Procédures modérées

Sous anesthésie générale, des souris subissent une ouverture du crâne et des injections dans le cerveau pour y faire produire des protéines fluorescentes, au cours d'une opération d'environ 90 minutes, puis toutes sont tuées trois semaines plus tard sous anesthésie, sans réveil, pour prélever leur cerveau. 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec comme risques cités l'hypothermie, l'arrêt cardio-respiratoire sous anesthésie, la douleur après l'opération et une perte de poids rapide. Le projet relève de la recherche fondamentale sur un noyau du thalamus, et le porteur relie ses retombées aux troubles psychiatriques par des données d'imagerie selon lesquelles des altérations de ces circuits "pourraient contribuer aux symptômes". Pour décrire ce qui est injecté, il parle de "techniques de biologie moléculaire" et ne mentionne qu'une fois, en passant, une "injection de virus", sans en préciser la nature.

Objectifs

Le thalamus, porte d'entrée du cortex, est constitué d’un ensemble de structures subdivisées sur des critères anatomiques en deux catégories : les noyaux de premier ordre et les noyaux d’ordre supérieur. Les noyaux thalamiques de premier ordre ont fait l’objet de nombreuses études. Les relations entre les neurones de ces noyaux et les autres structures cérébrales ont été bien décrites et leurs rôles dans le traitement des informations, en particulier sensorielles, sont en partie établis. En revanche, l’organisation anatomique et les fonctions des noyaux d’ordre supérieur sont très mal connues. Les neurones de ces noyaux reçoivent des informations excitatrices et inhibitrices issues de nombreuses régions cérébrales mais la manière dont ces différentes entrées sont distribuées au niveau de la cellule thalamique unique et comment elles interagissent sont à ce jour inconnues. Centré sur un noyau d’ordre supérieur lié au système somatosensoriel, le noyau postérieur médian, notre projet vise à comprendre comment ces diverses informations sont intégrées par le neurone thalamique pour aboutir à un traitement complexe sensorimotreur.

Bénéfices attendus

Le thalamus est une structure sous-corticale par laquelle transitent la plupart des circuits neuronaux de notre cerveau ; elle établit de multiples connexions avec les régions corticales, sous-corticales et cérébelleuses. En tant que nœud de ce vaste système, le thalamus joue un rôle central dans le traitement des données sensorielles et constitue une plaque tournante essentielle pour le traitement cognitif, tel que mise en œuvre dans la mémoire de travail, l'attention ou pendant le sommeil. Des anomalies dans le système de connectivité thalamique ont été décrites chez les patients atteints de schizophrénie, de troubles bipolaires, de troubles dépressifs majeurs et de troubles du spectre autistique. De récentes données de neuro-imagerie proposent que des altérations de la circuiterie thalamique pourraient contribuer aux symptômes et aux déficits présents chez des patients psychiatriques. L’étude de la circuiterie thalamique aurait donc une grande utilité translationnelle et transdiagnostique mais les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à ces altérations sont peu connus. En étudiant de manière précise comment s’organise d’un point de vue fonctionnel la circuiterie thalamique, ce projet de recherche fondamentale apportera des données cellulaires et moléculaires indispensables pour répondre à ce type de question.

Procédures

Toutes les souris du projet recevront sous analgésie et anesthésie générale des injections intracérébrales afin de faire exprimer des protéines fluorescentes dans des régions spécifiques du cerveau par des techniques de biologie moléculaire. Chaque souris est opérée une fois et l'ensemble de la procédure chirurgicale, de l'induction au réveil de la souris, dure environ 90 minutes. Trois semaines après injection les protéines fluorescentes sont exprimées dans les neurones. Les souris sont alors euthanasiées sous anesthésie générale sans réveil et le cerveau est prélevé soit dans le but d'effectuer des études anatomiques, soit pour étudier les propriétés fonctionnelles des régions cérébrales d'intérêt, comme par exemple d'analyser le fonctionnement des réseaux de neurones.

Impact sur les animaux

Dans de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous analgésie et anesthésie générale pendant lesquelles une ouverture de la boîte crânienne est réalisée afin de procéder à des injections dans une région cérébrale donnée. Les éventuels nuisances et effets indésirables à court et à long terme liés à cette chirurgie sont : i) une hypothermie, ii) un arrêt cardio-respiratoire liée à l’anesthésie, III) une douleur post-opératoire se traduisant par une apparence, une position et des comportements anormaux et iv) une perte de poids rapide.

Devenir

Toutes les souris sont euthanasiées environ 3 semaines après les injections intracérébrales. Les cerveaux sont ensuite prélevés soit dans le but d'effectuer des études anatomiques, soit pour étudier les propriétés fonctionnelles des régions cérébrales d'intérêt.

