination. En fin de vie, ces souris connaîtront des crises d'épilepsie mortelles. Pour les souris où l'expression du gène d'intérêt est abolie dans le cœur et les muscles squelettiques, elles naîtront sans problème apparent, mais avec le temps, elles développeront une maladie du cœur grave, comme cela a été observé dans d'autres modèles de souris similaires. En plus de la maladie cardiaque, ces souris peuvent présenter une perte de poids, des difficultés de mouvement et adopter une posture anormale. Les souris seront soumises à des situations stressantes liées à l'injection, aux tests comportementaux, au transport depuis l’institut jusqu'au centre spécialisé en échocardiographie, ainsi qu'à l'anesthésie pour les échocardiographies. Les injections intrathécales peuvent causer une certaine douleur après l'injection, mais des mesures seront prises pour minimiser leur inconfort.

Devenir

Mise à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

Nous effectuerons des tests sur des cellules pour identifier les morceaux génétiques qui n'expriment pas du tout ou très faiblement le matériel génétique prévu. Cependant, il est important de noter que, même si nous pouvons déterminer ces caractéristiques sur cellules, nous devons encore utiliser des modèles animaux pour nos recherches. C'est parce que nous ne pouvons pas prédire avec certitude combien de la protéine souhaitée sera produite à l'intérieur d'un organisme vivant, et si la quantité générée sera suffisante pour traiter la maladie.

Réduction

Nous avons utilisé des méthodes et des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimum de souris nécessaires pour évaluer l'efficacité du traitement de manière fiable et statistiquement significative. Pour la création et l'étude des modèles de souris malades, nous réduirons le nombre d'animaux en effectuant plusieurs types d'analyses, lorsque cela est possible. Par exemple, la détermination du début et de la progression du phénotype sera effectuée en parallèle avec des tests comportementaux et les tissus extraits des souris à un stade avancé seront utilisés pour des expérimentations de biologie moléculaire. L'échographie est une autre méthode qui nous permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires, car elle permet de suivre l'évolution des souris au fil du temps, évitant ainsi une mise à mort répétée. Une approche similaire peut être appliquée à la sélection des vecteurs, l’optimisation et le développement du traitement.

Raffinement

Nous mettons en place des pratiques visant à réduire la souffrance des souris tout au long de notre recherche. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Les souris seront surveillées au moins deux fois par semaine pour détecter tout signe de souffrance ou d'anxiété. Lors des injections effectuées sur les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress. Cela inclut l'éloignement temporaire de la mère, la préservation de la litière de la cage maternelle, et un prélèvement de sang minime, effectué par un personnel expérimenté de la veine sous-maxillaire considérée comme étant une des zones les moins sensibles. Pour les injections intrathécales, une anesthésie générale sera administrée, et des analgésiques seront utilisés avant et après l'injection pour éviter toute douleur. Nous mettrons en place un suivi régulier des souris. Les cages seront aménagées avec des éléments pour leur bien-être, tels que des boules de coton, des maisons pour se cacher, et des objets à ronger. L'isolement prolongé sera évité autant que possible pour assurer une stimulation sociale. Le transport des souris entre l’institut et le centre expert en échocardiographie se fera dans des cages de transport spécialement conçues, dans des véhicules adaptés pour réduire les vibrations et le bruit.

Choix des espèces

L'utilisation de mammifères est essentielle pour évaluer l'efficacité des virus dans le développement de la thérapie génique. Les souris sont couramment choisies pour les essais de phase I/II en raison de leur similitude physiologique avec les humains et de leur facilité d'élevage et de soins. De plus, les modèles de souris où l'expression du gène d'intérêt est supprimée dans le cœur et le cerveau peuvent développer une pathologie qui ressemble aux symptômes de la maladie gène d'intérêt chez l'homme. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines et plus. Nous commencerons par des nouveau-nés, car à cet âge, le virus peut atteindre le cerveau. Cependant, étant donné que l'expression du virus peut diminuer pendant la croissance rapide des nouveau-nés, nous utiliserons également des souris jeunes adultes (3 à 6 mois) pour certaines parties de nos expériences.

