Procédures modérées

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lésions précancéreuses de la prostate leur sont induites par des injections répétées, puis elles reçoivent pendant 28 jours des composés par injection intrapéritonéale ou par gavage, seuls ou combinés. Le porteur affirme que l'induction n'entraîne "pas de douleur ni de souffrance dans la fenêtre choisie" et n'attend pas d'effet indésirable des composés testés, l'objet étant de cibler une population cellulaire liée à la résistance du cancer. Il indique que des études en culture ont précédé le projet et envisage des organoïdes en trois dimensions s'ils reproduisent fidèlement les tumeurs.

Objectifs

Le cancer de la prostate est la 3ème cause de mortalité par cancer chez l'homme. Dès lors qu'il est invasif, il conduit inévitablément au décès du patient par échappement aux traitements actuels. Notre laboratoire et d'autres ont identifié des populations des cellules épithéliales résistantes aux traitements dans des modèles "souris" qui reproduisent l'évolution du cancer de la prostate chez l'homme. Par des analyses moléculaires, nos collaborateurs ont identifié des molécules régulatrices de cellules résistantes aux traitements. Ces facteurs réprésentent donc des cibles thérapeutiques potentielles pour les formes aggressives du cancer de la prostate. L'efficacité des composés chimiques ciblant ces facteurs a déjà été demontré par nos collaborateurs dans des systèmes cellulaires en culture. Nous aimerions continuer leur charactérisation dans le modèle de souris pour étudier l'effet de ces drogues sur les tumeurs prostatiques aggressives.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'effectuer l'analyse des potentielles cibles thérapeutiques sur un modèle du cancer de la prostate aggressif.

Procédures

Les animaux seront sujets à des traitements par des injections au niveau de l'abdomen pendant 5 jours pour induire l'apparition des lésion précancéreuses prostatiques. Une fois que les lésions précancéreuses deviennent sufisamment avancées (3 ou 5 mois après injection initiale), des injections quotidiennnes d'un des composés en intra-péritonéale pendant 28 jours seront réalisées (30 souris/lot). Un autre composé sera administré aux souris par gavage tous les 3 jours pendant 28 jours (30 souris/lot). Enfin, une thérapie combinée sera également vérifiée avec un composé injecté en intrapéritonéal et l'autre - administré par gavage à la même souris (30 souris/lot). Les injections intra-péritonéales comprennent une préhension de souris et l'injection en elle-même ce qui prend environ 10 secondes. Les gavages comprennent une préhension de souris et le gavage en lui-même, environ 15 secondes sont réquises pour effectuer ce geste par le personnel formé.

Impact sur les animaux

Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables liés aux gavages.Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables liés aux composés administrés. L'induction des lésions précancereuses dans notre modèle de souris conduit à une augmentation de taille de prostate mais ne cause pas de douleur ou de souffrance dans la fenêtre choisie pour cette étude d'après les analyses longitudinales de cette lignée effectués dans le cadre du projet antérieur.

Devenir

Tous les animaux de l'étude seront mis à mort et sa prostate sera utilisé pour les analyses moléculaires et cellulaires.

Remplacement

Des études préliminaires ont été ménées par nos collaborateurs sur les modèles cellulaires en culture pour montrer l'efficacité des drogues sur les cellules épithéliales similaires à celles retrouvées dans notre modèle de souris. Nous allons mettre en place des cultures d'organoides (cultures cellulaires en 3D) à partir des souris non-traîtées et si ces derniers reproduisent de manière assez fidèle les charactéristiques moléculaires de nos tumeurs, nous envisageons de les utiliser davantage dans le cadre de ce projet.

Réduction

Nous prévoyons d'utiliser 30 souris par lot expérimental dont 10 souris pour les analyses histologiques, 10 souris pour les analyses de populations cellulaire et 10 souris pour les expériences sur les organoides. A l'aide des calculs statistiques, nous avons estimé que 10 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement sur les populations cellulaires étudiées.

Raffinement

Immédiatement après et la semaine suivante les injections intra-péritonéales, la souris sera surveillée afin de détecter les signes de douleurs, des irritations ou d'inflammation du site d'injection. De plus, les injections seront réalisées en altérnant les côtés d'injection. Immédiatement après le gavage oral, la souris sera surveillée pour détecter les signes de passage de traitement dans les conduits respiratoires. Suite aux traitements, les souris seront pésées quotidiennement. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage en cas de perte de poids. Tout animal en souffrance sans possibilité de soulagement sera sorti de l'étude et mis à mort.

Choix des espèces

Notre modèle de souris récapitule de manière fidèle l'évolution des lésions précancéreuses et du cancer de la prostate chez l'homme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'efficacité des traitements, nous allons étudier l'effet systémique de ces traitement ce qui est impossible en utilisant les systèmes in vitro. Seuls les souris mâles adultes seront utilisés pour ce projet car l'induction de lésions précancéreuses doit se faire sur des prostates matures et donc après la puberté.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de protéines puis de parasites du paludisme, un traitement, des prélèvements sanguins tous les un à deux jours et, sous anesthésie, une exposition de 45 minutes à des piqûres de moustiques. Le porteur signale un affaiblissement, une anémie et de possibles symptômes neurologiques liés à l'infection, l'objet étant de tester une immunothérapie redirigeant des anticorps existants vers les globules rouges infectés. Il indique qu'aucune culture continue de ce parasite ne permet de remplacer la souris pour produire et sélectionner les parasites transgéniques.