Remplacement

La complexité inhérente du cerveau impose l'utilisation de modèles animaux. Ainsi, l’étude du fonctionnement des réseaux synaptiques ne peut être abordée que par des enregistrements effectués dans un cerveau intact ou sur des préparations ex-vivo qui préservent une grande partie de la circuiterie neuronale comme les préparations de tranches de cerveau. Par ailleurs, la variété des techniques de modifications génétiques chez la souris, qui permettent de visualiser ou de cibler spécifiquement des mécanismes cellulaires ou des protéines, fait de cette espèce le modèle animal privilégié. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour les différentes procédures afin d’obtenir des résultats fiables a été dimensionné en s’appuyant sur nos études antérieures. L’analyse en continue des résultats nous permettra de limiter le nombre de souris dès que les valeurs moyennes estimées par rapport à notre échantillon seront dans l’intervalle de confiance satisfaisant. 250 souris seront nécessaires. Les animaux mâles et femelles seront utilisés. Cela permet de maximiser l’utilisation des animaux et de ne pas euthanasier inutilement des souris générées dans l’animalerie. Cette démarche s’inscrit donc dans l’esprit de la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans l’animalerie sous la supervision des soigneurs et du vétérinaire-référent. L’hébergement des animaux est réalisé conformément à la directive européenne 2010-63-EU en terme d’espace et d’environnement. Les souris sont soumises à un cycle de lumière-obscurité dans un environnement à température et hygrométrie contrôlées avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. L’anxiété des animaux est réduite par un maintien en groupe social. Les cages complètes sont changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal est placé dans la cage. Après les interventions chirurgicales, le réveil des souris est étroitement surveillé. Afin de faciliter l’hydratation des croquettes humidifiées sont disposées au fond de la cage. Des analgésiques sont administrés pour gérer la douleur post-opératoire. Lorsque le réveil est complet, la souris retourne dans sa cage avec ses congénères. Une surveillance accrue journalière est réalisée pendant 5 jours suivant l’opération afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être. Les critères absolus suivants seront observés : i) Apparence et position anormale: poil ébouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie, ii) Comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déshydratation, iii) une perte de poids rapide. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie puis 1 fois par semaine, et iv) difficulté respiratoire. Puis une surveillance quotidienne est assurée soit par l’expérimentateur soit par les zootechniciens qui préviennent le responsable du projet en cas d’anomalie. Celui-ci prend alors une décision sur le devenir de cet animal en coordination avec le vétérinaire-référent.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris car il s’agit du modèle mammifère de référence pour les approches expérimentales nécessitant des modifications génétiques. La puissance des outils génétiques permettra de connaitre la nature des neurones, par exemple excitatrice ou inhibitrice, et d'étudier comment l'activation de ces neurones contrôle le fonctionnement des réseaux synaptiques. Les injections intracérébrales sont effectuées chez des souris âgées d'environ 6 à 8 semaines afin que le système somatosensoriel soit parfaitement mature. Les expériences anatomiques ou les enregistrements électrophysiologiques sont réalisés 3 à 4 semaines après l'injection de virus pour permettre l’expression des protéines, soit chez des souris âgées de 9 à 12 semaines.

Le but affiché est de commercialiser des agents qui font entrer de l'ADN ou de l'ARN dans les cellules, et les essais sur des souris doivent en vérifier l'activité et l'absence de toxicité. 1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit jusqu'à trois injections, sous la peau, dans la veine, le muscle, le péritoine ou par le nez selon le produit, puis une prise de sang sous anesthésie avant d'être tuée pour l'examen de ses organes, avec un risque de thrombose, de réactions inflammatoires et de troubles de la démarche. Le porteur affirme que l'administration par voie locale ou générale est "nécessaire pour permettre de valider l'activité et l'absence de toxicité des produits", et choisit la souris parce qu'elle permet "d'induire une réponse inflammatoire facilement identifiable".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le développement de solutions pour la production de thérapies biologiques, cellulaires et géniques. Le but est de commercialiser des agents pour libérer in vivo de l’ADN et de l’ARN. Dans le cadre des développements, de la production commerciale et des études de stabilité des produits précliniques et cliniques, des essais sur des modèles in vitro sont réalisés. Néanmoins, ces derniers ne reflètent pas le comportement des produits in vivo, notamment en termes d’activité et de toxicité. Pour cela, l’administration par voie locale ou systémique est nécessaire pour permettre de valider l’activité et l’absence de toxicité des produits. Ainsi, dans le cadre de ce projet, des vecteurs de transfection ou des acides nucléiques synthétiques seront testés chez la souris selon différents modes d’injection (sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intra-nasal) en fonction de leur composition. L’objectif sera de valider l’efficacité de transfection in vivo, l’absence de toxicité mais aussi d’évaluer l’élimination des produits testés.

Bénéfices attendus

Ces agents, une fois testés chez la souris, pourraient être transférables à des applications thérapeutiques en clinique humaine. Ce projet aura pour but de dégager des conditions optimales d’utilisation du système ayant une bonne distribution dans différents types cellulaires et sans impact toxique sur la souris.

Procédures

Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection (durée 2-3 minutes). On réalisera ensuite un prélèvement sanguin (durée 2-3 minutes) avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection et un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%). Une potentielle toxicité suite aux injections pourra être observée dans ces études, avec notamment un risque de thrombose, de réactions pro-inflammatoires, ou encore du trouble du comportement en particulier de la démarche.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d'évaluer l'administration de produits de transfection délivrant ADN ou ARN. Les premières évaluations seront réalisées in vitro, dans des systèmes cellulaires. Les réactifs retenus seront ensuite évalués in vivo, en vue d'utilisation dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé suite à des projets précédents. Nous avons effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que l’effectif de 6 animaux pour chaque condition utilisée dans l'étude constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux. Le test statistique utilisé sera un test paramétrique (comparaison des animaux traités avec des animaux contrôles).

Raffinement

Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Le systèmes évalués dans ce projet sont essentiellement utilisés dans les phases de recherche, qui sont majoritairement effectuées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux standardisés comme la souris permet d’induire une réponse inflammatoire facilement identifiable. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 semaines, âge qui permet d'identifier une activité maximale des produits lipidiques, autrement dit des réactifs de transfection.

1 424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans le plexus veineux derrière l'œil, par la trachée, par gavage ou dans l'abdomen, et sont infectées par des bactéries pour provoquer un sepsis suivi d'une perte de poids et de poils hérissés. Le porteur indique retenir un inoculum faible censé éviter la mortalité, et précise qu'aucun anti-inflammatoire ne peut être administré sur un projet portant sur le système immunitaire. Il étudie le rôle de lymphocytes régulateurs dans l'immunodépression qui suit une infection sévère et affirme que seule l'étude in vivo permet cette approche globale.