10 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées modérées malgré leur lourdeur. Une pathologie de type Alzheimer et des déficits cognitifs leur sont induits, et chaque animal subit trois neurochirurgies de six à huit heures pour injection intracérébrale et implantation d'électrodes, des IRM et scanners sous anesthésie, des injections de scopolamine, des ponctions lombaires tous les six mois et des tâches en chaise de contention. Le porteur mentionne des restrictions alimentaires ou hydriques, un risque d'infection lié aux électrodes percutanées, puis une euthanasie pour analyse histologique du cerveau. Il affirme que le cortex préfrontal dorsolatéral "n'existe que chez le primate" et conclut au caractère "indispensable" du modèle primate.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans l’objectif général de développer de nouvelles approches de neurostimulation pour les déficits mnésiques, observés en particulier dans la maladie d'Alzheimer. Malgré leur incidence très élevée, il n’existe actuellement pas de traitement pharmacologique adéquat, et la neurostimulation représente une approche alternative qui a déjà fait l’objet de plusieurs études préliminaires. Cependant, les approches testées chez l’humain actuellement produisent des effets variables et insuffisants, et qui ne sont pas statistiquement significatifs. Ces protocoles sont relativement simples car ils ne ciblent qu’une seule aire cérébrale et ce, de manière continue au cours du temps. Nous faisons l’hypothèse qu’une intervention ciblant plusieurs aires cérébrales et modulée au cours du temps mènera à une amélioration plus robuste des performances mnésiques dans un phénotype similaire à celui de la maladie d’Alzheimer. Pour tester cette hypothèse, nous allons implanter chez le primate non-humain des technologies d’électrodes intracrâniennes similaires à celles utilisées chez l’humain, et que nous avons déjà testées dans des modèles imprimés en 3D et chez le cochon. Ces électrodes seront implantées dans des aires critiques pour la mémoire de travail et la mémoire épisodique, dont certaines sont spécifiques aux primates (cortex préfrontal dorsolatéral). Nous allons induire chez 10 macaques cynomolgus une physiopathologie similaire à la maladie d’Alzheimer, ainsi que des déficits cognitifs temporaires, et étudier l’impact de nouvelles méthodes de neurostimulation (ciblant plusieurs aires et adaptées en temps réel en fonction de l’état cérébral) sur cette physiopathologie et sur les performances cognitives de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : (1) d'élucider les mécanismes physiologiques sous-tendant l'apprentissage et la mémoire chez le primate dans des états sains et pathologiques, notamment dans un nouveau modèle physiopathologique de la maladie d’Alzheimer ; (2) de développer une nouvelle catégorie d'interfaces cerveau-machine bidirectionnelles permettant d'enregistrer l'activité neuronale et de la stimuler en temps réel dans plusieurs aires cérébrales différentes, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les troubles mnésiques et la maladie d'Alzheimer, qui ne connaît aucun traitement à l'heure actuelle. Le développement et l’amélioration de ces technologies de neurostimulation est en effet en plein essor, en raison de leur potentiel thérapeutique pour plusieurs maladies neurologiques, incluant non seulement la maladie d’Alzheimer, mais également la maladie de Parkinson, la dépression, les troubles obsessionnels compulsifs, etc. Les applications cliniques sur la maladie d’Alzheimer se limitent actuellement à la stimulation d’une aire unique, avec des protocoles relativement simples, et mènent à des effets très limités et variables. Ce projet va au-delà des protocoles utilisés cliniquement car il stimule plusieurs aires simultanément afin de restaurer leur activité naturelle, et les protocoles de stimulation dépendent de l’état du cerveau grâce à des algorithmes dits en boucle fermée. Un tel développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tâches comportementales en chaise et en comportement libre avec enregistrements électrophysiologiques et neurostimulation (séances quotidiennes de 1-2h pendant toute la durée du projet), à des imagerie par résonance magnétique sous anesthésie (environ 5 séances de 2-3h maximum), à des tomodensitométries sous anesthésie (2 séances de 30 minutes), à 3 procédures neurochirurgicales de 6-8 heures environ (1 pour l'injection intracérébrale de protéines, et 2 pour l'implantation d'électrodes intracérébrales), à des injections intramusculaires de scopolamine (5-10 séances estimées, avec un effet durant 4h maximum), à des ponctions lombaires (réalisées tous les 6 mois à partir de l'implantation et pendant la durée du projet), et à une euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce projet peut avoir les effets indésirables suivants sur les animaux : (1) stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tâche comportementale, (2) douleurs suite à des procédures neurochirurgicales et à l'injection intramusculaire de substances (scopolamine, anesthésiants), (3) potentielles infections liées à la présence d'un système percutané d'électrodes intracérébrales, (4) nuisances liés à la potentielle restriction alimentaire ou hydrique, (5) nuisances liées à l'imagerie, (6) nuisances liées aux transports entre établissements utilisateurs

Devenir

Les animaux seront eutahanasiés et une analyse histologique du cerveau sera effectuée.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les effets de la neurostimulation intracrânienne sur la mémoire lors d’une tâche cognitive. Ceci ne peut être réalisé in vitro. Par ailleurs, les modèles informatiques actuels ne permettent pas de remplacer l’expérimentation animale car les processus mnésiques ne sont pas suffisamment bien compris. Néanmoins, nos travaux de recherche incluent déjà une partie modélisation afin de guider la sélection de certains paramètres de stimulation. Dans le futur, de tels modèles permettraient de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, l’expérimentation humaine n’est pas encore possible à ce stade car les méthodes utilisées sont invasives, impliquent une craniotomie, et nécessitent donc une preuve de concept pré-clinique. En termes de modèle pré-clinique, notre développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.

