Procédures modérées
Impact d’un ARN circulaire issu de l’oncogène majeur d’un herpès virus aviaire chez la poule
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
96 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Inoculées avec le virus de la maladie de Marek, elles subissent huit prélèvements de sang et trois prélèvements de plumes, et le porteur indique s'attendre à ce que la majorité développe la maladie, avec fièvre, paralysie, lymphome, perte de plumes ou mort subite. Les oiseaux sont hébergés en isolateurs qui restreignent leurs mouvements, et ceux présentant des symptômes graves sont euthanasiés après confirmation du diagnostic. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'étudier la latence virale et qu'aucun autre modèle animal ne convient, ce virus n'infectant que les gallinacés.
Objectifs
Le virus de la maladie de Marek est un herpès virus aviaire hautement contagieux et entrainant des lymphomes mortels pour les animaux dans un délai de quelques semaines. Ce virus est actuellement sous contrôle grâce à des protocoles de vaccination très stricts, bien que ceux-ci ont montré des failles dans les dernières années. Ce virus est également un outil en recherche biomédicale de par son côté modèle d’oncogenèse viro-induite. L’objectif de ce projet est d’approfondir les connaissances sur l’oncogenèse induite par ce virus. Alors que celle-ci a été longtemps réduite au résultat de l’expression d’un facteur de transcription viral dérégulant la biologie cellulaire des cellules infectées de manière latente, les découvertes successives d’acides ribonucléiques (ARN) non-codants impactant le cycle viral et l’oncogenèse viro-induite ont remis en cause ce modèle. Dans le cadre de ce projet, nous proposons qu’un ARN non-codant nouvellement découvert et encodé à partir du même gène permettant l’expression de l’oncogène majeur du virus puisse avoir un impact sur l’apparition de la lymphomagenèse. Pour répondre à cette question deux virus OGM ont été produits en laboratoire et testés in vitro avant cette approche in vivo. L’approche in vitro a montré ses limites car l’effet est suspecté de se produire durant la latence du virus, qui n’est pas observable dans les modèles cellulaires. Ce projet nécessitera au maximum l’utilisation de 96 poules.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact de l’ARN circulaire étudié sur l’oncogenèse requiert un volet in vivo pour répondre à la question de recherche. Actuellement, et depuis leur première description en 2018, aucun ARN circulaire viral n’a été décrit pour ses rôles promouvant l’oncogenèse viro-induite in vivo. Le virus de la maladie de Marek est un modèle adéquat pour investiguer ce pan inexploré de l’oncogenèse viro-induite. Au travers de ce projet, nous espérons comprendre le rôle de l’ARN circulaire associé au locus de l’oncogène majeur du virus de la maladie de Marek. Les bénéfices sont donc à répartir sur plusieurs niveaux : 1- Maladie de Marek : Meilleure compréhension du cycle viral et de la tumorigenèse viro-induite 2- Biologie moléculaire : Descriptions de nouvelles fonctions des ARN circulaires, notamment viraux 3- Virologie : Description d’un pan très récent de la virologie.
Procédures
une inoculation de virus sur animaux vigiles + 8 prélèvements de sang sur animaux vigiles + 3 prélèvements de plumes sur animaux vigiles. Durée de chaque acte : moins d’une minute.
Impact sur les animaux
1/ L’hébergement des animaux en isolateurs est nécessaire dans le cadre des recherches portant sur le virus de la maladie de Marek. Cependant, l’hébergement en isolateurs peut induire une compétition sur les ressources alimentaires en fonction de la fréquence des nourrissages. Ce type d’hébergement réduit également la liberté de mouvement des animaux. 2/ La maladie de Marek est une maladie virale hautement contagieuse et fatale pour la majorité des animaux infectés. Il est attendu que la majorité des animaux de l’étude soient atteints de la maladie durant le temps de l’étude. Parmi les symptômes possibles : fièvre, paralysie, mort subite, lymphome, perte de poids, perte de plumes, difficultés respiratoires, ailes pendantes, boiterie. 3/ Les prises de sang et prélèvements de plumes entraineront un stress récurrent chez les animaux concernés. Ces manipulations entraineront également des douleurs ponctuelles : un animal dont la contention serait mal assurée pourrait se faire mal ou se blesser ; l’injection intramusculaire peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection et les prises de sang peuvent être sources d’hématomes au site de prélèvement. Les prélèvements de plumes entrainent une douleur ponctuelle pour l’animal.
Devenir
En fin d’expérience, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser différents prélèvements d'organes et de plumes.
Remplacement
Il est impossible de remplacer le modèle par des approches in vitro ou in silico car les méthodes actuelles n‘offrent qu‘une approche limitée de la maladie. Notamment, il n‘est pas possible d‘étudier in vitro la latence virale, responsable de la lymphomagenèse. L’utilisation d’un autre modèle animal, moins sensible, est également impossible car cet herpès virus n’infecte que les gallinacés.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque lot a été établi afin d’être en conformité avec le principe de réduction des règles de bien-être animal et de manipuler un nombre d’échantillons suffisants pour établir si les différences mesurées entre lots sont statistiquement significatives et donc non dus au hasard. Les meilleurs tests statistiques seront appliqués dans les comparaisons des différents groupes pour permettre un traitement optimal des données.
Raffinement
Une visite des animaux est effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié afin de détecter l’apparition de symptômes de la maladie ou tout autre signe anormal lié à la santé et au bien-être des animaux. Les animaux présentant des symptômes graves de la maladie de Marek seront euthanasiés après confirmation du diagnostic par le responsable du projet. Les animaux présentant des symptômes légers feront l’objet d’une surveillance accrue pour détecter l’apparition de nouveaux symptômes. L’ensemble des gestes techniques est assuré par du personnel formé et compétent, ce qui limitera le stress des animaux. La contention est effectuée en douceur et les prélèvements sont le plus rapide possible. Les prélèvements de plumes et de sang sont réalisés simultanément pour limiter le stress. Le nombre de prélèvements a été réduit au minimum et espacés au minimum de 7 jours pour limiter la manipulation et la souffrance liées aux prélèvements répétés. Dans le cas des prélèvements de plumes, de petites plumes seront prélevées, ce qui limite la douleur par rapport aux prélèvements de plus grosses plumes. Afin de limiter la douleur lors de l’inoculation du virus, nous utiliserons des seringues avec des aiguilles fines et courtes. Les injections seront réalisées sous PSM (poste sécurité microbiologique) avant l’entrée des animaux dans les isolateurs afin de faciliter la manipulation, notamment la contention des animaux et ainsi rendre l’injection plus simple et moins stressante pour les animaux. des vers de farine seront testés comme aliment de récompense après les prélèvements. Des points limites adaptés ont été définis.
Choix des espèces
Le virus de la maladie de Marek ne provoque des lymphomes que chez les gallinacés. L’utilisation de la race choisie permet d’obtenir des effets plus importants et donc, de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude. De plus, chaque année, malgré la vaccination, des élevages de poulets présentent des cas de maladie de Marek malgré la vaccination. Cela peut être dû à une mauvaise vaccination, à des souches hypervirulentes ou à des environnements très contaminés. Pour des raisons techniques, les poulets seront infectés à l’âge de 14 jours. Ils seront euthanasiés à maximum 75 jours d’âge. L’âge d’inoculation de 14 jours a été déterminé car il permet de commencer les prélèvements sanguins dès le début de l’expérience, tout en restant suffisamment sensible à la maladie pour obtenir des résultats robustes en un minimum de temps.
Etudes et traitements des maladies du nerf optique
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une atrophie du nerf optique menant à la cécité, elles subissent tatouage, biopsie de la queue, plusieurs anesthésies pour des examens oculaires et, pour une partie, une injection dans l'œil qui peut provoquer une inflammation. Le porteur affirme à plusieurs reprises que ce modèle est le "seul moyen" d'explorer la maladie et de tester des traitements, et que le recours à la souris est "nécessaire" pour la thérapie génique. Les animaux, modifiés ou infectés par des virus, ne peuvent être ni relâchés ni adoptés et sont tués pour prélèvement de tissus, le bénéfice pour les patients étant renvoyé au long terme.
Objectifs
Les objectifs du projet sont d’étudier les mécanismes qui sont responsables de la perte de vision dans les atteintes du nerf optique et d’identifier des traitements capables de protéger le nerf optique. Le projet porte sur une maladie qui entraine une perte de la vision progressive dû à une perte de la fonction du nerf optique qui permet de relier l’œil au cerveau. Il n’existe actuellement pas de traitement pour traiter cette maladie. Nous avons donc généré un modèle animal pour reproduire la maladie et tester des traitements. Ce modèle animal reproduit fidélement les atteintes retrouvées ches les patients. Il est important de noter que ce modèle représente le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie. Ce modèle est également le seul model qui puisse être utilisé pour tester des traitements sur la rétine. Nous développerons 2 approchent : 1) une étude sur les cellules de la rétine qui sont défectueuses que nous mettrons en culture afin d’étudier leur croissance en réponse à plusieurs traitements. 2) Un axe sur les animaux vivants auquels nous injecterons dans l’œil une protéine connue pour protéger la rétine. Nous mesurerons le bénéfice de cette thérapie sur la fonction visuelle des animaux au cours du temps.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence si notre traitement est capable de protéger la vision des animaux. A long terme ce projet permettra de proposer un traitement de thérapie génique chez les patients atteints de perte de fonction du nerf optique.