Objectifs

Notre laboratoire a montré que suite d’une infection sévère, une cicatrice immunitaire se mettait en place, avec des perturbations prolongées des capacités des organismes à se défendre contre une nouvelle infection. Cette cicatrice immunitaire associé à un plus haut risque de complication infectiologique secondaire est associée à l’apparition de plusieurs populations de lymphocytes dont l’activation des lymphocytes dit « T régulateurs » spécialisés dans le contrôle de l’inflammation. Nous avons montré qu’une sous population ces lymphocytes T régulateurs porteur d’un récepteur de type 2 au Tumoral Necrosis Factor (aussi appelé TNFR2) jouaient un rôle majeur la survenue de cette immunodépression faisant suite à une infection sévère. Les objectifs du projet sont de caractériser le rôle de ces populations de lymphocytes T régulateurs porteur du récepteur TNFR2 au cours de la défense anti-infectieuse et lors de la phase d’immunodepression post-septique.

Bénéfices attendus

Notre projet nous permettra d’améliorer nos connaissances des mécanismes d’extinction des capacités de réaction du système immunitaire faisant suite à une infection sévère aussi appelée immunosuppression post-septique (IS). Ce projet nous aidera à comprendre les modifications induites par le sepsis sur les fonctions des lymphocytes des Treg et les conséquences de ces modifications au cours d’une 2ème infection. Ceci nous permettra la mise en place de traitements adaptés pour lutter contre les infections bactériennes.

Procédures

Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-veineuse retro-orbitale sous anesthésie générale. Un tiers des animaux de ce projet est soumis à une administration intra-trachéale sous anesthésie générale. Deux tiers des animaux sont soumis à une administration unique per os (sonde de gavage pour l’administration du traitement) en condition vigile. Un tiers des animaux est soumis à des injections intrapéritonéales en condition vigile. Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et pour les souris anesthésiées, le réveil est quasiment instantané. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques pourraient être réalisées.

Impact sur les animaux

Modèles d’infection bactérienne : Le modèle d’infection par administration de bactéries par voie intra-veineuse, a déjà été validé dans ce projet, nous utiliserons des souches bactériennes de référence de laboratoire. Nous réaliserons une injection dans le plexus veineux sous orbitaire d’une suspension bactérienne. Suite à l’administration de bactéries (inoculum faible concentration) par voie intra-veineuse, une inflammation est attendue durant les 4 premiers jours avec comme signes cliniques une perte de poids inférieure à 20% et des poils hérissés, suivis d’une récupération progressive de leur poids au 5ième jour du sepsis. Cette injection entraine une septicémie sans induction de mortalité, permettant d'évaluer l'impact d'une seconde infection et d'éviter les biais de sélection. Les procédures de gavage et de transfert adoptif utilisées au cours des procédures expérimentales n’induisent pas d’effets indésirables connus chez la souris. La pesée de référence est réalisée au J0 avant le début de l’induction du sepsis ou de tout autre procédure. Avec l’utilisation d’un inoculum bactérien faible pour l’induction du sepsis (permettant de reproduire l’IS), aucun signe de souffrance n’est observé en dehors d’une perte de poids inférieure à 20% et les poils hérissés. L’effet de la délétion du TNFR2 sur les Treg sur le sepsis. Il est envisageable que les Treg étant moins suppresseurs, les effets du sepsis sur l’état général des souris pourraient être plus marqués. Il en est de même pour l’effet du traitement par des anticorps anti-TNFR2 sur le sepsis. Pour ces raisons, Les animaux seront observés quotidiennement pendant 3 jours après l’induction du sepsis et pesés tous les 48 à 72h de façon à s’assurer que s’il y des effets, ils ne soient pas durables dans le temps. Les modèles d’inflammation respiratoires aiguës sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (inférieure à 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.

Remplacement

Les mécanismes responsables d’une immunosuppression suite au sepsis sont à l’heure actuellement mal compris. Les méthodes in vitro développées par d’autres laboratoires de recherche ne permettent pas une étude globale des modifications entrainées par une activation du système immunitaire. L'étude du rôle des Treg dans cette maladie et la mise au point de nouveaux traitements ne peut se faire qu'in vivo. Cependant, dès que la question scientifique le permet nous privilégions l’utilisation de méthodes substitutives (méthode in vitro et ex vivo) pour y répondre. Nous avons développé des protocoles de culture de Treg primaires permettant de disposer d’une grande quantité de Treg.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=7) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Le test statistique utilisé sera une Anova suivie d’un test post-hoc. Une valeur de p inférieure à 0,05 sera considérée comme significative.

Raffinement

L’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation par scoring des points limites adapté aux modèles a été mis en place. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. L’utilisation d’anti-inflammatoire n’est pas possible dans le cas de projet sur le système immunitaire. Comme indiqué dans notre tableau de points limites, il est également prévu un apport d’enrichissement en cas de signes cliniques légers ou modérés, définis par les scores de 1à 14 suivant notre échelle de suivi (cf annexe). Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’anesthésiant local afin d’anesthésier localement la trachée. Une anesthésie générale est réalisée pour les procédures d’injection intraveineuse. Pour les injections IV en retro-orbital, en plus de l'anesthésie par inhalation, une anesthésie ophtalmique sera réalisée sur l'œil qui recevra l'injection. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable, en comparaison des souris contrôles, elles ne développent aucune forme de maladie apparente même à l’âge d’un an.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections bactériennes sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature

450 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent six semaines de stress chronique destiné à provoquer un état anxio-dépressif chez la moitié d'entre eux, quatre-vingt-dix d'entre eux étant en outre opérés pour l'implantation d'électrodes intracérébrales, avant des tests comportementaux de locomotion et d'anxiété. Le porteur reconnaît que le protocole de stress peut induire de l'agressivité entre congénères et impose un isolement en cage individuelle. Il cherche des biomarqueurs de la réponse à la kétamine et affirme qu'on ne peut se passer de l'"animal entier" pour ce type d'exploration.