Réduction

Chaque animal sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, les mêmes animaux seront réutilisés pour plusieurs interventions (effets de la stimulation dans l'état sain et dans différents états pathologiques, i.e. après injection de scopolamine et dévelopement de la tauopathie). Un nombre de 5 animaux est le minimum pour effectuer des tests statistiques de comparaison entre plusieurs états. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur primates non-humains se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Par ailleurs, ces animaux seront divisés en deux groupes d'âge. Au total, nous planifions donc d'utiliser un maximum de 10 animaux. Enfin, certains des animaux utilisés dans ce projet seront des animaux réutilisés de projets précédents.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes, dans une structure spécialement agréée pour l’hébergement et l’utilisation des primates en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce. Les hébergements seront enrichis par des approches standards (jouets pour animaux, nourriture variée, fonds sonore) ainsi que l’utilisation d’un système d’écran tactile pour primates permettant de délivrer des récompenses alimentaires lors de l’exécution de tâches de pointage ou de mémorisation. L’habituation aux interactions avec l’humain et aux diverses procédures expérimentales se fera progressivement et par renforcement positif, à un rythme adapté à chaque animal et qui s’étendra sur une durée de plusieurs mois. Nous utiliserons des méthodes chirurgicales aseptiques ainsi qu’une anesthésie gazeuse suivant au plus près les standards cliniques. Les procédures chirurgicales seront menées par un neurochirurgien, à l’aide d’un système de neuronavigation fondé sur des imageries non-invasives du cerveau par IRM et de la morphologie crânienne par tomodensitométrie, permettant d’atteindre une précision d’implantation submillimétrique. Nous effectuerons un suivi post-opératoire accru, plusieurs fois par jour, qui sera consigné par le personnel en charge de l’animalerie sur une feuille de suivi post-opératoire suivant une échelle d'évaluation du bien-être adaptée au primate, basée sur des critères tels que la posture, l’activité motrice, les interactions sociales, la nutrition, l’hydratation, etc. Le suivi post-opératoire inclura également des antalgiques pour contrôler la douleur, des antibiotiques pour réduire le risque d’infection, et si nécessaire des corticoïdes afin de contrôler de possibles augmentations de pression intracrânienne. Les cicatrices seront inspectées quotidiennement et désinfectées à la bétadine. Les transports entre différents établissements s’effectueront dans une cage dédiée placée sur un chariot protégé des regards extérieurs par une housse, l’animal étant sédaté, maintenu au chaud sous une couverture, et bordé d’une bouillotte. Les éventuelles restrictions alimentaires ou hydriques seront introduites ou arrêtées de manière progressive, maintenues au niveau minimal efficace, et feront l’objet d’une surveillance et d’une réévaluation régulières. Ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité SBEA. Enfin, les procédures seront arrêtées en cas d'atteinte d'un des points limites.

Choix des espèces

Au niveau scientifique, ce projet vise à étudier l’impact de la neurostimulation sur un réseau cérébral à grande échelle constitué notamment de l’hippocampe, du cortex entorhinal et du cortex préfrontal. Il existe une grande homologie de ce réseau entre le macaque et l’humain, mais cette homologie est nettement réduite avec d’autres espèces de vertébrés tels que les rongeurs, chez lesquels la définition du cortex préfrontal fait même débat. De plus, l’entraînement à des tâches cognitives suffisamment élaborées pour avoir un équivalent chez l’humain requiert l’usage de primates. Au niveau technologique, ce projet vise à développer des technologies de neurostimulation qui pourrait par la suite être appliquées à l’humain, ce qui nécessite un modèle anatomique suffisamment proche. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte (i.e. de plus de 5 ans environ). Le premier groupe contiendra des animaux entre 5 et 15 ans environ (âge adule moyen). Le deuxième groupe utilisera des animaux plus âgés (15-30 ans) dans le but d’observer des déficits de mémoire liés au vieillissement cognitif et de les compenser par la neurostimulation.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Un appareil de déplacement orthodontique est posé sous anesthésie et maintenu sept jours, le porteur anticipant une douleur liée à la pression de l'appareil ainsi qu'une perte de poids et un arrêt possible de l'alimentation. Les mandibules sont ensuite prélevées pour étudier le ligament parodontal chez des souris diabétiques et non diabétiques. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale pour simuler l'influence du diabète sur ce ligament, un suivi analgésique n'étant prévu qu'au-delà d'un score de douleur défini.

Objectifs

L’ objectif de ce projet est d’étudier et de comparer les propriétés des différents compartiments du ligament parodontal chez les souris diabétiques et non diabétiques. Cela va nous permettre de mimer la fonctionnalité du ligament chez les humains diabétiques afin de développer de nouvelle approche thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont : - Comparaison des ligaments chez les patients diabétiques et non-diabétiques en fonction d’une force de pression exercée. - Peut-être une contribution au développement des nouveaux traitements pour les maladies concernant les ligaments parodontaux.

Procédures

Un seul type d’intervention : la mise en place d'un système de déplacement orthodontique des dents chez les souris. Un appareil dentaire va être placé pendant 7 jours sur 48 souris (anesthésiées durant la pose de celui-ci).

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à une perte de poids, donc les effets indésirables prévus sont : un animal qui ne boit ou ne s’aliment plus. Et l’on peut également s’attendre à une douleur causée par la pression de l’appareil dentaire.

Devenir

Tous les souris vont être euthanasier ce qui va nous permettre le prélèvement des mandibules et l'étude de la structure du Ligament parodontal (LPD).

Remplacement

Ce projet de recherche consiste à étudier la structure des LPD in vivo sur un modèle animal proche de l’homme pour essayer de comprendre la composition et les propriétés mécaniques de cette structure. Cela va être réalisé pour essayer de trouver de nouvelles méthodes du diagnostic et du traitement des maladies parodontales. Il n’existe pas d’alternatives non animales pour simuler l’influence de du diabète sur le LPD dans des conditions in vitro.