Procédures
600 animaux seront identifiés par tatouage pour leur identification et une biopsie de queue pour le génotypage (identification génétique des animaux). 180 de ces animaux seront anesthésiés pendant 30 minutes, 2 fois à une semaine d’intervalle à 3 mois et 5 mois (4 anesthésies en 5 mois) pour les expériences de fond d’œil (10 min par animal) et d’OCT (10 min par animal), ERG (10 min par animal). 120 d’entre eux auront une anéthesie supplémentaire de 20 min pour l’injection intravitréenne (5 minute par animal) à 3 mois (injection unique pour toute la durée du projet). 180 animaux seront anesthésiés pendant 30 minutes, 2 fois à une semaine d’intervalle à 3 mois, 5 mois et 11 mois (6 anesthésies en 11 mois) pour les expériences de fond d’œil et d’OCT, ERG. 120 d’entre eux auront une anéthesie supplémentaire de 20 min pour l’injection intravitréenne à 3 mois (injection unique pour toute la durée du projet). 240 animaux auront une injection intravitréenne, procédure durant 5 min maximum par animaux.
Impact sur les animaux
Les tests fonctionnels sont indolores et pratiqués couramment en ophtalmologie humaine. Les injections induisent une légère lésion au niveau de la sclère de l’œil et peuvent induire une inflammation. Une partie des tests se feront sous anésthésie générale. Après chaque exploration (test), les souris seront observées quotidiennement.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvement de tissus post-mortem. De plus, la plupart des animaux utilisés étants génétiquement modifiés et/ou infectés par des virus génétiquement modifiés eux aussi, il nous est impossible de replacer ou de faire adopter ces animaux. Ils seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Nous avons généré une souris reproduisant une maladie qui entraine une baisse progressive de l’acuité visuelle dû à la perte du nerf optique. Il n’y a pas de traitement. Il est important de noter que ce modèle représente le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie et de tester des traitements. Dans le cadre d'essais cliniques de thérapie génique, le recours à la souris est necessaire et permet d’apporter une indication de l’efficacité du traitement.
Réduction
Notre projet étudie toutes les souris qu’elles soient porteuses de mutation ou non. Nous avons également constaté une différence d’atteinte chez les mâles et les femelles, de ce fait notre étude prend en compte mâles et femelles. Les mêmes animaux seront étudiés à 3, 5 et 11 mois avant leur euthanasie.
Raffinement
Tous les tests comportementaux présents dans ce projet sont effectués sur animal éveillé ou sous anesthésie. Les animaux sont placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu'au réveil. Après toutes analyses, les souris seront observées quotidiennement. Si des animaux montrent des signes de douleurs ou de souffrances nous évaluerons cette souffrance et nous prendrons les décisions nécessaires afin de réduire la durée et l’intensité de la souffrance et y mettre fin.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris, car c’est le modèle mammifère de référence pour étudier l’impact d’une mutation d’un gène sur l’organisme. La souris modèle que nous avons générée porte la mutation la plus souvent retrouvée chez les malades (30% des cas) atteints d’atrophie optique dominante, une maladie dans laquelle le nerf optique disparait et qui rend aveugle. Ce modèle reproduit les caractéristiques cliniques de la maladie chez l’homme. Cette souris est donc un très bon modèle animal pour tester des traitements. Les animaux seront testés à 3 jours après la naissance pour faire des cultures de cellules rétiniennes. Ce stade est le stade utilisé pour avoir les meilleurs résultats. Des traitements seront testés sur ces cellules afin d’identifier des molécules protectrices des cellules ganglionnaires de la rétine. Les animaux génétiquement modifiés reproduisant la maladie seront traités par thérapie génique à l’âge de 3 mois et leur vision sera explorée au cours du temps (à 5 et 11 mois) afin d’évaluer le bénéfice thérapeutique de l’approche de thérapie génique. Des prélèvements de rétines seront réalisés sur les animaux de 5 et 11 mois après euthanasie afin d’évaluer l’effet du traitement sur la morphologie de la rétine.
Evaluation par microscopie intravitale des effets de la Photobiomodulation sur l’inflammation chronique et aiguë suivant un traumatisme de la moelle épinière
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Toutes reçoivent l'implantation d'une fenêtre vitrée dans la colonne vertébrale, et 420 d'entre elles une section partielle de la moelle épinière qui provoque une paralysie postérieure temporaire, avec difficultés à s'alimenter et à vider la vessie. Le porteur teste ensuite un traitement par lumière et compare la récupération à celle de 300 souris non lésées, avec des prélèvements sanguins deux fois par semaine et une mise à mort par perfusion intracardiaque. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ou in silico ne rend compte de la complexité du traumatisme médullaire, les bénéfices annoncés restant formulés au conditionnel.
Objectifs
Ce projet mettra en place un modèle murin de traumatisme médullaire permettant de clarifier les mécanismes neuroinflammatoires régulés par ce traitement, en vue d'accélérer et maximiser la récupération fonctionnelle. Il s'agit donc non seulement d'un enjeu de recherche fondamentale mais aussi de recherche cliniquement applicable.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’évaluer le traitement par photobiomodulation en fonction d’une application précoce, tardive ou combinée et de comparer l’évolution des densités cellulaires et de la récupération sensori-motrice post-traumatique avec celles observées pour des animaux lésés mais non traités. Ainsi nous pensons pouvoir mettre en évidence un effet anti-inflammtoire et neuroprotecteur de la PBM appliquée en phase aiguë immédiatement après le traumatisme et pendant 5 jours consécutifs. Nous pensons également pouvoir mettre en évidence un effet neurotrophique et neuro-régénératif de la PBM dans les phases chroniques grâce à une action directe sur la microglie après exposition brève pendant 5 jours à compter de la 5ème semaine post-traumatique. Si tel est le cas, la combinaison de ces deux protocoles thérapeutiques permettra d’amplifier les effets positifs de la lumière et d’accélérer, sinon de maximiser, la récupération fonctionnelle post-traumatique.
Procédures
Sur cinq ans, la totalité des 720 animaux seront soumis à une chirurgie pour implanter une fenêtre vitrée spinale permettant de réaliser des expériences de microscopie intravitale longitudinale sous anesthésie. L’implantation d’une fenêtre vitrée n’induit pas de nuisance majeure pour la locomotion et le comportement de l’animal non lésé. 420 souris seront de plus soumises à une transection partielle de moelle épinière thoracique (hémisection) de laquelle elles récupèrent spontanément au bout de 6 à 7 semaines en l’absence de traitement. 92% de ces animaux traumatisés recevront un traitement de 6 min de photobiomodulation quotidienne appliquée pour 5 jours consécutifs soit immédiatement au moment du traumatisme, soit un mois après, soit combiné (immédiat et un mois après). La durée des expériences sera limitée à 60 jours post-trauma. La réponse au traitement de ces animaux sera comparée à celle de 300 animaux non lésés. Les sessions d’imagerie intravitale ne sont pas douloureuses, ni destructives. Sur tous les animaux, la réponse musculaire réflexe sera évaluée 2 fois par semaine sous anesthésie volatile légère grâce à des enregistrements électromyographiques de la contraction musculaire induite par stimulation du nerf tibial. Sous anesthésie gazeuse également, des prélèvements sanguins seront réalisés 2 fois par semaine à raison de 50 µl par prélèvement sans dépasser un volume maximum équivalent à 7,5% de la volémie totale de nos animaux chaque semaine. Ces prélèvements n'auront lieu qu'après reprise du poids initial de l'animal. Tous les animaux seront mis à mort dans les 60 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/CSF nécessaires aux études et caractérisations post-mortem.
Impact sur les animaux
Les différentes techniques d'exploration utilisées dans ce projet sont suceptibles d'engendrer les nuisances suivantes : anesthesie, implantation de fenetre vitrée spinale, lésion de moelle épinière, gêne locomotrice : paralysie temporaire unilaterale postérieure pouvant occasionner une difficulté à la prise alimentaire, risque éventuel de difficulté de la vidange de la vessie peut-être observé dans les premiers jours, traitement quotidien par photobiomodulation non invasive, l'hébergement en cage individuelle, stress et/ou douleur, prélèvements sanguins. Des électrodes adhésives sont proposées en lieu et place d’électrodes implantées. Prelevement LCR par citerne et perfusion intracardiaque.
Devenir
Tous les animaux (720) seront euthanasiés dans les 60 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem.
Remplacement
Les pathologies neurodégénératives et traumatismes médullaires sont des processus complexes impliquant l’interaction entre de très nombreux organes et systèmes physiologiques (nerveux, immunitaire, endocrinien, cardiovaculaire… ) qu’il est nécessaire d’analyser et de comprendre. Aucun modèle cellulaire ou aucun modèle in silico ne sont aujourd’hui en mesure de rendre compte de cette complexité. L'importance de l'interaction entre les axones, la myeline, les vaisseaux sanguins et les autres types cellulaires (microglie et astrocyte) rend la mise en place d'un système in vitro reproduisant toutes les composantes trop complexe et n'est pas envisageable. Le modèle d’hémisection est nécessaire pour permettre de tirer des conclusions sur les mécanismes de récupération fonctionnelle. La procédure de thérapie par photobiomodulation dans notre modèle est une étude pré-clinique visant à ouvrir la voie à des essais cliniques pour des applications dans le traitement du traumatisme de moelle sachant que celle-ci est dors et déjà appliquée sur l'humain dans le cadre d'études cliniques pour le traitement de la maladie d'Alzheimer et des contusions cérébrales chez les sportifs. Dans notre cas, un des critères principaux de l'effet du traitement est l'évolution des capacités motrices, avec et sans traitement, au cours du temps. Cette étude ne pourrait donc pas etre réalisée autre que in-vivo.