Objectifs

Dans le cadre de la dépression, il existe une catégorie de patients résistants aux traitements conventionnels, qu'ils soient pharmacologiques ou basés sur la stimulation transcrânienne. Récemment, la kétamine a été proposée pour ses effets bénéfiques chez ce type de patients. Notre étude fait partie d'un projet translationnel, comprenant un versant clinique et un versant préclinique. Dans notre laboratoire elle a pour but de déterminer chez un modèle animal de dépression résistante aux traitements conventionnels, des biomarqueurs permettant de mieux comprendre et prédire la réponse à la kétamine.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de révéler les biomarqueurs les plus pertinents de la réponse à la kétamine comme traitement antidépresseur afin d'améliorer nos connaissances sur ces effets et améliorer la prise en charge des patients et leur orientation vers un tel traitement.

Procédures

Dans le projet, 180 rats seront soumis à un protocole de stress léger chronique pendant 6 semaines en tout, lors d'une première session d'une durée de 4 semaines, puis lors d'une deuxième session d'une durée de 2 semaines à la suite de procédures comportementales. Ce protocole de stress léger chronique comportera plusieurs situations stressantes légères - une par jour - d'une durée allant de 6 à 12 heures. Quatre-vingt-dix des 450 rats seront soumis à une opération chirurgicale sous anesthésie gazeuse et analgésie d'une durée de 150 minutes. Tous les rats seront soumis à 3 sessions de tests comportementaux visant à analyser leur comportement locomoteur (durée 24h) ou d’anxiété (durée moyenne de 5 minutes) répartis sur 2 sessions de 1 semaine et 1 session de 2 semaines avec une durée de 2 jours entre chaque test quand il y en aura plusieurs.

Impact sur les animaux

L’exposition à des situations stressantes légères répétées induit du stress pouvant conduire sur 50% des rats à l’apparition d’un comportement anxio-dépressif incluant notamment une prise de masse inférieure sur la durée du protocole de stress comparé à des rats non stressés, ce qui est l’objet de la question ; de plus, l’une des situations stressantes pourrait induire de l’agressivité entre congénère, qui serait immédiatement arrêtée si elle se produisait. La chirurgie peut induire de l’inflammation et une perte de masse transitoires. Les tests comportementaux peuvent induire un stress transitoire.

Devenir

Les rats seront mis à mort à des fins expérimentales dans toutes les procédures, soit, dans le cadre de la procédure expérimentale 1, pour vérifier histologiquement la position des électrodes d'enregistrement intra-encéphaliques, soit, dans le cadre des procédures expérimentales 2 et 3, pour prélever le cerveau afin de pratiquer les mesures correspondant à chaque procédure expérimentale (procédure expérimentale 2: électrophysiologie in vitro; procédure expérimentale 3: mesure de régulations génétiques et épigénétiques).

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer de l'animal entier dans des études visant à étudier une stratégie thérapeutique dans le cadre de la dépression, avec des explorations comportementales incluant des tests d'anhédonie et d'anxiété.

Réduction

L’étude a été mise en place afin de réduire le nombre de rats utilisés selon les contraintes statistiques. Notre expérience nous a appris que les résultats lors des tests comportementaux suivent une loi normale avec un effectif de 15 rats par groupe selon une analyse de pouvoir statistique. Ce nombre de 15 rats par groupe sera appliqué aux rats témoins ; en ce qui concerne les rats soumis au SLC, comme le protocole de SLC entraine un phénotype anxiodépressif chez 50 % des rats ("vulnérables"), les 50 % restant étant "résistants", il faudra donc, pour obtenir des groupes de 15 rats, doubler le nombre de rats soumis au départ SLC, par rapport au nombre de rats témoins. Les données obtenues seront analysées statistiquement afin d'observer les conséquences comportementales néfastes du SLC et si ces dernières sont contrecarrées par l'administration de kétamine.

Raffinement

Tout sera mis en oeuvre pour limiter la souffrance et l'inconfort des animaux tout au long de cette étude. Si les animaux soumis au protocole de stress léger chronique devont être en cage isolée, les animaux des groupes témoins seront maintenus à 2 par cage avec des pièces de bois à ronger constamment présentes. Les procédures chirurgicales se feront sous anesthésie générale et analgésie. La température corporelle des animaux sera maintenue pendant toute la durée de la procédure chirurgicale, ainsi que pendant la phase de réveil, grâce à un tapis chauffant. Pendant les deux semaines suivant la chirurgie les animaux seront suivis quotidiennement et leur état général évalué selon une grille de scoring validée par notre structure du bien être animal. En cas de signes d'infection suite à la procédure chirurgicale, ou en cas de blessure ou de mal-être pouvant survenir suite à certaines situations du protocole de stress léger chronique, des décisions seront prises en accord avec la structure du bien-être animal et la vétérinaire référante.

Choix des espèces

Le Rat est un bon modèle de la physiologie humaine en ce qui concerne les réseaux cérébraux impliqués dans la réponse au stress et la dépression. L'exposition à un protocole de stress léger chronique est un modèle validé et reconnu en ce qui concerne la dépression résistante aux traitements conventionnels. Il a de plus été démontré que la kétamine produit des effets antidépresseurs sur ce modèle. Nous utiliserons des animaux adultes au moment du démarrage de la procédure de SLC car nous avons besoin d’un système nerveux arrivé à maturité afin de constater les effets du stress et de la kétamine.

600 poussins de busard cendré, une espèce protégée en déclin, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être relâchés vivants au nid. Chaque oiseau est capturé, mesuré, soumis à une prise de sang, une injection intradermique, un lavement cloacal et un arrachage de plumes par traction, le tout en moins de trente minutes hors du nid. Le porteur décrit chacune de ces atteintes comme légère et transitoire, quand la gravité déclarée pour le projet est modérée. Il vise à quantifier les effets des pesticides agricoles sur la faune sauvage et affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut remplacer le suivi d'animaux vivants en milieu naturel.

