Procédures modérées

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dans le cadre de travaux pratiques de master, elles sont immunisées trois fois par différentes voies, orale, nasale, sous-cutanée, intradermique ou sublinguale, avec prélèvements de sang, de fèces et de lavages vaginaux. Elles sont ensuite tuées pour étudier les réponses immunitaires dans la rate et les ganglions, une inflammation ou une prostration marquée entraînant une mise à mort anticipée. Le porteur affirme que cet apprentissage ne peut se faire sur un autre support qu'un "organisme entier" et que les analyses in vitro ne suffisent pas.

Objectifs

Chaque année, les étudiants devront réaliser un TP durant 2 semaines dont le but est d'évaluer les réponses immunitaires suite à l'immunisation par différentes voies muqueuses chez la souris (souche OF1).

Bénéfices attendus

Le projet permet aux étudiants Master d’observer les effets des différentes voies d’immunisation d’une formulation vaccinale sur un organisme entier. Il permet d’apprendre aux étudiants la manipulation des souris, les prélèvements de sang, sécrétions muqueuses et organes afin d’etudier les réponses immunitaires après diffférents types d’immunisation.

Procédures

Les souris seront immunisées 3 fois par voie orale, nasale, sous-cutanée, intradermique ou sublinguale. Le sang, les fèces et les lavages vaginaux seront prélevés 2 fois pour mesurer les réponses anticorps.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables peuvent survenir chez les souris après la vaccination comme une inflammation au site d’administration de la formulation vaccinale pour les voies intradermique et sous-cutanée, une augmentation de la température du corps et une diminution de l’activité des souris ainsi qu’une légère perte de poids des souris. Ces paramètres seront vérifiés 3h, 24h, 48h, 72h après chaque immunisation. Les animaux seront surveillés pour vérifier l’absence d’inflammation du site d’injection (voies intradermique et sous-cutanée) et la température corporelle sera surveillée à chaque temps à l’aide d’un thermomètre rectal. Les souris seront pesées 72h après l’immunisation. L’apparition de troubles du comportement pouvant traduire une douleur ou une détérioration de l’état général seront surveillés. L’immobilité, la prostration, l’apathie, une inflammation excessive au niveau des sites d’injection et/ou de prélèvements, seront considérées comme critères de points limites qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal.

Devenir

A la fin de l'expérience, tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir étudier les réponses immunitaires post-vaccinales au niveau de la rate et ganglions.

Remplacement

Cette étude permet d'apprendre aux étudiants comment on analyse les réponses immunitaires après vaccination chez la souris et comment on prélève les échantillons pour analyser ces réponses immunitaires. Cette apprentissage ne peut pas se faire avec un support pédagogique autre qu'un modèle souris. Les techniques ne peuvent pas être pratiquées et s'acquérir différemment. De plus, les étapes préliminaires d’analyse in vitro, bien qu’indispensables, ne sont pas suffisantes pour analyser l’effet des différentes voies d'immunisation d’une formulation vaccinale sur les réponses immunitaires. Les analyses in vitro avec des lignées cellulaires, ex vivo avec des cellules humaines ou murines ou des modèles 3D peuvent permettre d'analyser comment l'antigène et/ou l'adjuvant entre(nt) dans les tissus et active(nt) certaines cellules immunitaires mais il faut un organisme entier pour que tous les acteurs cellulaires soient présents et puissent se déplacer dans les sites d'induction afin que des réponses immunitaires post-vaccinales puissent étre générées. Ainsi les effets des voies d'immunisation ne peuvent pas être étudiés autrement que dans un modèle in vivo.

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans cette étude est restreint afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés au cours de ce TP. Etant donné que lors de chaque promotion annuelle il y a 30 étudiants, l’utilisation de 30 souris permet à chaque étudiant de manipuler, réaliser les prélèvements et de préléver les organes d’un animal. Etant donné que l’on a 6 conditions différentes (5 voies d’administration de la formulation vaccinale et le groupe contrôle négatif), 5 souris seront utilisées par groupe.

Raffinement

Les souris seront observées dans les heures suivant l’administration de la formulation vaccinale (examen à 3h, 24h, 48h et 72h) pour vérifier qu’il n’y ait pas d’installation d’un état de prostration, l’absence de douleur au site d’administration par voie intradermique et sous-cutanée (difficulté à se déplacer, voire boitement, sensibilité importante au toucher des sites d’injection manifesté par un vif retrait de la patte).

Choix des espèces

La souris développe des réponses immunitaires très similaires aux humains. C’est la raison pour laquelle parmi les espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l'animal le mieux adapté pour évaluer les réponses humorale et cellulaire après vaccination. Les souris OF1 sont connues pour développer une forte réponse humorale et présentent donc un intérêt pour notre étude dans le cadre de ce TP. Les souris seront âgées de plus de 7 semaines pour s’assurer que le système immunitaire est mature.

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles enchaînent mises à jeun, contentions répétées, gavages et injections, et une inflammation intestinale leur est provoquée par un produit ajouté à l'eau de boisson, avant un prélèvement sanguin terminal. Le porteur décrit des signes de souffrance attendus, poil hérissé, perte de poids, léthargie, dos courbé, ataxie et tremblements. Il affirme que ces phénomènes sont "impossibles à étudier directement chez l'Homme", tout en indiquant avoir déjà utilisé des organoïdes intestinaux pour une partie des questions.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) un rôle endocrine et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposées comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2, les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action intestinale de l'insuline contribue à l'hyperperméabilité et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales au cours du diabète. Notre projet identifiera à la fois les cellules cibles impliquées et les voies de signalisation permettant l'action de l'insuline dans l'épithélium intestinal, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes) -Un 1er lot d'animaux vigiles feront l'objet d'une mise a jeun (14h), de 2 à 7 contentions (30 secondes chacune), de 0 à 5 administrations orale de produit (1 min chacune), d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). Ce 1er lot d'animaux recevra également un traitement dans l'eau de boisson (7 jours) induisant une inflammation intestinale. -Un 2ieme lot d'animaux fera l'objet d'une mise a jeun (14h), de 3 à 8 contentions (30 secondes chacune), de 0 à 5 administrations orale de produit (1 min chacune), d'un prélèvement de sang (1min) et de 2 injections de produit (1min). -Un 3ième lot d'animaux fera l'objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 4 à 9 contentions (30 secondes chacune), de 2 à 7 administrations orale de produit (1min) d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). -Un 4ième lot d'animaux fera l'objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 3 à 8 contentions (30 secondes chacune) de 1 à 6 administrations orale de produit (1min), d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). - Tous les animaux seront placés sous analgésie anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