Réduction
Sur la base de nos travaux passés, les lots d’animaux sont dimensionnés au minimum pour s’assurer de la significativité statistique des quantifications in vivo et sur tranches en utilisant le test statisitque dédié aux petits échantillons. Ce test nous a permis de définir le nombre d'animaux requis pour l'étude. Ainsi il est nécessaire de réaliser la quantification in vivo pour 8 animaux par groupe à J60. Compte tenu d’une probabilité d’environ 70% d’obtenir une fenêtre claire sur deux mois post-traumatiques suivant l’expertise des expérimentateurs chirurgiens, il est prévu d’utiliser 12 animaux par groupe pour les expériences intravitales. Les expériences d’imagerie sur coupes histologiques sont moins bruitées et permettent de moyenner l’analyse sur un plus grand volume de tissus pour obtenir des résultats moins variables. Le nombre d’animaux nécessaires à chaque temps est donc de 3 au lieu de 8 in vivo. Afin de couvrir les 6 temps d’intérêts, 18 animaux seront nécessaires par groupe pour réaliser les expériences d’immunohistochimie. Le nombre de 720 animaux a donc été établi afin d'avoir un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe permettant d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences avec significativité statistique. Le modèle souris est choisi en raison de sa très bonne récupération spontanée suite à un traumatisme de moelle, récupération que nous souhaitons accélérer par une prise en charge thérapeutique de type clinique tout en étudiant dans le même temps l’implication du système immunitaire. Les mêmes animaux et les mêmes données servent ainsi à la recherche fondamentale ET à la recherche applicative.
Raffinement
Reception et adaptation de 7 jours. Après induction à l'isoflurane, injection de buprénorphine, les animaux sont anesthésiés avec injection intrapéritonéale d'une solution de kétamine et xylazine; ces doses sont augmentées de 50% avant la perfusion intracardiaque pour anesthésie profonde pré-opératoire et mis sur un tapis chauffant. Les yeux sont oints de gel hydratant, une infiltration de lidocaine est appliquée avant toute incision. Après laminectomie, Une injection sous-cutanée d'une solution d'anti-inflammatoires, dexamethasone et rimadyl, est réalisée le jour de la chirurgie puis tous les deux jours pendant 10 jours. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles respectant la surface minimale requise, avec objet d’enrichissement de l’environnement (dômes en carton ou en plexiglas ou encore coton). un accès non limité à la nourriture et l’eau, un cycle de 12h jour et 12 nuit, une température et une humidité contrôlées. Les animaux sont visités tous les jours par des personnes compétentes dans le domaine de l’expérimentation et du bien-être animal comme attesté par les autorités référentes. Pour s'assurer de la bonne vidange de la vessie le bas du ventre de chaque animal est palpé 2 fois par jours. Dans le cas éventuel où la vessie ne se viderait pas, nous appliquons des massages jusqu'a vidange de celle ci. Du gel sucré énergétique est mis à disposition au fond de la cage pendant la procédure afin de s’assurer que l’animal a les apports énergétiques dont il a besoin. Le recours à l’anesthésie a lieu aussi souvent que nécessaire pour limiter le stress ou la douleur inhérentes aux manipulations requises pour les prélèvements ou les sessions d’imagerie. Les animaux sont pesés quotidiennement les 5 premiers jours avec pour poids de référence le poids avant la procédure chirurgicale. Une variation de plus de 20% pendant plus de 3 jours, malgré la supplémentation sous-cutanée en solution sucrée, sera considérée comme un point limite. Les procédures choisies s seront accompagnées d'un suivi rigoureux des signes cliniques (score de douleur: Grimace scal Langford et al). La mise a mort de l'animal sera effectuée s'il atteint son point d'arrêt.
Choix des espèces
Nous utilisons la microscopie de fluorescence intravitale. Il est donc nécessaire d’étudier des animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents. Nous disposons d’une lignée unique, établie et caractérisée depuis plusieurs années par notre équipe et dans laquelle les populations cellulaires d’intérêt sont génétiquement marquées de différentes couleurs. Le phénotype de ces cellules est aujourd’hui très bien caractérisé par nos travaux précédents. Ceci évite de perdre des animaux en mise au point de protocole. Dans le cadre du traumatisme de moelle, la souris démontre une très bonne récupération spontanée tout en impliquant des processus physiologiques fortement similaires à ceux rencontrés chez l’humain : neurodégénération et repousse de colatérales d’axones, angiogénèse et recrutement de cellules inflammatoires, gliose réactionnelle… Les observations sont donc facilement transférables au contexte clinique. Les vastes connaissances actuelles sur l’organisation de la moelle épinière chez la souris et sur son comportement en font un modèle pré-clinique de choix dans lequel les signes de douleur ou souffrance sont aisément détectables et interprétables. Tous les animaux seront de animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observée chez les patients traumatisés médullaire. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement, tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux. Les deux sexes seront utilisés pour rendre compte de la diversité des cas observés chez les patients lésés médullaires.
Chirurgie expérimentale : formation réglementaire destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales chirurgicales sur des animaux
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 480
930 souris et rats vont être utilisés pour une formation réglementaire à la chirurgie, la plupart tués sous anesthésie sans réveil, certains réveillés puis suivis quatre heures avec une douleur postopératoire possible. Chaque animal sert à une intervention abdominale ou thoracique réalisée par un stagiaire après démonstration, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnels. Le porteur indique que les stagiaires s'exercent d'abord sur des supports inertes, cuisses de poulet et rats en plastique, et affirme qu'aucun modèle inerte ne reproduit les signes d'anesthésie profonde et de réveil. Il justifie l'ensemble par le caractère obligatoire de la formation et le "besoin" d'acquérir les bases chirurgicales.
Objectifs
Le projet consiste à réaliser des travaux pratiques sur Rongeurs (rats et souris) au cours des sessions du « module spécialisé en procédures chirurgicales » de la formation spécifique en expérimentation animale, destiné aux concepteurs de projets intégrant des interventions chirurgicales et aux personnels réalisant ces procédures chirurgicales. Cette formation réglementaire est obligatoire pour être autorisé à pratiquer des actes chirurgicaux sur l’animal. L’objectif est d’enseigner aux stagiaires les bases en chirurgie : rappels d’anesthésie, monitoring, gestion de la douleur pré-/per-/post-opératoire, sutures, cicatrisation, asepsie et d’acquérir des bases pour la réalisation de gestes chirurgicaux. Les stagiaires s’entrainent sur des supports inanimés (cuisses de poulets pour les sutures, rat MD-PVC pour les microsutures) avant de passer sur l’animal anesthésié. Plusieurs types d’interventions chirurgicales sont réalisées afin d’avoir une approche pluridisciplinaire (chirurgie abdominale, thoracique). Chaque stagiaire dispose d’un animal pour réaliser chaque intervention après démonstration de la technique par vidéo puis mise en œuvre par un intervenant compétent. Il y a donc une progression dans la compréhension de la technique avant sa mise en œuvre par le stagiaire. Chaque intervenant supervise au maximum 5 stagiaires afin d’assurer un encadrement de qualité. Pour réaliser ces travaux pratiques 15 souris et 16 rats maximum sont utilisés à chaque session soit sur 5 ans et pour 6 sessions de formation par an un total maximal de 480 rats et 450 souris.
Bénéfices attendus
Les formations réglementaires en chirurgie sur l’animal sont obligatoires et ont pour objectif de former les personnels impliqués dans ces procédures afin de minimiser les contraintes imposées aux animaux. Il leur est nécessaire d’acquérir les bases en chirurgie afin de garantir la mise en oeuvre de bonnes pratiques vétérinaires, tant éthiques que techniques. A l’issue de la formation, les stagiaires connaissent les points-clés indispensables à cette mise en œuvre éthique et responsable des protocoles de chirurgie.
Procédures
les animaux sont soumis à des procédures chirurgicales effectuées sous analgésie et anesthésie (1 procédure par animal). Chaque procédure chirurgicale est d’abord montrée par un intervenant qualifié et elle dure de l’ordre de 30 à 45 minutes. Lorsque les procédures sont mises en œuvre par les stagiaires, elles durent entre 1h et 1h30.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés pour la formation subissent une chirurgie qui peut avoir des effets indésirables : mauvaise mise en place de l’analgésie/anesthésie, détresse respiratoire, chute de température centrale. Les souris peuvent subir une lègère douleur au point de piqure lors de l’adminsitration de l’anesthésique par voie intrapéritonéale. La plupart des souris ne sont pas réveillées après le geste chirurgical. Celles dont le réveil est suivi pendant 4 heures peuvent ressentir une douleur post-opératoire. L’anesthésie des rats est induite par de l’isoflurane : ils peuvent subir un stress au moment de les placer dans la cage d’induction. Ils ne sont pas réveillés.
Devenir
Ces procédures sont mises en oeuvre dans le cadre d'un stage de formation aux bonnes pratiques chirurgicales. Les animaux sont euthanasiés à l'issue de la mise en oeuvre du geste technique(1 procédure par animal). Chaque procédure chirurgicale est d’abord montrée par un intervenant qualifié et elle dure de l’ordre de 30 à 45 minutes. Lorsque les procédures sont mises en œuvre par les stagiaires, elles durent entre 1h et 1h30.