Objectifs

A ce jour, la contribution des pesticides au déclin des espèces aviaires emblématiques du milieu rural est toujours controversée. La plupart des études se limitent à une évaluation de la dose létale testée sur un nombre restreint d’espèces modèles. Elles ignorent souvent les effets différés (effets sublétaux) sur la physiologie, le comportement, la reproduction et la survie des individus, et leurs conséquences au niveau populationnel. Comprendre et quantifier de tels effets est fondamental pour notre compréhension du déclin des populations aviaires. Le projet vise à caractériser l'impact de l'exposition aux pesticides sur le comportement, la physiologie du système immunitaire et digestif et la condition corporelle des poussins de busard cendré (Circus pygargus). Le busard cendré est une espèce patrimoniale protégée à l’annexe I de la Directive Oiseaux de l’Union Européenne pour laquelle les populations sont en déclin en France depuis plusieurs décennies et fait déjà l'office d'un suivi de populations à l'échelle nationale et même européenne. Par son écologie, le busard cendré et surtout les poussins sont particulièrement exposés aux pesticides. En effet, le busard cendré niche au sol dans les parcelles de céréales ce qui le rend particulièrement exposé aux pesticides utilisés en agriculture conventionnelle. Par ailleurs, leur position de prédateurs supérieurs les exposent également à ces produits par l'alimentation, principalement constituée de micromammifères (campagnol commun) et d'orthoptères. Ainsi, le busard cendré peut être une espèce sentinelle d'intérêt pour suivre l'état de santé de l'écosystème rural.

Bénéfices attendus

Bénéfices à court-moyen terme : Ces expérimentations sur le busard cendré s'inscrivent dans une problématique globale visant à comprendre comment la biodiversité aviaire est impactée par l'usage massif des pesticides en agriculture conventionnelle en investiguant différents aspects de la biologie des oiseaux et ce sur différentes espèces. Ceci permettra de mieux appréhender le lien entre déclin des populations et exposition aux pesticides dans des conditions réalistes d'exposition aux pesticides. Bien que l’autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) recommande fortement une approche en conditions naturelles, peu d’études à ce jour ont finalement été réalisées. Ainsi, à court terme, ce projet permettra d’établir les niveaux d’exposition aux pesticides d’une espèce d’oiseau spécialiste du milieu rural. Il nous permettra également de mettre en relation l’état de santé des poussins juste avant leur envol. Bénéfices à long terme : Avec un suivi pluriannuel, nous serons en mesure d’établir le lien entre l’exposition aux pesticides des poussins, leur état de santé et les répercussions sur la dynamique populationnelle de cette espèce. Nos travaux s’inscrivent plus globalement dans une démarche considérant que la santé de la faune sauvage, de l’écosystème et de l’Homme sont interdépendants (concept une santé unique aussi connue sous le nom One Health). Le busard cendré est potentiellement un bon indicateur de l’état de santé du milieu et de ce à quoi, nous sommes nous-mêmes exposés. Ainsi, la compréhension des effets des pesticides sur les oiseaux devraient nous permettre d’anticiper d’éventuels problèmes sanitaires chez l’Homme.

Procédures

L’ensemble des manipulations se fera sur des animaux vigiles. Les poussins seront capturés au nid puis placés en contention dans un sac en coton pour les garder au calme avant les manipulations à proprement parlé. Puis, une série de manipulation sera réalisée avec : la prise de mesures morphométriques et de la masse, une prise de sang pour les mesures immunitaires et le dosage de pesticides, une injection intradermique pour mesurer l'intensité de la réponse immunitaire, un lavement cloacal pour récolter des bactéries intestinales, et un prélèvement de plumes du thorax par traction pour avoir une seconde référence d'exposition aux pesticides. A la suite, les poussins seront replacés au nid. Pour l'ensemble de ces interventions, les animaux seront sortis du nid pendant maximum 30 min. Le lendemain, les poussins seront de nouveau capturés au nid pour mesurer la taille de la réaction cutanée suite à l'injection intradermique, puis replacés au nid, le tout en moins de 5 min.

Impact sur les animaux

Pour tous les individus -- Capture/recapture au nid : stress transitoire, intensité légère / Contention et manipulation : stress transitoire, intensité légère. / Prise de sang par ponction de la veine brachiale: stress ponctuel, intensité légère, douleur faible. / Injection de phytohémagglutinine (test de réaction immunitaire) : stress ponctuel, intensité légère, douleur faible. / Lavement cloacal : stress transitoire, intensité légère, gêne légère, absence de douleur. / Prélèvement de plumes par traction : stress ponctuel, intensité légère, douleur faible. Trois à 4 plumes sont prélevées au niveau du thorax et ne sont donc pas impliquées dans le vol. La peau de l’oiseau n’est pas non plus mise à découvert. / Il n’y a aucun impact connu de la manipulation des poussins proche de l’envol sur la relation avec les parents.

Devenir

Tous les animaux sont relachés au nid vivants.

Remplacement

S’agissant de suivi populationnel pour comprendre des mécanismes complexes en milieu naturel, il est impossible de remplacer les animaux vivants par des méthodes in vitro ou in silico car ces données n’existent pas à l’heure actuelle.

Réduction

Le point central de notre protocole est relatif au positionnement des nids dans un paysage contrasté en utilisation de pesticides. La zone d’étude représente 450km2 contrastés en pratiques agricoles et donc en utilisation de pesticides. Ne pouvant pas choisir la localisation des nids, nous essayons de suivre un nombre de nichées de 40. La moyenne du nombre de poussins à l’envol étant d’environ 3 poussins, cela représente donc 120 poussins par an. Compte tenu de l’hétérogénéité de l’exposition aux pesticides des poussins d’une même nichée, il est obligatoire de suivre tous les poussins d’un même nid. Les busards cendrés étant en déclin au niveau national, nous sommes donc limités par la taille de la population qui est suivie et nous suivons donc de façon exhaustive toutes les nichées. Sur les dernières années (2016-2022), cela représente un maximum de 31 nids et un peu moins de 90 poussins par an. Le nombre de 120 poussins est donc un nombre idéal, rarement atteint. Nous compensons ces faibles effectifs par un suivi sur le long terme (5 ans) et l’utilisation de modèles statistiques adaptés.