L'identification, les prélèvements, l’anesthésie/analgésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou liées à l’inflammation intestinale. Concernant les procédures incluant l’induction d’une inflammation intestinale ou l’infection par des entéropathogènes, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend 816 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent contentions, biopsies, mises à jeun, gavages, prélèvements de sang et injections, certaines recevant une pompe osmotique implantée chirurgicalement sous la peau et un diabète induit provoquant polydipsie et glycosurie. Le porteur décrit des signes de souffrance possibles comme un poil hérissé, une perte de poids et une léthargie, avant un prélèvement sanguin terminal. Il indique que les dérégulations métaboliques et inflammatoires sont "impossibles à étudier directement chez l'Homme" et recourt à l'animal quand la culture in vitro ne suffit pas.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) un rôle endocrine et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2, les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action d’un facteur qui médie les effets du glucose, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice potentiel de ce projet serait de mieux comprendre la fonction d'un facteur relayant habituellement les effets du glucose dans l'intestin. Il permettrait de notamament de comprendre si son blocage pourrait suffir à renforcer la barrière formée par l'intestin et ainsi empêcher l'augmentation de la perméabilité intestinale en cas d'hyperglycémie, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques, dans le contexte clinique des patients diabétiques et/ou obèses.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes). Un 1er lot d’animaux feront l’objet de deux mises à jeun (5h et 14h), de 6 administrations orales de produit (1min chacunes), de 3 prélèvements de sang (1min pour le prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvementcaudal) et de 2 injections de produit (1min chacun). ; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), Un 2ieme lot d’animaux feront l’objet de deux mises à jeun (5h et 14h), de 6 administrations orales de produit (1min chacunes), de 3 prélèvements de sang (1min pour le prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvementcaudal) et de 2 injections de produit (1min chacun). ; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), Ces animaux seront également placés sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). Un 3ieme lot d’animaux feront l’objet de trois mises à jeun (deux de 4h et une de 14h), de 8 administrations orales de produit (1min chacune), d’un prélèvement de sang (1min) et d’une injection de produit (1min). Un 4ieme lot d’animaux feront l’objet de trois mises à jeun (deux de 4h et une de 14h), de 8 administrations orales de produit (1min chacune), d’un prélèvement de sang (1min) et d’une injection de produit (1min). -Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les prélèvements, l’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou encore les douleurs post-opératoire (implantation de la pompe) ou liées à l’inflammation intestinale. De plus, la chirurgie comporte un risque pour l'animal lié à l'anesthésie (réveil, dépression respiratoire, hypothermie). Les souris rendues diabétiques présenteront une polydipsie associée à une glycosurie. L’implantation des pompes osmotiques en sous cutanée peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). L’infection par des entéropathogènes, ou l’induction d’un diabète, peut entraîner l’apparition de signes généraux de souffrance : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but certaines caractéristiques de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. L'étude comprend au total 280 animaux. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser les conséquences intestinales de la perte d’action du glucose à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas au glucose.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles du syndrome de Barth, elles présentent dès la naissance un déficit de poids et un défaut cardiaque, et reçoivent un gavage deux fois par jour pendant cinq mois ainsi que des prélèvements de sang rétro-orbitaux, pour tester le repositionnement de quatre médicaments déjà commercialisés. La moitié est tuée pour prélèvements d'organes, l'autre moitié transférée vers une autre animalerie pour des analyses cardiaques puis tuée également. Le porteur affirme que le modèle cellulaire reste incomplet pour un "organisme tout entier" et conclut à la "nécessité" du modèle animal avant le passage à l'Homme.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (2 fois par jour pendant 5 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Si la procédure de gavage pose problème, comme des irritations, il pourrait y avoir éventuellement la pose de mini pompes 1 fois par/mois pendant 4 mois (de l'âge de 2 mois à 6 mois) où chaque intervention n'exéderait pas 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 5 mois. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10-12 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins rétro-orbitaux sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. Le prélèvement se fera dans un oeil différent d'une fois sur l'autre. Le gavage 2 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal . Les mises au points de gavage 2 fois par jour durant 3 mois lors d'une précédente DAP n'ont pas révélé de nuisances particulières.

Devenir

Euthanasie de 180 animaux (la moitié du nombre total d'animaux) pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet (DAP) précédentes. L'autre moitié (180 animaux) sera transféréé dans une autre animalerie (autre DAP acceptée) pour analyse par echocardiographie et course sur tapis (treadmill) et sera également euthanasiée afin de récupérer les organes pour analyses.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis la mise en place des conditions optimales pour le bien-être des animaux. Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre (hors point limite), des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine, isolement si nécessaire jusqu'à ce qu'une amélioration soit observée. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des animaux modèles de la maladie (KO TAZ) inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance : si on dépasse les 25 pourcents d'écart l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste développés dans chaque procédure. Pour les animaux KO TAZ, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les animaux contrôles, non malades (WT) seront séparés des KO dans les cages.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque semaine pendant huit semaines une injection intrathécale de protéines pathologiques prélevées sur des patients atteints de la maladie de Charcot, pour tenter de reproduire la maladie, et subissent des tests de motricité, de force musculaire et de curiosité. Le porteur indique que les souris pourraient développer une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive, un point limite portant sur la fonction motrice déclenchant alors la mise à mort. Il affirme qu'il est "indispensable" de générer un modèle de la forme sporadique, inexistant à ce jour, aucune alternative cellulaire ne permettant selon lui d'étudier la propagation de la protéine.

Objectifs

La maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative qui touche les neurones du cerveau et de la moelle épinière responsables du mouvement. La maladie débute en moyenne à l’âge de 60 ans et est responsable d’une paralysie progressive, de troubles de la parole et de la déglutition, et de difficultés respiratoires aboutissant au décès en 2 à 5 ans. Il n’existe à ce jour aucun traitement de la maladie, et la recherche sur la maladie de Charcot a été marquée ces 20 dernières années par une multitude d’essais thérapeutiques négatifs. Ces résultats sont en grande partie liés à la faible connaissance des mécanismes à l’origine de la maladie, et à l’absence de modèles animaux fiables. Deux formes de la maladie existent, les formes héréditaires causées par des mutations génétiques représentent moins de 10% des patients, et les formes dites sporadiques qui représentent plus de 90% des patients et pour lesquelles l’origine de la maladie est inconnue. Un acteur semble toutefois jouer un rôle central dans la maladie : une protéine appelée TDP-43, qui s’accumule de manière anormale dans les neurones des patients atteints de la maladie. Parallèlement, cette protéine semble jouer un rôle dans la propagation de la maladie au sein du système nerveux en se propageant de neurone en neurone. Malgré les avancées réalisées dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la maladie ces dernières années, l’absence de modèle animal reproduisant la maladie est une limite majeure. Des modèles animaux portant les mutations génétiques responsables de formes familiales existent mais ne représentent que moins de 10% des patients. Il est donc indispensable de générer de nouveaux modèles représentatifs des 90% des patients atteints de la forme sporadique pour avancer dans la compréhension de la maladie et faire émerger de nouvelles pistes thérapeutiques. L’objectif du projet est de répondre à l’absence de modèles animaux fiables dans la recherche sur la maladie de Charcot en générant un modèle animal de la forme sporadique (inexistant à ce jour limitant les progrès de la recherche) pour permettre la compréhension des mécanismes impliqués et appliquer des stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Si les souris développent une pathologie similaire à la maladie de Charcot chez l’Homme, alors elle pourra être étudiée sur un modèle fiable de la maladie pour identifier les mécanismes impliqués afin de mieux comprendre l'origine et la propagation de la maladie, et enfin permettre d’identifier de nouvelle cible thérapeutique.

Procédures

Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées et formées. Au total, 36 souris subiront une injection intrathécale par semaine pendant 8 semaines (équivalence de la ponction lombaire chez l’Homme) sous anesthésie générale courte avec anesthésie locale. L’anesthésie générale et l’injection durent en moyenne 10 minutes. La procédure démarre par deux semaines d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, ainsi que l’habituation aux tests comportementaux qui seront réalisés. Une semaine après chaque injection, et avant l’injection suivante, les animaux subiront des tests comportementaux et cognitifs. Ces tests sont au nombre de 3 et visent respectivement à évaluer la motricité, la force musculaire et la curiosité. La durée de ces tests est d’environ 30 minutes par souris (3 tests différents de 10 min chacuns avec des temps de récupération entre chaque). Un mois après la dernière injection, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem et études biochimiques et d’imagerie.