Remplacement
Il s’agit de former aux bons gestes chirurgicaux. Les stagiaires commencent par pratiquer sur des supports inertes (cuisses de poulet, rats plastiques) puis ils mettent en œuvre 2 gestes chirurgicaux (procédures 1 et 2) après démonstration et sous supervision des enseignants. Il n’existe actuellement pas de modèle inerte permettant l’observation des signes d’anesthésie profonde et de réveil et un abord le plus précis et le moins invasif possible d’un organe. Quand cela est possible pour un bon apprentissage des gestes, les modèles plastiques sont utilisés. C’est le cas d’une des procédures qui est réalisée uniquement en démonstration par les enseignants : 1 seul animal est concerné par groupe de TP et par séance, les stagiaires reproduisant les gestes sur des modèles de vaisseaux en silicone.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste : 1 animal par démonstration de procédure et 1 animal par stagiaire pour les 2 premiers gestes (pas d’animal pour les stagiaires pour le 3e geste), auxquels on ajoute 2 rats et 4 souris supplémentaires par stage pour tenir compte des aléas chirurgicaux. Il y a 10 stagiaires par session, 6 sessions par an et la demande est faite pour 5 ans. Au total pour 5 ans, 930 Rongeurs : 450 souris et 480 rats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des locaux conformes à la réglementation. Il s’agit d’animaux surnuméraires issus du pôle élevage de l’animalerie, ou ils sont exceptionnellement achetés chez un éleveur agréé lorsqu’il est nécessaire de compléter les lots. Ils sont habitués aux locaux de stabulation et à la manipulation pendant une semaine minimum avant les expérimentations. Les cages sont enrichies en nid végétal pour les souris et en buchettes à ronger pour les rats. Lors des chirurgies, une analgésie pré-opératoire est mise en place et, pour les rats, une sédation est d’abord induite avant d’installer l’anesthésie. En cas de besoin, une demi-dose du mélange anesthésique est administrée et/ou un relais est fait par de l’anesthésique local. Tout au long de l'hébergement et des procédures, la surveillance quotidienne permet de vérifier l'état de santé des animaux et des points limites précoces et adaptés sont mis en place.
Choix des espèces
Pour apprendre à gérer le stress inhérent à toute chirurgie, il est nécessaire en plus de l’apprentissage des gestes techniques sur des supports inertes de se placer dans les conditions réelles et donc de manipuler l’animal. La formation est essentiellement axée sur les Rongeurs (rat et souris) qui représentent plus de 80 % des animaux utilisés dans le cadre des procédures expérimentales. La formation est effectuée sur des animaux adultes car ils sont de gabarit adapté d'un point de vue pédagogique
Mécanismes des récepteurs du glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement chez la souris 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau, implantation d'électrodes de deux à six heures et injection de virus, suivies d'enregistrements de l'activité neuronale et de tests de mesure de l'anxiété et de la peur. Le porteur décrit une recherche fondamentale sur des récepteurs au glutamate et affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour préserver un réseau neuronal intact chez le rongeur. Les applications thérapeutiques pour les troubles anxieux sont annoncées à long terme, l'euthanasie servant à des analyses histologiques post-mortem.
Objectifs
Le projet, qui se déroulera dans deux établissements, a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs au glutamate étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement, dans un cadre physiologique et pathologique. Il s’agira notamment de comprendre l’importance de ces récepteurs dans la formation et la stabilisation des souvenirs associant un contexte à une émotion donnée et leur implication dans les comportements liés à l'anxiété. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à la réactivation et la coordination de plusieurs structures cérébrales pendant l'exécution et la consolidation des souvenirs aversifs dépendante du sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements in vivo chez des souris libres de leurs mouvements et endormies. L'identification des processus de formation de souvenirs émotionnels est essentielle pour comprendre comment ces processus sont affectés dans la maladie. Ce projet devrait permettre des avancées scientifiques sur les mécanismes et la diversité des récepteurs du glutamate, sur la régulation des signalisations neuronales et des fonctions cérébrales et comportementales associées. Notre travail ouvrira de nombreuses perspectives tant avec des implications importantes sur notre compréhension de la neurotransmission et le développement de nouveaux agents protecteurs contre les troubles neurologiques et psychiatriques. Ainsi des retombées sont attendues tant dans le domaine fondamental qu’appliqué (développement de nouvelles stratégies thérapeutiques).
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ces troubles touchent environ 15 à 20 % de la population à un moment ou un autre de leur vie. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.
Procédures
Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr) avec ou sans comportement (1h maxi / jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) comportement (mesure de l’anxiété ou de la peur), 2) injection de virus + comportement, 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones + comportement. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui, selon les besoins, pourra permettre des prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes (hors enregistrement de l’activité neuronale et comportement) est réalisés sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement nécessaire à la préservation des électrodes implantées (stress modéré) ; comportement (stress modéré).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem).
Remplacement
Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.
Réduction
Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 2104 animaux.
Raffinement
Après leur réception, les animaux sont habitués aux expérimentateurs par une manipulation bienveillante pendant 5jrs (5min) de manière à réduire le stress lors des procédures. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes ou individuellement et disposeront d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur, les animaux seront exclus du protocole. Les procédures comportementales sont modérément aversives et brèves et n'induisent pas d'angoisse sur le long-terme.
Choix des espèces
Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Sa robustesse et ses capacités d'apprentissage la qualifient comme un modèle idéal d'étude de la mémoire chez les mammifères. Nous utiliserons des souris non génétiquement modifiées et des souris génétiquement modifiées dans le cadre de ce projet. Ces souris se développent normalement et ont un comportement général sans anomalies évidentes. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Etude de la dangerosité cutanée de substance chimique, agrochimique ou pharmaceutique sur la santé humaine par l’utilisation d’un modèle de cobaye.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
2820 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré. Des substances chimiques, agrochimiques ou pharmaceutiques sont appliquées sur leur peau rasée et injectées dans le derme pour vérifier si elles provoquent une allergie, selon deux tests réglementaires (Magnusson-Kligman et Buehler). Le porteur décrit des effets locaux pouvant aller jusqu'à la nécrose du derme, des escarres, des croûtes et une destruction de l'épiderme, ce qui contraste avec la gravité seulement "modérée" retenue. Il affirme que les modèles in vitro ne sont pas encore assez élaborés et que ces tests restent imposés par la réglementation européenne.
Objectifs
Le but du projet est d’évaluer la toxicité des produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques pour définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Un des paramètres étudiés pour évaluer la toxicité d’un produit chimique est de savoir s’il peut induire une réation allergique par contact cutané. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaires européennes. Pour répondre aux obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit chimique, agrochimiques et pharmaceutiques nous réaliserons des tests de sensibilisation cutanée sur le modèle du cobaye (SMK : test de sensibilisation cutanée sur cobaye selon Magnusson et Kligman ou SMB : test de sensibilisation cutanée sur cobaye selon Buehler). Pour cela, le produit à tester est appliqué sur la peau rasée du cobaye afin de vérifier, par l’observation d’érythème, si une réaction allergique se produit.
Bénéfices attendus
Le projet permet d’évaluer la dangerosité sur la santé humaine liée à une àune substance chimique, agrochimique ou pharmaceutique. Ces études de toxicité permettront de définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Sur un plan plus large, ces évaluations basées sur des normes reglementaires très strictes permettent d’évaluer l’inocuité de médicaments ou denrées alimentaires à usage humain ou vétérinaire.
Procédures
- SMK : sur 15 animaux vigiles, 6 injections intradermiques, une application locales occlusive pendant 48h et une application locale pendant 24h. 3 pesées, observations locales. Injection intrapéritonéale pour la mise à mort - SMB : sur 30 animaux vigiles, 3 à 9 applications occlusives locales de 24 heures, 3 pesées, observations cliniques quotidiennes. Injection intrapéritonéale pour la mise à mort.
Impact sur les animaux
Un phénomène de sensibilisation peut apparaître. Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Les effets locaux peuvent rester jusqu’à la fin de l’étude, soit 35 jours. Selon l’intensité des effets observés, s’il y a atteinte des points limites alors l’animal peut être euthanasié pour raison éthique avant la fin de l’étude. Il peut y avoir, assez rarement, des effets de toxicité systémique. - test SMK : À la suite des injections intradermiques, il peut y avoir de l’érythème allant jusqu’à la nécrose du derme. À la suite des applications locales, peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une desctruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée. - test SMB : peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une desctruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée.
Devenir
SMK et SMB : Les animaux ayant reçu des traitements sur différentes parties de leur corps ceux-ci ne peuvent donc pas être réutilisés pour une procédure différente ultérieurement. Ils sont donc mis à mort en fin d’essai.
Remplacement
Les relations quantitatives structure-activité et les modèles in vitro ne sont pas encore suffisamment élaborés à l’heure actuelle pour jouer un rôle significatif dans l’évaluation du potentiel de sensibilisation cutanée des substances chimiques à tester. On doit donc continuer à déterminer ce potentiel sur des modèles in-vivo. L’évaluation du potentiel sensibilisant des produits chimiques est de plus imposée par la règlementation européenne pour leur mise sur le marché. Conformément à la réglementation des produits chimiques, deux tests in vitro sont réalisés sur les produits et doivent être négatifs avant de passer chez l'animal pour étudier le pouvoir sensibilisant du produit d'essai.