Raffinement

L’ensemble des manipulations est réalisé dans le respect de l’animal aussi bien des poussins qui sont directement manipulés que des adultes nicheurs présents au nid. Pour chaque acte, un point limite qui induit la mise au calme immédiate de l'oiseau a été défini . Les expérimentations sont faites de façon à minimiser le stress, tout dommage durable et la douleur et ce dans un temps limité et toujours à proximité du nid. Les expérimentations sont réalisées en parallèle du suivi pluriannuel de la population de busard cendré dans un but de protection. Le nombre de visites au nid est également limité dans le même but de minimisation du dérangement. Les poussins manipulés seront placés dans des sacs spécifiques (pochons en coton fin) pour les oiseaux qui permet à la fois une respiration optimale pour les individus et de les laisser à l’obscurité, réduisant ainsi leur stress. Un seul expérimentateur approchera le nid pour prélever les poussins et les placera directement dans un sac en coton propre (pas de souillure d'autres individus, pas d'échange de parasite ou pathogène). Les poussins ne seront manipulés que s’ils sont en bon état et uniquement dans des conditions météorologiques favorables.

Choix des espèces

Le busard cendré est un bon modèle d’étude pour la thématique des pesticides car il est particulièrement exposé aux pesticides directement (via l’épandage en plein champ) et indirectement (via les proies consommées, insectes et surtout campagnols). Les poussins sont suivis de l'éclosion à l'envol mais les manipulations auront lieu que lorsqu'ils seront âgés de 26 +/- 2 jours. Contrairement aux adultes volants, les poussins sont directement exposés à ces produits sans pouvoir les éviter.

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, deux plaies dorsales leur sont créées au biopsy punch avec pose d'une attelle et de sutures, puis infectées par la bactérie Staphylococcus aureus, avant l'application d'un plasma froid ou d'un antibiotique et quatre prises de sang. Le porteur signale une douleur et une gêne au réveil, ainsi qu'un risque de blessures si les souris se grattent ou se mordent, l'objet étant de tester le plasma froid contre les bactéries résistantes des plaies. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour cette phase et présente le porc, dont la peau est plus proche de la nôtre, comme écarté pour des raisons logistiques.

Objectifs

L’objectif est à la fois d’optimiser les technologies plasmas existantes et de développer de nouvelles technologies pour éliminer les bactéries résistantes responsables d’infections nosocomiales. Ceci est accompli dans un consortium interdisciplinaire et international qui met en synergie ses expertises démontrées. Les sources de plasma sont testées dans différents contextes pour leur efficacité antimicrobienne in vitro et in vivo en utilisant un modèle murin de plaie infectée. Des études mécanistiques sur la destruction bactérienne médiée par le plasma froid sont effectuées tandis que des échantillons de plaies provenant de patients facilement disponibles sont utilisés pour fournir du matériel réaliste pour étudier l’efficacité de cette nouvelle approche. Enfin, le traitement de plaies colonisées par des bactéries résistantes aux antibiotiques fournira les données d’une preuve de concept. Les résultats ne serviront pas uniquement à rendre prometteur l’utilisation du plasma froid contre les plaies infectées, mais également à améliorer la cicatrisation de plaies afin de lutter contre le développement de l’antibiorésistance en médecine humaine et vétérinaire. Le projet se déroule en trois étapes et feront l’objet de plusieurs demandes d’autorisation de projet. Première étape : Le premier objectif a été de mettre au point un modèle murin de plaie pseudo-chronique et de montrer l'efficacité des plasmas à froid sur la cicatrisation. Cette étape est donc validée et a permis de mettre en place le modèle de chirurgie, les soins à la douleur et le traitement à plasma froid.

Bénéfices attendus

Au sein du projet global, il est attendu que l’utilisation de plasma froid avec différents gazs soit efficace pour lutter contre l’infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques ou pas et pour améliorer la cicatrisation des plaies présentant un déficit cicatriciel. Cela se traduirait notamment par une baisse significative de la colonisation bactérienne de la plaie, et une éventuelle accélération de la cicatrisation des plaies. Un nouveau dispositif à plasma sera également utilisé et ses effets seront comparés à ceux du plasma de référence, déjà utilisé dans des cas cliniques en Allemagne. Il est attendu que ce nouvel outil soit aussi efficace, sinon plus, que le plasma de référence quant à la désinfection et la cicatrisation des plaies, car il permettrait de traiter une surface de plaie plus importante plus rapidement et d’augmenter l’efficacité de la réponse immunitaire. A plus long terme, cela pourrait permettre de généraliser l’utilisation de divers dispositifs à plasma à l'être humain, chez des patients souffrant de troubles de la cicatrisation (diabète, immunodépression, etc.) ; mais aussi de lutter contre l’antibiorésistance s’installant notamment sur ces plaies dans le cas d’infections nosocomiales. Cela pourrait également offrir des opportunités de traitement dans divers domaines (chirurgie, ophtalmologie, oncologie, etc.). La généralisation de l’utilisation de cette technologie pour entièrement décontaminer du matériel médical en milieu hospitalier pourrait être envisagée.