Impact sur les animaux

Une procédure modérée telle que l’injection intrathécale entraine peu de douleur car cette procédure est réalisée sous anesthésie générale avec anesthésie locale sur la zone de l’injection, et que les animaux recevront une injection d’analgésique pour couvrir une éventuelle douleur post-injection. Les animaux sont surveillés au réveil, et dans les premières heures suivant l’injection puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée et des antalgiques setont administrés si toutefois une douleur est décelée. L’injection de protéines pathologiques ayant pour but de créer un modèle de la maladie, les animaux seront également surveillés quotidiennement. D’après notre expérience, pas ou peu de signes de mal être sont attendus car la maladie de Charcot chez l’Homme n’entraîne pas de troubles cognitifs ni de dépression, mais ces symptômes seront tout de même surveillés. En revanche, si notre modèle permet d’induire des symptômes semblables à la maladie chez l'Homme, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive (entrainant une perte de poids). Pour ces raisons, nous suivrons l’apparition de symptômes éventuels à travers la surveillance quotidienne des animaux, la pesée bihebdomadaire à partir des premiers symptômes, ainsi que par l’utilisation de tests hebdomadaires d’évaluation de la fonction motrice des animaux. La grille de score des points limite s’attarde notamment sur la fonction motrice des animaux de façon à ce qu’ils soient euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement et donc de s’alimenter et de boire correctement. Enfin, les tests comportementaux réalisés pouvant engendrer un stress lié à l’isolement et à la contention des souris, une habituation 15 jours avant le début de la procédure sera réalisée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des 2 procédures pour exploration de la propagation de la maladie par des études biochimiques et histologiques.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle cellulaire car à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier le rôle de la protéine TDP-43 dans l’induction et la propagation de la maladie de Charcot. En effet la maladie met en jeu l’organisme entier et plus particulièrement le système nerveux central (cerveau et moelle épinière). Les modèles cellulaires ne permettent d’évaluer le mode d’action qu’au niveau moléculaire et cellulaire sans pour autant apporter des informations extrapolables à l’organe ou à l’organisme entier. Aussi, il n’existe pas de modélisation mathématique ou d’alternatives non animales dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, 36 animaux au maximum seront nécessaires à ce projet : 3 groupes de 12 animaux (groupe expérimental, contrôle sain, contrôle négatif), dans chaque groupe se distinguent 2 sous-groupes en fonction de la destinée des animaux (6 animaux pour analyses biochimiques et 6 animaux pour analyses histologiques), et chaque sous-groupe est constitué de 50% de souris mâles et 50% de souris femelles. Ainsi 36 animaux sont nécessaires pour avoir minimum 3 réplicas par sous-groupe et par sexe. De plus, un groupe de souris sera utilisé pour mettre au point le protocole de mise à mort et de dissection permettant ainsi d’améliorer le protocole et de diminuer le nombre d’animaux utilisés par lots car moins de perte étant donné que le personnel sera formé. Ce groupe de souris utilisera des animaux de l’animalerie n’ayant pas les caractéristiques qui sont voués à être sacrifiés dans tous les cas.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animaux (4 souris par cage car ce sont des animaux sociaux), et les animaux évolueront dans un environnement enrichi (cabane, coton, rouleau de sopalin, etc…). Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l’animalerie. La douleur susceptible d’être induite par les injections sera limitée car elles seront réalisées sous anesthésie générale courte et accompagnée d’une anesthésie locale par précaution. Les animaux seront surveillés au réveil, et dans les premières heures suivant l’injection puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée grâce à une grille de score. L’injection a pour but de créer un modèle pathologique modéré. En revanche, si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive. Pour ces raisons, nous suivrons l’apparition de symptômes éventuels à travers la surveillance quotidienne des animaux, ainsi que par l’utilisation d’une grille de score et de points limites adaptés. La grille de score s’attarde notamment sur la fonction motrice des animaux de façon à ce qu’ils soient euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement. Par ailleurs, si moins de 8 injections sont nécessaires à l’induction de la pathologie elles seront réduites au strict minimum. Aussi, les tests comportementaux pouvant engendrer un stress lié à l’isolement, une habituation 15 jours avant le début des tests sera réalisée. Par ailleurs, un groupe de souris sera prévu pour mettre au point le protocole d'injections, de dissection/expérimentation. Ce groupe utiliseras des animaux de l’animalerie n’ayant pas les bons génotypes qui sont voués à être sacrifiés dans tous les cas. Ceci contribue à réduire le nombre d’animaux dans les autres groupes et permet une meilleure utilisation des animaux dans un soucis de réduction et de raffinement.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour l’étude des maladies humaines car l’organisation de son ADN et l’expression de ses gènes sont similaires à celles de l’Homme. La souris est donc un outil précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permet d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacent à de nombreuses pathologies humaines. De plus, c’est un modèle facile à entretenir, bien décrit et documenté. C’est un modèle utilisé dans le monde entier permettant ainsi de comparer les résultats entre les laboratoires de recherches. Les souris seront âgées d’environ 4 mois, l’âge moyen pour avoir des animaux adultes et mature car la maladie de Charcot est une maladie qui touche des adultes.

75 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des sensibilisations cutanées hebdomadaires pendant six semaines, puis un gavage à l'éthanol trente minutes avant l'ingestion forcée de gluten, de façon à déclencher une réaction anaphylactique servant à étudier l'alcool comme cofacteur d'allergie. Certaines reçoivent aussi une puce implantée chirurgicalement dans l'abdomen, et le porteur décrit une baisse de température corporelle et des douleurs stomacales attendues. Il affirme que le modèle in vivo est "irremplaçable" pour reproduire la réaction allergique dans son ensemble.

Objectifs

Les allergies sont très répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ainsi, l’allergie est considérée comme un enjeu majeur de santé publique. Coûteuses, les allergies altèrent également la qualité de vie des patients. Depuis une vingtaine d’années, une augmentation constante de la prévalence de cette pathologie et notamment de la forme sévère (dite anaphylactique) a été constatée. A l’heure actuelle, les mécanismes impliqués dans le développement de la réaction allergique et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence sont peu établis. Les quelques études publiées sur la survenue de l’anaphylaxie révèlent une implication majeure de cofacteurs tels que l’effort, l’alcool et les anti-inflammatoires non stéroïdiens. Dans le cas de l’anaphylaxie induite par l’effort et dépendante du blé (cas le plus répandu), l’hypothèse soutenue repose sur une altération importante de la fonction gastro-intestinale notamment marquée par l’augmentation de la perméabilité intestinale lors de l’effort. Ces modifications favorisent ainsi le passage des allergènes dans le sang. Chez les sujets souffrant d’allergie d’origine alimentaire, la réaction et les symptômes sont alors amplifiés pouvant entraîner le décès du sujet. Il a également été admis que la réactivité IgE de certaines fractions protéiques diffère lors de la réaction anaphylactique. L’objectif de ce projet est d’établir le mécanisme impliqué dans l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé. L’alcool est considéré comme étant le deuxième cofacteur intervenant dans les réactions de l’allergie alimentaire, mais de manière surprenante les mécanismes moléculaires par lesquels l’alcool amplifie la réaction allergique n’ont jamais été élucidés. Le blé a été choisi car c’est un allergène commun et connu pour être impliqué dans la réaction allergique sévère et notamment en présence de cofacteurs. Plus spécifiquement, l’étude se focalisera sur le gluten, un complexe protéique du blé, composé des allergènes majeurs de la céréale. Aussi lors de cette étude, un examen approfondi de le barrière intestinale sera menée afin de déterminer les modifications dues au cofacteur. La symptomathie et le mécanisme de la réponse immunitaire lors de la réaction anaphylactique seront également caractérisés en détail.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le mécanisme impliqué dans l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé. De ce fait, la réponse immunitaire précise de cette physiopathologie sera élucidée. Les effets de l’alcool au niveau de la barrière intestinale dans le cas d’une allergie alimentaire au blé seront déterminés. Aussi, une étude sur les fractions protéiques intervenant dans cette physiopathologie sera effectuée. A terme, ce projet a pour but de permettre une compréhension plus approfondie de l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé pour améliorer la prise en charge des sujets atteints. Des solutions préventives et thérapeutiques pourront être proposées.

Procédures

Lors de ce protocole, 5 groupes de 10 souris seront soumis à des sensibilisations percutanées hebdomadaires pendant 6 semaines. Les animaux seront alors anesthésiés tous les 7 jours pour la réalisation de la réalisation du geste. Aussi, sur ces souris, un total de 4 prélèvements de sang seront effectués avant le début des sensibilisations, après la 3ème sensibilisation, après la 4ème sensibilisation et après la 5ème sensibilisation. Elles seront effectuées 48h après les sensibilisations. Aussi, les souris subiront un gavage oral. Le groupe des 10 souris permettant d’évaluer l’impact du cofacteur seront gavées à l’éthanol 30 min avant le challenge au gluten. Quatorze souris de la procédure 1 subiront une chirurgie pour l’implantation de la puce Anipill (2 souris des groupes : CTL NA ; CTL SENS ; CTL CHAL et 4 souris des groupes : AA ; AA+EtOH). Elles seront anesthésiées par voie gazeuse, puis l’abdomen sera ouvert et une suture sera effectuée. Elles auront un suivi post opératoire.