Réduction

La mandibule qui va être divisé en deux hemi-mandibules va réduire le nombre de souris par deux. Concernant le dépôt de l’appareil (effet d’une force parodontale), les expériences de contrôle vont être faites sur la même mandibule, plus précisément avec la deuxième hemi-mandibule qui n’a pas subi la force ce qui va encore réduire le nombre de souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies en Coton, papier Craft et igloo. Concernant les animaux portant l’appareil dentaire nous disposerons du Gel Diet pour faciliter l’accès à la nourriture de nos animaux. Et si la souffrance causée par l’appareil dentaire dépasse le scoring prédéfinie alors un suivi analgésique sera mis en place.

Choix des espèces

La souris représente aussi une espèce mammifère avec une qualité tissulaire proche de celle de l’homme qui nous permettra d’obtenir des conditions expérimentales proches des situations cliniques. L’étude va être faite sur des animaux en croissance (4 semaines) et animaux adultes (10 semaines): pour pouvoir comparer et suivre les changements de la structure du LPD

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Une maladie rénale chronique est induite par un régime enrichi en adénine pendant quatre semaines, suivie de six semaines d'administration de probiotiques dans la joue puis par gavage, avec incisions répétées du bout de la queue, test de tolérance au glucose et passage en cage métabolique. Le porteur reconnaît que les gavages répétés peuvent irriter l'œsophage, tout en indiquant n'avoir observé aucun comportement anormal lors de protocoles similaires. Il affirme qu'aucun modèle mathématique ou cellulaire ne peut répondre à la question et conclut à la nécessité du modèle animal.

Objectifs

La maladie rénale chronique touche 3 millions de français(es). Elle se caractérise par une diminution du fonctionnement des reins et par l’accumulation de déchets, les toxines urémiques, que le rein ne peut plus éliminer. Actuellement, la seule option thérapeutique pour diminuer ces toxines est la dialyse (solution thérapeutique lourde, invasive et réservée aux patients au stade terminal de la maladie). Récemment, le microbiote intestinal a emergé comme un acteur majeur de la production de ces toxines. Ainsi, l’utilisation de probiotiques dans le cadre de la maladie rénale chronique est une stratégie attractive visant à restaurer l’équilibre du microbiote, diminuer les toxines et donc améliorer l’état de santé. Pour rappel, les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui excercent un effet positif sur l’organisme qui les ingère. L’objectif de ce projet est de tester le potentiel thérapeutique de 6 probiotiques, sélectionnés selon des critères spécifiques, regroupés en 3 combinaisons différentes chez des souris ayant une maladie rénale chronique. Les paramètres étudiés seront : la production de toxines, la fonction rénale, le métabolisme du glucose et l’équilibre du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’identifier un ou plusieurs probiotiques capables de diminuer la production des toxines à l’origine de la progression et des complications associées à la maladie rénale chronique. A moyen terme, ces probiotiques pourront être utilisés dans un essai clinique et ainsi, à plus long terme, être proposés comme solutions thérapeutiques aux patients souffrant d’une maladie rénale chronique. Comme mentionné précédemment, aucune solution n’est disponible pour ces patients.

Procédures

Grâce à une nourriture riche en adénine, la maladie rénale chronique sera induite de manière douce. 48 animaux recevront ce régime pendant 4 semaines (pause dans le régime tous les wek-ends, remise des croquettes contrôles). Les 8 autres souris recevront une alimentation normale pendant ces 4 semaines. Les fécès seront collectées avant le traitement aux probiotiques. Les 56 souris seront placées dans des cages individuelles propres pour collecter leurs fécès pendant 30 minutes. Un prélèvement de sang sera réalisé avant le traitement aux probiotiques et après 3 semaines de traitement pour mesurer l’urée (mesure le degré de fonction rénale). Une incision (- de 1mm) sera réalisée au scalpel sur souris vigiles à l’extrêmité de la queue et 15µL de sang seront recueillies avec un capillaire (propre et stérile). La durée du prélèvement sera inférieure à 1 minute/souris. Les 56 souris recevront les probiotiques (ou la solution contrôle) dans le creux de la joue pendant les 3 premières semaines (5 jours/7). L’administration se fera sur animal vigile et durera, contention comprise, 30 secondes/animal. Pendant les 3 semaines suivantes, les 56 souris recevront les probiotiques (ou la solution contrôle) par gavage dans l’estomac (6 jours/7). Le gavage se fera sur animal vigile et durera, contention comprise, 30 secondes/animal. Les 56 souris subiront un test de tolérance au glucose. Les souris seront mises à jeun le matin à 8h pour 6 heures pour mesurer la glycémie à jeun. Une incision (- de 1 mm) sera réalisée au scalpel à l’extrêmité de la queue et une goutte de sang sera deposée sur la bandelette de l’appareil mesurant la concentration de glucose. Ensuite, une injection de glucose sera réalisée dans l’abdomen puis la glycémie sera mesurée en recueillant au bout de la queue une goutte de sang à différents temps après l’injection (15, 30, 45, 60 et 90 minutes). Au cours de la dernière semaine, les 56 souris seront déplacées pour 24 heures, 2 par 2, dans des cages métaboliques pour collecter leur urine et leur fécès. A l’issue de la procédure, les 56 souris seront profondément anesthésiées par une injection dans l’abdomen (une fois 15 secondes contention comprise/animal) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).