Procédures

Des puces d’identification dorsales seront injectées en sous-cutané à tous les animaux, sous anesthésie (5 minutes par animal). Les animaux seront soumis à une anesthésie générale et à la chirurgie visant à créer les plaies chroniques (biopsy punch et pose de l’attelle avec points de suture, 20 minutes par animal). 4 prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille. Tous les animaux seront vigiles (2 minutes par animal). Pendant 3 jours après la chirurgie, tous les animaux recevront des injections d’analgésiques en sous-cutané pour gérer la douleur au maximum (2 minutes par animal). Les plaies des animaux seront infectées par Staphylococcus aureus (dépôt de solution non invasif, 5 minutes par animal). Des prélèvements seront effectués à la surface des plaies de chaque animal à l’aide d’un coton-tige (10 secondes par animal). Les traitements plasma à froid ou avec antibiotique seront appliqués sur les plaies (5 min par animal vigile).

Impact sur les animaux

Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourrait être observés. Suite à la création des deux plaies dorsales, une douleur et une gêne possible dans les déplacements sont attendues au reveil de l’animal sans analgésie. Si les souris se grattent ou se mordent, des blessures pourraient apparaitre sur le dos ou les flancs. La contention lors des prises de sang peut engendrer du stress pour l’animal. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Des symptômes de l’infection pourraient être observés après l’inoculation de S. aureus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit les 672 souris. Des prélèvements de tissus seront effectués post-mortem pour la partie histologie (zone de biospsie et rate) pour l'analyse biologique de la reconstruction de l'épiderme cutané, ainsi que des prélèvements de la surface de la plaie pour analyses bactériologiques. La décision est prise par les responsables scientifiques et concepteurs.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale pour cette partie du projet, puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur l'infection et la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro. Les premières expériences du projet global sont des expériences in vitro qui ont confirmé la nécessité d’une phase in vivo pour obtenir des résultats supplémentaires et plus précis quant à l’objectif final : la phase clinique.

Réduction

Les volumes de sang à prélever par animal et leur fréquence étant contraints, les volumes prélevés à chaque prise de sang seront « poolés » par 2 (même couple d'animaux pour chaque prise de sang). Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques et en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique pour l’étude de la réponse immunitaire et de l’effet de l’infection sur les dérivés oxygénés produits notamment. Deux plaies dorsales seront réalisées sur chaque animal. Cela permet de réduire le nombre d'animaux car le nombre d’échantillons par animal est multiplié par deux, plutôt que de n’avoir qu’une seule plaie plus étendue par animal.

Raffinement

Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation est prévue pour permettre l'adaptation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour à partir du jour de la chirurgie (J0) : relevé télémétrique de la température de J0 à J10, signes cliniques tels que le poids, l’aspect du faciès et le comportement général. En cas de mal-être suspecté, de la nourriture sera déposée sur le sol de la cage pour limiter les efforts nécessaires aux animaux. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront euthanasiés par inhlalation contrôlée de CO2 dès que leur état état clinique se dégradera en dépit du traitement analgésique mis en place. En particulier, l’expression de trois des signes cliniques suivants sur une période de 24h entrainera leur mise à mort : hypothermie, de J0 à J2, hyperthermie de J2 à J10, comportement anormal, prostration, amaigrissement (>15%), poil hérissé, isolement, diarrhée. Les souris bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid et objet à ronger). Les souris sont hébergées 4 par cage dans une animalerie A2 en portoirs ventilés. Afin de diminuer la douleur de l'injection de la puce, les animaux seront sous anesthésie générale et un léger massage au niveau de la zone d’injection est effectué. Pour la partie chirurgie et le suivi post-opératoire : Période préopératoire : injection pré-opératoire 'un analsgésique (0,1 mg/kg, SC), au moins 20 minutes avant le début de la chirurgie, maintien au chaud sous lampe chauffante Période opératoire : anesthésie gazeuse : 4% pour l’induction, 1-2% pour le maintien, sur tapis chauffant Période postopératoire : injection post-opératoire immédiate d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (10 mg/kg, SC), maintien au chaud sous lampe chauffante. Injection d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (même dose) le soir. Injection d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (10 mg/kg SC, 1 fois/jour, à J1 et J2). Injection d'un analsgésique (même dose) (2 fois/jour, à J1 et J2), voire J3 en fonction du résultat de l'évaluation de la douleur, si elle n'est pas contrôlée par le méloxicam. Visite animalier matin et soir de J0 à J10. En cas d’hypothermie, les souris seront placées sous une lampe chauffante n’émettant pas de lumière. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchés fruitées ou des rondelles de bananes sèches ou popcorn sera réalisée.

Choix des espèces

La souris est l’animal le plus utilisé en expérimentation animale, en particulier quand il s’agit d’expériences impliquant un dispositif médical. Puisque l’objectif est de généraliser l’utilisation du plasma à froid à l’être humain, le porc aurait pu être choisi car la structure de l’épiderme est plus proche de la nôtre. Cependant, il est tout de même préférable de commencer par des expérimentations sur souris d’un point de vue logistique et statistique. Age des souris = 6-7 semaines pour la lignée de référence (déjà validée pour la chirurgie et l'infection à S. aureus). Les souris doivent être de jeunes adultes pour avoir la place de faire les biopsies (décrits dans les modèles publiés) et avoir un système immunitaire mature. Age des souris = 12-13 semaines pour la lignée diabétique Les souris doivent présenter un diabèté confirmé au moment de la réalisation des plaies pour mimer au mieux ce qui se déroule chez le patient.