Impact sur les animaux

Il est possible que les animaux aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués. En effet, lors des sensibilisations percutanées, une gêne peut être ressentie due à l’adjuvant utilisé (SDS) et à la répétabilité du geste (1 fois par semaine pendant 6 semaines). La phase de déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge), peut également contribuer à des nuisances. Une baisse de la température corporelle des animaux est généralement observée. Aussi pour le groupe de souris étudiant l’effet du cofacteur dans l’allergie alimentaire au blé, la phase d’administration du cofacteur peut également être cause de stress et de gène au niveau de l’œsophage étant réalisé 30 minutes avant le challenge au gluten. Lors de cette étape, une baisse de la température corporelle pourra également être attendue ainsi qu’une baisse de l’état de santé général de l’animal. Les souris pourront aussi ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration d’alcool et de gluten. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris. Aussi, des symptômes caractéristiques de l’anaphylaxie peuvent être observés. Généralement, les effets surviennent entre 0 et 30 minutes après le geste et peuvent persister pendant une trentaine de minutes.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et de la fonction gastro-intestinale.

Remplacement

Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire. Notamment, le cas de l’étude du mécanisme et de la symptomatie de la réponse allergique impliquant un co-facteur le modèle in vivo est irremplacable.

Réduction

Le protocole d’allergie alimentaire est régulièrement réalisé au sein du laboratoire. De ce fait, en se basant sur les études précédentes, le nombre de souris a été déterminé à 10 souris par groupe. Le nombre d’animaux réduit au minimum permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques de type test de Wilcoxon-Mann-Whitney ou test de Student. La valeur P-value de p

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d’analgésie et d’anesthésie permet de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi pour limiter l’inconfort lors de la prise de température, des puces seront placées chirurgicalement chez certaines souris (de 2 à 4 souris par groupe hormis pour le groupe contrôle alcool). Les mesures obtenues par les puces télémétriques Anipill seront comparées aux mesures prises par voie rectale pour évaluer la fiabilité des puces et pouvoir à termes favoriser l’utilisation des puces dans les protocoles. En parallèle de la procédure 1 et avant le challenge oral avec l’alcool, le groupe contrôle alcool réalisé sur un petit nombre de souris (n=10) déterminera exactement la dose d’éthanol la plus tolérable par les souris. Ainsi, cette procédure permet de limiter le nombre de groupe allergie alimentaire et cofacteur et de limiter des nuissances importantes sur les animaux.

Choix des espèces

Lors de cette étude, des souris femelles de souche Balb/c seront utilisées. Ces souches de souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l’expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. Les femelles Balb/c utilisées auront 3 semaines de vie à réception et auront 5 semaines de vie au début des procédures. Cinq semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature. Pour les souris avec une implantation d’une puce type Anipill, l’intervention chirurgicale sera effectuée à 4 semaines de vie permettant aux souris d’avoir un poids corporel correct.

750 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à trois anesthésies, deux laparotomies dont l'une pour léser le nerf des corps caverneux et poser des électrodes, ainsi que la pose de cathéters dans l'aorte et le pénis pour mesurer des pressions. La dernière anesthésie, irréversible, est menée sans réveil et dure jusqu'à trois heures, avant la mort et le prélèvement d'organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne reproduit la dysfonction érectile dans sa complexité et conclut au caractère incontournable de l'expérimentation animale.

Objectifs

Après 40 ans, un homme sur trois a des troubles de l’érection, pouvant avoir une incidence sur la qualité de vie des patients. La dysfonction érectile (DE) est un symptôme sentinelle des maladies cardio-vasculaires mais peut être également due à des traumatismes (chirurgicaux ou accident). Les traitements actuels présentent soit des contre-indications importantes soit des contraintes d’utilisation et/ou de prescription, d’où l’importance de développer de nouveaux candidats médicaments sur différents types de modèles. L’érection est une fonction complexe faisant intervenir des mécanismes vasculaires, musculaires et nerveux. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de candidats médicaments dans un modèle de dysfonction érectile chez le rat mâle anesthésié.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de dysfonction érectile.

Procédures

Les animaux subiront : - 3 anesthésies au maximum (2 gazeuses qui vont durer 15-20 min et 1 fixe sans réveil qui va durer jusqu’à 3 heures), - 2 chirurgies (1 laparotomie pour la lésion du nerf des corps caverneux qui va durer 20-30 min selon les expérimentateurs, 1 laparotomie pour installation d’électrodes au niveau des nerf du corps caverneux qui va durer 1 heure). - L’administration des composés à tester pourra se faire sous anesthésie gazeuse pour l’administration dans les corps caverneux (directement via le pénis, anesthésie de 20 min) ou via des voies plus classiques (i.p., s.c….). Les gestes étant réalisés par du personnel qualifié, les administrations de composés, d’antalgiques ne dureront que quelques secondes. De plus des cathéters seront implantés dans l’aorte carotide et dans le pénis au niveau du corps caverneux afin de mesurer des pressions. Le dernier acte fait sur l’animal est sans réveil pour l’animal.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Cependant, les animaux vont être manipulés, ce qui d’une part peut engendrer un stress, une nuisance, une douleur. Les animaux vont également subir 1 laparotomie sous anesthésie gazeuse pouvant induire une gêne post-opératoire. L’administration du produit à tester pouvant se faire sous anesthésie gazeuse (pour l’administration dans les corps caverneux par exemple), cette succession d’anesthésie pour induire une nuisance à l’animal. De plus, une troisième anesthésie sans réveil sera réalisée pour l’évaluation de l’effet des candidats médicaments avant l’euthanasie de l’animal (ceci ne devant pas conduire à des nuisances particulières) à part la douleur de l’aiguille pour l’administration intrapéritonéale de l’anesthésiant).

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure car l’anesthésique utilisé est irréversible et les animaux ne pourront pas se réveiller. De plus, des organes pourront être collectés à la fin de la procédure.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la dysfonction érectile. Tous les traitements existants ont d’importants effets secondaires. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le modèle de dysfonction érectile se faisant sous anesthésie, cela permet de réduire la douleur et le stress chez l’animal. Dans une étude classique, il y aura 5 groupes expérimentaux. Un nombre minimum de 15 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et interprétables.

Raffinement

Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux (tunnel, aspen brick…). L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Ce modèle est très bien décrit dans la littérature chez le rat. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

Imagerie, puis ovariectomie par une incision d'une dizaine de centimètres sur la ligne médiane du ventre pour provoquer une ménopause, puis pose d'un stimulateur cardiaque destiné à déclencher une fibrillation auriculaire, avec des équipements électroniques implantés sous le muscle du cou : 95 brebis âgées de 7 à 10 ans vont passer par ces étapes. Pendant six mois au plus, elles repassent chaque mois sous anesthésie générale pour des séances d'imagerie, invasives ou non, et des prélèvements de fluides biologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que la fibrillation provoquée est "asymptomatique chez la brebis" et cite comme effets possibles l'hypothermie et la désorientation au réveil des anesthésies, une hernie après l'incision et une cicatrisation prolongée autour des implants. Toutes seront tuées à l'issue, pour caractériser dans leurs tissus le remodelage cardiaque obtenu par la ménopause ou la fibrillation.

Objectifs

De plus en plus d’études montrent que la fibrillation auriculaire (FA) diffère entre les femmes et les hommes. Les femmes sont plus âgées au moment de l'apparition de la FA et la prise en charge est plus complexe et moins efficace. Parmi les rares études disponibles, nous observons qu’ un âge ménopausique plus jeune et un traitement hormonal limité ont été associés à un risque accru de FA et de maladies corrélées. Peu d'attention scientifique a été accordée aux différences entre les femmes et les hommes, d'où un manque de connaissances et de sensibilisation dans la communauté des chercheurs et dans le public. Par conséquent, afin d'améliorer le diagnostic et la thérapeutique de la maladie, nous devons mieux comprendre comment le rôle des hormones sexuelles influence le développement, la progression et le traitement de la FA. L'objectif de ce projet est la validation et caractérisation d’un modèle ovin de femelle ménopausée et son impact sur le remodelage atrial au cours de la fibrillation auriculaire

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de créer un modèle d’ovin pour mieux comprendre le rôle des hormones sexuelles dans la progression des maladies cardiaques, notamment de la FA. Les résultats de ce projet nous aideront à identifier les mécanismes spécifiques favorisants cette arythmie, et ils nous fourniront une base pour mieux prendre en charge les soins des patients atteints ou a risque de développer la FA à cause de leur sexe.