Objectifs

Le paludisme est dû à l’infection par le parasite Plasmodium, qui se multiplie dans les globules rouges. L’émergence de parasites résistants aux médicaments antipaludiques actuels impose de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet a pour objectif d’évaluer dans un modèle murin une nouvelle stratégie d’immunothérapie contre le paludisme, visant à rediriger une réponse anticorps pré-existante vers les globules rouges infectés pour entraîner leur destruction par le système immunitaire. Une preuve de concept de cette stratégie a déjà été établie contre des cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à apporter la preuve de concept de l'efficacité d'une stratégie d'immunothérapie contre le paludisme dans un modèle pré-clinique murin. Le développement de thérapies basées cette méthode, interférant avec la pathogénicité et/ou la transmission du parasite, pourrait offrir de nouvelles alternatives de contrôle du paludisme.

Procédures

Administrations sur animaux vigiles: injection intrapéritonéale d'anesthésiants (1 injection, durée 10 secondes), injection sous-cutanée de protéines (3 injections espacées de 2 semaines, durée du geste 10-15 secondes), injection intrapéritonéale de protéines (2 injections espacés de 2 jours, durée du geste 10-15 secondes), injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), injection intraveineuse de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), injection intrapéritonéale de médicament (3 injections espacées d'1 jour, durée du geste 10 secondes), administration de médicament dans l'eau de boisson (durée 7 à 10 jours). Prélèvements sur animaux vigiles: prélèvement d'une goutte de sang ( tous les 1 à 2 jours pendant 3 à 21 jours, durée du geste 10 secondes). Prélèvements sur animaux anesthésiés: prélèvement de sang (acte unique, durée 10 minutes, suivi immédiatement par une euthanasie par une méthode réglementaire). Exposition d'animaux anesthésiés à des piqûres de moustiques (pendant 45 minutes).

Impact sur les animaux

Stress lié à la contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales, intraveineuses ou sous- cutanées sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, douleur au site des injections sous-cutanées, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie, symptômes neurologiques).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.

Remplacement

Le projet vise à évaluer dans un modèle murin une nouvelle stratégie d'immunothérapie contre le paludisme, notamment à l'aide de parasites génétiquement modifiés. Le projet nécessite l'utilisation d'un organisme immuno-compétent, en l'occurrence la souris. De plus, il n'existe pas à l'heure actuelle de système de culture continue des Plasmodium berghei in vitro permettant le remplacement du modèle murin pour la production et la sélection de parasites transgéniques.

Réduction

Au total ce projet utilisera 320 souris. Le nombre d'animaux a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs des procédures. La taille des effectifs a été établie à l'aide d'un calcul de puissance pour permettre de détecter un effet significatif par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères (2 à 5 par cage) dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Les conditions environnementales des locaux d’hébergement sont réglementaires. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation sera également respectée dans l'appareil de contention avant les injections intraveineuses sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. La présence de points limites définis permettra d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux infectés par Plasmodium, la nourriture pourra être donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal permettant des études fonctionnelles chez Plasmodium berghei, un parasite qui reproduit de multiples aspects du paludisme causé par les parasites infectant l'homme. La souris est un hôte doté d'un système immunitaire permettant d'évaluer l'efficacité de stratégies d'immunothérapie contre le paludisme. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.

837 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de mélanome leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent des cellules immunitaires modifiées, un suivi par imagerie pendant neuf semaines et des prélèvements sanguins hebdomadaires, une partie étant soumise à un régime carencé en acides aminés. Le porteur reconnaît que ces tumeurs peuvent entraîner une perte de poids importante et gêner les déplacements, l'objet étant de tester un système limitant l'expression du récepteur anti-tumoral à l'intérieur de la tumeur. Il affirme s'appuyer sur de nombreuses données en culture cellulaire mais conclut à la nécessité de la souris pour valider l'approche sur un "organisme entier".

Objectifs

Aujourd’hui de nombreux essais ont démontré l’efficacité de l’immunothérapie par injection de cellules immunitaires modifiées pour exprimer un récepteur leur permettant de détruire les cellules tumorales, notamment dans le cas des leucémies et lymphomes. Cependant leur efficacité est bien moindre quand il s’agit de tumeurs solides telles que les mélanomes, en raison des propriétés de la tumeur qui supprime la réponse immunitaire contre les cellules cancéreuses. La solution proposée est d’équiper les cellules immunitaires du patient avec un nouveau récepteur leur permettant de détecter et détruire efficacement les cellules tumorales. Cependant, ces modifications qui renforcent l’agressivité des cellules immunitaires peuvent engendrer des effets secondaires de destruction des tissus sains de l’organisme. Pour accroitre l’efficacité des cellules immunitaires tout en minimisant les effets adverses, nous préconisons l’utilisation de notre système de régulation pour que les cellules immunitaires modifiées, n’expriment le récepteur anti-tumoral qu’à l’intérieur de la tumeur. En effet cette régulation permet de contrôler spatialement (dans la tumeur) ou temporellement (par le biais d’un traitement pharmacologique ou d’un régime spécial), l’expression du récepteur anti-tumoral à la surface de ces cellules permettant d’allier efficacité et sécurité dans le contexte de ces thérapies. Le contrôle de l’expression du récepteur anti-tumoral permettrait d’éviter les effets secondaires précédemment mentionnés de manière à considérablement accroitre l’efficacité et le contrôle de ces stratégies d’immunothérapies dans le contexte des tumeurs solides. L’étude préclinique proposée constitue une étape indispensable de notre projet de sécurisation des thérapies par récepteur anti-tumoral à l’aide du système de régulation, pour confirmer chez l’animal les résultats précédemment obtenus, montrant l’efficacité de ce système sur cellules isolées.