Impact sur les animaux

Cette prodécure expérimentale devrait entraîner des nuisances modérées. La nourriture riche en adénine induit une diminution de la prise alimentaire et donc un léger ralentissement de la croissance pondérale pendant les 4 semaines d’induction de la maladie rénale chronique. La petite incision au bout de la queue pour récupérer du sang et mesurer l’urée peut générer du stress chez l’animal. Une contention quotidienne est nécessaire pendant 6 semaines pour réaliser l’administration des probiotiques dans le creux de la joue ou par gavage. Cette contention peut générer un stress chez l’animal le temps de la manipulation (moins d’une minute). La répétition des gavages pendant 3 semaines à raison de 6 jours sur 7 peut générer une irritation de l’œsophage et donc un inconfort pour les animaux. Pour le test de tolérance au glucose, l’incision du bout de la queue, le prélèvement d’une goutte de sang à 6 reprises et l’injection de glucose dans l’abdomen peuvent générer un stress et une légère douleur chez les animaux. Le changement d’environnement lors du passage en cages métaboliques peut générer un léger stress. Il est important de noter qu’au cours de protocoles similaires, il n’a pas été observé de comportements anormaux traduisant un stress, une souffrance, une douleur ou une anxiété des animaux.

Devenir

Les 56 animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du prélèvement sanguin terminal afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans la production des toxines et dans le développement de la maladie rénale chronique sont multifactoriels et le résultat de la communication entre plusieurs organes (intestins, reins, foie,…). Des modèles mathématiques ou de la culture cellulaire ne permettraient pas de répondre à la question scientifique. Une étude clinique chez l’homme n’est pas envisageable à ce stade car il est impossible d’étudier en profondeur la fonction intestinale, la fonction rénale et le métabolisme de façon non invasive. L’étude de l’impact des probiotiques sur la production des toxines et sur l’évolution de la fonction rénale ne peut donc se faire, à ce jour, sans l’aide d’un modèle animal.

Réduction

Les probiotiques utilisés ici n’ont jamais été testés dans le cadre de la maladie rénale chronique. Les dispositions nécessaires ont été prises pour éviter le double emploi de la procédure. Le nombre de souris par groupe a été calculé à l’aide d’un logiciel et sur la base des données obtenues dans de précédents procotoles utilisant des souris atteintes de maladie rénale chronique. Afin d’obtenir une différence significative entre les groupes expérimentaux un effectif de 12 animaux par groupe est nécessaire. Pour le groupe contrôle (pas de maladie rénale chronique), un effectif de 8 animaux est suffisant pour une obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre maximum d’animaux utilisés dans cette procédure sera de 56. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger suite à l’obtention des premiers résultats et pourront également être partagés avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.

Raffinement

L’utilisation du régime riche en adénine évite le récours à la méthode chirurgicale classique (2 interventions). Le régime sera interrompu tous les week-ends afin de limiter la perte de poids. Cette pause permet aux animaux de reprendre le poids perdu tout en ne nuisant pas au développement de la maladie. Les probiotiques seront donnés par gavage seulement pendant la seconde moitié du traitement (3 semaines/6) afin de réduire le stress et les irritations qui pourraient être liés aux gavages. Au cours des 3 premières semaines les administrations se feront dans le creux de la joue. Parmi les probiotiques testés certains sont anaérobies (ils ne doivent pas rentrer en contact avec l’air ambiant) et il a été démontré que l’administration de ces probiotiques par gavages donnaient de meilleurs résultats que l’administration dans le creux de la joue. Par conséquent, la phase de gavages ne peut pas totalement être éliminée du protocole au risque de diminuer fortement ses chances de réussite. Le volume des probiotiques administrés a été réduit au minimum. Les souris seront placées 2 par 2 dans les cages métaboliques pour limiter le stress dû à l’isolement et au changement d’environnement. Une période de 15 minutes d’habituation à ce nouvel environnement aura été réalisée un ou deux jours en amont afin de limiter encore d’avantage le stress des animaux. La concentration de la solution de glucose a été calculée de manière à limiter le volume injecté. Une seule incision au bout de la queue (moins de 1 mm) sera réalisée en début de test pour recueillir la goutte de sang nécessaire à chaque mesure. Les animaux seront maintenus dans leur cage d’origine pour limiter le stress. La glycémie sera surveillée jusqu’à son retour à la valeur basale. Les animaux seront surveillés 3 fois/semaine pendant le régime adénine puis tous les jours par la personne qui réalisera les administrations de probiotiques. Les animaux seront pesés 2 fois/semaine. Les souris seront profondément anesthésiées pour permettre le prélèvement terminal de sang. Les gestes techniques : incisions du bout de la queue, administrations intra-buccales, gavages et injection seront réalisés par une personne expérimentée afin de limiter le stress de l’animal. Des points limites précis, prédictifs et précoces seront définis afin de mettre à mort tout animal le nécessitant. Lors de nos précédents protocoles de ce type aucun mal-être, douleur ou souffrance n’a été observé.