Réduction
Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les normes demandent de réaliser des groupes témoins positifs à chaques tests. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un test témoin positif tous les six mois et non à chaque essai.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages communes par 2 ou 3, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles contiennent de la litière constituée de particules de bois résineux déshydratée puis tamisée et un tunnel en carton comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 3 fois par semaine. En cous d’étude (pendant une phase de repos) les animaux sont passés en cages plus grandes, par 5, toujours dans un souci de respect des règles de bien être animal (surface au sol). Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter toute souffrance animale inutile. Des points limites sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Le cobaye reste le modèle de choix utilisé pour les tests de sensibilisation cutanée, comme le décrit la ligne directrice de la norme que nous suivont qui a été révisée en 2022. De plus la capacité de sensibilisation du cobaye est assez voisine de celle de I'homme. L’espèce et le stade de développement des animaux est imposé par les normes correspondantes. Cobayes jeunes adultes de 3 à 6 semaines pesant au moins 300g au début d’étude et arrivant à environ 800g à 1kg en fin d’étude. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.
Développement sur modèle murin de nouveaux vecteurs thérapeutiques pour le traitement des hémoglobinopathies Beta
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Les souris de ce projet portent des altérations génétiques qui provoquent une immunodéficience sévère et les rendent vulnérables aux infections microbiennes, et elles reçoivent entre cinq et sept semaines d'âge une greffe de cellules souches humaines. 2 058 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole énumère des anesthésies, un conditionnement chimiothérapeutique injecté dans le péritoine, sept injections sous la peau, une injection de cellules souches dans la veine, des prises de sang, une séance d'imagerie intravitale et la pose chirurgicale d'une pompe osmotique. Pour tester des vecteurs censés traiter la bêta-thalassémie et la drépanocytose en modifiant les cellules souches directement dans le corps, le porteur écrit que la nature du projet "nous oblige naturellement à nous tourner vers un modèle animal proche de l'homme".
Objectifs
La β-thalassémie et la drépanocytose sont les maladies héréditaires génétiques les plus fréquentes au monde. Elles sont dues à des mutations génétiques causant de nombreux symptômes ainsi qu’une réduction de l’espérance de vie (40 ans). Des thérapies géniques sont développées depuis des années afin de guérir ces maladies. Cependant, ces traitements nécessitent la manipulation des cellules souches hors du corps de chaque patient avant leur transplantation. Ce genre de manipulation est complexe et présente plusieurs limitations techniques. De plus, les traitements actuels nécessitent que les patients subissent une chimiothérapie dont les conséquences sont lourdes pour l’organisme. Nous proposons dans ce projet de contourner toutes ces limitations et d’améliorer l'efficacité de ces thérapies en testant une nouvelle génération de vecteurs thérapeutiques ciblant directement les cellules souches à l’intérieur du corps du patient.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet apporteront une preuve de concept de l’application de nos stratégies de modification du génome par administration directe dans la circulation sanguine. Ces nouveaux traitements permettront d’augmenter l’efficacité des thérapies actuelles et de réduire à la fois leur coût et la souffrance des patients.
Procédures
Anesthésie gazeuse (2X), 30s à 15min. Anesthésie profonde (1X), 1min. Injection intra péritonéale (3X), 30s par intervention. Injection en intraveineuse (1X), 1 min par intervention. Prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (2X) et sous anesthésie profonde (1X), 2 min par intervention. Injection en sous-cutanée (7X), 10s par intervention. Imagerie intravitale (1X), 10min par intervention. Pose de pompe osmotique (X1) : incision, 15min par intervention.
Impact sur les animaux
Les altérations génétiques des animaux utilisés dans ce projet provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. Le traitement myéloablatif léger appliqué aux souris peut provoquer une douleur transitoire durant les heures qui suivent l’injection intrapéritonéale. L’anesthésie gazeuse ou par injection intrapéritonéale peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. L’administration par injection sous-cutanée ou intrapéritonéale peut provoquer une douleur légère et un stress. La pose de pompe osmotique par chirurgie sous-cutanée peut provoquer une douleur légère durant plusieurs jours après l’opération. L’injection de cellules souches en intraveineuse et sous anesthésie peut provoquer un stress transitoire. L’imagerie intravitale peut provoquer chez les animaux un stress et une baisse de la température corporelle liée à l’anesthésie gazeuse prolongée nécessaire à sa mise en œuvre. Les prélèvements de sangs réalisés sous anesthésie gazeuse peuvent provoquer une douleur.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de réaliser plusieurs analyses moléculaires et biochimiques.
Remplacement
Le développement des vecteurs de ce projet a été réalisé en laboratoire, sans l’usage d’animaux, dans les conditions qui se rapprochent des celles observées dans le corps humain. La nature de ce projet, qui se focalise sur la capacité de ces nouveaux vecteurs à fonctionner dans la circulation sanguine, nous oblige naturellement à nous tourner vers un modèle animal proche de l’homme.
Réduction
La lignée de souris utilisée dans ce projet a été choisie dans le but de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats significatifs. Pour le traitement statistique de nos données, nous aurons recours à plusieurs tests statistiques destinés à réduire les lots du projet de manière optimale. Par ailleurs, nos élevages de souris seront synchronisés en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.
Raffinement
La lignée de souris utilisée dans ce projet a été choisie dans le but de raffiner nos protocoles en diminuant la souffrance engendrée par le conditionnement chimiothérapeutique. Chaque procédure douloureuse sera précédée d’une anesthésie gazeuse ou une anesthésie par injection. Lors des prélèvements de sang, un anesthésique local sera appliqué à l’œil afin de diminuer la douleur qui suit la manipulation. Les animaux seront pesés au cours du conditionnement afin de surveiller toute perte de poids anormale. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance hebdomadaire par les responsables du projet. Les animaux seront hébergés sur portoir ventilé, avec un accès à la nourriture et à la boisson ad libitum. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnel translucide rouge destiné à diminuer le stress et stimuler l’activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Enfin, la souffrance des animaux sera surveillée régulièrement et la décision de leur mise à mort encadrée par une grille de score spécifique.
Choix des espèces
Les seuls modèles animaux aujourd'hui disponibles pour l'étude des cellules souches humaines ont été développés chez la souris. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une homogénéité génotypique importante. Les membres de notre laboratoire disposent d'une expertise sur cette espèce, ce qui facilite la réalisation d'un tel projet. Les animaux subiront une greffe de cellules souches à l'âge de 5 à 7 semaines car il s'agit de l'âge optimal pour obtenir les meilleures chances de succès de greffe de cellules souches humaines.
Développement et maintien de la lignée Eo-Cre Rac pour comprendre le rôle de Rac1 dans les éosinophiles au cours de l’asthme sévère chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
3663 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet crée et entretient une lignée transgénique, avec puçage et biopsie de la queue sous anesthésie, puis induit un asthme dit sévère par des sensibilisations et des challenges répétés, une partie des souris subissant une trachéotomie sous curarisation. Les reproducteurs sont tués vers huit à dix mois et les génotypes intermédiaires éliminés. Le porteur affirme n'avoir jamais observé de gêne respiratoire ni d'altération du bien-être malgré l'asthme induit, et juge "indispensable" le modèle transgénique in vivo pour étudier le rôle d'une protéine dans les éosinophiles.
Objectifs
L'asthme est l'une des maladies chroniques les plus courantes dont la prévalence augmente dans le monde. Les cas les plus graves sont résistants aux traitements actuels. Il est urgent d'améliorer la prise en charge de ces patients asthmatiques sévères et de pouvoir proposer de nouveaux traitements prévenant les crises d'asthme mortelles. L'identification de nouvelles cibles pharmacologiques et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques devraient permettre de relever ce défi dans lequel s'inscrit notre projet. Récemment, nous avons identifié le rôle majeur d’une protéine (Rac1) qui régule la contraction et la prolifération du muscle des voies respiratoires. Nous avons démontré que la suppression spécifique du gène Rac1 dans le muscle bronchique empêche l'hyperréactivité et le remodelage des bronches chez les souris asthmatiques. Grâce à notre modèle expérimental d'asthme sévère, nous avons également identifié la population de cellules inflammatoires présentant une sur-activité de Rac1 : les globules blancs (éosinophiles). Notre objectif est maintenant d’identifier le rôle de Rac dans cette population cellulaire au cours de l’asthme sévère. Ainsi, nous devons générer une lignée murine n’exprimant pas spécifiquement la protéine Rac1 dans les éosinophiles . Ce travail permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique d’inhiber Rac1 chez les patients asthmatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de générer une lignée murine unique permettant l’analyse du rôle de Rac1 spécifiquement dans les éosinophiles. Grâce à notre protocole expérimental d’asthme, nous pourrons également déterminer le rôle de Rac1 dans les éosinophiles au cours de l’asthme. La réalisation de cette étude déterminera si la protéine Rac1 est une nouvelle cible thérapeutique pour cette pathologie.