Bénéfices attendus

Ce projet qui combine des approches en culture cellulaire et chez l’animal, permettra de caractériser, pour la première fois, l’efficacité d’un système de régulation pour l’expression exclusive du récepteur anti-tumoral à l’intérieur de la tumeur à l’aide de conditions présentes de manière systématique dans les tumeurs solides, à savoir une baisse des niveaux de nutriments et d’oxygène. Les avancées remarquables récentes dans ce domaine de recherche, en équipant les cellules immunitaires avec des récepteurs anti-tumoraux pour combattre les cancers, permettent désormais de combiner différentes thérapies innovantes et de décupler l’efficacité de ces nouveaux traitements en les adaptant à chaque patient. Notre projet innovant, met en avant les bénéfices de notre système permettant l’expression du récepteur anti-tumoral par les conditions particulières présentes dans la tumeur et prévient les effets adverses autrement liés à ces traitements. De plus ce système d’expression régulée permettra de rendre possible une thérapie combinant, régimes alimentaire spéciaux, ayant par ailleurs d’importants effets anti- tumoraux. Ces effets combinés sur l’expression du récepteur anti-tumoral et sur la réduction de la croissance des tumeurs peuvent potentiellement favoriser l’effet curatif. Dans ce projet, nous nous attendons à ce que notre système restreigne l’expression du récepteur anti-tumoral spatialement et temporellement, permettant de réduire les risques d’effets secondaires délétères chez les patients. En effet, les connaissances générées par nos travaux pourraient à terme être exploitées dans le cadre des thérapies par l’expression d’un récepteur anti-tumoral dans les cellules immunitaires, chez des patients atteints de tumeurs solides, aujourd’hui dans une impasse thérapeutique.

Procédures

Ce projet inclut des injections sous la peau de cellules tumorales et en intraveineux dans la queue pour les injections de cellules immunitaires. Les injections en sous-cutané seront faites sur souris anesthésiées tandis que les injections en intraveineux seront faite sur souris éveillées et ne dépasseront pas 5 minutes. L’injection sous la peau de cellules tumorales faite au début de l’expérience permettra la croissance d’une tumeur de mélanome et les injections intraveineuses faites 8 jours après l’injection des cellules tumorales, permettront d’administrer les cellules immunitaires, permettant la potentielle destruction de la tumeur. Le suivi de la croissance tumorale sera effectué par imagerie non invasive sur souris anesthésiées (maximum 10 minutes par individu) une fois par semaine pendant 9 semaines. De plus, des prélèvements sanguins (au niveau de la veine la joue; durée 30s) seront effectués une fois par semaine pour quantifier l’état inflammatoire des animaux (9 prélèvements au maximum). Pour tester la combinaison de notre système d’expression avec un régime alimentaire altérant la croissance tumorale, les souris suivront un régime alimentaire à base de croquettes carencées en acides aminés à partir du jour de l’injection des cellules immunitaires. En parallèle, pour tester la combinaison de notre système avec l’utilisation de molécules cliniques permettant de réduire la croissance tumorale, des souris recevront une injection intraveineuse d’une de ces molécules à des doses cliniques, à partir du jour de l’injection des cellules immunitaires.

Impact sur les animaux

Les protocoles de développement de tumeurs utilisées dans ce projet pourraient entraîner une perte de poids importante chez les animaux et une réduction de leur activité. Les tumeurs sous-cutanées sur le flanc de l’animal, même celles considérées comme relativement petites, pourraient causer des problèmes aux animaux lors de leur toilettage ou de leurs mouvements, ainsi que des lésions cutanées bien que celles-ci n’aient pas été décrites. Les procédures d’injection de médicaments intraveineux ne devraient pas produire de nuisances particulières. Par ailleurs, le traitement par un régime alimentaire spécial se fera en utilisant des croquettes spéciales mais ne devrait être associé à aucun effet indésirable important.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans les procédures expérimentales seront euthanasiés en fin d'étude. Les tumeurs seront prélevées pour leur analyse histologique ; la rate et le sang seront également prélevés pour l’analyse par immuno- marquage et cytométrie, des cellules immunitaires administrées.