Choix des espèces

La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste un bon modèle pour étudier la maladie rénale chronique et les effets bénéfiques pouvant découler de la supplémentation en probiotiques. Cette espèce possède une physiologie proche de celle de l’homme et permet de reproduire les altérations de la fonction rénale observées chez les patients (accumulation des toxines, modifications du microbiote, modification du métabolisme). Des souris âgées de 8 semaines seront utilisées. A cet âge là, le régime riche en adénine est bien toléré par les animaux et on observe le développement d’une maladie rénale chronique modérée.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Chaque animal subit une chirurgie de section cutanée du réseau lymphatique associée à un curage ganglionnaire sous anesthésie générale, précédée d'un gavage au tamoxifène cinq jours de suite, pour mettre au point un modèle de lymphœdème secondaire. Seules des femelles sont utilisées, le modèle reproduisant le lymphœdème du bras après cancer du sein, et les souris sont tuées en fin de projet pour prélever les tissus. Le porteur affirme qu'il n'existe à ce jour ni organoïde ni explant conservant l'intégrité des vaisseaux lymphatiques et conclut à la nécessité du modèle animal.

Objectifs

Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème peut être soit primaire ou syndrome de Milroy, qui est une maladie génétique due à une mutation du gène codant pour le récepteur VEFGR3 , soit secondaire, généralement la conséquence d’un curage ganglionnaire chez les patients atteints d’un cancer (prostate, sein, mélanome). Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Pour ce projet, nous allons débuter la mise au point d’un nouveau modèle murin de lymphoedème secondaire induit pas une section cutanée du réseau lymphatique associé à un curage ganglionnaire axillaire et brachial chez les souris transgéniques ou le système lymphatique peut être visualisé grâce à l'expression spécifique d'une proteine fluorescente dans les cellules lymphatiques. Ceci va nous permettre de déterminer quelles sont les conséquences du lymphœdème sur l'ensemble du réseau lymphatique dermal et sous-cutané.

Bénéfices attendus

Nous pourrons établir l'architecture du systeme lymphatique et son organisation avec les différents compartiments du tissu dermal dans un contexte sain et pathologique. A ce jour, seuls les vaisseaux superficiels c'est à dire les capillaires lymphatiques pres du derme sont analysés. Or, un large reseau de vaisseaux pré-collecteurs sous le derme est affecté. Nous espérons pas ce projet déterminer de nouveaux marqueurs des cellules endothéliales lymphatiques nous permettant de transposer nos connaissances sur la pathologie humaine du lymphoedeme, et de mieux comprendre cette pathologie.

Procédures

les animaux subissent une seule procédure chirurgicale sous anesthésie générale. La durée de la procédure est de 20 min approximativement par animal. Les souris seront traitées par gavage oral avec 100ul solution de tamoxifene à 10mg/ml dissous dans de l'huile durant 5 jours consécutifs à l'age adulte (1mg/jour). cette procedure dure moins de 30 sec.

Impact sur les animaux

Les animaux seront observés par le chercheur ou les personnels de l’animalerie tous les jours pendant 1 semaine apres chirurgie et puis 3 fois par semaine pendant le reste de l'expérimentation . Ce suivi post-opératoire aura pour but de détecter une mauvaise cicatrisation, ou le moindre signe de douleur (signes tels que le dos encourbé, poils hérissés, isolement...), la capacité de s'alimenter, de boire, et de se déplacer.

Devenir

Les souris serons mis à mort à la fin du projet afin de prélever les tissus et organes pour des expérimentations en histologie.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de système 3D, d'organoïdes ou d'explants permettant de garder l'intégrité et la fonctionnalité des vaisseaux lymphatiques et vasculaires. Nous souhaitons apres cette étude transposer nos hypotheses sur l'étude de biopsies de patients ayant subi une lipodermatectomie du à un lymphoedeme secondaire trop important.

Réduction

Seules les souris femelles seront analysées dans cette étude car la chirurgie du lymphoedeme secondaire mime le lymphoedeme secondaire apres un cancer du sein chez la femme. Il existe une variabilité du au modele de chirurgie donc nos lots seront de 8 animaux pour chaque objectif. Les quantifications seront faites à partir de l'analyse des images 3D. Les tests statistiques dépendront des parametres analysés sur chaque image.

Raffinement

Les animaux seront 5 par cage avec l'ajout de tunnels et de cachettes. L'utilisation d'anesthésique et d'analgésiques sera réalisée pour limiter la douleur de l'animal avant et apres opération pour minimiser les effets indésirables sur le bien-être pour les animaux.. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance: dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessus, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux seront observés par le chercheur ou les personnels de l’animalerie tous les jours pendant 1 semaine puis 3 fois par semaine pendant le reste de l’expérimentation. Ce suivi aura pour but de détecter la douleur (signes tels que le dos encourbé, poils hérissés, isolement...), détecter la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer selon une grille de lecture par score. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, l'animal sera anesthésié par anesthésie chimique et apres perte de conscience, les animaux seront euthanasiés. Une observation quotidienne sera réalisée pendant la durée du projet. Dans nos connaissances actuelles, les procédures ne doivent pas changer le comportement des animaux et leur bien-être, même si les animaux sont gardés jusqu’à l’âge adulte.