Procédures

Dans ce projet, 95 seront traitées. Ces animaux subiront des analyses d’imagerie, suivies par une procédure chirurgicale pour l’induction de la ménopause par ovariectomie. Ensuite, ils recevront un stimulateur cardiaque pour le déclanchement de la FA. Au long de leur suivi de maximum 6 mois, nous répèterons, avec une cadence mensuelle, ldes procédures d’imagerie non-invasive et invasive. Des prélèvements de fluides biologiques auront lieu mensuellement afin d’étudier les changements hormonaux et le bila métabolique. Toutes ces procédures seront effectuées sous anesthésie générale et monitorage des paramètres vitaux.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes procédures, notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie). L’ovariectomie par laparotomie médiale sur la ligne blanche d’une dizaine de centimètres pourrait éventuellement provoquer une hernie. Pour éviter ce type de complications, des points séparés et rapprochés seront réalisés afin d’éviter les tensions. Des effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des équipements électroniques localisés en sous-musculaire dans la zone du cou pour induire et enregistrer la progression de la FA mais ils sont maîtrisés et correspondent à des phases de cicatrisation prolongées. L’induction de la FA chez la brebis peut provoquer une fréquence ventriculaire cardiaque irrégulière mais à noter que l’installation de la FA est asymptomatique chez la brebis ainsi les brebis saines et en FA sont indiscernable au niveau du comportement et de l’aspect physique.

Devenir

Tous les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de caractériser à l’échelle tissulaire, cellulaire et biochimique les effets du remodelage cardiaque obtenu par la ménopause et/ou l’induction de fa fibrillation atriale. Ces données sont fondamentales pour prouver si et comment les hormones sexuelles jouent un rôle de protection contre la fibrillation atriale, et finalement envisager des thérapies ciblées et appropriée aux spécificités de la population féminine des patients.

Remplacement

Pour répondre aux questions d’ordre clinique, des modèles animaux de pathologies humaines et des tissus animaux sont nécessaires. Le remplacement des animaux n’est actuellement pas possible pour cette étude. En effet, les mécanismes physiologiques sont complexes dans leur globalité et nécessitent d’avoir recours à un modèle animal. S’y ajoute, qu’il n'existe pas à ce jour de modèles numériques ou même cellulaires pour répondre aux objectifs.

Réduction

Pour la première phase, nous avons estime une taille de 20 animaux en total, divisée entre un groupe ménopause et groupe ménopause + remplacement hormonale. Cela nous permettra d’avoir un nombre de 10 par groupe suffisant pour les observations des changements des niveaux hormonaux et ceux de type anatomique et électrophysiologique plus évidents. Pour la deuxième phase, nous avons fixé un nombre de 75 animaux max au long des 5 ans. Il s’agit du nombre minimal d’animaux nécessaire en se basant sur notre expérience antérieure dans l’utilisation d’autres modèles au cours de divers projets menés jusqu’à présent. Pour les deux phases, une attention sera portée à la réduction du nombre de ces animaux en recalculant le nombre statistiquement relevant après les premiers 5 et 10 animaux par groupe. Dans cet objectif de réduction, nous ferons également en sorte que chaque animal soit son propre contrôle dès que cela sera possible. Cela nous aidera dans le but d’obtenir des résultats plus robustes en utilisant moins d’animaux.

Raffinement

Le raffinement du projet et le respect du bien-être animal reposent sur plusieurs mesures, d’une part lors de l’hébergement dans des locaux agréés, les animaux bénéficient de soins quotidiens dispensés par du personnel compétent et soucieux du bien-être animal. Les animaux sont habitués au personnel animalier afin de limiter tout stress. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux ce qui leur permet d’exprimer des comportements naturels et ils disposent d’enrichissements adaptés (i.e. foin, pierre à sel, etc.). Afin de minimiser les risques amenés par la chirurgie, nous les habituerons à porter des gilets médicaux. D’autre part, lors de l’intervention chirurgicale et implantation de dispositifs de stimulation, la procédure est réalisée sous anesthésie générale (mise en œuvre et surveillance par du personnel dédié) et une analgésie adaptée est mise en place. Des critères d’alerte précis et effets adverses seront évalués et surveillés. Si un point limite est atteint, des mesures adaptées seront mises en place dans le plus court délai (administration d’une thérapie analgésique ou bien augmentation des doses si déjà en cours). Parallèlement, le responsable du projet, le responsable du bien-être et le vétérinaire délégué seront contactés.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proches de l’homme (ovin, porc, chèvre, chien), l’ovin a été identifié comme le plus adéquate car : •Les équipes possèdent une très grande expérience sur la création des modèles dans cette espèce ; •Ce modèle animal est bien décrit et caractérisé, et constitue une référence dans la communauté scientifique ; •Le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie dans la gestion de cette espèce ; •Les moutons fournissent également les dimensions et les propriétés physiologiques comparables à celles de l'homme. Nous utilisons des Femelles matures de 7 à 10 ans d’âge pour reproduire la ménopause et la susceptibilité à la FA chez la femme.

2288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des mutations sont introduites par électroporation dans le cerveau de souris nouveau-nées pour y induire un glioblastome, avant une euthanasie par perfusion intracardiaque précédée d'une thoracotomie sous anesthésie. Le porteur affirme n'avoir jamais observé d'effet dommageable jusqu'à six semaines, tout en décrivant au-delà une prostration et un poil hérissé qui le conduisent à ne pas garder les animaux plus longtemps. Il conclut qu'aucun modèle cellulaire ne récapitule les niches où se développent ces tumeurs et justifie l'étude sur l'animal entier.

Objectifs

Les glioblastomes (GBM) représentent la forme la plus fréquente et la plus agressive des tumeurs primaires du cerveau avec un pronostic de survie très bas. Lors d’experiences pilotes décrites dans une DAP précédente, nous avons établi un modèle de GBM chez la souris, qui permet d’étudier les étapes précoces de l’apparition des tumeurs. Ces tumeurs se déclanchent à cause de mutations qui surviennent dans des cellules souches du cerveau. Notre équipe travaille depuis longtemps sur ces cellules souches et nous sommes capables d’introduire des mutations en utilisant la méthode d’électroporation in vivo du cerveau de nouveaux-nés décrite dans les procédures et que nous utilisons régulièrement depuis plus de 10 ans. L’analyse de ces cellules ainsi modifiées sera effectuée à différents temps après l’induction des mutations et permettra de caractériser les évènements cellulaires et moléculaires qui interviennent pendant la période d’induction et de développement précoce des GBM.

Bénéfices attendus

Grâce à notre méthode qui permet d’introduire des mutations dans les cellules souches du cerveau, nous avons le moyen unique de pouvoir étudier les étapes précoces du développement des glioblastomes chez l’animal entier, possibilité qui n’existe pas à l’heure actuelle. Notre modèle pourra être utilisé pour tester l’effet de molécules particulières dans le développement précoce de ces cancers ou dans leur régression. Enfin, nous pourrons générer un modèle adulte des glioblastomes reflètant plus fidèlement ce qui se passe chez les patients atteints de ce type de cancer, dans le but ultime d’identifier des pistes thérapeutiques.

Procédures

Interventions: 1) electroporation du cerveau: geste réalisé sous anesthésie générale. Durée de l'acte: 1 minute maximum, effectué sur 2288 animaux nouveau-nés, 1 seule fois par animal. 2) Injection intrapéritonéale, durée moins de 1minute, effectuée 1 fois sur 336 animaux vigiles âgés de 2 à 30 jours, ou 2 fois sur 108 animaux âgés de 21 à 35 jours. 3) Thoracotomie dans le cadre d'une euthanasie par perfusion intracardiaque. Geste réalisé sous anesthésie générale sub-létale (surdosée) après une pré-médication avec un analgésique morphinique. Durée: 5 minutes, 1 seule fois car conduit à la mort de l'animal, sur 2288 animaux.