Remplacement

L’étude de l’expression du récepteur anti-tumoral induite dans la tumeur ou par le biais d’un régime alimentaire ou d’un traitement pharmacologique, nécessite des modèles animaux récapitulant des conditions complexes, qu’on ne sait pas modéliser en culture de cellules. Cependant, dans un souci de pratique éthique, en accord avec la règle des 3R (réduire, remplacer, raffiner), la faisabilité de ce projet est basée sur une grande quantité de données préalablement réalisées sur cellules primaires humaines en culture. Ces expériences indiquent dans des modèles de culture de masses de cellules tumorales, qu’il est possible d’induire l’expression du récepteur anti-tumoral par les cellules immunitaires modifiées, grâce à notre système de régulation dans des conditions récapitulant des aspects importants de l’environnement tumoral. Cependant, l’étude chez l’animal, doit permettre de mesurer le bénéfice clinique de la greffe de cellules exprimant le récepteur anti-tumoral de façon régulée dans la tumeur sur un organisme entier, plus proche de la clinique humaine. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser la souris comme modèle d’étude pour ce projet de recherche, car cela permettra d’étudier plus précisément la régulation du récepteur anti- tumoral, dans un contexte de développement tumoral dans un organisme entier. Les résultats obtenus contribueront à l’élaboration de nouveaux traitements pour le ciblage de tumeurs solides en médecine humaine.

Réduction

Pour standardiser nos résultats, nous utiliserons des souris mâles. À la fin de chaque expérience, une étude rétrospective permettra de déterminer la possibilité de réduire le nombre d'animaux dans les expériences suivantes. L’imagerie, nous permettra de faire des observations sur l’animal vivant et ainsi de maximiser l’utilité de chaque animal. Les données et les échantillons issus de tissus seront stockés pour une utilisation ultérieure par nous- mêmes ou par d'autres. Nous utiliserons le nombre minimal d'individus pour chaque procédure tout en garantissant la fiabilité des résultats (reproductibilité et significativité). Nous n’avons pas d’expérience antérieure nous permettant d’évaluer statistiquement la taille des groupes nécessaire pour évaluer un effet biologique avec ce modèle. Cependant de nombreuses publications sur des modèles semblables parviennent à obtenir des différences statistiquement significatives entre groupes de 5 à 9 individus. Aussi, dans notre étude nous prévoyons d’utiliser 9 animaux par groupe pour obtenir des résultats permettant de pouvoir effectuer des analyses statistiques. Après accumulation de plusieurs expériences, si les données sont reproductibles et suivent une distribution normale et peuvent être comparées unilatéralement, le nombre d’animaux nécessaire pour chaque nouvelle expérience sera revue à la baisse.

Raffinement

Une surveillance quotidienne sera mise en place pour permettre un suivi clinique des animaux utilisés avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de score (grille de signes cliniques prenant en compte l’apparence physique, le comportement, le poids, etc.). Toute souris qui atteindra un point limite sera euthanasiée. Les études menées ne permettent pas l'utilisation d'un traitement anti-inflammatoire en raison d’une possible perturbation de la réponse immunitaire. En cas de signe de douleur (expression faciale, posture voutée) ne justifiant pas l’euthanasie immédiate, les souris seront traitées avec un antalgique. Si 24h après l’administration d’antalgique, l’état de l’animal ne s’améliore pas, nous procèderons à l’euthanasie de l’animal. Une étude rétrospective sera menée pour déterminer les moyens de standardiser les procédures afin de minimiser la variabilité des gestes expérimentaux et ainsi pouvoir réduire le nombre d’animaux dans les expériences suivantes. Le design expérimental a été conçu pour minimiser la douleur des animaux, notamment en limitant le nombre de cellules tumorales injectées, la taille maximale des tumeurs ainsi que la durée des expériences. La grille de score sera utilisée quotidiennement, c’est-à-dire incluant les week-ends, pendant 9 semaines.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus utilisé pour les études concernant le développement tumoral, car le taux de prise de greffe est le plus élevé. De plus, par sa petite taille, la souris est facilement manipulable et il existe dans cette espèce plusieurs types de souris qui acceptent la greffe de cellules d’autres espèces. Aussi, ces dernières sont couramment utilisées pour étudier le fonctionnement de cellules immunitaires humaines dans le contexte d’un cancer implanté chez ces animaux. Les souris sans système immunitaire présentent également la particularité de ne pas avoir de poils, ce qui facilite le suivi de la formation de la tumeur. Le bien-être de la souris est également facilement évaluable notamment par l’observation des signes cliniques et de modifications du comportement et peut être pris en charge. Les souris utilisées seront âgées de 6 à 8 semaines, âge à partir duquel les souris sont considérées comme jeunes adultes.

1 530 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous la peau de cellules tumorales de prostate humaine, 180 d'entre elles subissant en outre une castration, avant l'administration répétée de composés de thérapie génique pendant onze semaines et le prélèvement terminal du sang et des tumeurs. Le porteur décrit une technologie "prometteuse" relevant de la médecine de précision, dont les bénéfices pour les patients sont renvoyés au futur, l'étape immédiate étant de mesurer l'efficacité de composés déjà criblés in vitro. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne peut se substituer à la souris pour cette phase préclinique.