Procédures
Trois semaines après leur naissance, les souriceaux seront sevrés. De ce fait, ils seront anesthésiés afin d’être pucés ou bagués pour identification ; au même moment, un prélèvement d’un bout de queue sera fait afin de les génotyper. Pour l’élevage, les animaux en reproduction seront gardés jusqu’à l’âge de 8-10 mois pour effectuer cette fonction après quoi ils seront mis à mort. Dans le cadre du protocole d’asthme, les animaux seront soumis au protocole de sensibilisation à 4 reprises, avec 7 jours de repos entre chaque sensibilisation. Chaque sensibilisation dure quelques minutes par souris au maximum (hors anesthésie). Par la suite, les animaux seront soumis au protocole de challenge à 6 reprises. La fréquence de 1 challenge par jour pendant 3 jours (répété 1 fois avec 1 semaine de repros entre les « deux groupes » de challenge) est nécessaire pour induire le phénotype recherché.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de la procédure d’élevage, il n’y a pas de nuisance prévue. Néanmoins, il est possible d’observer des cas de cannibalisme des parents sur leurs petits ou agressivité dans le couple. Dans ce cas, les animaux seront exclus de l’aspect reproduction et mis à mort. De plus, des cas de dystocies peuvent être observées chez les femelles qui seront alors mises à mort. Dans le cadre de la procédure visant à induire l’asthme sévère : les souris seront anesthésiées durant les étapes de challenge et de sensibilisations, ce qui limitera le stress ressenti. Lors de l'exploration des fonctions respiratoires, un stress pourra être ressenti par les animaux en raison de la restriction d’espace dans la chambre. Pour prévenir ce stress, les souris seront habituées environ 3 jours avant l’expérimentation, en les laissant quelques minutes dans la chambre. De plus, lors de l’expérimentation, avant d’entamer les nébulisations, les souris seront laissées quelques minutes dans la chambre pour faciliter encore leur acclimatation. L’analyse des résistances pulmonaires, plus invasive, s’effectue sur des souris anesthésiées et curarisées. Une trachéotomie est donc réalisée. Pour limiter la douleur une injection d'analgésique est réalisée 20 minutes avant la trachéotomie. Nous souhaitons ajouter que bien que l’objectif soit d’induire un asthme sévère, le mot sévère indique seulement un phénotype équivalent aux patients résistants aux traitements corticoïdes. De plus, nous pratiquons ce protocole depuis plusieurs années et il n’a jamais été observé de gêne respiratoire en raison de l’induction de l’asthme. En effet, on observe même que des souris laissées 1 mois dans leur cage après le dernier challenge retrouvent un état symptomatique et inflammatoire équivalent à celui des souris n’ayant pas subi le protocole d’asthme. Il n’est donc pas attendu de phénotype délétère dans ce nouveau modèle expérimental ni d’impact sur le bien-être animal. Cette supposition s’appuie sur le fait que les corticoïdes sont les traitements classiques des asthmatiques sévères qui visent notamment les éosinophiles. Les patients, comme les modèles animaux, traités aux corticoïdes n’ont pas d’altération du bien-être.
Devenir
Pour l’élevage : les animaux nécessaires au maintien de la lignée sont gardés en vie. Les génotypes intermédiaires seront mis à mort. Protocole asthme : animaux mis à mort en fin de procédure
Remplacement
L’objectif de ce projet est l’étude du rôle de la protéine Rac1 dans le polynucléaire éosinophile au cours de l’asthme sévère. Pour répondre à notre problématique scientifique, nous avons établi un modèle d’étude in vitro sur des progéniteurs hématopoïétiques qui ont été différenciés en éosinophiles matures. Bien que nos résultats démontrent un rôle majeur de Rac1 dans la physiologie de l’éosinophile, notamment dans sa fonction de dégranulation, il nous manque la composante pathologique de l’asthme pour approfondir notre recherche. C’est pourquoi un modèle in vivo est indispensable à la poursuite de ce projet. De plus, notre objectif étant d’identifier les rôles de Rac1 spécifiquement dans l’éosinophile, un modèle transgénique où l’expression de la protéine est déplétée spécifiquement dans ces cellules inflammatoires est la méthode la plus précise et rigoureuse que nous pouvons mettre en place. Ainsi, pour valider ou non nos hypothèses scientifiques et répondre à nos problématiques de projet, l’étude in vivo sur une lignée transgénique est indispensable.
Réduction
Pour l'élevage, les croisements ont été optimisés pour obtenir le plus rapidement possible nos animaux d’intérêt. Pour notre projet asthme, des groupes de 12 souris seront nécessaires pour réaliser une analyse statistique robuste pour les différentes approches mises en œuvre. Ne connaissant pas l’impact du sexe sur les paramètres observés, mâles et femelles seront étudiés. Si nous n’observons pas d’effet sexe, le nombre de souris sera alors divisé de moitié. Enfin, les manipulations seront réalisées en duplicat afin de prévenir un effet observé dû au groupe d’étude. Cependant, pour réduire au maximum le nombre d’animaux, les analyses seront regroupées au maximum.
Raffinement
Dans le cadre de la procédure élevage, lors de la mise en accouplement, l’alimentation des mères est enrichie. Pour enrichir le nid, du coton est ajouté en plus des frisottis. Afin de ne pas perturber les relations parents-petits, le change est décalé à minimum J+3 après la mise bas ; une étiquette est apposée pour signaler ce report. De plus, pour limiter le stress, le nid parental est conservé pendant le change. Afin de faciliter l’accès à la nourriture aux petits lors des sevrages, des croquettes sont mises directement dans la cage. Les gestes invasifs tel que le bagage et le prélèvement de biopsie sont réalisés sous anesthésie générale. Dans le cadre des procédures expérimentales, les animaux anesthésiés et curarisés seront placés sur un tapis chauffant afin d’éviter une hypothermie. De plus, l’utilisation d'un analgésique adapté permettra d’atténuer la douleur lors de la trachéotomie. Du fait d’une durée longue de l’anesthésie, une injection sous-cutanée d’un bolus réchauffé de solution saline injectable sera réalisée pour éviter toute hypotension de l'animal. Pour l'exploration des fonctions respiratoires, et pour limiter le stress des souris, une acclimatation sera mise en œuvre en laissant les souris seules quelques minutes dans la chambre quelques jours avant et durant l’expérimentation.
Choix des espèces
Dans notre modèle murin d’asthme, nous retrouvons l’endotype éosinophilique de l’asthme allergique décrit chez les patients asthmatiques sévères. En effet, un fort infiltrat éosinophile est observé au niveau pulmonaire, contrairement à d’autres espèces animales. De plus, on observe chez la souris les mêmes composantes physiopathologiques de l’asthme que chez les patients : une inflammation exacerbée, une hyper réactivité bronchique et un remodelage des voies aériennes. Les autres modèles animaux pouvant reproduire un asthme sévère sont essentiellement le cheval, le chat et le cochon-dinde. Or, nous ne disposons pas de modèles transgéniques exprimant la CRE recombinase sur le promoteur de l’éosinophile peroxydase, ni les séquences lox autour du gène Rac1 chez ces animaux. Les animaux seront utilisés à un âge entre 8 et 10 semaines pour effectuer les reproductions, afin que les animaux soient matures sexuellement. Cependant, pour la procédure visant à rendre les animaux asthmatiques, les animaux utilisés seront âgés d’environ 7 semaines afin d’avoir un système immunitaire optimal permettant une bonne mise en place du phénotype pathologique. De plus, certains prélèvements comme la récupération de moelle osseuse doivent être réalisés sur des animaux qui ne sont pas trop âgés afin que les progéniteurs hématopoïétiques soient suffisamment nombreux pour obtenir une culture d’éosinophile, et pas trop jeunes afin d’avoir une maturité du système immunitaire suffisante. Pour toutes ces raisons les prélèvements seront effectués sur des animaux à 13 semaines.
Effet d’un inhibiteur d’histones désacétylases sur l’instabilité des triplets CTG dans un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de la dystrophie myotonique de type 1, elles reçoivent jusqu'à trente-six injections sous-cutanées sur douze semaines pour tester si une molécule réduit l'expansion d'ADN caractéristique de la maladie. Le porteur indique que les injections répétées peuvent causer des irritations et des ulcérations de la peau, et que les souris sont tuées à la fin pour des analyses incompatibles avec leur maintien en vie. Il présente cette étude comme un travail pilote et précise que les 12 souris proviennent de croisements déjà réalisés pour d'autres projets.
Objectifs
La dystrophie myotonique de type 1 est une maladie qui touche plusieurs organes tels que le muscle et le cerveau. Elle se caractérise principalement par un trouble du tonus musculaire et une détérioration progressive des fonctions neuromusculaires. Cinq formes cliniques ont été décrites dans la population atteint de la dystrophie myotonique de type 1. Parmi ces cinq formes, il y a une forme tardive qui se caractérise par une cataracte et une forme congénitale qui se caractérise par des problèmes musculaires et cognitifs très sévères. Le défaut génétique de cette maladie correspond à une expansion d'un morceau d'ADN dont la taille augmente généralement au cours des générations et dans les tissus. Plus la taille est grande, plus les symptômes sont sévères et l’âge d’apparition précoce. L’objectif principal du projet est d’identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la diminution de la taille du morceau d'ADN et donc de ralentir la progression de la maladie. L’objectif du projet est de tester les effets d'une molécule chimique sur la taille du morceau d'ADN chez la souris et ainsi savoir si cette molécule pourrait être utilisée comme outils thérapeutique.