Impact sur les animaux

Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 77 jours après. Nous pratiquons en routine depuis une douzaine d’année les procédures décrites dans ce projet et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à ces actes sur la santé et le bien être des animaux. L’animal peut ressentir un stress au moment de sa contention et lorsqu’on introduit une aiguille fine dans son abdomen mais au regard de la durée extremement courte de l’intervention (moins d’une minute) nous pouvons estimer que le stress et la douleur induits sont très limités dans le temps. Les produits injectés n’entrainent pas d’effet indésirable sur les animaux. Nous n’avons jamais observé d’effet toxique du tamoxifène (molécule qui permet de réguler le récepteur à l’hormone oestrogène) injecté à des animaux dans d’autres projets. Les lignées transgéniques que nous utilisons dans ce projet sont non dommageables. Les autres effets indésirables attendus sont les effets du développement des tumeurs cérébrales. Dans un précédent projet, nous avons réalisé des expériences pilotes sur plusieurs animaux pour évaluer la taille des tumeurs et leurs conséquences sur leur santé et nous n’avons jamais observé d’effet dommageable selon la grille de score sur des animaux jusqu’à 6 semaines après l’induction des glioblastome malgré que la tumeur occupe une partie importante du cerveau. Il est possible que la tumeur engendre une augmentation de la pression intracranienne mais sans impact visible sur la santé de l'animal. Toutefois, nous avons observé sur quelques animaux l’effet de la tumeur après 6 semaines, qui apparait de façon soudaine et se caractérise par le comportement prostré de l’animal ayant un poil hérissé. Cependant nous ne gardons pas les animaux au-delà de ces 6 semaines car notre projet ne nécessite pas de garder des animaux présentant des tumeurs délétères pour leur santé.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélever leur cerveau en vue de leur analyse

Remplacement

Le but de notre projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires intervenant dans les phases précoces de développement des GBM dans le contexte écologique de l’avènement des tumeurs en ciblant les cellules souches neurales de la ZSV des ventricules latéraux qui sont à l’origine de ces GBM. La prolifération et la différenciation de ces cellules souches sont contrôlées par des facteurs extrinsèques ou environnementaux présents au niveau de niches cellulaires qui entourent ces cellules. Ces facteurs sont sécrétés par exemple par les cellules gliales ou celles du système vasculaire. Malheureusement il n’existe pas de modèles cellulaires capables de récapituler ces niches cellulaires.

Réduction

Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des cellules souches directement dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette méthode par électroporation des cerveaux in vivo est utilisée en routine depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et nous pouvons estimer au plus juste le nombre d’animaux suffisants à utiliser pour avoir des résultats reproductibles et tenant compte du taux d’échec des expériences réalisées par la suite sur les échantillons biologiques. Les groupes témoins et les groupes tests seront constitués à partir de mêmes portées, sans distinction de sexe, afin d’optimiser le nombre de nouveaux-nés utilisés par portée et donc de réduire le nombre de portée par expérience. Pour les analyses histochimiques, le nombre d’animaux nécessaires à l’étude a été réduit grâce au fait que chaque cerveau prélevé servira à l’analyse de plusieurs marqueurs. Le nombre d’animaux a été estimé en s’appuyant sur des tests statistiques appropriés pour ce type de procédure (test non paramétrique adapté aux petits échantillons, qui ne sont pas distribués selon une loi normale). De plus grâce à notre expérience concernant l’analyse statistique de résultats obtenus en utilisant ces méthodes dans d’autres projets, le nombre d’animaux pour ce projet a pu être réduit au strict nécessaire.

Raffinement

Selon les recommandations règlementaires, les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. 5 personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin aux animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation post-expérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises. -Lors de la perfusion intracardiaque, pour éviter toute souffrance, une prémédication de buprénorphine est administrée avant la perfusion, puis les animaux sont anesthésiés par un surdosage d’anesthésique. L’acte n’est réalisé qu’après s’être assuré que l’animal est sans réaction.

Choix des espèces

De façon générale, la souris est le modèle mammifère le plus utilisé par la communauté scientifique pour établir des modèles de cancers in vivo permettant l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires des phases précoces de développement de cancer. Le modèle d'induction de glioblastome par mutation de 3 gènes critiques a déjà été décrit chez la souris par d'autres équipes scientifiques et mime différentes caractéristiques cellulaires et moléculaires de la genèse et du développement des glioblastomes. Ce modèle est donc réalisable et pertinent. De plus, grâce à notre adaptation basée uniquement sur l’électroporation, nous pouvons étudier les étapes d’induction et de développement précoce des glioblastomes dans des contextes génétiques mutants existant uniquement chez la souris. Tous les animaux seront électroporés au stade nouveau-né car c’est le stade où les cellules souches neurales qui bordent les ventricules latéraux sont extrêmement nombreuses et peuvent être modifiées génétiquement en introduisant facilement des molécules d'ADN. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l’électroporation, de 2 jours jusqu’à un maximum de 11 semaines, pour suivre l’évolution des cellules génétiquement modifiées. Toutefois la plupart des animaux sera euthanasiée avant 4 semaines.

6 furets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le titre annonce un vaccin contre la tuberculose, mais aucun vaccin n'est administré, les furets ne recevant que du sérum physiologique et servant à entraîner le personnel aux gestes techniques, jusqu'à douze prises de sang, un lavage broncho-alvéolaire, la pose de puces télémétriques et des administrations intratrachéales sous anesthésie générale. Ils sont tués à la fin pour prélever une banque de tissus témoins destinés aux projets suivants. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit la complexité du tissu pulmonaire et décrit le furet comme un bon modèle pour remplacer le blaireau.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans un projet scientifique plus global visant à étudier la vaccination contre la tuberculose. Le modèle furet est utilisé pour la première fois dans nos conditions d’expérimentation. L’objectif est de permettre au personnel d’acquérir une maîtrise des actes classiquement utilisés dans les projets en infectiologie sur le modèle furet et plus particulièrement dans l’étude de la tuberculose animale. Pour ce projet, 4 animaux (sexe indifférent, en fonction des possibilités d'approvisionnement) seront utilisés. Ce projet a deux finalités : 1) Il répond à la réglementation en expérimentation animale en vigueur concernant la maitrise et le maintien du savoir-faire du personnel en particulier animalier. Ce projet a en effet pour objectif de les former à la mise en œuvre de gestes techniques (manipulation et contention, anesthésie générale, prise de sang, pose de puces télémétriques, administration par voie intratrachéale ou par voie digestive, injections intramusculaire et sous-cutanée et lavage broncho-alvéolaire) et à l’utilisation du modèle furet dans le cadre de projets de recherche impliquant un agent pathogène respiratoire. 2) Constituer une banque de tissus d’animaux sains qui serviront de contrôles pour les expériences ultérieures. A l’issue du projet, les animaux seront mis à mort afin de prélever une variété de tissus. Le personnel animalier est habitué à l’utilisation d’animaux vivants (animaux de rente et animaux de laboratoire) et au respect du bien être animal. Les furets seront hébergés dans leur nouvel environnement pendant une durée de 2 semaines avant les premières interventions (période d'acclimatation à l'environnement et période d'habituation au personnel). Ils seront hébergés dans des cages reliées entre elles par un sytème de tunnels. Plusieurs types d’enrichissement seront proposés : hamac, jouets.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont doubles : 1) Permettre la mise en place du modèle furet et l’acquisition d’un savoir-faire expérimental nécessaire à la recherche en infectiologie et plus particulièrement dans le cadre de l’étude de la vaccination contre la tuberculose. En effet, ce projet permettra d’optimiser les techniques (manipulation et contention, anesthésie générale, prise de sang, pose de puces télémétriques, administration par voie intratrachéale ou par voie digestive, injections intramusculaire et sous-cutanée et lavage broncho-alvéolaire) mais aussi de tester et adapter le matériel (enrichissement, télémétrie sur des animaux sains, friandises). 2) Constituer des banques de tissus et d’échantillons de sang pour réduire l’utilisation d’animaux lors des prochains projets. Tous ces échantillons et prélèvements constitueront les contrôles pour les prochains projets qui visent à étudier la réponse immunitaire après vaccination par le BCG (Bacille de Calmette et Guérin). Autrement dit, grâce aux prélèvements réalisés dans ce projet, il ne sera pas nécessaire d’avoir un lot contrôle non vacciné dans les prochaines études sur furet/BCG. Les prélèvements de sang permettront d’acquérir des données sur la population des cellules immunitaires d’animaux sains. Les différents tissus et organes prélevés à l’issue du projet constitueront une banque d’échantillons témoins. Par ailleurs, une partie de ces prélèvements sera également envoyée dans des plateformes spécialisées dans le marquage histologique des tissus. Il est également envisagé d’établir une grille de bien-être qui pourra être utilisée lors des prochains projets.