Choix des espèces

L'étude des souris génétiquement modifiés est largement répandue et partagée dans la communaute scientifique internationale ce qui est un avantage en termes de transmission et de validité de nos résultats et permet une analyse integrée sur plusieurs tissus. Le stade de developpement est adulte. les animaux seront au stade adulte entre 8-10 semaines afin de mimer les conditions de la pathologie humaine.

12 primates non-humains, six macaques à longue queue et six babouins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Importés pour une "expérimentation terminale", ils subissent des séances d'imagerie répétées sous anesthésie générale et une chirurgie du cortex visuel avec pose d'électrodes, précédées de mises à jeun. Le porteur indique un caractère répétitif de l'anesthésie et des irritations aux oreilles et à la gorge liées à la contention et à l'intubation. Il affirme que le primate non-humain est "la seule espèce pertinente" et qu'aucun modèle computationnel ne peut le remplacer, l'étude étant présentée comme un "raffinement".

Objectifs

L’activité du cerveau et en particulier des neurones dépends de l’apport énergétique (nutriments + oxygène) qui est régulé par le flux sanguin. Connaître précisément la relation entre l’activité des neurones et l’apport sanguin, un phénomène connu comme « couplage neurovasculaire », permettrait ainsi de détecter un mauvais fonctionnement du cerveau qui est présent dans un grand nombre de maladies neurologiques. Aujourd’hui, aucune mesure non-invasive est capable de mesurer le couplage neurovasculaire chez l’homme ou chez l’animal de laboratoire. L’objectif de ce projet de recherche est de comparer une méthode sans intervention chirurgicale et donc non-invasive (par imagerie par résonance magnétique) avec une méthode invasive standard pour la quantification de l’activité neuronale et métabolique chez le primate non-humain anesthésié. Deux grands principes seront étudiés dans ce projet : le couplage neuro-vasculaire et le couplage « métabo-vasculaire », par l’enregistrement simultané de l’activité électrique neuronale à l’aide d’électrodes et de l’activité vasculaire à l’aide de l’imagerie fonctionnelle ultrasonore, et par l’enregistrement simultané de grandeurs métaboliques (comme la quantité locale de lactate, de glucose ou d’oxygène) et de l’activité vasculaire. Si la méthode non-invasive est validée, cela aura un impact majeur dans les projets de recherche qui font appel à l’animal pour ce type de mesure (raffinement et réduction) et pour l’homme, vu que les séquence d’imagerie RMN (résonnance magnetique nucléaire) peuvent facilement s’implémenter en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une compréhension plus fine du couplage neurovasculaire dans deux modèles de primates non-humains (chez le babouin et le macaque) afin de mieux comprendre le lien entre activité et le métabolisme neuronale et activité vasculaire qui apporte l’énergie nécessaire à cette activité. La comparaison entre les mesures non-invasives obtenues grâce à l’imagerie RMN et invasives en plaçant des électrodes permettra de valider la mesure par imagerie et remplacer une méthode invasive par une méthode non-invasive. Ceci constitue un raffinement et impacte directement le bien-être des animaux utilisés en recherche et des patients qui pourront bénéficier de cette nouvelle technologie. Il serait ainsi possible d’obtenir des données sur le dysfonctionnement du lien entre la vascularisation et l’activité neuronale chez les patients atteints de maladies neurologiques et utiliser cette mesure comme un biomarqueur pour suivre l’efficacité d’un traitement. De plus, grâce au réseau du don de tissus, les tissus biologiques éventuellement récupérés pourront être utilisés à la réalisation d’autres objectifs scientifiques, différents de ceux prévus dans cette étude.

Procédures

Les animaux seront soumis à un maximum de 6 séances d’imagerie de 3h max sous anesthésie générale non-invasive et pratiqué en routine chez l’animal d'une durée maximale de 7 heures comprenant une chirurgie réalisée en condition d'asepsie au niveau du cortex visuel primaire ainsi que des enregistrements de l'activité vasculaire (par ultrasons fonctionnels), électriques (par électrophysiologie) et métaboliques (avec des électrodes adaptées à ces enregistrements).

Impact sur les animaux

La procédure d’imagerie est non-invasive et indolore. Cependant, le caractère répétitif de l’anesthésie et la mise à jeun la veille de chaque séance d’imagerie sont prises en compte et des point limites sont établis à cet égard. Le risque d’hypothermie est contrôlé par le soutien thermique (couverture chauffante et plaides) pendant les examens d’imagerie et la chirurgie. L’irritation locale au niveau des oreilles pour fixation de la tête dans le cadre stéréotaxique et de la gorge suite à l’intubation sont minimisés grâce à l’utilisation de la lidocaïne en gel et la xylocaïne en spray respectivement comme détaillé dans la procédure expérimentale. Le temps d’acclimatation et le respect de temps de pause entre séances d’imagerie devraient résulter en une nuisance minime pour les animaux. La pesée hebdomadaire permettra de dépister toute altération du poids causée par les mises à jeun répétées et compenser avec un supplément de nourriture comme indiqué dans les points d’alerte avant d’arriver aux points limites.