Objectifs

Le cancer de la prostate est l'un des cancers les plus courants dans les pays développés. Les patients atteints d'un cancer localisé peuvent être traités par chirurgie ou radiothérapie, tandis que la castration est utilisée comme traitement initial pour les patients atteints d'une maladie avancée. Bien que la plupart des patients répondent initialement à cette thérapie hormonale, une résistance peut apparaître dans les deux ans, ce qui signifie que le cancer de la prostate devient résistant à la castration. Les chimiothérapies actuelles ne permettent qu'une survie de 12 à 18 mois, provoquant 9000 décès par an et faisant de ce cancer l’un des plus mortels. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de cancer de la prostate résistant à la castration. Une stratégie appelée thérapie d'acides nucléiques ou thérapie génique peut améliorer les traitements actuels en ciblant les gènes actifs après la castration pour retarder ou empêcher l'apparition de la résistance aux traitements. La thérapie génique présente un intérêt thérapeutique pour notre laboratoire. Nous avons développé des composés qui ont été utilisés pour induire la mort des cellules tumorales in vitro et pour réduire la progression tumorale in vivo chez la souris. Notre laboratoire souhaite réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de nos composés de troisième génération. Les modèles que nous utiliserons sont basés sur la transplantation de cellules de prostate humaines résistantes aux traitements à des souris immunodéficientes, capables de mimer la maladie observée en clinique. Il n'existe actuellement aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l'expérimentation animale durant cette étape préclinique.

Bénéfices attendus

La thérapeutique génique est de plus en plus considérée comme une solution prometteuse pour la prise en charge des cancers de la prostate. Elle s'intègre dans la médecine de précision et permet de fabriquer un traitement individualisé en quelques semaines, pour une guérison plus rapide et efficace. Contrairement aux médicaments classiques, qui peuvent prendre jusqu'à dix ans pour être développés et cibler spécifiquement la mutation génétique responsable de la tumeur, la technologie génique agit directement sur des gènes impliqués dans la prolifération tumorale. Notre technologie est conçue pour contourner les principales limites de l'expansion du marché des composés géniques, notamment la faible biodisponibilité, la toxicité et la difficulté à atteindre les tissus cibles. En utilisant des lipides comme vecteurs de délivrance des composés géniques, nous sommes en mesure d'augmenter la stabilité, la solubilité et la spécificité de nos composés. De plus, notre technologie offre également la possibilité de co-délivrer sélectivement des agents diagnostiques ou thérapeutiques, ce qui ouvre de nouvelles perspectives pour la médecine personnalisée. En résumé, notre technologie représentent une avancée majeure dans la lutte contre les cancers de la prostate, en offrant une approche plus ciblée, efficace et personnalisée pour le traitement de cette maladie complexe.

Procédures

Les interventions sont les suivantes : a) Xénogreffe sous-cutanée : Les 1530 animaux de ce projet seront injectés sous-cutanément avec des cellules tumorales prostatiques sous anesthésie. Cette procédure dure environ 3 minutes par animal. b) Castration : Cette procédure concerne un groupe de 180 souris. Elle sera réalisée directement après la xénogreffe pour les animaux concernés, sous anesthésie. La durée maximale de la castration est de 30 minutes par souris. c) Suivi par imagerie : Cette procédure sera effectuée pour un groupe de 180 souris. La fréquence des imageries dépendra de la vitesse de croissance tumorale : une fois par semaine les deux premières semaines, puis une imagerie tous les 15 jours pendant 11 semaines de traitement. Le temps d'imagerie sera adapté à chaque modèle de tumeur. d) Traitement : L'administration des composés thérapeutiques se fera pendant 7 jours consécutifs pour les 450 souris dans la procédure d'évaluation de la spécificité des composés, et 3 fois par semaine pendant 11 semaines pour les 1080 souris dans la procédure d'évaluation de l'efficacité thérapeutique. Nous utiliserons l'injection intrapéritonéale, qui ne durera que quelques secondes par souris et ne nécessitera pas d'anesthésie. À la fin de l'étude, ainsi qu'en cours d'étude si nécessaire en fonction des critères limites, les souris seront euthanasiées et le sang ainsi que les tumeurs de tous les individus seront collectés.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales chez les souris peut causer des effets indésirables tels que des douleurs, une faiblesse générale et une perte de poids. De même, l'injection d'oligonucléotides peut également provoquer des réactions indésirables telles que des inflammations et des douleurs au site d'injection. En outre, la castration peut également avoir des effets négatifs sur le comportement et la santé des souris, tels que des changements hormonaux et des modifications de l'activité locomotrice. Les modalités d'imagerie choisi n'entrainent pas d'algie chez l'animal. Cependant, l'induction anesthésique est une source de stress potentiel avant et pendant l'imagerie et l'acte chirurgical.

Devenir

À la fin de l'étude, les souris seront euthanasiées. Le sang et les tumeurs de tous les individus seront collectés pour des analyses post-mortem afin de contrôler la toxicité de nos composés et de valider la spécificité de chaque composé testé.