Procédures

Les animaux ne recevront que du sérum physiologique stérile. Il peut y voir des hématomes liés aux différentes injections. Les injections pourront être différées. Il peut y voir des soucis anesthésiques (cas rares) liés à la réaction propre à chaque individu face aux molécules d’anesthésies. Au cours des 3 mois du projet, chaque furet sera soumis au maximum à : - 12 prises de sang : au maximum 1 prélèvement par semaine. Une prise de sang dure quelques secondes - 1 LBA (lavage-broncho-alvéolaire) qui dure 2 à 5 min - 6 administrations en IM (intra musculaire) ou SC (sous cutanée), qui durent quelques secondes - 3 administrations par voie digestive, qui durent 2 à 5 minutes - 3 administrations en intra-trachéale, qui durent quelques secondes - 1 pose d’implant contraceptif en SC (sous cutanée), qui dure quelques secondes - 2 poses de puces télémétriques qui durent quelques secondes Tous ces actes se feront sous anesthésie générale pendant 5 à 30 minutes selon la nature et le nombre d’actes effectués

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pourraient être liés à une mauvaise réaction des animaux à l’anesthésie générale ou à un des gestes techniques qui induirait une réaction inflammatoire locale, un hématome ou une infection. En raison de leur hébergement en groupe, d'éventuelles blessures infligées par les congénères sont possibles (griffure, morsure…)

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de constituer une banque de tissus d’animaux sains qui serviront de contrôles pour les expériences ultérieures.

Remplacement

A ce jour, il n’existe aucun système in vitro ou méthode alternative permettant de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le blaireau est l’espèce cible pour l’étude de la tuberculose mais les expériences sur cette espèce sauvage sont difficiles à mettre en œuvre. Cependant, il a été démontré par la communauté scientifique que le furet est un bon modèle pour remplacer le blaireau.

Réduction

Pour ce projet, le nombre d’animaux minimal a été fixé à 4 pour favoriser d’une part le lien social entre les animaux, pour avoir suffisamment d’échantillons biologiques qui soient statistiquement pertinents pour la suite du projet et enfin pour avoir la possibilité d’expérimenter les interventions sur différents animaux et former plusieurs personnes. Le nombre d’animaux utilisés pour fournir des échantillons « contrôle » a été déterminé grâce à un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge vaccinale). Ces animaux seront utilisés pour fournir les échantillons « contrôle » d’un projet qui se déroulera ultérieurement. Ces animaux n’étant ni vaccinés, ni infectés par Mycobacterium, la réponse immunitaire contre cette bactérie sera faible et homogène entre les animaux.

Raffinement

Le projet est prévu sur une durée de 3 mois (12 semaines). Une période d’acclimatation à l’environnement et d’habituation au personnel animalier sera mise en place à reception des animaux pendant 14 jours. Lors de cette période, la seule intervention du personnel sera d’habituer les animaux à leur présence et aux contacts : contention, jeux, friandises. Les animaux seront hébergés dans des cages conçues spécifiquement pour le furet. Chaque furet disposera de sa propre cage mais toutes les cages seront interconnectées entre elles par un système de tunnels permettant aux furets de se regrouper. Le tunnel constitue également une forme d’enrichissement. Un hamac en tissu sera suspendu à l’intérieur de chaque cage pour permettre aux furets d’avoir un coin de repos. Pour le jeu, différents types de jouets seront testés (balle, jouets en plastique dur, tissus, tunnel dans la cage…) afin de déterminer les plus attractifs. Des récompenses alimentaires pourront être données après les interventions qui ne nécessitent pas d’anesthésie générale (contentions, injections sous-cutanée et intramusculaire si possible). Les furets maintenus sous anesthésie générale gazeuse (avec induction en boite) seront sous monitoring (fréquence respiratoire, saturation, fréquence cardiaque, température), sous lampe et/ou tapis chauffant, et sous la supervision de personnel. Lors de l’intubation intra-trachéale, du gel de xylocaïne sera mis sur la sonde d’intubation et un spray de xylocaïne sera utilisé pour anesthésier la gorge. Lors da la phase de réveil, une surveillance rapprochée de l’animal sera faite. En cas de besoin, du doxapram et de la buprénorphine seront disponibles, pour faciliter le réveil et gérer une éventuelle douleur. En cas d'infection, un traitement antibiotique de 1ère intention à base d'amoxicilline sera mis en place. Deux visites quotidiennes seront réalisées afin de surveiller l’état de santé des animaux. Des point limites adaptés ont été définis et la vétérinaire de l’unité sera avertie en cas d’apparitions de signes cliniques.

Choix des espèces

Le furet est un modèle validé pour l’étude d’espèces de la faune sauvage (blaireau) qui constitue l’espèce ciblée par le projet de vaccination contre la tuberculose animale. Le furet et le blaireau sont deux espèces de Mustélidés qui sont sensibles à Mycobacterium bovis. Le blaireau étant une espèce sauvage, l’expérimentation sur cette espèce est soumise à une réglementation complémentaire contrairement au furet qui est une espèce domestique. Animaux adultes âgés d’environ 1 an (poids d’environ 1400 g pour les mâles et 1200 g pour les femelles). Le choix d’animaux adultes est conditionné par le fait que la vaccination est plus pertinente sur animaux adultes que chez des jeunes dont le système immunitaire est en cours de développement.

1392 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire le syndrome de Leigh, une maladie mitochondriale mortelle, elles développent une perte de poids, un retard de croissance puis une faiblesse musculaire et des difficultés respiratoires avant d'être tuées à des âges définis pour prélever leurs organes. Le porteur présente cette première étude comparative de deux modèles murins comme une source de connaissances sur une maladie sans traitement. Il affirme que les lignées cellulaires ne peuvent pas reproduire les mécanismes d'adaptation de l'organisme entier.

Objectifs

Les maladies mitochondriales sont des maladies causées par des mutations du génome des mitochondries, les centrales énergétiques des cellules, ou du génome nucléaire, et à l’issue souvent fatale. Elles peuvent se manifester à tout âge et se présentent comme des maladies qui affectent généralement les muscles et le cerveau. Il n’existe pas de thérapies efficaces contre ces maladies à ce jour, en raison d'une compréhension insuffisante des mécanismes sous-jacents. Des mécanismes complexes impliquant une réponse au stress lié aux déficits des mitochondries sont de plus en plus suspectés d’être impliqués dans ces pathologies. Le syndrome de Leigh représente la maladie mitochondriale pédiatrique la plus courante. C'est une maladie mortelle affectant à la fois le cerveau et les nerfs. Elle est causée par des mutations de plus de 75 gènes impliqués dans le métabolisme mitochondrial. Ce projet, financé par l’Association Française contre les Myopathies, vise à caractériser de manière exhaustive les mécanismes de réponse précoce au stress induits dans les organes par un dysfonctionnement des mitochondries, en comparant différents modèles de souris du syndrome de Leigh. Ceci devrait permettre d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes physiopathologiques du syndrome de Leigh, afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Il s'agit de la première étude comparative métabolomique de 2 modèles murins du syndrome de Leigh, et qui, de ce fait, devrait apporter des connaissances importantes sur cette pathologie qui ne dispose d'aucun traitement à l'heure actuelle. Elle pourrait nous aider à identifier des cibles thérapeutiques concrêtes et jusqu'à aujourd'hui non suspectées.

Procédures

Les animaux ne vont pas subir d'intervention puisqu'ils seront euthanasiés dès qu'ils atteignent l'âge requis pour un prélèvement d'organes post-mortem (7 jours, 14 jours, 21 jours, 28 jours, 35 jours et 42 jours).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (à respectivement 4 et 3 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir qui vont à terme résulter en phénotype de faiblesse musculaire, avec difficultés respiratoires peu avant le décès (vers 8 et 7 semaines respectivement).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, car nous réalisons uniquement des prélèvements d'organes post-mortem à différents âges d'analyse.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les échantillons tissulaires destinés à la protéomique et la transcriptomique. Pour obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, nos expériences solides de ces méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental pour la métabolomique.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son génome est très similaire à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, l'utilisation de deux modèles du syndrome de Leigh, qui présentent des atteintes mitochondriales différentes , permettra de mieux comprendre la pathogenèse de cette maladie. Les souris seront utilisés à divers stades post-naissance, de 7 jours à 42 jours, afin de déceler les changements rapides qui s'opèrent lorsque le syndrome de Leigh se développe chez ces animaux.