15 946 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie au cours de laquelle l'utérus est exposé et chaque embryon transpercé par un capillaire de verre avant l'application d'un courant électrique, technique d'électroporation in utero destinée à modifier l'expression de gènes dans le cerveau en développement. Les femelles sont tuées pour collecter embryons et nouveau-nés, ces derniers subissant une injection dans le cerveau ou une perfusion intracardiaque terminale, tous étant tués pour prélever les cerveaux. Le porteur affirme que la complexité du cortex ne peut pas être recréée in vitro et conclut à la nécessité de la souris.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Chez certains patients avec des maladies du développement cortical, il existe des mutations dans des gènes qui montrent une forte probabilité d’être la cause de la maladie. Ces pathologies sont associées aussi bien à des défauts de prolifération, de migration et de différenciation neuronale. Comprendre les mécanismes par lesquels la mutation entraine la pathologie est essentiel pour faciliter le diganostic d’autres maladies et envisager un traitement. Pour comprendre ce qu’il se passe dans les neurones, nous allons adopter une approche génétique visant à modifier l’expression ou la fonction des molécules étudiées. Nous utiliserons l’électroporation in utero chez la souris. Cette technique permet l’introduction de matériel génétique contrôle et muté dans les cellules progénitrices de la zone ventriculaire du cerveau en développement, permettant donc l’étude de la structure, de la fonction et du développement du système nerveux central. Elle offre l’avantage d’un contrôle spatio-temporel de la délivrance d’ADN, permet des études de perte et de gain de fonction et est simple, rapide et efficace. On pourra ainsi étudier l’effet d’un gène : # sur la prolifération : électroporation au stade embryonnaire (un seul stade par gène selon le pic d’expression du gène étudié) et analyse du devenir des cellules modifiées 1 ou 2 jours plus tard. Dans ce cadre, les mères recevront une ou deux injection(s) nous permettant des analyses de données plus fines# sur la migration des neurones : électroporation au stade embryonnaire et analyse du devenir des cellules modifiées 3 ou 4 jours après # sur la différenciation et la connectivité neuronale en introduisant le gène d’intérêt au stade embryonnaire et en analysant 2, 4, 8 ou 21 jours après la naissance .

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction de protéines ou d'autres molécules impliqués dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels leur déplétion ou surexpression conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées pour les patients. En effet, notre collaboration avec des cliniciens nous permet de tester par cette approche des variants retrouvés chez des patients présentant des maladies du développement du cerveau. Comprendre les mécanismes peut permettre d’envisager des pistes thérapeutiques.

Procédures

Les femelles gestantes vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes), suivie d’une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, pour une durée de 1 à 10 secondes pour chaque embryon). La durée totale de la chirurgie n'exèdera pas 45 minutes ( en moyenne 25 minutes pour un chirurgien expérimenté). Un courant électrique sera appliqué sur la paroi utérine, en 5 pulses de 50 ms espacés de 1 seconde (temps total entre 5 et 6 secondes par embryon). Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. Certaines recevront une ou deux injections (5 secondes) 1-2 jours après la chirurgie. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (entre 1 et 10 secondes). Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes) puis d’un anesthésique (environ 5 secondes) avant de subir une chirurgie de perfusion intracardiaque terminale sous anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

La barrière cutanée des femelles gestantes donc rompue en plusieurs endroits (site d'injection dans le dos entre les omoplates, aiguille très fine, cicatrice de la laparotomie sur le ventre), il en résulte une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées et de ce fait privées de congénères pendant quelques jours de convalescence. Certaines recevront une ou deux injections sous cutanées 1-2 jours après la chirurgie, pouvant entrainer un stress et d'autre(s) rupture(s) le la barrière cutanée. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin aux stades embryonnaires ainsi que l'application d'un courant électrique sur leur tête. Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique puis d’un anesthésique (pouvant entrainer du stress) avant de subir une chirurgie terminale de perfusion intracardiaque.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles sont mises à mort pour collecter les embryons ou dès collecte des nouveaux nés. Les embryons ou nouveaux nés sont mis à mort pour collecter les cerveaux.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.

Réduction

Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Les experiences (prolifération, migration, maturation) seront choisies en fonction de la nature du gène étudié, son profil d’expression et du phénotype observé chez les patients. Aussi toutes les expériences ne seront pas systèmatiquement éffectuées. Seules celles relevantes seront faites. En ce qui concerne les études post-natales, et afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris, nous avons adapté nos croisements pour obtenir des souris moins agressives et meilleures nourrices. La bonne maitrise de la technique chirurgicale acquise par l’équipe tout au long de ces dernières années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (40-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous prévoyons aussi dans cette étude 10 femelles gestantes pour la formation de nouveaux expérimentateurs afin de nous assurer de leur succès et d’un bon taux de survie.

Raffinement

Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Avant le début de l’expérience, les femelles reçoivent une injection d'analgésique 30 minutes avant l’anesthésie. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse. Leurs yeux sont protégés de la deshydratation. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’anesthésie. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, est injecté à la fin de l’opération afin de prendre le relais de l’analgésique pendant 24h. L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. 1) Etude de la prolifération : Femelles adultes gestantes de 13 jours ou 14, stades auxquels la proliferation des progeniteurs est à son maximum. Le choix du stade se fera en fonction du profil d’expression deu gène d’intérêt (un seul stade sera retenu pour les expériences, celui avec le pic d’expression de la protéine d’intérêt) : l’électroporation du matériel génétique d’intérêt en même temps qu’un marqueur fluorescent permettra de suivre la prolifération de ces cellules. Analyse à 14 ou 15 jours de gestation, stade d’étude de la prolifération cellulaire. 2) Etude de la migration cellulaire : Femelles adultes gestantes de 13,5, 14,5 ou 15,5 jours, stades auxquels les neurones migrent le long de la glie pour atteindre leur localisation finale. L’electroporation à ces trois stades permettra de visulaiser la migration de types neuronaux diffèrents (nés à chacun de ces stades). Analyse à 18,5 jours de gestation pour les visualiser grâce à un marqueur fluorescent électroporé en même temps que le matériel génétique à étudier. 3) Etude de la maturation neuronale et connectivité : femelles adultes gestantes de 15,5 jours (stade auquel les neurones callosaux sont générés). L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’intégrer le gène à étudier uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à 2, 4 et à 8 jours après la naissance respectivement et le branchement des axones à 21 jours post-natals, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer ces différentes étapes.