Bénéfices attendus
Chez les patients atteints de la dystrophie myotonique de type 1, la taille du morceau d'ADN dans les tissus augmente avec l’âge du patient et est corrélé avec la progression des symptômes de la maladie. Plus la taille du morceau d'ADN est grand plus les symptômes sont sévères. Il est donc important de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à réduire la taille de ce morceau d'ADN dans l’ensemble des tissus et donc à ralentir les symptômes chez les patients. Il a été montré qu’une molécule chimique peut réduire la taille de ce morceau d'ADN dans des modèles cellulaires. Une étude pilote chez l’animal permettra de savoir si cette molécule, peut également réduire la taille de ce morceau d'ADN dans plusieurs tissus tels que le muscle après 3 mois de traitement. Cette étude permettra également de savoir si l’effet de cette molécule est homogène entre les tissus et de mieux comprendre son mode d’action, in vivo. À ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible pour la dystrophie myotonique de type 1. Cette étude pilote est une étape importante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Le temps de la procédure est de 3 min. Les injections sous-cutanées seront réalisées 3 fois par semaine sur une période de 12 semaines. Le nombre maximum d’injections sera de 36 par souris. Les injections seront réalisées sur animal vigile. Les injections de la molécule d’intérêt se fera sur un lot de 6 animaux et les injections de l’adjuvant se fera sur un autre lot contrôle de 6 animaux. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à l’issue de la période de traitement afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
Les souris hemizygotes, qui vont être utilisées dans ce projet, ne présentent aucun phénotype. Dans le cadre de ce projet, une procédure d’injection sous-cutanée va être utilisée. Les animaux pourront ressentir une douleur ponctuelle réversible liée aux injections. Les injections répétées peuvent causer des irritations et des ulcérations de la peau et des muqueuses. Les injections répétées seront réalisées à des endroits différents afin de diminuer les risques d’apparition de plaie, d’ulcère… Aucun effet indésirable résultant de la molécule ou de l’adjuvant a été répertorié dans la littérature.
Devenir
Afin de pouvoir analyser la distribution de la taille du morceau d'ADN dans différents tissus, les 12 souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure. Les différentes analyses de biologie moléculaire réalisée dans le cadre de l’étude pilote ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux.
Remplacement
Il a été montré qu’une molécule chimique réduit le morceau d'ADN dans les cellules. Si certains mécanismes cellulaires peuvent être étudiés en culture, seule l'utilisation d'un modèle animal permet d'étudier les mécanismes tissu-spécifiques. C’est pour cela qu’un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1 est utilisé dans l’étude pilote. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de cette molécule sur la taille du morceau d'ADN dans différents tissus tels que le muscle qui est l’un des tissus les plus atteints chez les patients.
Réduction
Afin d'optimiser et de réduire le nombre d'animaux, les 12 souris utilisées dans cette étude pilote proviendront de croisements réalisés pour d’autres projets du laboratoire qui ont été autorisés. Sur la base de nos expériences préliminaires, une analyse statistique a permis d’estimer à 6 le nombre de souris nécessaire par condition (Molécule versus Adjuvant). Le nombre d’animaux est minimisé dans le cadre d’une étude pilote avec un protocole mis en place précédemment par des collaborateurs internationaux.
Raffinement
Les conditions d'hébergement des animaux seront adaptées pour réduire à son minimum le stress et la souffrance animale. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température (20-24 degrés) et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (éclairage 6h30-18h30). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec des nids de lanière kraft. La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de celui-ci. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de la boisson, la nourriture et de l’état des animaux. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration de la molécule et de l’adjuvant pour visualiser tout signe de toxicité imprévue qui nécessiterait l’euthanasie de l’animal. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent.
Choix des espèces
Un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1 sera utilisé dans le cadre de ce projet. Dans ce modèle de souris, la taille du morceau d'ADN malade augmente au cours des générations et dans les tissus. Notre choix s'est donc orienté vers ce modèle afin de valider le rôle de notre molécule sur la dynamique de ce morceau d'ADN, in vivo. Les souris hémizygotes d’intérêt seront inclues au début de la procédure à l’âge de 3 mois. Les souris seront euthanasiées à l’âge de 6 mois après 3 mois de traitement. Les changements de la taille de ce morceau d'ADN sont facilement détectés dans les tissus de souris âgées de 3 mois par les méthodes de biologie moléculaire utilisées au laboratoire. Il a été montré que les variations de taille de ce morceau d'ADN sont plus importantes chez des souris de 6 mois comparées aux souris de 3 mois.
Implication des polluants ayant des propriétés de perturbateurs endocriniens dans la physiopathologie de l’arthrose chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont exposées à des polluants perturbateurs endocriniens par l'eau de boisson dès le stade embryonnaire, ou par injection intra-articulaire, puis une arthrose leur est induite au genou par chirurgie ou par injection d'un composé inflammatoire. Le porteur évalue ensuite leur douleur avant de les tuer pour disséquer les articulations. Il affirme que le modèle animal est "indispensable" car aucun système in vitro ne recrée la complexité d'un "organisme entier" pour observer l'effet de ces polluants.
Objectifs
L’arthrose est la maladie articulaire la plus fréquente, touchant plus de 500 millions de personnes dans le monde et se caractérise par une douleur et une raideur articulaire entrainant un handicap. Sa prévalence a doublé entre l’ère préindustrielle et post-industrielle. Cette augmentation est indépendante du vieillissement de la population et de l’accroissement de l’obésité entre ces 2 périodes, suggérant l’implication de nouveaux facteurs de risques environnementaux non connus et notamment celui des polluants. L’Homme est exposé dès la vie in utero à de nombreux polluants. Récemment, un mélange de polluants aux propriétés de perturbateurs endocriniens (PE), reflet de l’exposition humaine, a été retrouvé dans le liquide amniotique de femmes enceintes et est associé à des anomalies de la fonction thyroïdienne et du développement neuro-cérébral fœtal. Il a été démontré que les souris exposées à ces polluants développaient des lésions précoces du cartilage dès 3 mois et que ceux-ci avaient des effets pro-inflammatoires. Cependant, nous ne savons pas si l’exposition à ces polluants aggrave la sévérité de l’arthrose ni si cet effet est lié à un effet local intra articulaire ou plus global. Notre objectif est donc de déterminer si le mélange de polluants et les perfluorés ont un rôle dans la physiopathologie de l’arthrose et dans son expression clinique (douleur), en exposant localement et/ou de manière globale, des souris modèles d’arthrose déjà parfaitement identifiés.
Bénéfices attendus
Notre projet est original car il s’agira de la première étude s’intéressant à l’effet synergique in vivo de plusieurs polluants sur les tissus articulaires avec des résultats préliminaires très encourageants. Ce projet a un double bénéfice attendu : d’une part, celui de découvrir un nouveau facteur de risque d’arthrose et d’autre part de renforcer les données scientifiques sur les effets néfastes des polluants ayant des propriétés de perturbateurs endocriniens sur la santé.
Procédures
Les animaux seront exposés aux polluants soit de manière systémique (tout au long de la vie) via l’eau de boisson, soit de manière locale par injection intra articulaire sous anesthésie (2 injections d’une durée de 2 minutes environ). Deux modèles d’arthrose seront ensuite mis en œuvre sous anesthésie/analgésie, l’un chirurgical (ou post-traumatique) au niveau du genou et l’autre chimique (ou inflammatoire) par injection intra articulaire d’un composé. Ces actes seront effectués une seule fois et seront de moins de 5 minutes par animal. Enfin, nous réaliserons une évaluation de la douleur et de l’activité physique avant l’induction des modèles d’arthrose (1 fois) et après (4 à 5 fois selon les groupes). Ces évaluations seront effectuées sur animal vigile non contraint pour une durée d’environ 30 minutes (15 minutes + 5 minutes + temps de préparation/nettoyage). A l’issue de la période de maintien les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements pour répondre à la question scientifique.
Impact sur les animaux
L’exposition des souris aux polluants aux mêmes doses a déjà été réalisée dans le cadre d’autres projets de recherche et aucun effet indésirable spécifique majeur n’a été observé. Cependant, l’exposition chronique aux polluants (seuls ou combinés) est connue pour induire des effets pro-tumoraux, des anomalies endocriniennes ou encore des cassures dentaires. Il s’agit d’effets observés à des doses différentes (souvent supérieures) de celle utilisée ici mais il est possible qu’une exposition chronique induise des effets de ce type chez les souris exposées. L’anesthésie mise en œuvre pour les actes chirurgicaux représente un risque de complication possible mais faible (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.). L’intervention chirurgicale de déstabilisation méniscale ou les injections intra articulaires présentent un risque de douleur post-opératoire immédiat lié à l’acte lui-même puis de manière chronique en favorisant la survenue de l’arthrose. L’évaluation de la douleur et de l’activité physique peuvent provoquer un stress et un inconfort de courte durée.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans le projet sera euthanasié car l’étude des tissus articulaires nécessite la dissection des genoux après euthanasie pour analyse histologique pour répondre à la question scientifique.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de l’arthrose qui est au cœur de ce projet. L’arthrose est une maladie multi-tissulaire impliquant l’ensemble des tissus articulaire et les tissus neuronaux impliqués dans la douleur communiquant de manière complexe entre eux. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. D’autant plus que les polluants étudiés ont des propriétés de perturbateurs endocriniens, c’est-à-dire qu’ils peuvent mimer l’effet des hormones, et donc un organisme entier est nécessaire pour observer leurs effets. Puisque le sexe influence la réponse à ces perturbateurs endocriniens, une analyse en fonction du sexe est nécessaire pour chacune des expériences menées.