Remplacement

Afin de vérifier la pertinence des composés développés dans le laboratoire, le premier criblage sera effectué in vitro sur des modèles cellulaires en culture. Seules les composés positives démontrant leur efficacité in vitro seront utilisées dans les études in vivo du présent projet. Cependant, le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie. La souris immunodéficiente est un modèle de choix puisqu'elle permet le développement et le suivi de lignées tumorales humaines, de mimer la maladie observée en clinique. L'induction des tumeurs par xénogreffes chez la souris est une technique maîtrisée et documentée. Il n'existe actuellement aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l'expérimentation animale durant cette étape préclinique.

Réduction

Pour chacun des composés, nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux tout en restant une statistique fiable permettant de caractériser leur efficacité sur les modèles de xénogreffes de cellules tumorales de cancer de la prostate. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes témoins. Afin de réduire au minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes témoins seront communs à plusieurs tests d'efficacité. Par ailleurs, nous réaliserons des études pilotes sur un petit nombre d'animaux par groupe afin de garantir une bonne tolérance aux molécules et d'adapter les doses à administrer avant de passer aux tests d'évaluation d'efficacité thérapeutique sur un nombre plus important d'animaux.

Raffinement

Nos études in vivo seront réalisées de manière séquentielle pour déterminer l'action des drogues sur le développement tumoral. Des études pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux afin de vérifier leur tolérance aux molécules et d'ajuster les doses à administrer à notre souche de souris. De plus, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant des méthodes non invasives sur les animaux. Enfin, nous améliorerons les conditions d'hébergement des animaux en proposant de la litière enrichie (copeaux de bois compactés et/ou coton) et en maintenant les souris en groupe de 4 à 5 individus pour éviter le stress lié à l'isolement. Les souris seront hébergées dans des cages ventilées, dans une pièce avec des cycles de lumière obscurité de 12 heures, où la température et l'hygrométrie seront constamment contrôlées. Elles auront un accès libre à la nourriture et à l'eau. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d'intervenir rapidement dès le moindre signe de souffrance. Pour minimiser la souffrance et le stress des animaux, les manipulations pourront être effectuées sous anesthésie gazeuse pour un endormissement et un réveil rapides, et une analgésie sera administrée en cas de signes de douleur. Tout signe ou comportement anormal tels que des difficultés respiratoires, une souris prostrée ou en retrait, ou une perte de poids supérieure à 20% du poids initial des animaux entraînera la fin de l'expérimentation et leur euthanasie immédiate afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici le cancer de la prostate). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d'un individu ou d'une lignée d'une espèce donnée chez un individu hôte d'une espèce différente. L'accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de nos approches. En effet, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise tumorale et éviter la réaction de l'hôte vis-à-vis du greffon. Pour la réalisation de xénogreffes de lignées tumorales humaines, cette espèce constitue le modèle in vivo le plus adapté : la maîtrise zootechnique (élevage/confinement); la praticabilité chirurgicale (technicité, accessibilité du site sous-cutané ou orthotopique); les connaissances actuelles et la diffusion dans le domaine scientifique (littérature, collaborations). Les animaux utilisés dans ce projet sont des souris mâles âgées de 6 semaines qui ont atteint leur maturité sexuelle, afin de garantir la sécrétion d'hormones masculines qui ont une influence sur le développement du cancer de la prostate chez l'homme.

48 rats et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Présenté comme un projet de raffinement destiné à améliorer le bien-être des animaux non-humains lors des prélèvements, il compare la ponction sous contention à un dispositif implanté chirurgicalement, le "Vascular Access Button", en imposant gavages, tests de tolérance au glucose et prélèvements sanguins hebdomadaires jusqu'à obturation du dispositif. Le porteur indique n'attendre "normalement" aucun effet indésirable tout en anticipant la perte de quelques animaux par complication chirurgicale, une nécropsie clôturant l'étude. L'amélioration annoncée du confort des animaux sert d'abord à valider un outil pour les futurs projets de recherche de la société.

Objectifs

La règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) est un des piliers majeurs du bien-être animal et il est aujourd’hui encore impossible de se passer totalement du modèle in-vivo pour certains projets de recherche. Quand cela est possible, l’utilisation d’animaux peut être remplacée, par des modèles in vitro (culture cellulaire, enzymologie …), des modèles non régi par l’expérimentation animale (drosophile, c elegan …) ou encore en ayant recours à de la modélisation informatique (in silico). Nos projets de recherche en développement nécessitent d’avoir recours à des prélèvements répétés de sang chez les rongeurs vigiles. Ces prélèvements en plus d’être chronophages, peuvent induire un stress aigu notamment à cause de la contention de l’animal ce qui peut participer à la variabilité des résultats. Pour répondre à cette problématique et dans un contexte de raffinement, l’objectif de ce projet de comparer deux techniques de prélèvement sanguin chez le rat et le hamster vigile. La première méthode est une des méthodes de référence pour obtenir un échantillonnage de sang via une contention de l’animal et une ponction au niveau de la veine gingivale (hamster) et de la veine caudale (rat). La seconde méthode de prélèvement nécessite d’avoir recours à une légère chirurgie pour permettre l’implantation du système « Vascular Access Button ». Ce bouton transcutané comporte un port externe avec un septum pour un accès rapide, propre et répété au cathéter implanté sur l’animal. Les applications incluent le dosage bolus ou continu, le prélèvement sanguin et l’auto-administration IV. Pour un accès intermittent, il est possible d’utiliser une seringue équipée d'un injecteur PinPort™ sans aiguille ; et pour un accès continu depuis l'extérieur de la cage, il est possible d’utiliser une attache d'accouplement. Ce système permettrait : - D’améliorer les prélèvements en contrôlant mieux le volume, la zone et la « propreté » du prélèvement (raffiner). - De diminuer le stress des animaux au moment du prélèvement (aucune contention n’est nécessaire) - D’améliorer le confort manipulateur