Devenir

A la fin de l’étude les primates non-humains seront euthanasiés pour valider la sensibilité et la robustesse d’une mesure non-invasive du métabolisme neuronal versus une mesure invasive dans une optique de remplacement technologique. A l'issue de cette dernière, un don de tissus sera effectué dans une optique de réduction de nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques afin de valoriser l'animal.

Remplacement

Le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour atteindre les objectifs fixés dans ce projet, les couplages « neuro-vasculaire » et « métabo-vasculaire » nécessitant un fonctionnement normal du système cardio-vasculaire, il n’est pas possible d’utiliser des systèmes computationnels ou autres dispositifs alternatifs à l’utilisation d’animaux. Le modèle primate non-humain très utilisé pour sa proximité anatomo-fonctionnelle avec le cerveau humain est la seule espèce pertinente pour ce type d’étude.

Réduction

Un total de 12 (2x n=6) primates sera prévu dans ce projet pour s’assurer de la robustesse des mesures IRM (nombre habituel pour obtenir des valeurs moyennes fiables à ~10% chez le rongeur dans l’expérience du laboratoire). Le suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives (imagerie) permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet significatif. L’utilisation de macaques (le modèle le plus répandu en laboratoire) et babouins (un modèle avec volume et densité neuronale plus proche de l’homme) vise à rajouter de la robustesse et prédictivité des mesures non-invasives chez l’homme

Raffinement

Afin de minimiser le stress et l’angoisse des animaux importés à des fins d’expérimentation terminale, les babouins et les macaques seront importés au moins un mois avant la date de la première séance d’IRM. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation d’examens d’imagerie dans le laboratoire comporte des analgésiques pour minimiser les sensations désagréables lors de l’intubation et l’emplacement dans le cadre d’imagerie. Des point limites ont été définis en lien avec une potentielle réaction à l’anesthésie de certains individus qui est très rarement observé dans notre laboratoire. Les primates non-humains seront hébergés en groupes sociaux dans des cages équipées spécifiques de l’espèce. On limitera la durée de l’hébergement individuel lors des mises à jeun pour les séances d’IRM tout en gardant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres primates. Un enrichissement adapté sera mis en place : structurel (balançoire et visuelle, miroir); alimentaire (fruits, graines dans le fourrage); manipulable (jouets); auditif (musique).

Choix des espèces

Les macaques et les babouins possèdent une architecture cérébrale semblable à celle chez l’humain, avec notamment un cortex plissé présentant de nombreux circonvolutions et sillons cérébraux. De plus, le métabolisme des primates non-humains est plus proche du métabolisme humain que ne l’est le métabolisme du rongeur. De plus, le cortex visuel des primates est particulièrement développé et sa structure est stabilisé, donc l’étude vasculaire, électrophysiologique et métabolique chez le primate anesthésié est une expérimentation appropriée pour la compréhension du fonctionnement du système nerveux central chez l’humain. Les animaux seront à un stade adulte (macaque) ou jeune adulte (babouin) pour uniformiser la taille de la tête et donc la sensibilité lors des mesures par RMN notamment.

640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée pour prélèvement d'organes et les animaux d'élevage gardés vivants pour maintenir la lignée. Génétiquement modifiées, elles portent une mutation qui provoque un déficit immunitaire et une inflammation pulmonaire, et subissent deux prélèvements de tissus sur animal vigile pour génotypage. Le porteur indique que les souris atteignant les points limites sont mises à mort. Il affirme que l'étude des coopérations cellulaires dans un "organisme entier" impose un modèle in vivo et retient la souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes d’une mutation génétique impactant les fonctions lymphocytaires ce qui conduit à induire un déficit immunitaire chez les souris. Cette demande concerne le maintien de la lignée de souris transgénique ainsi que son génotypage.

Bénéfices attendus

Les souris porteuse de la mutation étudiée dans ce projet présentent une baisse du taux de lymphocytes (phénotype de déficit immunitaire) et une inflammation pulmonaire, dont nous souhaitons comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par l’étude des cellules immunitaires des souris, et de leur production d’anticorps. La mutation gain étudiée a été décrite chez des patients atteints d’une maladie inflammatoire appelée SAVI, ainsi les mécanismes qui seront décrits grâce à l’étude des souris mutantes pourront permettre une meilleure compréhension de la maladie et une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Deux prélèvements tissulaires seront réalisés sur chaque animal vigile pour une durée de 2 minutes environ pour chaque geste.

Impact sur les animaux

Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire.

Devenir

Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier les réponses immunes qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la moelle osseuse, le thymus et la rate. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire, car les connaissances chez la souris sont très développées dans le domaine de l'immunité.

Réduction

Le nombre total d‘animaux comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Les croisements seront arrêtés dès l'obtention des lots expérimentaux afin d'éviter la surproduction.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Chaque animal sera mis à mort dès que le score correspondant au point limite est atteint. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer (entre 2-3 mois d'âge et 8 mois) pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations compris entre 2-3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et 8 mois.