Réduction
Le projet impliquera un total de 792 animaux dont 720 animaux nécessaires pour les analyses et 72 fondateurs exposés aux polluants (48 femelles et 24 mâles) Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Nous utiliserons les mêmes contrôles pour les 2 expositions : mix ou composés perfluorés, afin de limiter le nombre de souris utilisées. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification (pas de possibilité d’utiliser d’enrichissement en plastique). Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les cages et les biberons utilisés sont spécifiques : Nous utiliserons des biberons en verre afin de limiter les polluants par l’utilisation de plastique. Les cages seront dans un plastique garantie sans bisphenol A de même taille que les cages classiques.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : Nous utiliserons le modèle souris car c’est ce modèle qui a été utilisés dans de précédentes études sur le rôle des perturbateurs endocriniens. De plus, les modèles d’arthrose utilisés ainsi que l’évaluation de la douleur ont été développés et démontrés chez la souris. Justification des stades : Pour l’exposition systémique aux polluants, les animaux seront exposés dès le stade embryonnaire et durant toute leur vie par l’eau de boisson aux différents polluants et les fondateurs (mâles 8 semaines et femelles de 6 semaines minimum) seront exposés 15 jours avant accouplement puis durant toute la gestation et allaitement. Pour l’exposition locale, nous réaliserons des injections intra articulaires à l’âge adulte avant et après l’induction de l’arthrose (2 modèles expérimentaux d’arthrose seront étudiés) Justification du sexe : Les femelles adultes sont utilisées pour l’exposition intra-utérine des souriceaux à naitre qui seront ensuite eux-mêmes exposés de manière systémique. L’effet des polluants sur l’arthrose sera étudié chez les femelles et les mâles séparément. En effet, il est possible que les mâles développent une arthrose plus sévère que les femelles, bien que cette donnée soit actuellement controversée. En revanche, l’effet des polluants perturbateurs endocriniens peut, par ses perturbations hormonales, induire des effets différents sur les femelles et les mâles. Il semble donc pertinent dans cette étude d’étudier les deux sexes.
Impact de l’immunisation contre la réponse anti-virale sur le développement de mélanome spontané murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
303 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent au moins cinq injections intramusculaires et cinq prélèvements de sang rétro-orbitaux sous anesthésie, et développent un mélanome sur le dos pouvant produire des métastases pulmonaires et des difficultés respiratoires. Le projet part de l'hypothèse, formée pendant la crise du Covid-19, que des auto-anticorps liés au vieillissement favoriseraient la croissance tumorale. Le porteur formule les retombées au conditionnel, ce mécanisme "pourrait ouvrir" une nouvelle piste de traitement, et affirme que les modèles cellulaires ne permettent pas d'étudier le système immunitaire.
Objectifs
L’immunosurveillance est la capacité du système immunitaire à lutter contre les cellules tumorales. Le système immunitaire devient cependant moins efficace au cours du vieillissement, favorisant le développement de tumeur. Pendant la crise du Covid-19, il a été montré que le vieillissement s'accompagnait de la présence d’auto-anticorps qui luttent contre les défenses immunitaires. Ces auto-anticorps compromettaient notamment la réponse contre le SARS-CoV2 et favorisaient les formes graves de la maladie. Nous émettons donc l’hypothèse que ces auto-anticorps favoriseraient aussi le développement tumoral dans le mélanome, cancer caractérisé par sa rapide agressivité. L’objectif de ce projet est de tester l’impact de la production d’auto-anticorps dans le développement de mélanome chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra potentiellement de décrire un nouveau mécanisme favorisant le développement tumoral et la résistance au système immunitaire dans le mélanome. Cela pourrait ouvrir une nouvelle perspective de traitement pour les patients atteint de cette maladie. En effet, malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie, la plupart des patients rechutent avec un mélanome résistant.
Procédures
Les animaux subiront au minimum 5 injections intra-musculaires (qui dureront moins d'une minute sur animaux vigiles), ainsi que 5 prélèvements rétro-orbitaux réalisés sous anesthésie gazeuse, qui dureront quelques minutes. Les petits (à J14 minimum) subiront un prélèvement d'oreille par poinçage, à l'état vigile. Le prélèvement durera moins d'une minute. Tous les animaux seront soumis à de la contention.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée aléatoirement sur le dos et possiblement métastatiques pouvant entrainer des difficultés respiratoires (métastases pulmonaires). Le prélèvement rétro-orbitaire et le poinçage des oreilles peuvent engendrer une irritation et une douleur de l'oeil ou de l'oreille. La contention va également leur générer du stress.
Devenir
Les animaux n'étant pas réutilisés dans un autre projet, ils seront mis à mort à la fin de chaque procédure ou avant si un point limite est atteint.
Remplacement
Des études préliminaires sur des modèles cellulaires ont été réalisées et ont permis de démontrer l'efficacité de l'immunisation. En parallèle, des analyses complémentaires ont été et seront réalisées sur des prélèvements de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet.
Réduction
Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=92) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (pousse tumorale, analyse histologique de la tumeur, analyse marqueurs sanguins).
Raffinement
La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux en générant le moins de stress possible par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine, et 3x lorsque la tumeur apparaitra. Une anesthésie gazeuse sera utilisée lors du prélèvement rétro-orbitaire pour diminuer le stress de l’animal, et des gouttes de Collyre seront appliquées avant le prélèvement pour éviter les risques d’irritation de l’oeil. Les animaux sont hébergés en groupe, avec de l’aliment et de la nourriture ad libitum.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études du mélanome car c'est un modèle proche de la pathologie humaine reproduisant les caractéristiques histologiques. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, pour la maturité sexuelle pour la reproduction et âge standard pour l'étude du système immunitaire.
Génétique des maladies auto-immunes sur modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
153 850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un agent chimique mutagène est injecté pour induire des mutations au hasard dans le génome, puis les descendants sont suivis pour repérer ceux dont la maladie auto-immune est modifiée, avec puçage et biopsie de la queue. Le porteur indique que l'agent chimique rend stériles 70 % des mâles et que les animaux sont tués dès les premiers signes de la maladie. Il affirme le "besoin" de recourir à la souris, aucun modèle in vitro ou in silico n'existant selon lui pour ces maladies génétiques.
Objectifs
Ce projet concerne les maladies auto-immunes qui ont une cause génétique. Le but est de caractériser les gènes impliqués en utilisant la souris comme modèle. Dans ce projet nous induirons des mutations au hasard dans le génome grâce à l’injection d'un agent chimique. Nous identifierons les mutations qui modifient les caractéristiques physiques de la maladie en suivant les descendants des souris traitées. Les mutations qui modifient de manière significative les caractéristiques de la maladie seront ainsi identifiées. Les protéines codées par les gènes identifiés seront des cibles thérapeutiques potentielles chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la maladie. Cette démarche donnera accès à de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie ainsi qu’à de nouveaux marqueurs génétiques et/ou biologiques permettant de dépister la maladie à des stades précoces. Nous prévoyons que de nouveaux gènes modifiant les caractéristiques de la maladie seront découverts.
Procédures
Chez certaines souris une injection unique intrapéritonéale sera pratiquée dans les 3 jours qui suivent la naissance (le geste dure 15 secondes) Une puce électronique sera implantée à tous les animaux de 3 semaines d’âge par voie sous cutanée. Des biopsies d’un fragment de queue seront effectuées à 3 semaines d’âge (le geste dure 15 secondes). Le projet comporte l'injection intrapéritonéale de 250 animaux avec un agent chimique 1 fois par semaine pendant 3 semaines (à 4, 5 et 6 semaines d'âge) (chaque geste dure moins de 15 secondes). Chez certaines souris un prélèvement unique de sang sera effectué à 6 semaines sous anesthésie générale (le geste dure 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les injections de l’agent chimique peuvent entraîner une infertilité chez 70% des mâles. L'injection intrapéritonéale peut en soi être à l'origine d'une douleur, les prélèvements de sang sous anesthésie peuvent être associés à une douleur à l'œil au réveil, les biopsies de queue peuvent engendrer une douleur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes biologiques de la maladie afin d'éviter toute souffrance.
Remplacement
Ce projet concerne l'étude de maladies auto-immunes qui sont d’origine génétique. Il n’existe pas de modèles in vitro ou in silico pour aborder le sujet. D’où le besoin d'avoir recours aux modèles de souris dont les caractéristiques récapitulent la maladie humaine. Les expériences proposées nécessitent de comparer des individus qui ne diffèrent pas de façon majeure pour leur fond génétique ou l’environnement. C’est le cas de la souche de souris que nous proposons d’étudier.
Réduction
Pour respecter le principe de la Réduction, le nombre proposé de souris a été établi sur la base d’études statistiques permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables. La méthode utilisée permet de cumuler les individus à des temps différents de suivi en diminuant ainsi de manière très importante le nombre de souris analysées à chaque temps individuel. Pour les expériences impliquant des croisements, le nombre d’individus prévus tient compte de notre expérience dans le domaine. Par ailleurs, le protocole prévoit un nombre limité de croisements (3) pour constituer les groupes d'animaux qui feront l'objet de l'analyse génétique.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour respecter le confort maximum des conditions d’hébergement, faire pratiquer les gestes nécessaires par un personnel formé et ayant de l’expérience des pratiques, réduire le stress et la douleur. Les souris sont hébergées dans des portoirs ventilés. Les cages sont dotées de tunnels d’enrichissement rouges et de cotons de nidification. Pour les prélèvements sanguins et les biopsies une prise en charge de la douleur sera mise en place avec des antalgiques et des anesthésiques. Une observation quotidienne avec une grille de points limites sera effectuée afin qu’en cas de besoin des mesures soient mises en place pour garantir le bien-être de l‘animal.
Choix des espèces
L'espèce animale choisie est une souche de souris qui développe une maladie dont les caractéristiques sont similaires à celles de la maladie humaine correspondante. Les souris sont engagées dans les procédures dès la naissance. La maladie apparait chez les souris adultes après 12 semaines d’âge. Les souris sont suivies une fois par semaine, à partir de 10 semaines d’âge, pour détecter de manière précoce la survenue de la maladie. Les expériences seront toujours interrompues dès les premiers signes biologiques de la maladie avant que celle-ci n’ait donné lieu à des manifestations physiques entraînant une souffrance des animaux.