Bénéfices attendus

Si les résultats de ce projet sont concluants, le VAB pourra être utilisé sur hamsters ou rats sur notre plateforme de recherche. Le système de prélèvement VAB permettrait de pouvoir réaliser des échantillonnages sanguins sans avoir recours à la contention de l’animal ou sans introduction multiples d’aiguilles, notamment dans le cadre de cinétiques sanguines (type OGTT, PK).

Procédures

Évaluation de la composition corporelle : 1 fois en début d'étude et 1 fois au moment du test de tolérance au glucose. Cet examen implique une légère contention inférieure à 1 min par animal. Test de tolérance au glucose : 1 fois (composé d'un gavage d'une solution sucrée puis de 5 prélèvements sanguins). Ce test dure 2h et inclus 1 gavage durant moins de 30 secondes et 4 contentions durant chacune moins de 1 min. Mise à jeun de 5h : 1 fois avant l'OGTT. Prélèvements de sang hors OGTT : 1 fois par semaine jusqu'à obturation du dispositif (fin de la procédure). Nécessite une contention inférieure à 1 min. Chirurgie d'implantation d'un système de prélèvement sanguin : 1 fois. L’anesthésie, la chirurgie et le réveil de l’animal sont réalisés entre 30 et 45 min par animal. Chacun de ces actes sont réalisés par des personnes formées et expérimentées.

Impact sur les animaux

L’objectif étant de mettre en place un système de prélèvement permettant d'améliorer le bien-être animal lors de prélèvements répétés, aucun effet indésirable sur les animaux n'est normalement attendu. S’agissant cependant d’un projet de mise au point passant par la pose d’un VAB par technique chirurgicale, des complications liées à cette pose se traduisant par perte d’un nombre restreint d’animaux dans le temps chirurgicale pourrait apparaitre en début de projet.

Devenir

Une nécropsie de fin d'étude sera nécessaire pour évaluer le site d'implantation des dispositifs. Les animaux ne pourront pas être réutilisés ou replacés.

Remplacement

Le prélèvement sanguin est un acte in vivo par définition. L’utilisation d’animaux est donc indispensable. D’autres techniques de prélèvement sur animaux vigiles sans recours à la chirurgie préalable existent, mais ils sont moins adaptés que la pose d’un cathéter lorsqu’il s’agit de recourir à des prélèvements répétés.

Réduction

La taille des groupes est choisie de manière à obtenir une puissance statistique minimale, mais suffisante pour les paramètres clés (évaluation de la perméabilité des capteurs dans le temps et glycémie lors de la cinétique OGTT). Les valeurs seront présentées comme la moyenne ± SEM. Les différences seront considérées comme statistiquement significatives à p

Raffinement

Tous les animaux de ce projet suivront une période d’habituation d’au moins une semaine avant de commencer les procédures, ils seront hébergés dans un environnement contrôlé et adapté (cages ventilées, 22°C, 30-70% d’humidité, cycle J/N 12 :12). Les cages seront enrichies à l’aide de matériel de nidification et d’un tube rouge permettant aux animaux de se cacher et aux techniciens de les manipuler. Un contrôle quotidien sera réalisé pour permettre de relever et documenter l’apparition de signes cliniques. Un traitement analgésique sera mis en place en péri-opératoire. La chirurgie sera réalisée sur animaux anesthésiés sous isoflurane 2.5% durant la procédure. Un traitement analgésique sera mis en place en péri-opératoire. Enfin des points limites sont déterminés et appliqués pour chaque procédure.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans ces projets correspondent aux espèces et souches utilisées dans nos différents projets de recherche et developpement. Il est nécessaire de valider le dispositif dans les conditions expérimentales de son utilisation ultérieure. Les animaux utilisés pour ce projet seront âgés de 8 semaines à la réception et suivront une chirurgie à 10 semaines. À cet âge un poids de 100/110g pour le hamster et de 300/350g pour le rat est attendu et correspond à un stade de développement de jeune adulte. Cet âge et ce poids sont compatibles avec l’acte chirurgical à réaliser et correspondent à l’âge et au poids d’utilisation des animaux dans les différents projets de développement de la société.

176 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier l'hypersensibilité à la douleur induite par une séparation maternelle précoce. La moitié des nouveau-nés est séparée de leur mère, puis soumise à des tests de douleur et à des injections dans la moelle épinière, l'autre moitié subit une chirurgie sans réveil avec ablation d'une vertèbre pour enregistrer la moelle jusqu'à huit heures. Le porteur indique aussi que toutes les mères sont mises à mort après le sevrage, au motif que la séparation altère leur système nerveux. Il affirme que la nociception est un processus intégré, impossible à étudier sans sujets vivants dotés d'un cortex développé.