1050 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée et le reste tué. Ils reçoivent des substances chimiques sur la peau rasée ou dans l'œil pour des tests d'irritation cutanée et oculaire de type Draize, qui peuvent provoquer érythèmes, escarres, œdèmes et atteintes de la cornée et de l'iris. Les lapins sans irritation sont réutilisés pour d'autres essais, ceux plus atteints étant tués. Le porteur indique que les tests in vitro suffisent "dans la grande majorité des cas" et ne recourt au lapin que lorsque la substance est incompatible avec ces méthodes.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer la toxicité des produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques pour définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Un des paramètres étudiés pour évaluer la toxicité d’un produit chimique est de savoir s’il peut induire une irritation par contact cutané et/ou oculaire. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaires européennes. Pour répondre aux obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques nous réaliserons des tests d’irritation cutanée et occulaire sur le modèle du lapin (IC : irritation cutanée sur le lapin et IO ; irritation oculaire chez le lapin). Pour cela, le produit à tester est appliqué sur la peau rasée du lapin ou dans le sac conjonctival de l’œil du lapin afin de vérifier, par l’observation d’érythème et autres signes cliniques locaux, si une réaction d’irritation se produit.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer la dangerosité sur la santé humaine liée à une substance chimique, agrochimique ou pharmaceutique. Ces études de toxicité permettront de définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Sur un plan plus large, ces évaluations basées sur des normes reglementaires très strictes permettent d’évaluer l’inocuité de médicaments ou denrées alimentaires à usage humain ou vétérinaire.

Procédures

- Irritation cutanée : C'est un traitement local par patchage / dépatchage (mise d’un pensement puis retrait), sur un animal vigile. Il y a 3 applications pour l’animal de l’essai initiale puis 1 application pour les 2 animaux de l’essai de confirmation. Les animaux sont pesés à J0 et à la fin de l’étude. Les sites de traitement sont soumis à des observations marcroscopiques à J0, J1, J2, J3, J7 et J14. A la fin de l'étude les animaux sont euthanasiés par injection intraveineuse. - Irritation oculaire : C'est un traitement local par instillation dans le sac conjonctival sur 1 à 3 animaux vigiles. Des injections sous cutanées sont faites aux animaux pour l'analgésie (3 à J0 puis 2/jour si nécessaire). Ils sont pesés à J0 et à la fin de l’étude. Les sites de traitement sont soumis à des observations marcroscopiques à J0, J1, J2, J3, J7, J14 et J21, nécessitant une instillation de fluoréscéine 10%. A la fin de l'étude, les animaux ne pouvant pas être utilisé pour une autre étude sont euthanasiés par injection intraveineuse.

Impact sur les animaux

Un phénomène d’irritation peut apparaître. Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Les effets locaux peuvent rester jusqu’à la fin de l’étude, soit 14 jours pour l’irritation cutanée et 21 jours pour l’irritation oculaire. - test IC : peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée, une perte de souplesse de la peau pouvant provoquer une douleur à l’animal. Un stress physique peut être engendré dû à la pose du patch de traitement que l’animal garde 4h. - test IO : peuvent apparaître du larmoiement, de l’œdème des conjonctives, de l’érythème des conjonctives, une atteinte cornéenne (opacité, néovascularisation, œdème cornéen), une atteinte de l’iris pouvant provoquer une douleur à l’animal. De plus un stress physique au moment du traitement et des observations post traitement.

Devenir

- IC : Les lapins n’ayant pas présenté de signes d’irritation cutanée ou très légers et uniquement sur les trois premiers jours d’observation peuvent être récupérés pour être réutilisés dans une autre procédure utilisant une voie d’administration de la substance d’essai différente. Ceci dans un souci d’éthique animale et de réduction des animaux utilisés. Si les signes d’irritation cutanée observés sont plus importants, alors les animaux ne pourront être réutilisés car ils auront été traités avec une substance d’essai classée à minima d’irritante pour la peau. - IO : Les lapins n’ayant pas présenté de signes d’irritation oculaire ou très légers et uniquement sur les trois premiers jours d’observation peuvent être récupérés pour être réutilisés dans une autre procédure utilisant une voie d’administration de la substance d’essai différente. Ceci dans un souci d’éthique animale et de réduction des animaux utilisés. Si les signes d’irritation oculaire observés sont plus importants, alors les animaux ne pourront être réutilisés car ils auront été traités avec une substance d’essai classée à minima d’irritante pour les yeux.

Remplacement

Ces tests ne sont réalisés qu’après avoir évalué, par une analyse du poids de la preuve, toutes les données relatives au caractère potentiellement corrosif ou irritant de la substance pour la peau. Ces tests ne sont réalisés qu’après l’évaluation sur le produit chimique des données existantes en in-vivo humaine, en in vitro et de ses propriétés physicochimiques. - IC : Dans la grande majorité des cas, il n’est pas nécessaire de mettre en œuvre un test in vivo pour évaluer l’irritation cutanée. Les tests in vitro selon l’OCDE 439, l’OCDE 431 et l’OCDE 435 suffisent pour évaluer cet effet. Le test in vivo n’est mis en œuvre que lorsque le produit à tester n’est pas compatible avec le système d’essai in vitro (résultats faux positifs, faux négatifs ou interaction empêchant la réalisation du test).

Réduction

Ces tests ne sont réalisés que si nécessaire et après obtention des données montrant l’absence d’effet corrosif par la peau. Les animaux utilisés dans ces études peuvent être issus d’autres études de tolérance locale par une autre voie d’administration et dans lesquelles aucun effet ou des effets très légers ont été observés, ou de test d’évaluation de la pyrogénécité dont les résultats sont négatifs. Les animaux utilisés dans ces études sont de sexe indifférent. Ces tests sont réalisés par étapes pour réduire au maximum les souffrances et le nombre d’animaux utilisés. L’étude nécessite de traiter trois animaux mais seulement un animal est traité dans un premier temps. Si le produit n’induit pas d’effet corrosif sur le premier animal alors uniquement dans ce cas les deux autres animaux seront traités.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages individuelles, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont équipées de plateformes, de cloisons transparentes, d’un fond perforé en noryl et un enrichissement par briquettes de bois est mis à leur disposition. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et le plateau contenant les fécès et les urines est nettoyé 3 fois par semaine. - IC : Ce test est réalisé par étapes pour réduire au maximum les souffrances et le nombre d’animaux utilisés. Le produit est appliqué à des temps croissants (3 minutes, 1 heure puis 4 heures). Si un effet corrosif est obtenu à l’un des premiers temps alors le produit ne sera pas appliqué à un temps plus long. S’il n’y a plus de réactions observées 72 heures post-traitement, l’étude peut être arrêtée. - IO : Ce test est réalisé par étapes pour réduire au maximum les souffrances et le nombre d’animaux utilisés. Un protocole d’analgésie générale et d’anesthésie locale permet d’éviter toute souffrance pendant ces études. L’anesthésie locale est réalisée avant traitement, l’analgésie générale est réalisée pré et post traitement le jour du traitement ainsi que quotidiennement si des lésions importantes de l’œil ou un comportement de souffrance est perceptible chez l’animal. S’il n’y a plus de réactions observées 72 heures post-traitement, l’étude peut être arrêtée. Des points limites sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Le lapin reste le modèle de choix utilisé pour les tests de tolérance locale comme l’irritation cutanée et oculaire. Il est décrit dans les lignes directrices de l’OCDE 404 et de l’OCDE 405 dont les versions originales ont été adoptées en 1981 et ont été mises à jour en juillet 2015 et en juin 2021, respectivement. De plus, le lapin est historiquement l’espèce utilisée pour l’évaluation du potentiel irritant par contact cutané et oculaire des produits chimiques, comme décrit dans le test de Draize mis au point en 1944. L’espèce et le stade de développement des animaux à utiliser sont imposés par les normes OCDE correspondantes. Lapins jeunes adultes de 9 à 15 semaines. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.