Objectifs

Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN) est un modèle reflétant la prématurité humaine et des études ont montré que les animaux exposés à la SMN présentent des déficit de comportements et une hypersensibilité douloureuse. Des études récentes suggèrent également un déréglement de l'expression de certaines molécules pouvant ainsi contribuer aux altérations comportementales observées suite à la SMN. Dans ce contexte, nous chercherons à évaluer le rôle de certaines de ces molécules exprimées par les neurones de la moelle épinière impliqués dans la transmission de l'information douloureuse. L’objectif du projet sera d’étudier l’effet du bumétanide (BTD), qui pourrait rétablir a) les seuils de douleur chez l’animal SMN adulte et b) la transmission de la douleur par des neurones dans la moelle épinière d'animaux SMN.

Bénéfices attendus

Le modèle de séparation maternelle a permis de décrypter nombre des mécanismes d’altération du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, l’étude permettra de mieux comprendre les voies et mécanismes impliqués dans la douleur qui sont altérés lors d’un stress néonatal non douloureux, et plus particulièrement une séparation précoce avec la mère. Ce projet vise aussi à caractériser l’action potentiellement bénéfique du bumétanide sur le comportement modifié des animaux séparés et sur les modifications moléculaires observées dans ce modèle.

Procédures

La moitié des animaux seront soumis au protocole de séparation maternelle néonatale, tandis que l'autre moitié des nouveau-nés resteront avec leur mère. Des tests d'évaluation de la douleur (durée 10min/animal), n'induisant pas de stress accru chez les animaux seront effectués une fois chacun du jour 30 au jour 60 postnatal pour la moitié des animaux. Ceux-ci recevront un total de 4 injections sous anesthésie générale 30 minutes avant chaque test comportemental. Une chirurgie durant 45 minutes sera effectuée sur l'autre groupe d'animaux puis des enregistrements de la moelle épinière seront effectués. Ces enregistrements dureront 8 heures maximum.

Impact sur les animaux

Le modèle de séparation maternelle néonatale chez le rat est un modèle de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. Les nuisances possibles liées à l'injection intrathécale seront le stress lié à l’anesthésie ainsi qu'une inflammation ou infection potentielle du site d’injection. Les tests comportementaux induisent un changement d’environnement pour les animaux et donc un stress.

Devenir

Toutes les mères de cette étude seront mises à mort après sevrage de leurs petits (P21) puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. En fin d’expérience, tous les animaux seront aussi mis à mort. Pour la moitié des animaux, la chirurgie subie est sans réveil puisqu'une vertèbre est ôtée lors de celle-ci et que leur moelle épinière est manipulée. Les animaux y prenant part seront mis à mort par excès d'anesthésie.

Remplacement

La nociception étant un processus intégré, ce projet nécessite l’étude d’un système intégré et mature. De plus, l’étude vise à caractériser les propriétés et le mode d’action d’une molécule d’intérêt dans notre modèle, et il est donc impossible de se passer de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable de restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.

Réduction

Chaque groupe de rats requiert 2 portées différentes (comportant chacune minimum 10 animaux) pour une bonne analyse statistique et confirmation des tests comportementaux. L’intégralité des animaux de chaque portée sera analysée à chaque fois, permettant également de préciser les différences mâles-femelles si elles sont observées. Les résultats obtenus sont alors statistiquement robustes et exploitables.

Raffinement

Durant la SMN, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Leur prise de poids sera contrôlée 2 fois par semaine. Les animaux sont hébergés en cages collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à disposition de la frisure pour un nid, un bâton à ronger et un tunnel. Les animaux sont suivis quotidiennement par les zootechniciens de l’animalerie et par les expérimentateurs afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental. Si des changements sont observés, le vétérinaire sera contacté pour décider de la procédure. Pour l’appréciation de la perte de poids, si lors d’une pesée hebdomadaire, il est observé qu’un animal ne prend pas de poids ou en perd par rapport à la pesée précédente, des aliments humides seront mis à disposition dans les cages pour faciliter la prise alimentaire. Si l’un de ces changements persiste plus de trois jours et est observé par un zootechnicien ou l’expérimentateur, le vétérinaire sera contacté et l’animal sera retiré de l’étude. Les injections seront effectuée sous anesthésie générale profonde (isoflurane 3%) pour limiter le stress des animaux. Les tests comportementaux sont realisés après une semaine d’habituation (manipulation par l'expérimentateur 5 minutes par animal chaque jour) afin de réduire le stress.

Choix des espèces

Le rat est un standart en tant que modèle expérimental pour ce type d’expérience impliquant des processus intégrés. Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de SMN a déjà été bien caractérisé chez cette espèce, permettant de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus, ce modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3ème trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3ème trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3ème trimestre de gestation chez l’Homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie postnatales chez le rat. Le protocole de SMN intervient au stade nouveau-né, entre le jour 2 et le jour 12 postnatal. Cependant, les conséquences de ce stress seront observées à l’âge adulte (45 jours postnatal).